CN102165072A - 玉米中与丝黑穗病抗性相关联的基因座 - Google Patents

Abstract

丝黑穗病是玉米中最具破坏性的疾病之一，在世界各地导致严重的产量损失。本发明描述了对赋予丝黑穗病抗性的主效QTL的精细作图。描述了对育种有用的标记和用于赋予丝黑穗病抗性的方法。公开了来自赋予丝黑穗病抗性的遗传基因座的核酸序列。公开了编码赋予丝黑穗病抗性的蛋白质的基因。

Description

玉米中与丝黑穗病抗性相关联的基因座

本专利申请要求提交于2008年8月21日的美国临时申请61/090,704的权益，该申请的内容以引用方式并入本文。

发明领域

本公开涉及用于提高玉米对丝黑穗病的抗性的组合物和方法。

背景技术

丝黑穗病是由宿主特异性的真菌丝轴黑粉菌(Sphacelotheca reiliana(Kühn)Clint.)在玉米中引起的一种源于土壤的系统性疾病(Frederiksen 1977)。来自埋于土壤中的孢子囊群的冬孢子，是主要的感染源，并且可在土壤中存活三年而不会发生感染能力的任何损失(Wu等人，1981)。在种子出苗期间或之后，上述真菌通过根或胚芽鞘感染幼苗(Krüger 1962)。在易感品种被感染后，植株继续正常的营养生长，但有一些可能会发育不良(Matyac和Kommedahl 1985a)。在成熟期，孢子囊群取代了被感染植株的穗或雄穗，导致该玉米植株几乎绝收。在被感染的大田中，被感染植株的比例可达80％(Frederiksen 1977)。根据对易感栽培品种进行栽培的结果，Jin(2000)报道该疾病的发生率为从7.0％到35.0％，有些甚至达到62.0％。在中国北方，丝黑穗病每年导致最多30万吨的产量损失(Bai等人，1994)。据报道，欧洲南部、北美和亚洲的玉米也受到该疾病的严重损害(Xu等人，1999)。考虑到经济学和生态学因素，抗性品种的栽培是控制丝黑穗病流行的一个有效途径。通过育种将抗丝黑穗病的多个抗性基因/QTL转入优良玉米品种，将会是提高对该疾病抗性的一条有希望的途径。

迄今为止，许多研究者已对丝黑穗病抗性的遗传模型进行了研究。Mei等人(1982)报道，丝黑穗病抗性受部分显性的核基因控制，这些基因在正反交中不表现出差异。Ma等人(1983)报道，玉米对丝黑穗病的抗性是定量性状，受部分抗性基因和它们的非等位基因相互作用影响。Stromberg等人(1984)发现，F₁种群表现出介于抗性的和易感的亲本之间的中等的疾病发生率。Ali和Baggett(1990)报道，加性遗传和显性遗传作用在不同处理下是优势的。Bernardo等人(1992)采用世代平均值分析法研究了抗性基因的遗传效应，表明加性效应是决定性的，而显性效应和上位效应是微弱的。Shi等人(2005)报道，除了加性效应之外，超显性效应在丝黑穗病抗性中也起着关键作用。显然，玉米中抗丝黑穗病的抗性可能涉及若干遗传因子，并以复杂的方式作用。

发明概述

提供了用于鉴定和选择具有提高的丝黑穗病抗性的玉米植物的组合物和方法。

在第一实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包括一种多核苷酸，其选自：

(a)至少一种编码赋予或提高丝黑穗病抗性的多肽的核苷酸序列，所述多肽选自SEQ ID NO：27、32、35、38、41、44、105、108、111、113和116；

(b)至少一种能够编码赋予或增强丝黑穗病抗性的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：25、26、30、31、34、36、37、39、40、42、43、45、104、106、107、109、110、112、114、115和117；和

(c)(a)或(b)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。

在第二实施方案中，本发明涉及载体，所述载体包括受权利要求书保护的分离的多核苷酸。

在第三实施方案中，本发明涉及重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括可操纵地连接到至少一个调控序列上的本发明的分离的多核苷酸。

在第四实施方案中，本发明涉及玉米细胞，所述玉米细胞包含本发明的重组DNA构建体或分离的多核苷酸。

在第五实施方案中，本发明涉及用于生产玉米植物的方法，所述方法包括用本发明的重组DNA构建体转化植物细胞以及从转化过的植物细胞再生植物。

在第六实施方案中，本发明涉及玉米植物，所述玉米植物包含本发明的重组DNA构建体。

在第七实施方案中，本发明涉及玉米种子，所述玉米种子包含本发明的重组DNA构建体。

在第八实施方案中，本发明涉及赋予或提高丝黑穗病抗性的方法，所述方法包括用本发明的重组DNA构建体转化植物，从而赋予或提高丝黑穗病抗性。

在第九实施方案中，本发明涉及判定本发明的多核苷酸在玉米植物中是否存在的方法，所述方法至少包括下列之一：

(a)从所述玉米植物分离核酸分子并扩增与本发明的多核苷酸同源的序列，或

(b)从所述玉米植物分离核酸分子并进行DNA杂交，或

(c)从所述玉米植物分离蛋白质并利用该蛋白质的抗体进行蛋白质印迹，或

(d)从所述玉米植物分离蛋白质并利用该蛋白质的抗体进行ELISA测定，或

(e)证明源自mRNA转录物、并且丝黑穗病抗性基因座特有的mRNA序列的存在，

从而证明本发明的多核苷酸在所述玉米植物中的存在。

在第十实施方案中，本发明涉及判定丝黑穗病抗性基因座在玉米植物中是否存在的方法，所述方法至少包括下列之一：

(a)从所述玉米植物分离核酸分子并扩增本发明的多核苷酸的特有的序列，或

(b)从所述玉米植物分离蛋白质并利用该蛋白质的抗体进行蛋白质印迹，或

(c)从所述玉米植物分离蛋白质并利用该蛋白质的抗体进行ELISA测定，或

(d)证明源自mRNA转录物、并且丝黑穗病抗性基因座特有的mRNA序列的存在，

从而证明丝黑穗病抗性基因座在所述玉米植物中的存在。

在第十一实施方案中，本发明涉及改变能赋予玉米细胞抗丝黑穗病的蛋白质的表达水平的方法，所述方法包括：

(a)用本发明的重组DNA构建体来转化玉米细胞，以及

(b)使上述转化的玉米细胞在适于所述重组DNA构建体表达的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达导致能在所述转化的玉米细胞中赋予丝黑穗病抗性的蛋白质的表达且其表达水平与该蛋白质在具有丝黑穗病抗性的野生型玉米植物中的表达水平相比发生改变。

在第十二实施方案中，本发明涉及能在玉米细胞中赋予丝黑穗病抗性的蛋白质的表达水平改变的方法，所述方法包括：

(a)用本发明的重组DNA构建体来转化玉米细胞；以及

(b)使上述转化的玉米细胞在适于所述重组DNA构建体表达的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达导致能在所述转化的玉米细胞中赋予丝黑穗病抗性的蛋白质的表达且其表达水平与该蛋白质在具有丝黑穗病抗性的野生型玉米植物中的表达水平相比发生改变。

在第十三实施方案中，本发明涉及改变能在玉米植物中赋予丝黑穗病抗性的蛋白质的表达水平的方法，所述方法包括：

(a)用本发明的重组DNA构建体来转化玉米植物细胞；以及

(b)从上述转化的玉米植物细胞再生转化的玉米植物；以及

(c)使上述转化的玉米植物在适于所述重组DNA构建体表达的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达导致能在所述转化的玉米植物中赋予丝黑穗病抗性的蛋白质的表达且其表达水平与该蛋白质在具有丝黑穗病抗性的野生型玉米植物中的表达水平相比发生改变。

在第十四实施方案中，本发明涉及改变能在玉米植物中赋予丝黑穗病抗性的蛋白质的表达水平的方法，所述方法包括：

(a)用本发明的重组DNA构建体来转化玉米植物细胞；以及

(b)从上述转化的玉米植株细胞再生所述转化的玉米植物；以及

(c)使上述转化的玉米植物在适于所述重组DNA构建体表达的条件下生长，其中所述重组DNA构建体的表达导致能在所述转化的玉米植物中赋予丝黑穗病抗性的蛋白质的表达且其表达水平与该蛋白质在具有丝黑穗病抗性的野生型玉米植物中的表达水平相比发生改变。

在第十五实施方案中，本发明涉及鉴定表现出丝黑穗病抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在玉米植物中检测遗传标记基因座，其中：

(a)包含所述遗传标记基因座或其互补序列的全部或部分的遗传标记探针，在严格条件下与bacm.pk071.j12、bacm.pk007.18和bacm2.pk166.h1杂交；并且

(b)所述遗传标记基因座包含与丝黑穗病抗性相关联的至少一个等位基因。

在第十六实施方案中，本发明涉及鉴定表现出丝黑穗病抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的种质中检测标记基因座的至少一个等位基因，其中：

(a)所述标记基因座位于SSR148152、CAPS25082、STS171、SNP661和STS1944的7cM内；并且

(b)至少一个等位基因与丝黑穗病抗性相关联。

在第十七实施方案中，本发明涉及鉴定表现出丝黑穗病抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的种质中检测标记基因座的至少一个等位基因，其中：

(a)所述标记基因座位于包括且两翼为umc1736和umc2184的染色体区间内，或包括且两翼为SSR148152/SNP661的染色体区间内；并且

(b)至少一个等位基因与丝黑穗病抗性相关联。

在第十八实施方案中，本发明涉及标记辅助的选择的方法，所述方法包括：

(a)获取具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植株，其中所述标记基因座位于公开的IBM基因图谱上的SSR148152、CAPS25082、STS171、SNP661和STS1944的7cM内，并且所述等位基因与提高的丝黑穗病抗性相关联；

(b)将所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交；

(c)至少就所述等位基因对子代进行评估；以及

(d)选择至少具有所述等位基因的子代玉米植株。

在第十九实施方案中，本发明涉及标记辅助的选择的方法，所述方法包括：

(a)获取具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植株，其中所述标记基因座位于包括且两翼为umc1736和umc2184的染色体区间内，并且所述等位基因与提高的丝黑穗病抗性相关联；

(b)将所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交；

(c)至少就所述等位基因对子代进行评估；并且

(d)选择至少具有所述等位基因的子代玉米植株。

在第十九实施方案中，本发明涉及检测丝黑穗病抗性基因座的方法，所述方法包括检测至少一个标记等位基因的存在，所述标记等位基因选自：MZA6393、1M2-9、E6765-3、2M4-1、2M10-5、2M11-3、3M1-25和STS148-1。

此外，显然在前述的任何方法中，任何所述的与丝黑穗病抗性相关联的标记等位基因均可与任何第二标记等位基因连接。此类第二标记等位基因也可与丝黑穗病抗性相关联，并以上文所述的方式起作用。

附图以及序列清单的说明

根据以下的详细描述和附图以及序列表可更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Research 13：3021-3030(1985)以及在Biochemical Journal 219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献全文以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

图1.针对AZM4_140313(来自TIGR的拼接的玉米序列)的单核苷酸多态性标记(SNP140313)的开发，及其在BC群体基因分型中的应用。

图2.新开发的标记在bin2.09区域的基因作图。

图3.来自Mo17和B73的木聚糖酶抑制剂基因的比对。Mo17序列存在于qHSR1中，该基因座在玉米中赋予丝黑穗病抗性。B73是丝黑穗病敏感的玉米品种。

图4.Mo17、B73和Huangzhao在qHSR区域中基因组结构的比较图。与Mo17相比，B73和Huangzhao在该区域中均具有缺失。本发明描述的标记显示于上方。标注了六个感兴趣的基因：Mo17特有的一个水解酶基因；基因1为锚蛋白重复蛋白基因，存在于全部三个品系中；基因2是一种细胞壁关联激酶，存在于Mo17和B73中；基因3和4是相关的LRR-Xa21-样激酶，它们是Mo17特有的；基因5是第三种LRR-Xa21D-样激酶，其完整地或部分地存在于全部三个品系中。在该区域中，Mo17的长度为172kb，Huangzhao的长度为56kb。

本文所附的序列描述和序列表遵循在37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的用于专利申请公开中的核苷酸和/或氨基酸序列的规定。序列表包含遵循IUPAC-IUBMB标准的核苷酸序列的单字母编码和氨基酸序列的三字母编码，IUPAC-IUBMB标准描述于Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)和Biochemical J.219(2)：345-373(1984)中，它们引入本文以供参考。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

SEQ ID NO：1为扩增引物CAPS25082-L。

SEQ ID NO：2为扩增引物CAPS25082-R。

SEQ ID NO：3为扩增引物SNP140313-L。

SEQ ID NO：4为扩增引物SNP140313-R。

SEQ ID NO：5为扩增引物SNP140313-snpL。

SEQ ID NO：6为扩增引物SNP140313-snpR。

SEQ ID NO：7为扩增引物SNP661-L。

SEQ ID NO：8为扩增引物SNP661-R。

SEQ ID NO：9为扩增引物SNP661-snpL。

SEQ ID NO：10为扩增引物SNP661-snpR。

SEQ ID NO：11为扩增引物STS1944-L。

SEQ ID NO：12为扩增引物STS1944-R。

SEQ ID NO：13为扩增引物STS171-L。

SEQ ID NO：14为扩增引物STS171-R。

SEQ ID NO：15为扩增引物SSR148152-L。

SEQ ID NO：16为扩增引物SSR148152-R。

SEQ ID NO：17为扩增引物STSrga3195-L。

SEQ ID NO：18为扩增引物STSrga3195-R。

SEQ ID NO：19为扩增引物STSrga840810-L。

SEQ ID NO：20为扩增引物STSrga840810-R。

SEQ ID NO：21为扩增引物STSsyn1-L。

SEQ ID NO：22为扩增引物STSsyn1-R。

SEQ ID NO：23为MZA6393标记(来自bacm.pk071.j12.f)，该标记限定了覆盖qHSR1基因座的BAC重叠群的一端。该标记的Huangzhao和B73版本分别列于SEQ ID NO：47和48中。

SEQ ID NO：24为ST148标记，来自ZMMBBc0478L09f的Mo17版本，该标记限定了覆盖qHSR1基因座的BAC重叠群的一端。该标记的Huangzhao版本可见于SEQ ID NO：49中。

SEQ ID NO：25为BAC重叠群，该重叠群由覆盖了qHSR1基因座的重叠克隆bacm.pk071.j12、bacm.pk007.18和bacm2.pk166.h1组成。

SEQ ID NO：26为来自Mo17的核酸序列，该序列代表qHRS1基因座中包含的一个木聚糖酶抑制剂基因的编码区。

SEQ ID NO：27为SEQ ID NO：26的翻译产物。

SEQ ID NO：28为来自B73的核酸序列，该序列代表一个木聚糖酶抑制剂基因的编码区，所述木聚糖酶抑制剂基因被包含于B73基因组上与qHRS1基因座同线的区域。

SEQ ID NO：29为SEQ ID NO：28的翻译产物。

SEQ ID NO：30为来自Mo17的、编码SEQ ID NO：26/27的木聚糖酶抑制剂的基因组DNA区域，以及该编码区上游的3kb区域。

SEQ ID NO：31为来自Mo17的核酸序列，该序列代表qHRS1基因座中包含的一个细胞壁关联激酶基因的编码区。

SEQ ID NO：32为SEQ ID NO：31的翻译产物。

SEQ ID NO：33为来自Mo17的、编码SEQ ID NO：31/32的细胞壁关联蛋白激酶的基因组DNA区域，以及该编码区上游的2.4kb区域。

SEQ ID NO：34为来自Mo17的核酸序列，该序列代表qHRS1基因座中包含的一个HAT家族二聚化蛋白基因(PCO662117)编码区。

SEQ ID NO：35为SEQ ID NO：34的翻译产物。

SEQ ID NO：36为来自Mo17的、编码SEQ ID NO：34/35的HAT家族二聚化蛋白的基因组DNA区域，以及该编码区上游的2.4kb区域。

SEQ ID NO：37为来自Mo17的核酸序列，该序列代表qHRS1基因座中包含的一个HAT家族二聚化蛋白基因(PCO662162/PCO548849/PCO523172)编码区。

SEQ ID NO：38为SEQ ID NO：37的翻译产物。

SEQ ID NO：39为来自Mo17的、编码SEQ ID NO：37/38的HAT家族二聚化蛋白的基因组DNA区域，以及该编码区上游的2.4kb区域。

SEQ ID NO：40为来自Mo17的核酸序列，该序列代表qHRS1基因座中包含的一个未表征蛋白的基因(PCO648231)编码区。

SEQ ID NO：41为SEQ ID NO：40的翻译产物。

SEQ ID NO：42为来自Mo17的、编码SEQ ID NO：40/41的未表征蛋白的基因组DNA区域，以及该编码区上游的2.4kb区域。

SEQ ID NO：43为来自Mo17的核酸序列，该序列代表qHRS1基因座中包含的一个未表征蛋白蛋白基因(61_24)编码区。

SEQ ID NO：44为SEQ ID NO：43的翻译产物。

SEQ ID NO：45为来自Mo17的、编码SEQ ID NO：43/44的未知蛋白的基因组DNA区域，以及该编码区上游的2.4kb区域。

SEQ ID NO：46为编码一个单独的EST的核酸序列，所述EST序列来自Mo17，被包含于qHRS1基因座中。

SEQ ID NO：47为来自Huangzhao的覆盖了qHSR1基因座的MZA6393标记。

SEQ ID NO：48为来自B73的覆盖了qHSR1基因座的MZA6393标记。

SEQ ID NO：49为来自Huangzhao的ST148标记。

SEQ ID NO：47为来自Huangzhao4的MZA6393标记。

SEQ ID NO：48为来自B73的MZA6393标记。

SEQ ID NO：49为来自Huangzhao4的STS 148-1标记。

SEQ ID NO：50为扩增引物MZA6393L。

SEQ ID NO：51为扩增引物MZA6393R。

SEQ ID NO：52为扩增引物1M2-9L。

SEQ ID NO：53为扩增引物1M2-9R。

SEQ ID NO：54为来自Mo17的1M2-9标记。

SEQ ID NO：55为来自Huangzhao4的1M2-9标记。

SEQ ID NO：56为扩增引物E6765-3L。

SEQ ID NO：57为扩增引物E6765-3R。

SEQ ID NO：58为来自Mo17的E6765-3标记。

SEQ ID NO：59为扩增引物2M4-1L。

SEQ ID NO：60为扩增引物2M4-1R。

SEQ ID NO：61为来自Mo17的2M4-1标记。

SEQ ID NO：62为扩增引物2M10-5L。

SEQ ID NO：63为扩增引物2M10-5R。

SEQ ID NO：64为来自Mo17的2M10-5标记。

SEQ ID NO：65为扩增引物2M11-3L。

SEQ ID NO：66为扩增引物2M11-3R。

SEQ ID NO：67为来自Mo17的2M11-3标记。

SEQ ID NO：68为扩增引物3M1-25L。

SEQ ID NO：69为扩增引物3M1-25R。

SEQ ID NO：70为来自Mo17的3M1-25标记。

SEQ ID NO：71为来自Huangzhao4的3M1-25标记。

SEQ ID NO：72为扩增引物STS148-1L。

SEQ ID NO：73为扩增引物STS148-1R。

SEQ ID NO：74为扩增引物MZA15839-4-L。

SEQ ID NO：75为扩增引物MZA15839-4-R。

SEQ ID NO：76为扩增引物MZA18530-16-L。

SEQ ID NO：77为扩增引物MZA18530-16-R。

SEQ ID NO：78为扩增引物MZA5473-801-L。

SEQ ID NO：79为扩增引物MZA5473-801-R。

SEQ ID NO：80为扩增引物MZA16870-15-L。

SEQ ID NO：81为扩增引物MZA16870-15-R。

SEQ ID NO：82为扩增引物MZA4087-19-L。

SEQ ID NO：83为扩增引物MZA4087-19-R。

SEQ ID NO：84为扩增引物MZA158-30-L。

SEQ ID NO：85为扩增引物MZA158-30-R。

SEQ ID NO：86为扩增引物MZA15493-15-L。

SEQ ID NO：87为扩增引物MZA15493-15-R。

SEQ ID NO：88为扩增引物MZA9967-11-L。

SEQ ID NO：89为扩增引物MZA9967-11-R。

SEQ ID NO：90为扩增引物MZA1556-23-L。

SEQ ID NO：91为扩增引物MZA1556-23-R。

SEQ ID NO：92为扩增引物MZA1556-801-L。

SEQ ID NO：93为扩增引物MZA1556-801-R。

SEQ ID NO：94为扩增引物MZA17365-10-L。

SEQ ID NO：95为扩增引物MZA17365-10-R。

SEQ ID NO：96为扩增引物MZA17365-801-L。

SEQ ID NO：97为扩增引物MZA17365-801-R。

SEQ ID NO：98为扩增引物MZA14192-8-L。

SEQ ID NO：99为扩增引物MZA14192-8-R。

SEQ ID NO：100为扩增引物MZA15554-13-L。

SEQ ID NO：101为扩增引物MZA15554-13-R。

SEQ ID NO：102为扩增引物MZA4454-14-L。

SEQ ID NO：103为扩增引物MZA4454-14-R。

SEQ ID NO：104为来自Mo17的核酸序列，该序列代表锚蛋白重复蛋白(基因1，图4)的基因编码区。

SEQ ID NO：105为SEQ ID NO：104的翻译产物。

SEQ ID NO：106为来自Mo17的编码锚蛋白重复蛋白的基因组DNA区域。

SEQ ID NO：107为来自Mo17的核酸序列，该序列代表水解酶的基因编码区。

SEQ ID NO：108为SEQ ID NO：107的翻译产物。

SEQ ID NO：109为来自Mo17的编码水解酶的基因组DNA区域。

SEQ ID NO：110为来自Mo17的核酸序列，该序列代表LRR-Xa21-样激酶(基因3，图4)的基因编码区。

SEQ ID NO：111为SEQ ID NO：110的翻译产物。

SEQ ID NO：112为来自Mo17的核酸序列，该序列代表LRR-Xa21-样激酶(基因4，图4)的基因编码区。

SEQ ID NO：113为SEQ ID NO：112的翻译产物。

SEQ ID NO：114为来自Mo17的编码LRR-Xa21-样激酶(基因4，图4)的基因组DNA区域。

SEQ ID NO：115为来自Mo17的核酸序列，该序列代表LRR-Xa21D-样激酶(基因5，图4)的基因编码区。

SEQ ID NO：116为SEQ ID NO：115的翻译产物。

SEQ ID NO：117为来自Mo17的编码LRR-Xa21D-样激酶(基因5，图4)的基因组DNA区域。

发明详述

本发明提供玉米等位基因组合物和鉴定并选择具有提高的丝黑穗病抗性的玉米植物的方法。等位基因组合物和用于鉴定并反选择具有降低的丝黑穗病抗性的玉米植物的方法也在本发明的范围内。提供以下定义以利于理解本发明。

所述丝黑穗病抗性基因座的作图描述于Yongsheng Chen、Qing Chao、Guoqing Tan、Jing Zhao、Meijing Zhang、Qing Ji和Mingliang Xu所著文稿“Identification and fine-mapping of a major QTL conferring resistance against head smut in maize”中。该文稿作为附录附属于本说明书。

术语“等位基因”指在特定基因座处发生的两个或更多个不同核苷酸序列的其中一个。“有利等位基因”为位于特定基因座、赋予或有助于所期望的农学表型的等位基因，所述表型例如提高的丝黑穗病抗性，或者作为另外一种选择，为允许具有降低的丝黑穗病抗性的植物的鉴定的等位基因，其中所述植物可从育种计划或种植中被筛除(“反选择”)。标记的有利等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因，或者作为另外一种选择，与不利植物表型共分离，从而提供鉴定植物的有益效果。染色体片段的有利等位基因形式是包括一段核苷酸序列的染色体片段，所述核苷酸序列在一个或多个位于所述染色体片段上的基因座有助于优异的农学性状。“等位基因频率”是指一个等位基因存在于一个个体、一个品系或一个包括多个品系的群体中的频率(比例或百分比)。例如，就等位基因“A”而言，基因型“AA”、“Aa”、或“aa”的二倍体个体分别具有1.0、0.5或0.0的等位基因频率。人们能够通过平均化来自品系的个体样品的等位基因频率来估计该品系中的等位基因频率。同样地，人们能够通过平均化构成种群的品系的等位基因频率来计算该种群品系中的等位基因频率。就一组限定数目的个体或品系而言，可将所有等位基因频率表示为包含等位基因的个体或品系(或任何其他指定组)的计数。

当等位基因与性状相关联时，并且当所述等位基因的存在是期望的性状或性状形式将发生在包含所述等位基因的植物中的指示时，所述等位基因与性状“正”关联。当等位基因与性状相关联时，并且当所述等位基因的存在是期望的性状或性状形式将不会发生在包含所述等位基因的植物中的指示时，所述等位基因与性状“负”关联。

假如个体在一个基因座仅有一种类型的等位基因(例如二倍体生物体在两条同源染色体中的每一条的一个基因座具有一个拷贝的相同等位基因)，则该个体在该基因座是“纯合的”。假如一种以上的等位基因类型存在于一个基因座上(例如二倍体个体具有两个不同等位基因中的每一个的一个拷贝)，则该个体是“杂合的”。术语“同质”指一组成员在一个或多个特定基因座上具有相同基因型。与之相反，术语“异质”用于指明一组内的个体在一个或多个特定基因座上基因型不同。

本文所用术语“染色体区间”或“染色体片段”是指植物体内存在于单个染色体上的连续的线性基因组DNA跨度。位于单染色体间隔上的遗传因子或基因是物理上连锁的。不特别限定染色体区间的大小。在一些方面，位于单个染色体区间内的遗传因子在遗传上连锁，遗传重组距离通常为例如小于或等于20cM，或者小于或等于10cM。即，位于单个染色体区间内的两个遗传因子以小于或等于20％或10％的频率进行重组。

术语“杂交的”或“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植物时)。“顶交测试”是通过将每一亲本与相同测试者(通常是纯合品系)杂交而进行的子代测试。测试亲本可为自由授粉的品种、杂交品系或近交系。

“基因图谱”是对一个给定物种的一条或多条染色体(或连锁群)上的基因座之间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式呈现。“基因作图”是通过遗传标记的使用、与这些标记相关的种群分离和重组频率的标准遗传学原理，界定基因座之间连锁关系的过程。“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。如果两个不同的标记具有相同的基因图谱位置，则这两个标记彼此紧邻，以至于它们之间发生重组的频率低至不能被检测到。

一个基因图谱与另一个基因图谱在遗传标记间的顺序和遗传距离上可能不同。这是因为每一基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。例如，在内部来源的基因图谱上(本文也将Pioneer Hi-Bred称为“PHB”)的10cM大概等同于在IBM22005邻接框公开图谱(在玉米GDB上可用的高分辨率图谱)上的25-30cM。然而，使用常见标记的通用框能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用常见标记的框架来鉴定在各个个体基因图谱上的遗传标记位置和QTL(数量性状位点)。表3中可见内部来源的基因图谱和IBM2neighbors基因图谱之间的标记位点比较。

“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。可将遗传重组频率用厘摩(cM)表示，其中一cM是两个遗传标记间的距离，它们显示1％的重组频率(即那两个标记间每100次细胞分裂发生交换事件一次)。

术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的一种或多种等位基因限定，个体已经从其亲本中继承了所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。

“种质”指个体(例如一个植株)、一组个体(例如一个植物品系、品种或家族)、或来源于一个品系、品种、物种、或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常给遗传物质提供特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植物的细胞、种子或组织，或者植物部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。

“单倍型”是个体在多个基因座上的基因型，即等位基因组合。单倍型描述的基因座通常是物理上和遗传上连锁的，即在相同染色体片段上。

“杂交”或“核酸杂交”是指互补的RNA和DNA链的配对以及互补的DNA单链的配对。“严格度”是指核酸杂交发生的条件，包括温度、离子强度和某些有机溶剂，例如甲酰胺的存在。在高严格度条件下(高温度和低盐)，只要两条核酸片段之间存在高频率的互补碱基序列，它们就将配对，或者说“杂交”。

术语“渗入”指基因座的期望等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景的现象。例如在特定基因座的期望等位基因通过渗入、经由相同物种的两个亲本间的有性杂交可被传递到至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中具有期望的等位基因。作为另外一种选择，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有期望的等位基因。期望的等位基因可为例如标记的选择等位基因、QTL、转基因等。在任何情况下，能够将包含期望等位基因的子代与具有期望遗传背景的品系反复回交并选择期望的等位基因以产生固定在选择遗传背景中的等位基因。

“品系”或“品种”是一组具有相同亲本的个体，它们一般是某种程度的自交体，并且一般在大多数基因座是纯合的和同质的(同基因的或接近同基因的)。“亚系”指子代的自交体亚群，它们与相同祖先来源的其他相似自交体亚群遗传上不同。

“祖先品系”是用作基因来源的亲本品系，例如用于开发优良品系。“祖先种群”是对被用于培育优良品系的大部分基因变异有所贡献的祖先的群体。“后代”是祖先的后代，并可通过许多世代的繁殖与其祖先分离。例如，优良品系是它们的祖先的后代。“谱系结构”规定了后代和产生该后代的各个祖先的关系。谱系结构能够跨越一代或多代，描述后代及其父母亲本、祖父母亲本、曾祖父母亲本等的关系。

“优良株系”或“优良品系”是农学上优异的品系，该品系由多代育种以及选择优异农学特性产生。多个优良品系对玉米育种领域的技术人员来说是可用的和已知的。“优良种群”是一类优良个体或品系，根据给定作物物种如玉米的农学上优异的基因型，它们将可用于代表技术发展水平。同样的，“优良种质”或优良品种的种质是农学上优异的种质，通常来源于和/或能够生成具有优异农学性能的植物，如现有的或新开发的优良玉米品系。

“公开的IBM基因图谱”指任何以下图谱：IBM、IBM2、IBM2neighbors、IBM2 FPC0507、IBM2 2004 neighbors、IBM2 2005neighbors、或IBM2 2005 neighbors框。所有这些IBM基因图谱基于B73×Mo17种群，其中来自初始杂交的子代在构建重组自交系用于作图前随机交配产生多代。较新的版本反映了基因和BAC作图基因座的加入以及由于包含来自其他基因图谱的信息带来的图谱精细度的提高。

与之相反，“外来玉米品系”或“外来玉米种质”是来源于不属于可利用优良玉米株系或品系的种质的玉米的品系或种质。在杂交发生在两个玉米植株或品系的种质之间的情况下，外来种质的子代不与它杂交的优良种质密切相关。最常见的是外来种质不来源于任何已知的玉米优良品系，而是选择将新遗传因子(通常新等位基因)导入育种程序。

如本文所用，术语“连锁”用于描述一个标记基因座与另一个标记基因座或其他基因座(例如丝黑穗病抗性基因座)“关联”的程度。分子标记和表型间的连锁关系被称为“概率”或“调整概率”。概率值(也称为p-值)是表型的特定组合和特定标记等位基因随机性存在或不存在的统计学可能性。因此，概率评分越低，表型和特性标记将共分离的可能性越大。在某些方面，认为概率评分是“显著的”或“不显著的”。在一些实施方案中，认为随机分离的概率评分为0.05(p＝0.05，或5％的概率)是共分离的显著性指示。然而，可接受的概率可为小于50％(p＝0.5)的任何概率。例如，显著概率可小于0.25、小于0.20、小于0.15、小于0.1、小于0.05、小于0.01、或小于0.001。

在区间作图中，两个标记基因座之间的连锁可以用优势比(即连锁对不连锁的比率)进行计算。上述比率更加方便地表示为比率的对数，称为优势对数(LOD)值或LOD分数(Risch，Science 255：803-804(1992))。两个标记之间的LOD值为3表示连锁的可能性比不连锁的可能性大1000倍。较低的LOD值，例如2.0或2.5，可用于检测较大水平的连锁。

“连锁基因座”位置紧邻，使得这两个基因座之间不发生高频率(等于或小于10％的频率)的同源染色体对间的减数分裂重组，例如连锁基因座在至少约90％的时间，如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.75％、或更多的时间共分离。当标记基因座显示与期望性状(例如提高的丝黑穗病抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们尤其有用。例如在某些方面，这些标记可被称为“连锁QTL标记”。

连锁可表示为所期望的界限或范围。例如在一些实施方案中，当标记分离距离为小于50、40、30、25、20、或15图谱单位(或cM)时，任何标记与任何其他标记连锁(基因上和物理上)。进一步的连锁可被描述为距离14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1图谱单位(或cM)。在某些方面，限定范围形式的连锁，例如介于10和20cM之间、介于10和30cM之间、或者介于10和40cM之间，是有利的。

标记与第二基因座连锁越紧密，标记越可能变成第二基因座的指示。因此，“紧密连锁基因座”例如一个标记基因座和一个第二基因座，表现出10％或更低、或约9％或更低、或约8％或更低、或约7％或更低、或约6％或更低、或约5％或更低、或约4％或更低、或约3％或更低、或约2％或更低的基因座间重组频率。在其他实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，或约0.5％或更低，或约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“邻近”。因为一cM是显示出1％的重组频率的两个标记之间的距离，当任何标记与任何其他标记紧邻，例如距离等于或小于10cM时，这两个标记紧密连锁(遗传上和物理上)。在相同染色体上的两个紧密连锁的标记可被彼此定位于彼此相距9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5、0.25、0.1、0.075、0.05、0.025或0.01cM或更小。

当涉及两个遗传因子间的关系时，如有助于提高丝黑穗病抗性的遗传因子和邻近的标记，“相引”相连锁指示下述状态：其中在茎秆强度基因座上的“有利”等位基因与相应连锁的标记基因座的“有利”等位基因物理上关联在相同染色体链上。在耦合相(前有丝分裂期)中，两个有利等位基因被继承了该染色体链的子代一起继承。在“相斥”相连锁中，在受关注基因座上的“有利”等位基因与在邻近的标记基因座上的“不利”等位基因物理上连锁，并且两个“有利”等位基因不被一起继承(即这两个基因座彼此“异相”)。

术语“连锁不平衡”指基因座或性状(或者两者都有)非随机地分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关的基因座沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以大于随机(即非随机)的频率一起分离(在共分离性状的情况下，产生该性状的基因座彼此足够接近)。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁基因座在超过50％的情况下共分离，例如约51％至约100％的情况。换句话说，共分离的两个标记具有小于50％(并且根据定义，在相同连锁群上分离距离小于50cM)的重组频率。如本文所用，连锁可存在于两个标记或者标记和表型之间。标记基因座可与性状“相关联”(连锁)，所述性状例如丝黑穗病抗性。测量分子标记与表型性状的连锁程度，例如分子标记与表型共分离的统计学概率。

连锁不平衡最常见地用量度r²测量，它通过Hill，W.G.和Robertson，A，Theor.Appl.Genet.38：226-231(1968)所述的公式计算。当r²＝1时，两个标记座位间存在完全的LD，意味着标记还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r²值大于1/3指示足够强的LD将被用于作图(Ardlie等人，Nature Reviews Genetics 3：299-309(2002))。因此，当成对标记座位间的r²值大于或等于0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。

如本文所用，“连锁平衡”描述其中两个标记独立地分离的情况，即，在子代中随机分离。认为显示连锁平衡的标记不连锁(无论它们是否位于相同染色体上)。

“基因座”是基因或标记所在的染色体区域。例如“基因座”是物种基因组中能够在其中发现特定基因的特定染色体位置。

“玉米(maize)”和“玉米(corn)”本文可互换使用。

术语“标记”、“分子标记”、“标记核酸”、和“标记座位”指核苷酸序列或其编码的产物(例如蛋白)，当鉴定关联的基因座时它们用作参考点。标记能够来源于基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA或cDNA)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或侧接标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。

“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记座位存在与否的核酸序列或分子，例如与标记座位序列互补的核酸分子探针。包含标记座位的30个或更多邻接核苷酸(“所有或部分”标记座位序列)的标记探针可用于核酸杂交。作为另外一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记座位上的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性“杂交”或配对时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。

以PHM命名的标记表示一组扩增一段特异性DNA(本文中称为“扩增子”)的引物。将来自多个玉米品系的扩增子的核苷酸序列进行比较，从而鉴定了多态性或变异。所述多态性包括单核苷酸多态性(SNP)、简单重复序列(SSR)、插入/缺失(插入缺失)等。

“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中一个，它就标记座位而言是多态的。作为另外一种选择，以数字命名的标记等位基因表示在该特异性标记基因座的信息性多态性位点的等位基因的特定组合，也称为“单倍型”。在一些方面，提供了与玉米中丝黑穗病抗性相关的标记基因座。

“标记座位”是可用于追踪第二连接基因座存在的基因座，例如编码或有助于表达表型性状的连接的基因座。例如标记座位能够用于监控等位基因在某一基因座的分离，如QTL，它们与标记座位在遗传上或在物理上连锁。

“遗传标记”是种群中的多态核酸，并且可通过一种或多种分析方法，例如RFLP、AFLP、同功酶、SNP、SSR等，检测并区分所述标记等位基因。该术语也指与基因组序列互补的核酸序列，如用作探针的核酸。

对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。

“丝黑穗病抗性”是指玉米植物耐受宿主特异性的真菌丝轴黑粉菌(Sphacelotheca reiliana(Kühn)Clint)感染的能力。这些抗性包括但不限于，与缺乏本文所述的抗性基因座的玉米植株相比，减少的孢子囊群生产、提高的植株活力、提高的抽穗功能和提高的玉米产量。

本发明实施方案的核酸和多肽可用于赋予或增强植物真菌抗性的方法中。抗性的来源可以是天然存在的遗传的抗性基因座，所述基因座通过育种实现向缺少该抗性基因座的敏感型玉米种群的基因渗入，或者，赋予抗性的基因可作为转基因异位表达，所述转基因当在敏感型种群中表达时赋予抗性。因此，本文公开的组合物和方法在保护植物不受病原真菌侵害中是有用的。“病原抗性”、“真菌抗性”和“疾病抗性”意指植物避免了作为植物-病原体相互作用结果的疾病症状。即，防止了病原体导致植物疾病和相关的疾病症状，或者，病原体导致的疾病症状被最小化或减弱了，例如压力和相关的产量损失的降低。本领域的技术人员将会知道，本文所公开的组合物和方法可与本领域中可用的其他组合物和方法一起被用于保护植物免受病原体攻击。

因此，本发明实施方案的方法可被用于保护植物免受疾病，尤其是由植物病原真菌导致的疾病的侵害。如本文所用，“真菌抗性”是指与野生型植物的对应性质相比，对病原真菌增强的抗性或耐受性。效果可以从对病原真菌的影响的耐受性的略微增加(例如部分抑制)，直至使得植物不受病原真菌存在的影响这样的完全抗性。针对一种特定的病原真菌或针对更广泛的病原真菌谱的抗性水平的提高，构成了“增强的”或提高的真菌抗性。本发明的实施方案也将增强或提高植物病原真菌抗性，使得植物对一种或多种病原真菌的抗性提高。术语“增强”是指提高、增加、扩大、倍增、提升、上升等。在本文中，本发明的植物被描述为由于本发明的丝黑穗病抗性基因座而对丝轴黑粉菌的感染具有抗性或者对丝轴黑粉菌的感染具有“增强的抗性”。相应地，与因缺少丝黑穗病抗性基因座而对丝轴黑粉菌的感染敏感的相应植物相比，它们通常表现出对该疾病提高的抗性。

在一些特定方面，赋予或增强植物真菌抗性的方法包括将至少一种表达盒转入植物，其中所述表达盒包括编码本发明实施方案的抗真菌多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地连接至在所述植物中驱动表达的启动子。植物表达所述多肽，从而赋予了该植物真菌抗性，或提高了该植物抗性的固有水平。在特定实施方案中，所述基因赋予了对病原真菌丝轴黑粉菌的抗性。

所述实施方案的抗真菌多肽的表达可定位于对病原体的抗性在其处尤其重要的特定的植物组织，例如叶、根、茎或维管组织。此类组织优先的表达可通过根优先的、叶优先的、维管组织优先的、茎优先的或种子优先的启动子而实现。

“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、和“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。“核苷酸”是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，它由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖、和磷酸基组成。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过它们下述的单字母命名法指：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。本发明实施方案的多肽既可从本文所公开的核酸产生，也可通过使用标准的分子生物学技术而产生。例如，本发明实施方案的截短的蛋白质可通过在适当的宿主细胞中表达本发明实施方案的重组核酸而产生，或者通过离体过程的组合，例如蛋白酶消化和纯化而产生。

如本文所用，术语“编码”或“编码的”当用于特定的核酸时，意指该核酸包含用以指导从其核苷酸序列向特定蛋白质的翻译的必要信息。蛋白质被编码所用的信息通过密码子的使用而具体化。编码蛋白质的核酸可在所述核酸的翻译区之间包含非翻译序列(即内含子)，或者可没有此类居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。

本发明的实施方案包括分离的或充分纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质，或其生物活性部分，是充分地或基本上不含那些在天然存在环境中伴随所述多核苷酸或蛋白质或与其相互作用的组分的。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质，当其是通过重组技术(例如PCR扩增)产生的时，基本上不含其他细胞物质，或者当其是化学合成的时，基本上不含化学前体或其他化学品。最理想的情况，“分离的”多核苷酸不含在该多核苷酸所来源于的生物的基因组DNA中天然地存在于所述多核苷酸两翼(即，位于所述多核苷酸的5′和3′端)的序列(例如，蛋白质编码序列)。例如，在不同的实施方案中，所述分离的多核苷酸可包含少于约5kb、约4kb、约3kb、约2kb、约1kb、约0.5kb、或约0.1kb的在该多核苷酸所来源于的细胞的基因组DNA中天然地存在于所述多核苷酸两翼的核苷酸序列。基本上不含细胞物质的蛋白质包括制备含有少于约30％、约20％、约10％、约5％或约1％(以干重计)的杂蛋白的蛋白质。当所述实施方案的蛋白质或其生物活性部分为重组生产的时，最佳的培养基包含少于约30％、约20％、约10％、约5％或约1％(以干重计)的化学前体或非目标蛋白质的化学品。

本文公开的核苷酸序列及其编码的蛋白质的片段和变体同样包括在本发明的实施方案中。“片段”意指核苷酸序列的部分，或氨基酸序列的部分以及由此编码的蛋白质的部分。核苷酸序列的片段可编码保留了天然蛋白质的生物学活性的蛋白质片段，所述蛋白质片段因此具有赋予植物真菌抗性的能力。作为另外一种选择，作为杂交探针起作用的核苷酸序列的片段不必编码保留了生物学活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列片段的长度范围可以是至少约15核苷酸、约50核苷酸、约100核苷酸、以及最多为编码本发明实施方案的多肽的全长核苷酸序列。

编码本发明实施方案的多肽的一个生物活性部分的一条核苷酸序列片段，将编码至少约15个、约25个、约30个、约40个或约50个连续的氨基酸，或最多存在于本发明实施方案的全长多肽中的总的数量的氨基酸。用作杂交探针或PCR引物的核苷酸序列片段一般不需要编码蛋白质的生物活性部分。

如本文所用，关于特定多核苷酸的“全长序列”，意指具有天然序列的完整的核酸序列。“天然序列”旨在表示内源性序列，即存在于生物体基因组中的非人工改造的序列。

因此，本发明实施方案的核苷酸序列的片段可编码多肽的生物活性部分，或者它可以是能用作使用下文所公开方法的杂交探针或PCR引物的片段。抗病原体的多肽的生物活性部分，可通过分离本发明实施方案的核苷酸序列之一的一个部分、表达所述蛋白质的编码部分、以及评估所述蛋白质的编码部分赋予或增强植物的真菌抗性的能力进行制备。作为本发明实施方案的核苷酸序列的片段的核酸分子，包含至少约15个、约20个、约50个、约75个、约100个或约150个核苷酸，或最多存在于本文所公开的全长核苷酸序列中的总的数量的核苷酸。

“变体”旨在表示基本上类似的序列。就多核苷酸而言，变体包括在天然多核苷酸的一个或多个内部位点有一个或多个核苷酸的缺失和/或插入，和/或在天然多核苷酸的一个或多个位点有一个或多个核苷酸的取代。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本领域的技术人员将认识到，本发明实施方案的核酸的变体将被构建为使得开放阅读框(ORF)被保留。就多核苷酸而言，保守的变体包括那些由于遗传密码的简并性，编码本发明实施方案的多肽之一的氨基酸序列的序列。天然存在的等位变体如这些能通过使用熟知的分子生物学技术鉴定的变体，所述技术例如下文所列出的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸还包括合成得到的多核苷酸，例如，那些通过利用例如定点诱变产生的多核苷酸，但其仍然编码本发明实施方案的蛋白质。一般来讲，如通过序列比对程序和本文其他地方所述的参数所测定的，本发明实施方案的特定多核苷酸的变体与该特定多核苷酸之间将至少具有约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的序列同一性。

本发明实施方案的特定多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体，还可通过比较变体多核苷酸所编码的多肽和参考多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分比来加以评估。因此，例如，本文公开了所编码的多肽与SEQ ID NO：3的多肽具有给定的序列同一性百分比的分离的多核苷酸。任何两种多肽之间的序列同一性百分比可利用序列比对程序和本文其他地方所述的参数计算出。当通过比较本发明实施方案的任何一对给定的多核苷酸所编码的两种多肽之间的序列同一性百分比，来评估所述任何一对给定的多核苷酸时，上述两种编码的多肽之间的序列同一性百分比为至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高。

“变体”蛋白质旨在表示通过在天然蛋白质的一个或多个内部位点有一个或多个氨基酸的缺失或插入，和/或在天然蛋白质的一个或多个位点有一个或多个氨基酸的取代而源自于所述天然蛋白质的蛋白质。本发明实施方案所包括的变体蛋白质是具有生物活性的，也就是说它们仍然拥有天然蛋白质所拥有的所期望的生物活性，即赋予或增强植物病原真菌抗性的能力，如本文所述。此类变体可得自例如遗传多态性或得自人工操纵。如通过序列比对程序和本文其他地方所述的参数所测定的，本发明实施方案的天然蛋白质的具生物活性的变体与该天然蛋白质的氨基酸序列之间将至少具有约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的序列同一性。本发明实施方案的蛋白质的具生物活性的变体与该蛋白质之间，可以在少至约1-15个氨基酸残基、少至约1-10个，例如约6-10个、少至约5个、少至4、3、2甚或1个氨基酸残基上存在不同。

本发明实施方案的蛋白质可用多种方法进行改变，包括氨基酸取代、删除、截短、和插入。此类操纵方法是本领域一般已知的。例如，所述抗病原体的蛋白质的氨基酸序列变体和片段可通过DNA上的突变进行制备。用于诱变和多核苷酸改变的方法是本领域熟知的。参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利4,873,192；Walker和Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company，New York)及其引用的参考文献。关于不影响受关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可参见Dayhoff等人的模型，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)，该参考文献以引用方式并入本文。可优选保守取代，如用一个具有相似性质的氨基酸取代另一个氨基酸。

因此，本发明实施方案的基因和多核苷酸既包括天然存在的序列也包括突变形式。同样的，本发明实施方案的蛋白质既包括天然存在的蛋白质也包括其变体和修饰形式。此类变体将继续拥有所期望的赋予或增强植物病原真菌抗性的能力。显然，在编码变体的DNA中制造的突变不应将所述序列置于阅读框之外，并且优选地将不产生能导致产生mRNA二级结构的互补区域。参见专利EP 0075444。

不期望本文包括的蛋白质序列的删除、插入、和取代导致所述蛋白质的特性产生巨大的改变。然而，考虑到取代、删除或插入的确切效果在进行这些操作之前难以预料，本领域的技术人员将会知道，将通过筛选用变体蛋白转化的转基因植物对所述效果进行评估，以确定对植物抵御病原真菌攻击的能力的影响。

变体多核苷酸和蛋白质也包括来源于诱变或重组过程(包括且不限于例如DNA改组这样的过程)的序列和蛋白质。本领域的技术人员能够设想那些将会改变蛋白质相应的病原体的范围的修饰。通过此类过程，一种或多种不同的蛋白质编码序列可被操作，以产生拥有所期望的性质的新蛋白质。如此，从一组包含具有基本的序列同一性、并且能在体外或体内进行同源重组的序列区域的相关多核苷酸序列，产生了重组多核苷酸文库。例如，采用这一途径，编码一个受关注的结构域的序列基序，可以在本发明实施方案的蛋白质基因和其他已知的蛋白质基因之间重排，以得到编码一种具有改良的受关注特性的蛋白质的新基因，所述特性例如提高的赋予或增强植物病原真菌抗性的能力。此类DNA改组方法是本领域已知的。参见例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391：288-291；和美国专利公开5,605,793和5,837,458。

本发明实施方案的多核苷酸可被用于从其他生物(尤其是其他植物)分离相应的序列。如此，能使用例如PCR、杂交等方法基于此类序列与本文所述序列的序列同源性鉴定此类序列。基于其与本文所述的完整序列之间或与它们的变体和片段之间的序列同一性而被分离的序列，被包括在本发明实施方案之内。此类序列包括是本文所公开序列的直系同源体的序列。“直系同源体”旨在表示源自共同的祖先基因，并由于物种形成存在于不同物种中的基因。当存在于不同物种中的基因的核苷酸序列和/或它们编码的蛋白质序列至少具有约60％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，或更高的序列同一性时，这些基因被认为是直系同源体。各物种之间的直系同源体的功能常常是高度保守的。因此，编码赋予或增强植物病原真菌抗性的蛋白质，以及在严格条件下与本文所公开的序列、或其变体或片段杂交的分离的多核苷酸，被包括在本发明实施方案之内。

在一个PCR方法中，能设计寡核苷酸引物用于PCR反应以从提取自任何受关注生物的cDNA或基因组DNA中扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域一般已知的，公开于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。See also Innis等人.，eds.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括且不限于使用成对引物、巢式引物、单个特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，将已知多核苷酸的全部或部分用作探针，探针选择性地杂交到来自所选择生物的存在于一组克隆基因组DNA片段或cDNA片段的其他对应多核苷酸上(即，基因组或cDNA文库)。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，并且可以用可检测的基团如³²P、或任何其他可检测标记物标记。因此，例如，通过基于本发明实施方案的多核苷酸标记合成的寡核苷酸，可制得用于杂交的探针。用于制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法是本领域一般已知的，并且公开于Sambrook等人所著文献(1989，参见上文)中。

例如，本文所公开的一种完整的多核苷酸，或其一个或多个部分，可被用作能特异性地与相应的多核苷酸和信使RNA杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包括特有的序列，并且所述序列的长度优选为至少约10个核苷酸、至少约15个核苷酸或至少约20个核苷酸。此类探针可被用于通过PCR从选定的生物扩增相应的多核苷酸。可使用此技术分离来自所期望生物的附加编码序列或作为诊断检测分析法测定编码序列在一种生物中的存在。杂交技术包括杂交筛选置于板上的DNA文库(噬菌斑或菌落；参见例如Sambrook等人(1989，参见上文)。

可在严格条件下进行此类序列的杂交。“严格条件”或“严格杂交条件”是指在该条件下探针将以比其他序列更高的可检测程度杂交到其靶序列上(例如至少2倍于背景)。严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。作为另一种选择，可调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度少于约1000个核苷酸，优选长度少于500个核苷酸。

通常，严格条件将是如下那些条件：在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.5M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长的探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在37℃下于含有30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，以及在50至55℃下用1X至2X SSC(20XSSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下于40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，以及在55至60℃下用0.5X至1X SSC洗涤。示例性的高度严格条件包括在37℃下于50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及最终在60至65℃下用0.1X SSC洗涤至少30分钟。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％的SDS。杂交时间一般小于约24小时，通常为约4至约12小时。洗涤时间为至少足够达到平衡状态的一段时间。

特异性通常取决于杂交后洗涤，最后的洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。就DNA-DNA杂交体而言，热力学熔点(T_m)可以估算自Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的方程式：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是以碱基对表示的杂交体的长度。T_m是(在确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。每出现1％的错配，T_m降低约1℃；因此，可调节T_m、杂交和/或洗涤条件以与具有所期望的同一性的序列杂交。例如，如果要寻求具有≥90％同一性的序列，则可将T_m降低10℃。通常，在确定的离子强度和pH下，严格条件选择为比特定序列及其互补序列的T_m低约5℃。然而，极严格条件可采用在比T_m低1、2、3或4℃的温度下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比T_m低6、7、8、9或10℃的温度下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在比T_m低11、12、13、14、15或20℃的温度下杂交和/或洗涤；利用所述等式、杂交和洗涤组合物以及所期望的T_m，本领域的技术人员将会理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上进行了描述。如果所需的错配程度导致T_m低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选提高SSC的浓度以便能使用更高的温度。对核酸杂交的一个广泛适用的指导可见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)；以及Current Protocolsin Molecular Biology，第2章，Ausubel等人编辑，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。参见Sambrook等人(1989，参见上文)。

有多种方法可被用于检测特定序列的DNA、RNA或蛋白质是否存在。这些方法包括，例如，DNA印迹、RNA印迹、蛋白质印迹和ELISA分析。诸如上述这些的技术为本领域的技术人员所熟知，并且有大量提供了详细操作规程的参考文献存在。此类参考文献包括Sambrook等人(1989，参见上文)和Crowther，J.R.(2001)，The ELISA Guidebook，Humana Press，Totowa，NJ，USA。

下列术语用于描述两种或更多种多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比对窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”。

(a)如本文所用，“参考序列”是用作序列比对基准的定义序列。参考序列可以是指定序列的一部分或全部；例如，全长cDNA或基因序列的一个片段，或全长cDNA或基因序列。

(b)如本文所用，“比对窗口”比较参考序列和多核苷酸序列的连续的指定片段，其中在所述比对窗口中的多核苷酸序列与参考序列(不包含插入或缺失)相比可以包含插入或缺失(即间隙)，以获得两段多核苷酸之间的最大匹配。一般来讲，比对窗口的长度为至少约20个连续的核苷酸，并且任选地可以为约30个、约40个、约50个、约100个或更长。本领域的技术人员懂得为了避免由于在多核苷酸序列中包含空位导致的它与参考序列的高度相似，通常导入空位罚分并从匹配数目中减去空位罚分。

用于比对的序列比对方法是本领域熟知的。因此，能使用数学算法测定任意两个序列之间的序列同一性百分比。此类数学算法的非限制性实例是Myers和Miller算法(1988)CABIOS 4：11-17；Smith等人的局部比对算法(1981)Adv.Appl.2：482；Needleman和Wunsch的全局比对算法(1970)J.Biol.48：443-453；Pearson和Lipman的局部搜寻比对方法(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448；Karlin和Altschul的算法(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264，Karlin和Altschul的改进算法(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877。

能利用计算机实施这些数学算法，以比对序列、测定序列同一性。此类具体实施包括且不限于：在PC/Gene程序中的CLUSTAL(得自Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(版本2.0)和GCG Wisconsin Genetics Software Package，版本10(可自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA获得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。能够使用默认参数进行使用这些程序的比对。CLUSTAL程序详述于Higgins等人(1988)Gene73：237-244(1988)；Higgins等人(1989)CABIOS5：151-153；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)CABIOS8：155-65；和Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331。上述ALIGN程序基于的是Myers和Miller的算法(1988，参见上文)。当比对氨基酸序列时，PAM120权重残基表、空位长度罚分12、以及空位罚分4能与ALIGN程序一起使用。Altschul等人的BLAST程序(1990)J.Biol.215：403基于Karlin和Altschul的算法(1990，参见上文)。可使用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获取与编码本发明实施方案的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可使用BLASTX程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获取与本发明实施方案的多肽同源的氨基酸序列。为了实现带间隙的比对以进行比较，可使用(BLAST 2.0中的)Gapped BLAST，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所述。或者，可使用(BLAST 2.0中的)PSI-BLAST来进行迭代搜索，以检测分子之间的远缘关系。参见Altschul等人(1997)同上。当利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可使用相应程序(例如用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。也可通过检查进行手动比对。

除非另有说明，本文提供的序列同一性/相似性值是指利用GAP版本10、采用下列参数获得的值：核苷酸序列的同一性百分比和相似性百分比采用的空位权重(Gap Weight)为50、长度权重(Length Weight)为3，并采用nwsgapdna.cmp计分矩阵；氨基酸序列的同一性百分比和相似性百分比采用的空位权重(Gap Weight)为8、长度权重(Length Weight)为2，并采用BLOSUM62计分矩阵；或者它们的任何等效程序。“等效程序”是指满足下列条件的任何序列比对程序：就任何正被讨论的两个序列而言，与GAP版本10生成的对应比对相比，所述序列比对程序生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分比的比对。

GAP使用Needleman和Wunsch算法(1970)J.Biol.48：443-453，以找出两个完整序列之间使匹配数最大化和空位数最小化的比对结果。GAP考虑所有可能的比对和空位位点，并制备最大数目的匹配碱基和最少的空位。它允许以匹配碱基单位提供空位形成罚分和空位延伸罚分。GAP必须对它插入的每个空位形成空位形成罚分匹配数。如果选择空位延伸罚分大于零，GAP必须另外形成对每个空位延伸罚分的空位次数的插入长度的空位罚分。蛋白质序列的GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10默认的空位形成罚分值和空位延伸罚分值分别是8和2。就核苷酸序列而言，默认的空位形成罚分为50，而默认的空位延伸罚分为3。空位形成和空位延伸罚分可表示为选自从0至200的整数。如此，例如，空位形成和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更高。

GAP提供了比对家族中的一个最优成员。此家族中可能有很多成员，并且其他成员没有更好的质量。GAP显示了用于比对的四个质量因数：质量、比率、同一性、和相似性。质量是比对序列的最大量度。比率是质量除以较短片段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。百分比相似性是相似符号的百分比。忽略来自空位对面的符号。当一对符号的得分矩阵值大于或等于0.50时(相似性阈值)，对相似性打分。GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10中使用的得分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

(c)如本文所用，涉及两种多核苷酸或多肽序列时的“序列同一性”或“同一性”是指两序列中的残基当在指定比较窗口中比对最大匹配时是相同的。已经认识到当序列同一性百分比用于蛋白质时，不同的残基位置常常存在保守氨基酸取代的差异，其中氨基酸残基被取代为具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，并因此不改变该分子的功能特性。当序列出现保守残基取代差异时，可上调序列同一性百分比进行纠正以保持取代的保守性质。存在此类保守取代差异的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行此类调整的方法为本领域的技术人员所熟知。通常这涉及给一个保守取代评分为部分而不是完全错配，因此提高序列同一性百分比。如此，例如，当完全相同的氨基酸评分为1，而非保守的取代评分为0时，给予保守的取代介于0和1之间的评分。保守取代评分的计算，例如，如程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)中所执行的。

(d)如本文所用，“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口中比较两个最优化比对的序列而测定的值，其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分与参考序列(参考序列不包括插入或删除)相比可包括插入或删除(即间隙)以达到两序列的最佳比对效果。所述百分比的计算方法是，统计相同的核酸碱基或氨基酸残基在两段序列中同时出现的位点的数量以得到匹配位点数，将此匹配位点数除以比对窗口中的总位点数，再将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。

术语“多核苷酸”的使用并无将实施方案限制于包括DNA在内的多核苷酸之意。本领域的一般技术人员将认识到，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本发明实施方案的多核苷酸还包括所有形式的序列，所述形式包括且不限于单链形式、双链形式等等。

可将本发明实施方案的分离的多核苷酸结合到能够导入并在宿主细胞中复制的重组DNA构建体中。“载体”可以是这样的一类构建体，其包括一套复制体系和能够在给定的宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的序列。适用于稳定转染植物细胞或构建转基因植物的许多载体，已描述于，例如，Pouwels等人，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985，supp.1987；Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989；以及Flevin等人，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990中。通常，植物表达载体包括，例如，一个或多个处于5′和3′调控序列控制下的克隆的植物基因和显性的选择性标记。这样的植物表达载体还可含有启动子调控区(例如控制着诱导型或组成型、环境或发育调控的、或细胞或组织特异性表达的调控区)、转录起始开始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。

术语“重组构建体”、“表达盒”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”、“重组DNA构建体”、和“重组DNA片段”在本文中可互换使用，并且均为核酸片段。重组构建体包括人造的核酸片段组合，包括且不限于天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。例如，重组DNA构建体可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源并以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员所熟知的。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包括本发明实施方案的任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传因子。为获得表现出所期望表达水平和模式的多核苷酸或Rcg1基因座的品系而进行的筛选，可通过扩增、DNA的DNA分析、mRNA表达的RNA分析、蛋白质表达的免疫印迹分析、表型分析等等完成。

术语“重组DNA构建体”是指从获得自不同来源的核酸片段组装而成的DNA构建体。所述核酸片段的类型和来源可以是大为不同的。

在一些实施方案中，进一步提供了表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至所述实施方案的异源核苷酸序列的启动子。所述实施方案的表达盒用于产生转化的植株、植物细胞和微生物，以及用于本文所公开的引起植物病原真菌抗性的方法的实施。所述表达盒将包括可操作地连接至所述实施方案的多核苷酸的5′和3′调控序列。“可操作地连接”旨在表示两种或更多种元件之间的功能性连接。“调控序列”是指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)，并且可影响所关联的编码序列的转录、RNA加工、稳定性或翻译的核苷酸。调控序列可包括且不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。例如，受关注的多核苷酸和调控序列(例如一个启动子)之间的可操作的连接，为允许该受关注的多核苷酸的表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。当用于指两个蛋白质编码区的连接时，“可操作地连接”意指所述编码区处于同一阅读框。所述盒可附加地包含至少一个将被转化到生物体中的附加基因。作为另外一种选择，能通过多个表达盒提供附加基因。这样的表达框具有多个限制性位点和/或重组位点，用以将编码抗病原体的多肽的多核苷酸插入至使其处于所述调控区的转录调控之下的位置。所述表达盒可附加地包含选择性标记基因。

所述表达框将在5′-3′的转录方向上包括一个转录起始区(即，一个启动子)、翻译起始区、所述实施方案的多核苷酸、一个翻译终止区以及任选地，一个在宿主生物中有功能的转录终止区。所述调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或所述实施方案的多核苷酸对宿主细胞而言或者对彼此而言可以是天然的/类似的。作为另外一种选择，所述调控区和/或所述实施方案的多核苷酸对宿主细胞而言或者对彼此而言可以是异源的。本文在序列方面所用的“异源”是指，源自外来物种的序列，或者，如果源自相同物种，则为通过蓄意的人为干预而从其天然形式在组成和/或基因组基因座方面受到充分修饰的序列。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的一个启动子所来自的物种，不同于所述多核苷酸所来源自的物种，或者，如果二者来自相同的/类似的物种，则二者之一或二者均为从其原始形式和/或基因组基因座经过充分修饰的，或者所述启动子并非针对可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。

任选地包括的终止区就转录起始区而言可以是天然的、就受关注的可操作地连接的多核苷酸而言可以是天然的、就植物宿主而言可以是天然的，或者就启动子、受关注的所述多核苷酸、宿主或者它们的任意组合而言，可以是源自其他来源的(即，外来的或异源的)。方便的终止区得自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶的终止区。也参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639。在特定实施方案中，使用马铃薯蛋白酶抑制剂II基因(PinII)。参见例如Keil等人(1986)Nucl.Acids Res.14：5641-5650；和An等人(1989)Plant Cell 1：115-122，上述参考文献全文以引用方式并入本文。

有多种启动子可用于本发明实施方案的实施中，包括所关注的多核苷酸序列的天然启动子。能基于所需结果选择启动子。Potenza等人最近的综述(2004)In Vitro Cell Dev Biol-Plant 40：1-22中讨论了范围广泛的植物启动子，该参考文献以引用方式并入本文。例如，核酸可与组成型的、组织优选的、病原体诱导的或者其他的启动子相结合以在植物中表达。此类组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子的核心启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白启动子(McElroy等人(1990)Plant Cell2：163-171)；泛素启动子(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.，18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如美国专利公开5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。

由诱导型启动子，特别是由病原体诱导型启动子表达基因有时可以是有益的。这样的启动子包括源自发病机理相关蛋白(PR蛋白)的那些，其是在被病原体感染后诱导的，所述蛋白是例如，PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等。参见例如Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes等人(1992)Plant Cell4：645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116。另参见WO 99/43819，该专利以引用方式并入本文。

受关注的是在病原体感染处或在其附近导致蛋白质局部表达的启动子。参见例如Marineau等人(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342；Matton等人(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331；Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430；Somsisch等人(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98；以及Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14972-14977。另参见，Chen等人(1996)Plant J.10：955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2507-2511；Warner等人(1993)Plant J.3：191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell 1：961-968；美国专利5,750,386(线虫-诱导型)；以及其中所引用的参考文献。特别关注的是针对玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达是由病原体串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)诱导的(参见例如Cordero等人(1992)Physiol.Plant Path.41：189-200)。

此外，在病原体发现经由伤口或昆虫损害而进入植物的入口时，伤口诱导型启动子可用于本发明实施方案的构建。这样的伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449；Duan等人(1996)Nature Biotechnology14：494-498)；wun1和wun2，美国专利5,428,148；win1和win2(Stanford等人(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)；系统素(systemin)(McGurl等人(1992)Science 225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp等人(1993)FEBS Letters323：73-76)；MPI基因(Corderok等人(1994)Plant J.6(2)：141-150)；等等，其引入本文以供参考。

化学调节的启动子可用于通过施用外来化学调节剂来调节基因在植物中的表达。根据这一目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质来诱导基因表达，或化学抑制型启动子，其中施用化学物质来抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括且不限于玉米In2-2启动子，其是通过苯磺酰胺除草剂安全剂来激活的，玉米GST启动子，其是通过用作芽前除草剂的疏水亲电性化合物而激活的，以及烟草PR-1a启动子，其是通过水杨酸激活的。所关注的其他化学调节的启动子包括甾类化合物反应性启动子(参见例如糖皮质激素诱导型启动子，Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.14(2)：247-257)以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见例如Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利5,814,618和5,789,156)，上述文献以引用方式并入本文。

组织优先的启动子可用于将本发明实施方案的多核苷酸增强的表达定位于特定植物组织内。例如，组织优先的启动子可被用于在一种植物组织中表达一种多肽，其中在所述组织处疾病抗性尤其重要，所述组织例如根、茎或叶。组织优先的启动子包括Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-134l；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等人(1993)Plant MolBiol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590；以及Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3)：495-505。如果必要，此类启动子可被修饰以进行弱表达。

维管组织优先的启动子是本领域已知的并且包括那些选择性地在例如木质部和韧皮部的组织中驱动蛋白质表达的启动子。维管组织优先的启动子包括且不限于，黑樱桃(Prunus serotina)野黑樱苷水解酶基因启动子(参见例如国际公布WO 03/006651)，以及见于美国专利申请10/109,488中的那些启动子。

茎优先的启动子可用于驱动本发明实施方案的多肽的表达。示例性的茎优先的启动子包括玉米MS8-15基因启动子(参见例如美国专利5,986,174和国际公布WO 98/00533)，以及见于Graham等人(1997)Plant Mol Biol 33(4)：729-735中的那些启动子。

叶优先的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等人(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等人(1993)Plant Mol。Biol.23(6)：1129-1138；和Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。

根优先的启动子是已知的，并且可以选自文献中记载的很多启动子或者从不同相容物种中重新分离的启动子。参见例如Hire等人(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(法国菜豆的GRP 1.8基因的根特异性控制元件)；Sanger等人(1990)PlantMol.Biol.14(3)：433-443(根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao等人(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见Bogusz等人(1990)Plant Cell2(7)：633-641，其中描述了两种根特异性启动子，它们是从来自固氮非豆科的Parasponia andersonii以及相关的非固氮非豆科的山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的。将这些基因的启动子与β-葡糖醛酸酶报道基因连接，并且导入非豆科的烟草(Nicotiana tabacum)和豆科的百脉根(Lotus corniculatus)内，在这两种情况下，都保持了根特异性启动子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们推断，增强子和组织特异性DNA决定子在这些启动子中解离。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合以表明编码章鱼碱合酶的农杆菌属(Agrobacterium)菌T-DNA基因在根尖的表皮中具有特别活性，以及TR2′基因在完整植物中是根特异性的，并且受叶组织中的伤害的刺激，这是用来与杀虫或杀幼虫基因一起使用的特别期望的特征组合(参见EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因表现出类似特征。另外的根优先的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)；和rolB启动子(Capana等人(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691。另参见美国专利5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。

“种子优先的”启动子包括“种子特异性的”启动子(那些在种子发芽期间有活性的启动子，如种子贮藏蛋白启动子)以及“种子发芽”启动子(那些在种子发芽期间有活性的启动子)。参见Thompson等人(1989)BioEssays 10：108，该参考文献以引用方式并入本文。此类种子优先的启动子包括且不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信使)；cZ19B1(玉米19kDa蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO00/11177和美国专利公开6,225,529；以引用方式并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白基因启动子(Gamma-zein)为优选的胚乳特异性启动子。Glob-1为优选的胚芽特异性启动子。就双子叶植物而言，种子特异性的启动子包括且不限于菜豆β-菜豆蛋白、napin、β-伴球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等的启动子。就双子叶植物而言，种子特异性的启动子包括且不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、糯质基因(waxy)、超甜基因1(shrunken 1)、超甜基因2(shrunken 2)、球蛋白1等的启动子。另参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选的启动子；该参考文献以引用方式并入本文。

在细胞宿主中促进基因表达的附加序列的修改形式是已知的。这些序列包括消除编码伪聚腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子接合位点信号的序列、转座子样重复序列、和其他此类对基因表达不利的特征明显的序列。就一个给定的细胞宿主而言，可以将所述序列的G-C含量调节至平均水平，所述平均水平通过参考宿主细胞中表达的已知基因进行计算。当可能的时候，修饰所述序列以避免经推测可能发生的mRNA发夹二级结构。

表达盒可附加地包含5′前导序列。此类前导序列能够促进翻译。翻译前导序列是本领域已知的，包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒(potyvirus)前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒)(Gallie等人(1995)Gene 165(2)：233-238)，MDMV前导序列(玉米矮小花叶病毒)，和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Maceiak等人(1991)Nature353：90-94)；非翻译前导序列，来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)(Jobling等人(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)in Molecular Biology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256)；和玉米枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人(1991)Virology 81：382-385)。另参见，Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968。也可使用增强翻译的其他已知方法，例如内含子等。

在制备表达盒的过程中，可操作多个DNA片段以在正确方向上，以及，如果适当的话，在正确阅读框中提供DNA序列。为了这一目的，可使用衔接子或连接子以接合DNA片段，或者使用其他操作方法提供方便的限制性位点以移除冗余DNA、移除限制性位点等。为了这一目的，可使用体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再取代，例如转换和颠换。

表达盒也可包含选择性标记基因，用于选择转化过的细胞。利用选择性标记基因以选择转化过的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草化合物抗性的基因，除草化合物如草胺磷铵、溴苯腈、咪唑啉酮类、和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。附加的选择性标记包括表型标记例如β-半乳糖苷酶，和荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等人(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9和Fetter等人(2004)Plant Cell 16：215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004)J.Cell Science 117：943-54和Kato等人(2002)Plant Physiol129：913-42)、和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP^TM，参见Bolte等人(2004)J.Cell Science 117：943-54)。关于附加的选择性标记，一般参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等人(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等人(1980)in The Operon，pp.177-220；Hu等人(1987)Cell48：555-566；Brown等人(1987)Cell 49：603-612；Figge等人(1988)Cell52：713-722；Deuschle等人(1989)Proe.Natl.Acad.Aci.USA86：5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)博士论文，University of Heidelberg；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-3956；Baim  等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)博士论文，University of Heidelberg；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人(1988)Nature334：721-724。此类公开内容以引用方式并入本文。

上文的选择性标记基因列表并不意味着受限制。本发明实施方案中可使用任何选择性标记基因。

在某些实施方案中，该实施方案的核酸序列可以与受关注的多核苷酸序列的任何组合堆叠以产生具有所需表型的植物。堆叠可通过在DNA构建体内的基因组合，或者通过将Rcg1与包含所述组合的其他品系杂交而实现。例如，所述实施方案的多核苷酸可以与该实施方案的任何其它多核苷酸或其它基因进行堆叠。生成的组合也可包括受关注的多核苷酸的多个拷贝中的任何一个。所述实施方案的多核苷酸也可与任何其它基因或基因组合发生堆叠以产生具有多种所期望的性状组合的植物，包括且不限于动物饲料所需的特性，如高油基因(例如美国专利6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专利5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson等人，(1987)，Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO98/20122)；和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等人，(1986)，J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人(1988)Gene 71：359；和Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；改进的可消化性(例如，修饰的贮藏蛋白质(美国专利申请10/053,410，提交于2001年11月7日)；和硫氧还蛋白(美国专利申请10/005,429，提交于2001年12月3日))，上述公开以引用方式并入本文。所述实施方案的多核苷酸也可与关于昆虫、疾病或除草剂抗性的期望性状(例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(美国专利5,366,892；5,747,450；5,737,514；5723,756；5,593,881；Geiser等人(1986)Gene 48：109)；凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；伏马毒素解毒基因(美国专利5,792,931)；无毒性和抗病基因(Jones等人(1994)Science266：789；Martin等人(1993)Science 262：1432；Mindrinos等人(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变体；谷氨酰胺合酶抑制剂，如草胺膦或basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因、GAT基因如那些公开于美国专利申请公布US2004/0082770、WO02/36782和WO03/092360中的基因))；和产品的加工或处理所期望的性状，例如高油(例如，美国专利6,232,529)；改性油脂(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉支链化酶(SBE)和淀粉去支链化酶(SDBE))；以及聚合物或生物塑料(例如美国专利5.602,321；有利于表达聚羟基脂肪酸酯(PHA)的β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合酶、和乙酰乙酰-CoA还原酶(Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847))相堆叠，上述公开以引用方式并入本文。也可以将所述实施方案的多核苷酸与提供农学性状的多核苷酸组合，所述农学性状例如雄性不育(例如，参见美国专利5.583,210)、秸秆强度、开花时间、或转化技术性状如细胞周期调节或基因打靶(例如WO99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821)，上述公开以引用方式并入本文。

可通过任何方法产生这些堆叠的组合，包括且不限于通过任何常规方法或TopCross

方法的杂交育种植物，或者基因转化。如果所述特性通过遗传转化植物堆叠，则受关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包括一种或多种所需特性的转基因植物用作靶，通过后续的转化导入更多特性。可以用共转化规程将特性与受关注的多核苷酸同时导入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，加入将导入两个序列，可将两个序列包含在分离的转化盒中(反式)或包含在相同转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子促进序列表达。在某些实例中，可能期望导入将抑制受关注的多核苷酸表达的转化盒。这可以与其它抑制盒或超表达盒的任何组合组合使用以在植物中生成所需特性组合。

本发明实施方案的方法可涉及且不限于将多肽或多核苷酸导入植物。“导入”旨在表示使所述多核苷酸出现在所述植物中。在一些实施方案中，多核苷酸将以使所述序列能够进入植物的细胞内部的方式存在，包括其向植物基因组可能的插入。所述实施方案的方法不依赖于将序列导入植物的特定方法，只要使多核苷酸进入植物的至少一个细胞的内部即可。用于将多核苷酸导入植物的方法是本领域已知的，包括且不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

“转化”是指将核酸片段转入宿主生物的基因组中，导致基因稳定遗传。包含转入的核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。“宿主细胞”指重组DNA构建体转化至其中的细胞，可包括酵母细胞、细菌细胞和植物细胞。植物转化方法的实例包括农杆菌介导的转化(De Blaere等人，1987，Meth.Enzymol.143：277)和微粒加速的或者“基因枪”转化技术(Klein等人，1987，Nature(London)327：70-73；美国专利4,945,050)，等等。

“稳定转化”旨在表示转入植物的核苷酸构建体整合进了该植物的基因组，并且能够遗传给其子代。“瞬时转化”或“瞬时表达”旨在表示多核苷酸被转入植物并且没有整合进该植物的基因组，或者多肽被转入植物。

转化规程以及用于将多肽或多核苷酸序列导入植物内的规程可以根据被作为转化目标的植物或植物细胞的类型，例如单子叶植物或双子叶植物而改变。将多肽和多核苷酸导入植物细胞的适当方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques 4：320-334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722)、以及弹道微粒加速(参见，例如Sanford等人.，美国专利4,945,050；5,879,918；5,886,244；和5,932,782；Tomes等人(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg 和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人(1988)Biotechnology 6：923-926)；和Lec1transformation(WO 00/28058)。另参见Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology6：559-563(玉米)；美国专利5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology 8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(London)311：763-764；美国专利5,736,369(谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等人(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(颈须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports 12：250-255和Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(玉米，通过根癌农杆菌)；所有这些文献以引用方式并入本文。

用于在植物基因组的特定位置定向插入多核苷酸的方法是本领域中已知的。在一个实施方案中，多核苷酸在所期望的基因组位置的插入利用位点特异性重组系统实现。参见例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855、和WO99/25853，它们均以引用方式并入本文。简而言之，所述实施方案的多核苷酸被包含在转移盒中，两翼与两个不同的重组位点相连。所述转移盒被导入植物中，所述植物的基因组中已稳定地整合了两翼与两个不同的重组位点相连的靶位点，所述重组位点对应于所述转移盒中的位点。提供了适当的重组酶，并且所述转移盒被整合至所述靶位点。受关注的多核苷酸从而被整合至所述植物基因组的特定染色体位置。

已经被转化的细胞可根据常规方法生长为植株。参见例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可以使这些植株生长，并用相同的转化品系或者不同的品系对其授粉，并且鉴定所期望的表型特征具有组成型表达的子代。可以生长两代或多代以保证所希望的表型特征的表达稳定地保持和遗传，然后收获种子以保证所希望的表型特征的表达已经实现。以这种方式，所述实施方案提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，所述转化的种子具有稳定地整合至其基因组中的所述实施方案的核苷酸构建体，例如所述实施方案的表达盒。

如本文所用，术语“植物”可以是整个植株、其任意的部分、或者来源于植物的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可指代以下任何一种材料：整个植株、植物的部分或器官(包括但不限于胚芽、花粉、胚珠、种子、叶片、花、枝、果实、果仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊，等等)、植物组织、植物细胞、植物原生质体、可从其再生出玉米植株的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛和植物种子。植物细胞是植物的细胞，其或者直接取自种子或植株，或者源自取自植物的细胞的培养物。谷物旨在表示商业化种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的生产的成熟种子。再生植物的子代、变体和突变体也包括在本发明实施方案的范围内，前提条件是这些部分包含导入的多核苷酸。

本发明的实施方案可被用于赋予或增强植物病原真菌抗性，或者使植物免受病原真菌攻击伤害，所述植物尤其是玉米(Zea mays)。其将保护植物的不同部分免受病原体攻击伤害，所述部分包括且不限于茎、穗、叶片、根和雄穗。在本发明实施方案的实施中，其他植物物种也可以是受关注的，所述植物物种包括且不限于，

术语“表型”或“表型性状”或“性状”指生物的一个或多个性状。表型可用肉眼或者本领域已知的任何其他评估手段观察到，例如显微镜法、生物化学分析、或电装置检测分析法。在某些情况下，表型由单个基因或基因座直接控制，即“单基因性状”。在其他情况下，表型是若干个基因的结果。

基因组的“物理图谱”是显示染色体DNA上可辨认的界标(包括基因、标记等)的线性顺序的图谱。然而与基因图谱相比，界标间的距离是绝对的(例如以碱基对测量的或分离的和重叠的邻接基因片段)并且不基于基因重组。

在玉米中，已经将许多BAC或细菌人工染色体装配成重叠群(重叠的邻接基因片段，或“邻接DNA”)，它们每个包含玉米基因组DNA的较大插入序列。BAC可基于序列比对装配至重叠群，如果该BAC经过测序，或者经由它的BAC指纹与重叠群中其他BAC指纹的比对装配至重叠群。公众可利用玉米基因组浏览器(Maize GenomeBrowser)进行装配，所述玉米基因组浏览器可从互联网上公开获得。

“植物”可为整个植株、其任何部分、或来源于植物的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可指代以下任何一种材料：整个植株、植物部分或器官(例如叶片、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞、和/或子代的相同材料。植物细胞是从植物中获取的细胞或来源于从植物中所获取细胞经培养出的细胞。因此，术语“玉米植物”包括整个玉米植株、玉米植物细胞、玉米植物原生质体、可从其中再生玉米植株的玉米植物细胞或玉米组织培养物、玉米植物愈伤组织、和玉米植物中的完整玉米植物细胞或玉米植物部分，如玉米种子、玉米芯、玉米花、玉米子叶、玉米叶、玉米茎、玉米芽、玉米根、玉米根尖等。

术语“数量性状基因座”或“QTL”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群中)，具有与表型性状的差异表达关联的DNA区域。QTL与基因或引起所讨论的性状的基因紧密连锁。

在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施方案的限制。也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不旨在进行限制。当在本文和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，单数和单数形式的术语包括复数指代。因此，例如术语“一个植物”也包括多个植物；取决于上下文，使用的术语“植物”也可包括该植物遗传相似或相同的子代；使用的术语“核酸”任选地包括该核酸分子的多个拷贝；

提供了通过对相关的标记基因座进行基因分型鉴定具有提高的丝黑穗病抗性的玉米植物的方法。鉴于丝黑穗病感染使产量降低，玉米中的丝黑穗病抗性是农学上重要的性状。

在相当一段时间内已经认识到，对生物基因组中与特定定量表型如丝黑穗病抗性相关联的特定染色体基因座(或区间)可进行基因作图。此类基因座称为数量性状基因座或QTL。有利的是，植物育种人员可使用分子标记通过鉴定标记等位基因鉴定期望的个体，所述标记等位基因显示与期望表型共分离的统计意义上显著的概率，表现为连锁不平衡。通过鉴定与定量性状共分离的分子标记或分子标记簇，育种人员因此鉴定QTL。通过鉴定并选择与期望表型相关联的标记等位基因(或来自多个标记的期望等位基因)，植物育种人员能够通过选择合适的分子标记等位基因迅速选择期望的表型(一种称为标记辅助选择或MAS的方法)。

本领域熟知的多种方法可用于检测与数量性状如丝黑穗病抗性共分离的分子标记或分子标记簇。所有这些方法背后的基本原理是检测具有显著不同平均表型的供选择的基因型(或等位基因)的标记。因此，比较标记座位之间的供选择基因型(或等位基因)之间的差异大小或差异显著性水平。推断性状基因位于最靠近一个或多个标记的位置，所述标记与基因型差异具有最大的关联性。

用于检测QTL的两种此类方法是：1)基于种群的结构关联分析和2)基于家谱的关联分析。在基于种群的结构关联分析中，从具有多个创始者(例如优良育种品系)的已有种群中获取品系。基于种群的结构关联分析依靠连锁不平衡(LD)的弱化和以下观点：在非结构化的种群中，在如此多代随机交配之后，仅有QTL和与QTL紧密连锁的标记之间的关联将保存下来。实际上，大多数已有种群具有种群亚结构。因此，通过把个体分配到种群中，使用得自无规分布于基因组的标记的数据，采用结构关联方法有助于控制种群结构，从而最小化由于单个种群(也称为亚种群)内的种群结构带来的不平衡。表型值与在亚群中每个品系的每个标记座位上基因型(等位基因)进行比较。显著的标记-性状关联指示标记座位和涉及该性状表达的一个或多个基因座接近。在基于谱系的关联分析中，通过从少量的创始者建立种群产生LD。例如，在区间作图方法中(Lander和Botstein，Genetics121：185-199(1989))，测试沿基因图谱(例如1cM间隔)的许多位点中的每一个位点上QTL位于该位点的概率。基因型/表型数据用于计算每个测试位点的LOD评分(概率比率的对数)。当LOD评分大于临界阈值(本文中为2.5)时，有显著证据表明，QTL位于基因图谱上的该位点上(它将位于两个特定标记基因座之间)。

本文中鉴定了与丝黑穗病抗性性状相关联的标记，同样地，鉴定了与提高或降低的丝黑穗病抗性相关联的标记等位基因。方法涉及检测与提高或降低的丝黑穗病抗性相关联的至少一个标记等位基因在玉米植物的种质中的存在。

连锁的常见量度是性状共分离的频率。这可以共分离百分比(重组频率)表示，或者以厘摩(cM)表示。cM是基因重组频率的量度单位。一cM等于由于在一代中的交换导致的在一个基因座上的性状将与在另一个基因座上的性状分离的概率为1％(意味着性状99％的情况下共分离)。因为染色体距离与性状间交换事件的频率大约成比例，有与重组频率关联的近似物理距离。例如，在玉米中，1cM平均与约2,140,000个碱基对(2.14Mbp)相关联。

标记座位本身是性状，并且在分离期间能够通过跟踪标记座位、根据标准连锁分析进行评估。因此，一cM等于经过单代杂交的标记座位将与在另一个基因座分离的1％的概率。

与QTL标记连锁的其他标记可被用于预测玉米植株中丝黑穗病抗性的状态。这包括距离所述基因座50cM以内的任何标记。一个标记与QTL标记连锁越紧密，该标记越会更有效地和更有利地成为期望性状的指示物。紧密连锁的基因座显示约10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内交换频率。在高度优选的实施方案中，相关基因座(例如标记座位和靶基因座如QTL)显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，或更优选的约0.25％或更低的重组频率。因此，所述基因座分开距离为约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM、0.25cM、0.1cM、0.075cM、0.05cM、0.025cM、或0.01cM或更低。换句话说，位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.1％、0.075％、0.05％、0.025％、或0.01％或更低)的两个基因座称为彼此“邻近”。

尽管特定标记等位基因可显示与丝黑穗病抗性表型共分离，但重要的是注意到标记基因座不一定是负责表达丝黑穗病抗性表型的QTL基因座的部分。例如，不要求标记多核苷酸序列是赋予丝黑穗病抗性的基因的部分(例如是基因开放阅读框的部分)。特定标记等位基因与提高或降低的丝黑穗病抗性表型的关联，是由于在QTL等位基因从中起源的祖先玉米品系中，标记等位基因和QTL等位基因之间的最初“相引”相连锁。最后通过反复重组，标记和QTL基因座间的交换事件能够改变这种取向。正是因为这个原因，有利标记等位基因可根据存在于耐受性亲本中的相连锁发生改变，所述耐受性亲本用于制备分离种群。这不改变可使用遗传标记监控表型分离的事实。它仅仅改变在给定分离种群中认为哪个标记等位基因是有利的。

本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。划定此类染色体区间的边界以包含将与一个或多个QTL连锁的标记。换句话说，染色体区间以使得位于区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)可被用作丝黑穗病抗性标记的方式划定。每个区间包含至少一个QTL，此外甚至可包含一个以上的QTL。相同区间中非常接近的多个QTL可搅乱特定标记与特定QTL的关联，因为一个标记可显示与一个以上的QTL连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与期望表型性状共分离，有时分不清楚是否那些标记中的每一个鉴定相同QTL或两个不同的QTL。无论如何，完成或实施本发明不需要了解在特定区间中有多少QTL。

也提供用于标记辅助选择(MAS)的方法，其中基于标记基因型选择表型。为了进行MAS，检测来自将进行选择的植物的生物样品中对应于标记核酸等位基因的核酸。这种检测能够采取探针核酸与标记等位基因或其扩增子杂交的形式，例如使用等位基因特异性杂交、DNA分析、RNA分析、原位杂交、引物杂交后进行标记区域的PCR扩增、PCR扩增产物的DNA测序等。用于检测标记等位基因的方法是本领域普通技术人员已知的。在证实生物样本中存在(或不存在)特定标记等位基因后，选择所述植物并与第二植物(优选来自优良品系的玉米植株)杂交。可评估杂交制备的子代植物的特定标记等位基因，并且仅有那些具有期望的标记等位基因的子代植物将被选择。

玉米植物育种人员期望所需基因座的组合，例如那些与提高的丝黑穗病抗性相关联的标记等位基因与高产量以及其他期望性状的基因的组合，以开发改良的玉米品种。通过非分子方法(例如玉米植物性状评估)筛选大量样品可能是昂贵的、耗时的并且不可靠的。当与丝黑穗病抗性基因座遗传连锁时，本文所述的多态性标记的使用提供了在育种程序中选择具有丝黑穗病抗性的品种的有效方法。例如，就丝黑穗病抗性而言，标记辅助选择(MAS)相对于田间评价的一个优点是，MAS能够在一年中的任何时间进行，不受生长季节的限制。此外环境效应很大程度上与标记辅助选择无关。

MAS在植物育种中的另一个用途是辅助通过回交育种恢复轮回亲本基因型。回交育种是将子代与其他的其中一个亲本或亲本品系回交的方法。回交通常用于将来自供体亲本(例如包含所期望的丝黑穗病抗性标记基因座的亲本)的一个或一些基因座，渗入来自轮回亲本(例如另外的高产量玉米品系)的其他期望的遗传背景中。回交进行的次数越多，轮回亲本对所得渗入品种的遗传贡献越大。这常常是必需的，因为植物否则可为非期望的，例如因为低产量、低结实率等。与之相反，作为多次育种程序的结果的品系，可具有优异的产量、结实率等，只不过缺少一个期望性状如丝黑穗病抗性。

MAS的一个应用是使用标记提高基因渗入或回交的效率，上述尝试的目的在于将提高丝黑穗病抗性的QTL导入所期望的(通常为高产量)背景。在特定标记(以及关联的QTL)的标记辅助回交中，例如从供体来源回交到优良的或外来的遗传背景，技术人员在回交子代中选择供体性状，然后重复回交到优良的或外来的品系以重构尽可能多的优良/外来背景的基因组。

用于MAS的最优选的QTL标记(或标记等位基因)，是与丝黑穗病抗性性状具有最强相关性的那些。

实施例

提供以下实施例以示出所述权利要求，但本发明不受以下实施例的限制。应当理解本文所述的实施例和实施方案仅用于例证性的目的，并且本领域的技术人员将认识到，在不脱离本发明精神或所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。

实施例1

植物材料

使用了两种对宿主特异性的丝轴黑粉菌抗性大为不同的近交系，“Ji1037”(供体亲本)和“Huangzhao4”(轮回亲本)，来培育本研究中的所有作图种群。本研究中测试的所有植物材料均人工接种了丝轴黑粉菌。“Ji1037”表现出对丝黑穗病的完全抗性，并且在大田中没有观察到任何易感个体；而“Huangzhao4”(一种中国的优良近交系)对丝黑穗病高度易感，大田中易感个体占～75％。2004年，由314个个体组成的BC₁种群与二亲本一起被种植于吉林省农业科学院(Jilin Academy of Agricultural Sciences)，公主岭(Gongzhulin)的实验农场中。对每一BC₁个体进行了丝黑穗病抗性的评估。将抗性BC₁个体与“Huangzhao4”回交，从而产生BC_1:2家族(BC₂种群)。2005年，来自每一BC_1:2家族的～20植株被种植于单独的实验田中，以评估它们的丝黑穗病抗性。鉴定了来自BC₂种群的重组个体，并将它们与“Huangzhao4”回交，以产生BC_2:3家族，或者进行自花授粉以产生BC₂F₂家族。2006年，来自59个BC_2:3家族和九个BC₂F2家族中每一个的约80个个体被种植于吉林省农业科学院的实验农场，以研究它们的丝黑穗病抗性。

实施例2

大田中的人工接种和抗性评分

在上一生长季节，从大田中收集了包含丝轴黑粉菌冬孢子的孢子囊群并置于布袋中，存储在干燥且通风良好的环境中。在种植前，将孢子从孢子囊群移出并过滤，然后按1∶1000的比例与土壤混合。播种时，用土壤和冬孢子的混合物覆盖玉米籽粒以进行人工接种。就穗或雄穗中孢子囊群的存在/不存在，对成熟期的植株进行了评分，作为易感性/抗性的指标。

DNA抽提

收集来自一月龄植株的叶片组织并在液氮中磨成粉末。按照Murray和Thompson(1980)描述的方法抽提了基因组DNA。

SSR(简单重复序列)标记基因分型和连锁图谱构建

首先检测了SSR标记在“Ji1037”和“Huangzhao4”二亲本之间的多态性。只有那些表现出清晰的多态性条带并且在十条染色体间均匀分布的SSR标记才被用于分离种群的基因分型。PCR反应的进行如下：94℃变性2分钟；然后是35个循环的：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；最后在72℃延伸10分钟。在6％聚丙烯酰胺凝胶中对PCR产物进行电泳，然后通过银染显影。

从BC₁代随机选择了总共94个BC₁个体，并分析了它们在113个多态性SSR标记处的基因型。如果PCR条带与供体亲本的PCR条带相同，则将其标记为“2”，如果它与轮回亲本的PCR条带相同，则将其标记为“1”。通过χ²检验，针对在每一SSR标记处1∶1的一致性，对BC₁回交种群中纯合体(1/1)对杂合体(1/2)的比例进行了分析。通过MAPMAKER/Exp版本3.0b(Lincoln等人1992)估算了SSR标记之间的遗传距离。另外，对2号染色体上的一些标记在不同规模的种群中进行了基因分型，并在JoinMap软件中针对整合数据调整了它们的遗传位置。

数据分析和QTL/基因作图

根据基于性状的分析(Lebowitz等人1987)的设计III，鉴定了赋予丝黑穗病抗性的假定的QTL。简而言之，带有抗性QTL的BC₁个体预期会比不带抗性QTL的那些更能耐受丝黑穗病。因此，在上述抗性组中，在偶合中与抗性QTL相邻的标记等位基因将表现出比在易感组中更高的频率。采用四重网格χ²检验(SAS 8.2版本)检测了所有的标记在抗性和易感组之间的等位基因频率，以对整个基因组进行假定的QTL的扫描。然后，采用了若干方法来确认主效QTL区域及其在丝黑穗病抗性中的有效性。首先，使用假定的主效QTL区域中的SSR标记，对全部的BC₁个体进行基因分型以确认主效QTL的存在。第二，基于BC₁个体的BC_1:2子代，估算了BC₁个体的感染百分比以通过单因素方差分析确认假定的主效QTL。第三，通过复合区间作图法(Windows QTL Cartographer软件，版本2.0)，对上述10条染色体鉴定了假定的QTL。最后，通过评估主效QTL在降低疾病发生率方面的遗传效应，进一步确认了主要的QTL。

实施例3

区域特异性标记的开发

主要抗性QTL区域中可用的序列，包括锚定的EST、IDP、RGA、BAC和BAC-末端序列，被用于开发高密度标记。通过tBLASTn，将这些序列与NCBI和MAGI数据库进行比较以获得可能的更长的序列。使用PRIMER5.0软件按照下列参数设计引物：长度为20个核苷酸，GC含量为40％至60％，无二级结构，并且没有连续成串的单种核苷酸。

引物对被用于从二亲本扩增对应的片段。除了退火温度根据不同的引物对进行调整之外，循环参数被设置为与上文所述的相同。仅将那些与预期的相同或更大的扩增子从凝胶上切下，并用Gel Extraction Kit(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)纯化。然后将纯化的PCR产物克隆进载体pGEM-T(Promega，Madison，USA)。通常，对每一扩增子，选择三至五个阳性克隆进行测序以避免任何污染或错配。首先将扩增子序列与其所源自的初始序列比较以确保获得的是正确的序列，然后通过使用DNAMAN软件，在二亲本之间进行比较以寻找序列差异。插入缺失被用于开发序列标签位点(STS)标记；而单核苷酸多态性(SNP)可被用于开发SNP标记或CAPS标记(酶切扩增多态性序列)。如果SNP与给定的限制性位点相关，则形成了CAPS标记。在SNP标记的开发中，SeqVISTA软件的SNPpicker程序被用于验看是否有可能通过向引物中引入错配碱基对，将特定限制性位点的“不完全位点”变为“完全位点”，从而构建出特定的限制性位点，如Niu和Hu(2004)所述的方法。

引物对被用于扩增二亲本以开发高密度标记。就STS标记而言，多态性PCR条带应在电泳之后出现在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上。就上述CAPS和SNP标记而言，多态性条带可在以特定的限制性内切核酸酶消化后在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上观察到。

实施例4

精细作图

用所述主效QTL区域的SSR标记，将重组个体从BC₂种群中筛选出。由于丝黑穗病抗性的局部外显性，基于单一个体的表现来判断一个BC₂重组体是否携带抗性基因将会有很高风险。因此，我们采用了更稳妥的方法，基于单个的BC₂重组体的子代的基因型和表型，来判断抗性基因在该重组体中的存在/不存在。如果在特定BC₂重组体的供体区域没有抗性基因，则其具有供体区域的子代与不含供体区域的那些在丝黑穗病抗性方面将不会表现出差异。相反，如果供体区域包含所述抗性基因，那么具有供体区域的子代将会比不含供体区域的那些表现出显著更高的抗性。通过比较上述“抗性的”和“非抗性的”供体区域的插入片段大小，我们能够确定所述抗性基因所在的区间。通过应用新开发的高密度标记，我们能够确切地界定携带抗性基因的供体区域，并从而将抗性区域缩短至一段很短的区间。在所有的比较中，显著性差异均在SAS软件商使用χ²检验估算。

实施例5

SSR连锁图谱的构建

对总计700个SSR标记检测了它们在“Ji1037”和“Huangzhao4”之间的多态性。在347个多态性SSR标记中，选择了113个在十条染色体间均匀分布的标记，用于对BC₁作图种群进行基因分型。在这113个标记中，33个(29.2％)表现出偏分离(P＜0.05或p＜0.01)。一般来讲，表现出遗传偏分离的标记对QTL检测没有负面影响。因此，使用全部113个SSR标记构建了连锁图谱。该图片长度为～1753.4cM，平均每14.6cM有一个标记。

实施例6

对假定的QTL进行作图

按照TB分析(Lebowitz等人1987)的设计III，测试了上述113个SSR标记中每一个在抗性组和易感组中1/2(杂合体)和1/1(纯合体)的频率。对位于四个染色体区域(位点1.02/3、2.08/9、6.07和10.03/4)的标记，观察到了在抗性组和易感组之间频率的显著偏差，暗示了四个假定的QTL的存在(表1)。例如，位点2.09上的标记表现出在整个BC₁种群中杂合体和纯合体之间没有偏离1∶1的比例。然而，对于这些标记，抗性组和易感组之间杂合体的百分比显著地不同，P值＜0.0001(表1)。该结果有力地表明了一个主效QTL(命名为qHSR1)在该区域的存在。位点10.03/4和位点1.02/3上的标记具有P值＜0.01(表1)，暗示在这两个区域中存在具有较弱效应的假定的QTL。位点6.07上的标记也表现出P值＜0.05(表1)的偏差，暗示一个可能的次要QTL的存在。此外，在位点4.01或位点5.03上，仅有一个标记被发现在抗性组和易感组之间表现出频率偏差(表1)，因此，难以判断QTL是否的确在这两个位点存在。

表1：通过对113个SSR标记的四重网格χ2检验，对整个基因 组扫描假定的QTL

每一位点上的SSR标记按照它们在本研究的遗传连锁图谱上的位置排序。R组：抗性组；S组：易感组；P值：基因型和性状相互独立的H0假设的概率。

位点2.09和位点10.03/4中，杂合体(1/2)的百分比在抗性组中显著高于在易感组中，暗示抗性等位基因来源于供体亲本“Ji1037”。相反，位点1.02/3和位点6.07中，杂合体(1/2)在抗性组中的百分比低于在易感组中的百分比，说明抗性等位基因来源于易感亲本“Huangzhao 4”。

将本研究中的四个假定的QTL与其他研究组发现的那些相比较，得到了两个共同的QTL。本研究中，位点1.02/3中的QTL也曾被Shi等人(2005)以及Lu和Brewbaker(1999)报道。我们的研究中，位点2.09中的主效QTL也曾在Shi的研究中被发现，在该研究中，作图种群来源于“Huangzhao4”דMo17”的杂交(Shi等人2005)。有趣的是，在本研究中，使用了相同的易感品系“Huangzhao4”和近缘的抗性品系“Ji1037”(“Ji1037”是从“Mo17”/“Suwan”的杂交发展而来)来制备作图种群。这或许解释了为什么在这两项研究中在位点2.09发现了具有相似遗传效应的相同的主效QTL。因此，位点2.09中的主效QTL是进行抗性基因克隆和标记辅助选择以增强玉米丝黑穗病抗性的最佳选择。

实施例7

主效QTL的确认

为了确认位点2.09中主效QTL(qHSR1)的存在及其在丝黑穗病抗性方面的遗传效应，有必要利用标记对全部的BC₁个体进行基因分型。位点2.09中的八个SSR标记，包括bnlg1520、umc1736、bnlg1893、umc 1207、phi427434、umc2184、umc2077和umc2214，被用于对118个抗性的和158个易感的BC₁植株进行基因分型。对于这八个标记，上述118个抗性个体中，107个(90.7％)为杂合体/重组体，而仅11个(9.3％)为纯合体。然而在上述158个易感个体中，仅60个(38％)为杂合体/重组体，而多达98个(62％)为纯合体。这些结果显示，位点2.09中的供体区域能够显著增强玉米的丝黑穗病抗性，有力地支持了位点2.09中主效QTL的存在。应当指出的是，由于苗期的干旱，丝黑穗病在2004年非常严重。与正常年份～75％的比例相比，易感的“Huangzhao4”有86％的易感个体。

此外，从抗性BC₁个体总计产生了97个BC_1:2家族。这些BC_1:2家族的疾病发生率为从5.9％至88.3％范围。通过分析疾病发生率与位点2.09区域上八个SSR标记中每一个的基因型，进行了单因素方差分析。结果显示，这八个SSR标记与qHSR1高度连锁(表2)。

表2：BC _1:2 家族的单因素方差分析

y＝b0+b1x+e；LR＝-2log(L0/L1)；^**在0.01％水平显著

此外，WinQtlCart 2.0软件(Statistical Genetics，North Carolina State University，USA)被用于以复合区间作图法(CIM)对整个基因组扫描假定的QTL。在位点2.09上发现了一个LOD值为11.8的主效QTL，其与SSR标记umc1736和umc2184邻接。该QTL能够解释～30％的表型变化。

实施例8

在位点2.09区域开发新的标记

在我们的研究中，基于位点2.09中的可用序列，设计了总计30个引物对来扩增亲本品系。所述30个引物对中的三个被直接发展成为多态性STS/SSR标记。两个STS标记，STS 1944和STSrga3195，分别从IDP1944和RGA3195(Zmtuc03-0811.3195)发展而来。SSR标记SSR148152自BAC克隆AC 148152(表3)发展而来。其余27个引物对中，20个产生了明确的扩增子，这些扩增子随后被克隆并测序。对于不同的扩增子，二亲本品系之间的序列比对显示了不同程度的核苷酸变异。就对应于两个锚定的EST的那些扩增子而言，在二亲本品系之间没有发现多态性。就对应于从TIGR网站检索到的三段玉米序列(总长度为2,056bp)的扩增子而言，发现了三个SNP。对应于BAC-末端序列的扩增子显示出更高的趋异度，累积长度为1,251bp的序列中总计有18个SNP。四个基于RGA的扩增子的序列比对的结果，是在累积3,711bp的序列中有五个插入缺失和26个SNP。五个基于IDP的扩增子的序列比对的结果，是在2,814bp的序列中有一个插入缺失和15个SNP。水稻中的同线型序列也被用于开发标记，并在2,088bp的序列中仅显示了一个插入缺失。合在一起，获得了七个插入缺失和62个SNP，结果是在qHSR1区域中大约每1,800bp一个插入缺失和每200bp一个SNP。基于以上多态性，最终开发了附加的六个标记，包括两个SNP标记(SNP140313和SNP661，分别自AZM4_140313和IDP661发展而来)，一个CAPS标记(CAPS25082，自IDP25082发展而来)，和三个STS标记(STS171、STSrga840810和STSsyn1，分别自IDP171、RGA BG840810和一个同线的水稻基因LOC_Os07g07050发展而来)(表3和图1)。

表3：九个新开发的标记的名称、原始序列和引物序列

L：左引物；R：右引物；

就SNP标记而言，首先使用一对“L”和“R”引物扩增基因组DNA，然后用一对“snpL”(错配引物)和“snpR”引物扩增经稀释的、来自第一步的PCR产物，以将特定限制性位点的“不完全位点”变为“完全位点”。在用特定的酶消化第二轮PCR产物，并在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳之后，能够观察到多态性条带。

九个新开发的标记中，SNP140313和STSrga3195被定位在染色体1上，STSsyn1被定位在染色体5上。其余六个标记可信地定位在位点2.09上，其中五个标记(SSR148152、CAPS25082、STS171、SNP661和STS1944)位于抗性qHSR1区域内，一个标记(STSrga840810)位于该区域外。上述新开发的标记将大大有利于MAS和抗性基因的精细作图(图2)。

实施例9

BC ₂ 重组体的表型评估和主效抗性QTL的精细作图

基于亲本BC₂重组体的基因型，我们使用标记STS171和/或STS1944对BC₂重组体的全部子代进行了基因分型。通过χ²检验，对抗性组和易感组之间杂合体百分比的差异进行了检验。概率值小于或等于0.05(在此我们设定阈值在p＝0.05)表明表型(抗性)和基因型(杂合体)之间显著相关，于是推断亲本BC₂重组体携带抗性供体区域(表4)。例如，BC2-64因在STS1944基因座较低的P值(＜0.05)而被推断携带qHSR1。就BC2-50而言，STS1944和STS171基因座表现出很低的P值，表明亲本BC2-50应当携带qHSR1。与此相反，就BC2-25而言，在抗性组和易感组之间没有观察到杂合体百分比的显著差异(如高P值所示)，表明在供体区域中不存在qHSR1。合在一起，11个BC₂重组体(BC2-64、BC2-50、BC2-65、BC2-27、BC2-19、BC2-46、BC2-66、BC2-60、BC2-43、BC2-37和BC2-69)被推断携带qHSR1，并被视为抗性BC₂重组体；相反，五个BC₂重组体(BC2-67、BC2-68、BC2-49、BC2-25和BC2-45)被推断不携带qHSR1，并被认为是易感的BC₂重组体(表4)。

表4A：亲本BC2重组体，它们在qHSR1区域的基因型，子代中 的χ ² 检验，以及推断的BC2表型

表4B：亲本BC2重组体，它们在qHSR1区域的基因型，子代中 的χ ² 检验，以及推断的BC2表型

基于推断的表型，能够通过在全部的BC₂重组体之间进行供体区域的比较(表4)，缩小主效抗性QTL区域的范围。BC2-50在qHSR1区域具有杂合的基因型，并且表现出P值＜0.01的高丝黑穗病抗性。在左侧，三个交叉点位于bnlg1893上游的BC₂重组体(BC2-64和BC2-65，以及BC2-27)表现出丝黑穗病抗性；而其他五个交叉点位于STS171(BC2-67、BC2-68和BC2-49)或SNP 661(BC2-25和BC2-45)下游的BC₂重组体显示出对丝黑穗病的易感性。在右侧，全部七个BC₂重组体表现出丝黑穗病抗性，并且它们在STS1944(BC2-19、BC2-46、BC2-66和BC2-60)或SNP661(BC2-43)或STS171(BC2-37和BC2-69)的下游具有交叉点。有趣的是，一个抗性BC₂重组体，BC2-66，在SSR148152和umc2184之间具有最短的供体区域，并且这一供体区域被假定覆盖了qHSR1。从上述分析能够推断，主效抗性QTL(qHSR1)位于SSR148152/SNP661的一个区间，基于可自University of Arizona获得的物理图谱估算，其为～2Mb。

实施例10

主效QTL遗传效应的评估

理论上，BC_2:3子代中93.75％的遗传背景恢复为轮回亲本“Huangzhao4”。由于BC_2:3子代中的低背景噪音，通过在相同的BC_2:3家族内含有/不含qHSR1的两组之间比较疾病发生率，能够清楚地评估qHSR1的遗传效应。用标记STS171和STS1944对来自24个BC_2:3家族的总计1,524个个体检测了qHSR1的存在/不存在。对每一BC_2:3家族中含有/不含qHSR1的两组估算了疾病发生率。结果是，在每一BC_2:3家族中不含qHSR1组表现出比含qHSR1组更易感，平均差异为28.6％±10.8％。换句话说，单一的抗性qHSR1能够使疾病发生率降低28.6％±10.8％(图2)。

除BC_2:3子代之外，BC₂F₂子代也被用于在本研究中评估qHSR1的遗传效应。首先就两个标记bnlg1893和umc2184对BC₂种群进行基因分型，结果是73个BC₂植株含有qHSR1而另外的31个BC₂植株不含qHSR1。所有这些BC₂植株均自花授粉，以产生相应的BC₂F₂家族。正如预期的，源自含有qHSR1的BC₂植株的BC₂F₂子代比源自不含qHSR1的BC₂植株的那些表现出更强的抗性。在源自不含qHSR1的31个BC₂植株的529个BC₂F₂个体中，204个(38.7％)被发现是易感的。而源自含有qHSR1的73个BC₂植株的1,358个BC₂F₂个体中，262个(19.3％)是易感的。源自含有qHSR1的BC₂植株的BC₂F₂子代中，在qHSR1基因座发生了分离，结果是四分之一的BC₂F₂个体不含qHSR1。预期这些不含qHSR1的BC₂F₂个体具有与从不含qHSR1的31个BC₂F₂家族所估算的相同的疾病发生率(38.7％)。就其余含有qHSR1的四分之三的BC₂F₂个体(四分之一为纯合体，二分之一为杂合体)而言，我们需要估算其疾病发生率。基于以上说明，我们能够得出方程式3/4X％+1/4*38.7％＝19.3％；其中，“X”表示含有qHSR1的那些BC₂F₂个体的感染百分比。“X”经计算为12.8％。总之，qHSR1基因座能使BC₂F₂子代中的疾病发生率降低25.9％，从38.7％(不含qHSR1的个体)降至12.8％(含有qHSR1的个体)。

实施例11

qHSR1基因组序列的表征

为了分离对qHSR1基因座所赋予的表型负责的基因，从制备自抗性Mo17品系的BAC文库分离了包含标记MZA6393(来自bacm.pk071.j12.f，SEQ ID NO：23)和标记ST148(Mo17版本的ZMMBBc0478L09f，SEQ ID NO：24)之间的区域的BAC。该文库的制备如下：使用标准技术(Zhang等人(1995)Plant Journal 7：175-184)制备基因组DNA，然后用HindIII进行部分消化，并将大小经过选择的片段连接至可商购获得的载体pCC1BAC^TM(Epicentre，Madison，USA)的经过修饰的形式中。在按照供应商的说明书(Epicentre，Madison，USA)转入EPI300^TM大肠杆菌细胞之后，125,184个重组克隆被排列在326个384-孔微孔培养皿中。然后将这些克隆以栅格状转至尼龙滤膜(Hybond N+，Amersham Biosciences，Piscataway，USA)上。三个重叠克隆(bacm.pk071.j12、bacm.pk007.18和bacm2.pk166.h1)被鉴定和表征。

用基于所述BAC序列中发现的序列设计的重叠寡核苷酸探针(overgo probes；Ross等人(1999)Screening large-insert libraries by hybridization，p.5.6.1-5.6.52，In A.Boyl，ed.Current Protocols in Human Genetics.Wiley，New York)检测了所述文库。进行了BLAST检索分析，以筛选出重复序列和鉴定用于探针设计的特有的序列。通过PCR验证了探针在重叠群上的位置和间隙。对每一探针，设计了两条在8bp跨度自身互补的24-mer寡核苷酸。它们的退火得到一个40bp的overgo，该overgo的两条16bp悬臂被填入。当它们被用作overgo而不是仅作为PCR引物时，确切的序列有所不同。用于杂交的探针的制备如Ross等人所述(1999，参见上文)，通过BAC文库的栅格状转膜制备的滤膜被用于杂交和洗涤，如Ross等人所述(1999，参见上文)。磷屏成像分析被用于检测杂交信号。然后，通过将滤膜置于刚沸腾的0.1X SSC和0.1％SDS溶液中，并让它们在所述溶液中过夜冷却至室温，使探针从滤膜上洗脱。

将给出了阳性信号的BAC从培养皿中分离。限制性图谱、使用对应于之前所用标记的引物的PCR实验、以及从每一BAC的末端获得的序列，被用于确定覆盖所关注的区域的BAC的顺序。选择了跨越整个区域的三个BAC(bacm.pk071.j12、bacm.pk007.18和bacm2.pk166.h1)用于测序。使用标准的鸟枪法测序技术对这些BAC进行了测序，序列的装配使用Phred/Phrap/Consed软件包(Ewing等人(1998)Genome Research，8：175-185)进行。所述BAC克隆的装配好的序列显示在SEQ ID NO：25中。

装备之后，基于作图数据，对被认为位于最靠近所述基因座的区域中的序列进行注释，意思是推断了可能的基因编码区域和代表重复元件的区域。使用fGenesH软件包(Softberry，Mount Kisco，New York，USA)查找了基因编码(基因的)区域。fGenesH预测了蛋白质的一个部分，该部分被BLAST检索(BLASTx/nr)时，在氨基酸水平表现出与一种水稻蛋白质的部分具有部分同源性，所述水稻蛋白质被注释为在水稻中赋予疾病抗性。表现出与该蛋白质具有同源性的玉米序列的部分，落于BAC共有序列的一个连续片段的末端，并且显得是截短的。为了获得所述基因在玉米BAC中的完整再现，使用所述水稻的氨基酸序列对来自相同玉米BAC克隆的全部其他共有序列进行了tBLASTn分析。结果是鉴定了一段代表所述玉米基因3′端的共有序列。然而，所述基因的中央部分并未显示在这样获得的序列中。基于假定的基因的5′和3′区域设计了PCR引物，使用所述引物，并以来自原始的玉米BAC的DNA作为模板，进行了PCR实验。所得到的PCR产物的序列包含了桥接之前分离的5′和3′片段的序列。

在SEQ ID NO：25中发现了七个开放阅读框，包括一个木聚糖酶抑制剂基因(SEQ ID NO：26/27)、一个胞壁关联蛋白激酶(SEQ IDNO：31/32)、两个HAT家族蛋白二聚化基因(SEQ ID NO：34/35和SEQID NO：37/38)以及两个未知蛋白质(SEQ ID NO：40/41和SEQ IDNO：43/44)。与B73中存在的直系同源基因相比，所述木聚糖酶抑制剂基因表现出多态性差异。通过Clustal V比对，所述Mo17基因与所述B73基因具有97.8％的一致性，并且包含分别对应2个和10个氨基酸的两处缺失(参见图3)。包括来自SEQ ID NOs：43/44的ORF的2.4kb上游序列的基因组DNA区域显示于SEQ ID NO：45中。编码另外的一个EST片段的来自qHSR区域的核酸序列显示于SEQ ID NO：46中。

这些基因中的任何一个、任意的组合或者它们全部可能赋予或者有助于qHSR1基因座的丝黑穗病抗性。预期与具有丝黑穗病抗性的Mo17相关联的多态性，将成为qHSR1的限定性序列的判定指征。

实施例12

qHSR1基因座向易感品系的回交

进行了近交系的qHSR1基因座渗入，以确证qHSR1基因座能够成功地回交至近交系，以及用含有qHSR1基因座的近交系产生的杂交体会具有增强的或赋予的丝黑穗病抗性。

MO17是具有强丝黑穗病抗性的近交系，但没有使用本文所述的标记辅助的育种方法时，它不佳的农学特性使其不宜作为供体亲本。为了证明qHSR1基因座的表型价值，将所述基因座渗入至10个优良近交系，然后加入附加的25个近交系直至BC3阶段如下。来源于MO17和所述优良近交系之间的杂交的F1种群，与轮回亲本(所述优良近交系)再次回交，得到BC1种群。将幼苗移植到大田，用跨越基因组的标记对其进行基因分型、选择(含有qHSR1基因座和最低限度的MO17背景)，并再次与轮回近交系回交，以培育出BC2种群。就所述MO17 qHSR1区域的存在对BC2家族再次进行基因分型和选择。将阳性植株再次与轮回亲本近交系回交，以培育出BC3种群。种植了来自这些BC3种群的种子，并对植株进行基因分型。将含有或不含所关注的区域的BC3植株自交，以产生BC3S1家族。这些家族被用于表型比较(含有或不含所关注的区域的BC3S1)。

为了观察qHSR1基因在例如会存在于商品杂交体中的杂合情况下的表现，进行了适当的测交。具体地讲，qHSR1基因纯合的BC3S1个体植株以及易感的等位基因纯合的植株被用于与挑选的近交系进行测交。

在来自BC3S1品系且为杂交体的情况下，预期的表型差异显示，在包含携带了qHSR1的区域的品系和杂交体中，丝黑穗病抗性有显著提高。该数据明显地证明，利用杂交技术将本发明实施方案的基因转入其他遗传上能够利用所述基因的品系，导致增强的丝黑穗病抗性。

由于对qHSR1基因位置的精细作图，任何两个与所述qHSR1基因在遗传上连锁的侧翼标记均可被用于对小的染色体区域进行选择，所述染色体区域与所述qHSR1基因的南北两端均有交叉。这具有减少连锁累赘的有益效果，当试图将特定基因从不适合的种质如MO17渗入至优良种质时，连锁累赘能够成为干扰因素。就基因的选择而言，具有紧密连锁的两翼标记是有利的，而在所述基因自身内部具有标记是高度有利的。这是优于使用单个标记或远距离的两翼标记的改进，因为使用单个标记或远距离的两翼标记时，与qHSR1相关的连锁可能会被打断，并且选用这样的标记使人更可能无意中选择到不含qHSR1基因的植株。由于一旦标记-性状关联被确定之后，即往往使用标记辅助的选择而不是表型选择，这样的错误的不幸后果将是选择了那些不抗丝黑穗病的植株，而将那些抗丝黑穗病的植株丢弃。就这一点而言，qHSR1基因内部的标记是尤其有用的，因为显然它们将保持与所述基因所增强或赋予的丝黑穗病抗性连锁。而且，qHSR1基因座内部的标记因为一个类似的原因而同样是有用的。由于它们极为靠近qHSR1基因，它们非常可能保持与qHSR1基因连锁。一旦发生了qHSR1基因的渗入，这样的优良近交系既可被用于杂交种子的生产，也可被用作qHSR1基因向其他近交系进一步渗入的供体来源。

因此，所述数据显示，通过使用MO17作为供体来源转变的近交子代保持了截短的MO17染色体区间。包含所述截短的MO17染色体区间的近交系自身作为供体来源是非常有用的，并且不需要恢复MO17作为供体来源。通过使用标记辅助的育种如本文所述，所述截短的MO17染色体区间必要时能够进一步缩短大小，而不必担心丢失所述标记与所述qHSR1基因之间的连锁。

实施例13

qHSR1作为转基因培育抗性玉米植物的使用

qHSR1基因还能够作为转基因得到表达，并且允许在不同环境下调控其表达。下列实施例显示了qHSR1基因如何能够以不同的方式得到表达，从而抵御不同的疾病或保护植物的不同部分，或者作为实施例12中所述方法的供选择的替代方案，仅仅将qHSR1基因作为转基因转入不同的玉米品系。

实施例13a：

在本实施例中，qHSR1候选基因(木聚糖酶抑制剂基因以及所述QTL区间中其他被注释的基因，如实施例11中所规定)使用它自身的启动子进行表达。

为了转化完整的qHSR1基因，包括启动子和蛋白质编码区，将BAC克隆用作模板DNA，通过PCR扩增了包含完整的编码区和大约2kb上游区域的DNA片段。为了能够使用Gateway

技术(Invitrogen，Carlsbad，USA)进行克隆，在PCR引物中整合了attB位点，并通过Gateway

BP重组反应将扩增产物克隆至pDONR221载体。得到的片段两翼为attL位点，通过Gateway

LR重组反应将该片段转入了一种双元载体。然后用所述DNA构建体进行玉米转化，如实施例14中所述。

实施例13b：

为了在整个植株中以低水平表达qHSR1基因(木聚糖酶抑制剂基因以及所述QTL区间中其他被注释的基因，如实施例11中所规定)，所述基因的编码区和它们的终止子被置于水稻肌动蛋白基因(美国专利5,641,876和5,684,239)或F3.7基因(美国专利5,850,018)的启动子之后。为了能够使用Gateway

技术(Invitrogen，Carlsbad，USA)进行克隆，在PCR引物中整合了attB位点，所述引物被用于从所述qHSR1基因起始密码子上游35bp处扩增该qHSR1基因。所述attB1引物中加入了一个NotI位点。经过扩增qHSR1产物通过Gateway

BP重组反应(Invitrogen，Carlsbad，USA)被克隆至pDONR221载体。克隆之后，得到的qHSR1基因两翼为attL位点，并且在其起始密码子上游35bp处有一个特有的NotI位点。然后，用包含NotI位点的引物扩增启动子片段。每一启动子被融合至qHSR1的NotI位点。在最终步骤中，嵌合基因构建体通过Gateway

LR重组反应(Invitrogen，Carlsbad，USA)被转入双元载体PHP20622。这被用于玉米转化，如实施例14中所述。

实施例13c：

为了在整个植株中以高水平表达qHSR1基因(木聚糖酶抑制剂基因以及所述QTL区间中其他被注释的基因，如实施例11中所规定)，所述基因的编码区和它们的终止子被置于一个玉米泛素基因(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632；Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)的启动子、5’非翻译区和一个内含子之后。为了能够使用Gateway

技术(Invitrogen，Carlsbad，USA)进行克隆，在PCR引物中整合了attB位点，所述引物被用于从所述qHSR1基因起始密码子上游142bp处扩增该qHSR1基因。扩增产物通过Gateway

BP重组反应(Invitrogen，Carlsbad，USA)被克隆至pDONR221载体。克隆之后，得到的qHSR1基因两翼为attL位点。在最终步骤中，qHSR1克隆通过GatewayLR重组反应(Invitrogen，Carlsbad，USA)被转入载体，所述载体包含玉米泛素启动子、5’非翻译区和该泛素基因的第一内含子，如Christensen等人所述(参见上文)，并且在泛素表达框之后，接着有用于插入所述qHSR1基因的Gateway

ATTR1和R2位点。所述载体还包含适合玉米转化的标记基因，因此得到的携带着嵌合基因(玉米泛素启动子-泛素5′非翻译区-泛素内含子1-qHSR1)的质粒适用于玉米转化，如实施例14中所述。

实施例13d：

为了以根优先的方式低水平地表达qHSR1基因(木聚糖酶抑制剂基因以及所述QTL区间中其他被注释的基因，如实施例11中所规定)，所述基因的编码区和它们的终止子被置于根优先的启动子之后，所述根优先的启动子例如但不限于，玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439，公布于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公布于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO06055487，公布于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公布于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GI No.1063664)。实施例13b中所述的包含两翼为attL位点的qHSR1编码区并在qHSR1起始密码子上游35bp处包含一个特有的NotI位点的片段，被用于使利用Gateway

技术(Invitrogen，Carlsbad，USA)的克隆成为可能。用包含NotI位点的引物扩增启动子片段。每一启动子被融合至qHSR1的NotI位点。在最终步骤中，嵌合基因构建体通过Gateway

LR重组反应(Invitrogen，Carlsbad，USA)被转入双元载体PHP20622。这被用于玉米转化，如实施例14中所述。

实施例14

农杆菌介导的玉米的转化和转基因植物的再生

实施例6a-6d中制备的重组DNA构建体被用于制备转基因玉米植物如下。

利用Zhao(美国专利5,981,840和PCT专利公布WO98/32326)的方法，用实施例13a和13c中所述的经过选择的多核苷酸构建体转化玉米。简而言之，从玉米中分离了未成熟胚芽并使胚芽接触农杆菌悬浮液，其中所述细菌能够将多核苷酸构建体转入至少一个未成熟胚芽的至少一个细胞中(步骤1：感染步骤)。在此步骤中将未成熟胚芽浸入农杆菌悬浮液中用于启动接种。胚芽与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在感染步骤后，未成熟胚芽在固体培养基上培养。紧接着此共培养时期，进行任选的“休眠”步骤。在此休眠步骤中，胚芽培养在存在至少一种已知抑制土壤杆菌生长的抗生素，同时不加入植物转化体选择剂的条件下进行(步骤3：休眠步骤)。未成熟胚芽被培养在具有抗生素但无选择剂的固体培养基上，用于消除农杆菌以及制备受感染细胞的休眠阶段。接下来，将接种的胚芽在包含选择剂的培养基中培养，并回收生长的经转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。之后，愈伤组织再生为植物(步骤5：再生步骤)，并且在固体培养基中对在选择培养基中生长的愈伤组织进行培养以再生所述植物。

实施例15

转基因植物评估

用实施例13a至13d中所述的构建体分别制备转基因植物，如实施例14中所述。用实施例9中所述规程对它们在丝黑穗病抗性方面的改良进行评估。

实施例16

qHSR1基因的种质分配分析和qHSR1序列变体的鉴定

在对qHSR1进行鉴定、测序和精细作图之后，就qHSR1基因对其他品系进行了筛选。为了判断所述qHSR1基因在其他玉米种质中的存在，通过聚合酶链式反应，利用基因特异性引物组合对来自一组不同的玉米近交系的基因组DNA进行了扩增。鉴定了携带qHSR1(MO17等位基因)的近交系。因此，除了使用MO17作为供体来源之外，包含qHSR1基因的其他来源也能够被用作供体来源。

对qHSR1基因的变体也进行了鉴定并就单核苷酸多态性(SNP)进行了分析。qHSR1基因的等位变体并非所有都表现出抗性表型。对具有不同的单体型或等位基因的近交系，就它们的丝黑穗病抗性进行了评估，并鉴定了假定的抗性等位变体。在分离种群(例如F2种群)中验证了它们在丝黑穗病抗性中的功效。在植物育种程序中，所述SNP可被用作标记，以精确地鉴定和追踪qHSR1序列，以及区分抗性和易感的等位变体。而且，这些SNP表明，存在显示出抗性表型并且能够被用于本文所公开的方法和产品中的变体序列。

实施例17

qHSR1基因的种质分配的进一步分析和qHSR1序列变体的鉴定

qHSR1区域在抗性亲本品系Ji1037中被进一步限定为一段172-kb的区间，在易感亲本品系Huangzhao4中被进一步限定为一段56-kb的区间。大小的差异是由于与Ji1037相比，Huangzhao4中有一缺失(116kb)。在吉林省公主岭和位于海南岛的冬季苗圃，对用于精细作图的关键重组体，就它们的丝黑穗病抗性进行了反复研究，结果其显示了稳定的丝黑穗病抗性。

基于对qHSR1区域的表征，选择了阳性的Mo17 BAC克隆。此外，qHSR1区域中的标记被用于筛选Huangzhao4 BAC文库。对最小覆盖量的阳性BAC克隆进行了测序，以得到qHSR1区域的大范围视图。Mo17、B73和Huangzhao4近交系之间的比较视图显示于图4中。鉴定了总计六个附加的假定的基因，在全部三种近交系中均发现了一种锚蛋白重复蛋白(SEQ ID NO：104-106，分别为编码序列、蛋白质翻译和基因组DNA)，Huangzhao4中缺失了一种编码细胞壁关联激酶蛋白的基因(SEQ ID NOs：31-33)，B73和Huangzhao4中缺失了一种编码水解酶的基因(SEQ ID NO：107-109)，Huangzhao4中缺失了三种Xa21-样激酶蛋白中的两种(SEQ ID NOs：110-115)，而第三种Xa21-样激酶蛋白(SEQ ID NOs：115-117)至少存在于Mo17和Huangzhao4中。

实施例18

qHSR1区域中候选抗性基因的表征

三种方法被用于验证候选抗性基因：1)互补性试验，由于Mo 17和B73均表现出一些丝黑穗病抗性，三个共有的基因(锚蛋白重复蛋白、细胞壁关联激酶蛋白和Xa21D激酶)有可能是促成该表型的候选基因，全部的这三个基因均从阳性BAC克隆被亚克隆至表达载体，然后被转入易感的近交系；2)RNAi方法，对上述172-kb区域中的全部六个假定的基因构建了RNAi载体，然后将载体转入Mo17，以将假定的基因逐个敲除，如此能够鉴定那些涉及丝黑穗病抗性的基因；3)在易感品系中过表达候选基因，将六个单独的候选基因中的每一个分别与强启动子相连，构建了过表达构建体，并转入易感品系，以测定是否qHSR1区域中的这些单独的候选基因中的任何一个足以赋予丝黑穗病抗性。

实施例19

qHSR1区域中对标记辅助的选择有用的标记的开发

BAC序列，尤其是那些编码序列，被进一步用于开发高密度标记。在所述172-kb区域(Ji1037的qHSR1，其等同于Mo17的)总计开发了八个标记(表5)。这些标记被用于通过标记辅助的选择将抗性的qHSR1整合进易感近交系。

表5：包含qHSR1区域的172kb区间中的标记

利用十一个BC4种群测试了qHSR1区域在丝黑穗病抗性中的遗传效应。将Mo17近交系与Ji853、444、4287、98107、99094、Chang7-2、V022、V4、982、8903和8902杂交。然后使qHSR1区域回交四代，利用标记选择含有qHSR1区域的植物，所述标记例如MZA6393、2M10-5、STS148-1、STS661和E148-4。在海南岛的冬季苗圃中对这些BC4种群进行了表型评估。这些BC4种群既包括含有qHSR1的植株又包括不含qHSR1的植株(表6A和B)。不含qHSR1区域的植株被当作对照物，以显示不同遗传背景的基准抗性。就丝黑穗病抗性对所述BC4种群中的个体植株进行了评分，并且对含有和不含qHSR1区域的组，均计算了抗性植株的百分比。所述qHSR1区域导致抗性指数提高了大约25％。近交系“4287”自身具有qHSR1区域并显示出丝黑穗病抗性，这是qHSR1区域向“4287”遗传背景中的整合对于丝黑穗病抗性只有极小效果的原因。

表6A：qHSR1区域在丝黑穗病抗性中的遗传效应

表6B：

实施例20

qHSR1区域中对标记辅助的选择有用的附加的标记的开发

制备了qHSR1的渗入系，以用作育种材料和用于在北美西部、墨西哥和中国对qHSR1功效的评估。二十五个先锋近交系(CN3K7为供体品系；GRB1M、HNA9B、HN4CV、HNVS3、HNN4B、HNH9H、HNGFT、GR0RA、HFTWK和GRVNS为用于中国的非坚杆品系；GR0P2、HEF3D、HF0SV、HFHHN、HN05F、HN088、HN0E1、HN8T0、HNNWJ和HNW4C为用于北美西部的非坚杆品系；EDGJ4、EDW1N、EDVNA、EDVS9和EDV9Z为用于中国的坚杆品系；和2HC5H、2H071、4F1FM、4F1VJ、4FJNE、7T9HV、1ARMJ、1AY0M、1AGFC和1A1V3为用于墨西哥的坚杆品系)被用于与Mo17杂交，以产生F1。在随后的回交中，SNP标记被用于选择qHSR1区域，所述SNP标记例如MZA15839-4、MZA18530-16、MZA5473-801、MZA16870-15、MZA4087-19、MZA158-30、MZA15493-15、MZA9967-11、MZA1556-23、MZA1556-801、MZA17365-10、MZA17365-801、MZA14192-8、MZA15554-13和MZA4454-14。介于39个和65个之间的SNP标记被用于在BC1代中进行针对背景的选择。

所述品系被用于与BC1、BC2、BC3或BC4代回交，然后自交。在自交世代中鉴定了qHSR1区域纯合的植株，然后就NSS(非坚杆)基因渗入将其与适当的测交近交系，例如EF6WC或EF890杂交。然后在适合该近交系的地区，例如北美西部、墨西哥或中国，对测交BC品系进行功效评估。在每一地区，使用了足够数量的重复和种群来评估qHSR1功效。同样栽培了不含丝黑穗病QTL的对应杂交体以进行比较。如果未预期会出现高水平的疾病压力，则实验将进行丝黑穗病病原体的人工接种，以确保高水平的疾病压力。

对进行标记辅助的育种以培育渗入系有用的标记显示于图7中。这些标记中的八个(MZA6393、1M2-9、E6765-3、2M4-1、2M10-5、2M11-3、3M1-25和STS148-1)位于qHSR区域内。表7中位于qHSR区域之外的那些标记被开发为Mo17特异性的，并因此与qHSR区域连锁。尽管这些标记是示例性的，但无意将其作为全部可用标记的完整列表。能够开发出许多就qHSR区域而言具有特异性的标记。此外，在标记辅助的选择中，与这些特异性标记之一连锁或相关联的任何标记能够是有用的。

表7A：qHSR区域中的标记

表7B：qHSR区域中的标记

Claims (12)

1.测定多核苷酸在玉米植物中存在或不存在的方法，所述方法至少包括下列之一：

(a)从所述玉米植物分离核酸分子并扩增与所述多核苷酸同源的序列，或

(b)从所述玉米植物分离核酸分子并进行DNA杂交，或

(c)从所述玉米植物分离蛋白质并利用所述蛋白质的抗体进行蛋白质印迹，或

(d)从所述玉米植物分离蛋白质并利用所述蛋白质的抗体进行ELISA测定，或

(e)证明源自mRNA转录物、并且是丝黑穗病抗性基因座特有的mRNA序列的存在；并且其中所述多核苷酸选自：

(i)至少一种编码赋予或提高丝黑穗病抗性的多肽的核苷酸序列，所述多肽选自SEQ ID NO：27、32、35、38、41、44、105、108、111、113和116；

(ii)至少一种能够赋予或增强丝黑穗病抗性的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：25、26、30、31、34、36、37、39、40、42、43、45、104、106、107、109、110、112、114、115和117；和

(iii)(i)或(ii)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补；

从而测定所述多核苷酸在所述玉米植物中的存在。

2.测定丝黑穗病抗性基因座在玉米植物中存在或不存在的方法，所述方法至少包括下列之一：

(a)从所述玉米植物分离核酸分子并扩增赋予丝黑穗病抗性的多核苷酸特有的序列，或

(b)从所述玉米植物分离蛋白质并利用所述蛋白质的抗体进行蛋白质印迹，或

(c)从所述玉米植物分离蛋白质并利用所述蛋白质的抗体进行ELISA测定，或

(d)证明源自mRNA转录物、并且是丝黑穗病抗性基因座特有的mRNA序列的存在；并且其中所述多核苷酸选自：

(i)至少一种编码赋予或提高丝黑穗病抗性的多肽的核苷酸序列，所述多肽选自SEQ ID NO：27、32、35、38、41、44、105、108、111、113和116；

(ii)至少一种能够赋予或增强丝黑穗病抗性的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：25、26、30、31、34、36、37、39、40、42、43、45、104、106、107、109、110、112、114、115和117；和

(iii)(i)或(ii)的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补；

从而测定所述丝黑穗病抗性基因座在所述玉米植物中的存在。

3.鉴定表现出丝黑穗病抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在玉米植物中检测遗传标记基因座，其中：

(a)包含所述遗传标记基因座或其互补序列的全部或部分的遗传标记探针，在严格条件下与bacm.pk071.j12、bacm.pk007.18和bacm2.pk166.h1杂交；并且

(b)所述遗传标记基因座包含与丝黑穗病抗性相关联的至少一个等位基因。

4.鉴定表现出丝黑穗病抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的种质中检测标记基因座的至少一个等位基因，其中：

(a)所述标记基因座位于SSR148152、CAPS25082、STS171、SNP661和STS1944的7cM内；并且

(b)至少一个等位基因与丝黑穗病抗性相关联。

5.鉴定表现出丝黑穗病抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的种质中检测标记基因座的至少一个等位基因，其中：

(a)所述标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并且侧接umc1736和umc2184；并且

(b)至少一个等位基因与丝黑穗病抗性相关联。

6.权利要求5的方法，其中所述标记基因座位于包含且侧接SSR148152/SNP661的染色体区间内。

7.标记辅助的选择方法，所述方法包括：

(a)获取具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植物，其中所述标记基因座位于公开的IBM基因图谱上的SSR148152、CAPS25082、STS171、SNP661和STS1944的7cM内，并且所述等位基因与提高的丝黑穗病抗性相关联；

(b)将所述第一玉米植物与第二玉米植物杂交；

(c)至少就所述等位基因对子代进行评估；以及

(d)选择至少具有所述等位基因的子代玉米植物。

8.标记辅助的选择方法，所述方法包括：

(a)获取具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植物，其中所述标记基因座位于包括且侧接umc1736和umc2184的染色体区间内，并且所述等位基因与提高的丝黑穗病抗性相关联；

(b)将所述第一玉米植物与第二玉米植物杂交；

(c)至少就所述等位基因对子代进行评估；并且

(d)选择至少具有所述等位基因的子代玉米植物。

9.检测丝黑穗病抗性基因座的方法，所述方法包括检测至少一个标记等位基因的存在，所述标记等位基因选自：MZA6393、1M2-9、E6765-3、2M4-1、2M10-5、2M11-3、3M1-25和STS148-1。

10.任何根据权利要求3-9所述的方法，其中所述与丝黑穗病抗性相关联的至少一个标记等位基因与第二标记等位基因连锁。

11.通过权利要求3-9的方法中的任何一个产生的玉米植物。

12.从权利要求11的玉米植物获得的后代。

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