JPH08507691A

JPH08507691A - 植物発生を制御するための方法及び組成物

Info

Publication number: JPH08507691A
Application number: JP6521053A
Authority: JP
Inventors: ネイル，ジヨン・デイー; ピアス，ドロシー・エイ; ギガン，アンドリユー・エム
Original assignee: パイオニア・ハイ−ブレツド・インターナシヨナル・インコーポレイテツド
Priority date: 1993-03-18
Filing date: 1994-03-09
Publication date: 1996-08-20
Also published as: US5728817A; HUT73336A; BR9405950A; CA2158584A1; PL310702A1; NL9420020A; AU683876B2; WO1994021804A1; US5760190A; AU6355194A; US5583210A; AU5636898A; HU9502724D0; CH689455A5; NZ263025A; DE4491714T1

Abstract

(57)【要約】哺乳動物ＱＭ遺伝子と相同構造を有する発生タンパク質のファミリーをコードする遺伝子のファミリーが植物で発見された。ＱＭプロモーター及び葯特異的プロモーターが単離された。植物中にＱＭ遺伝子を含む組換え分子は、細胞を形質転換させ、その結果として発生経路を改変された植物を再生するために有用である。雄性不稔植物の生産方法は、適当なプロモーターと共にＱＭセンス遺伝子又はアンチセンス遺伝子を含む組換え分子を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】植物発生を制御するための方法及び組成物発明の背景植物における発生タンパク質ファミリーの構造及び遺伝子コーディング配列は、哺乳動物ＱＭタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子との間に相同を有する。植物ＱＭコーディング領域及び適切なプロモーターを含む組換え分子を使用すると、発生の改変された形質転換植物が生産される。発生の改変は雄性不稔をもたらす。全てではないとしても殆どの植物遺伝子の発現は何らかの方法で植物発生に関係するとみなすことができる。多くの類の遺伝子は細胞分化、組織及び器官の形成、又は植物成長の制御に関与する発生シグナルに応答することが知られている。数種の遺伝子が十分に特徴付けられており、その例としては光（例えばｒｂｃＳ及びｃａｂ遺伝子ファミリー）又はホルモンにより調節される遺伝子や、葯、根、種子もしくは葉、又はこれらの組織における特定細胞型で特異的に発現される遺伝子を挙げることができる。Ｅｄｗａｒｄｓら，１９９０及びＫｕｈｌｍｅｉｅｒら，１９８７の総説を参照されたい。２２ｋｄゼイン遺伝子の発現を調節する転写アクチベーターをコードするトウモロコシ調節遺伝子“Ｏｐａｑｕｅ２”（Ｓｃｈｍｉｄｔら，１９９２，Ｕｅｄａら，１９９２）や、Ａ１及びＢＺ１の発現を調節する転写アクチベーターをコードするトウモロコシにおけるＣ１及びＲ遺伝子（Ｋｌｅｉｎら，１９８９）といった他の型の遺伝子が更に他の遺伝子の発現を調節することも知られている。新分野の研究は、動物及び酵母系からの遺伝子との相同に基づき、細胞分裂等の基本的細胞プロセスの制御に関与すると考えられる植物遺伝子の同定及び単離に関する。総説としてＪａｃｏｂｓ，１９９２を参照されたい。このような遺伝子の１例はトウモロコシからクローニングした酵母ｃｄｃ２遺伝子の相同体である（Ｃｏｌａｓａｎｔｉら，１９９１）。将来は、他の基本的細胞又は発生プロセスを制御する他の遺伝子も植物で同定されよう。哺乳動物において発生タンパク質は悪性状態を特徴付けるような異常細胞分裂に関係付けられている。例えば、ウィルムス腫瘍は胚芽腫細胞で発生し、散発性及び遺伝性の両形態で存在する小児腎腫瘍である。３つのグループがウィルムス腫瘍に関連する２種の異なる遺伝子のクローニングについて報告している。第１の遺伝子はＷＴ１であり、初期成長応答（ＥＧＲ）遺伝子ファミリーに属する亜鉛フィンガータンパク質をコードし、腫瘍形成細胞では欠失していることが多いヒトの１１ｐ１３遺伝子座に位置する（Ｃａｌｌら，１９９０，Ｇｅｓｓｌｅｒら，１９９０）。第２の遺伝子はＱＭと呼称され、夫々腫瘍形成及び非腫瘍形成ウィルムスマイクロセルハイブリッド細胞に由来するｃＤＮＡ及びＲＮＡを用いてサブトラクティブハイブリダイゼーションを使用することにより、Ｄｏｗｄｙら，１９９１によりクローニングされた。この遺伝子は、マウスで試験したほぼ全部の正常組織にＲＮＡレベルで発現されることが判明したが、ウィルムス腫瘍形成細胞系では欠失していた。ＱＭ遺伝子によりコードされるタンパク質は２５ｋＤの寸法であり、ｐＩ＝約１１．０と非常に塩基性である。Ｄｏｗｄｙは更に、ＱＭが多数の哺乳動物、特に霊長類における遺伝子ファミリーの１員であることも立証した。ｖａｎｄｅｎＯｕｗｅｌａｎｄら（１９９２）はヒトＸｑｔｅｒ染色体ライブラリーからＱＭ遺伝子をクローニングし、この遺伝子が従来クローニングされているＱＭ遺伝子と１００％類似することを示した。ＱＭ遺伝子の発現はマウスで立証された（Ｄｏｗｄｙら，１９９１）。ニワトリでクローニングされた遺伝子情報とｖａｎｄｅｎＯｕｗｅｌａｎｄらのデータをまとめると、この遺伝子は広い系統発生範囲にわたって保存されていると考えられる。ＱＭは非腫瘍形成表現型の維持に関与するらしいと仮定された（Ｄｏｗｄｙら，１９９１）。最近の実験によると、ＱＭは転写アクチベーターＪｕｎと結合する他のタンパク質（Ｆｏｓ）と競合することによりＪｕｎの負のレギュレーターとして機能すると考えられ、従って、ＱＭタンパク質が欠失すると非調節下の細胞成長が生じ、遂には腫瘍形成に至ると推測される（Ｍｏｎｔｅｃｌａｒｏら，１９９３）。しかしながら、動物におけるＱＭ遺伝子に関連する表現型に対応する表現型が植物では存在しないので、これらの結果からＱＭ遺伝子が植物に存在するとは予想されなかった。雄穂除去、細胞質雄性不稔及び自家不和合性等の現在使用可能な他の方法には重大な欠点があるので、植物発生を改変させる遺伝子が発見されるならば、雄性不稔を誘導する遺伝的方法の開発に有用であり得る。雄性不稔植物はハイブリッド種子の生産に有用である。市販用ハイブリッド種子の生産は大規模産業である。ハイブリッド種子から成長した植物は、２種の遺伝的に区別される育種系を交配させる異種効果を享受する。この子孫の耕種学的性能は典型的には成長力、生産性及び均質性の点で両親よりも優れている。ハイブリッド種子種は開放受粉種に比較して性能が優れているため、ハイブリッド種子の播種は農業家にとって魅力的であり、従って、市場価格は高騰する。自家種子で汚染していないハイブリッド種子を生産するためには、自家受粉でなく他家受粉を確保するように受粉制御法を実施しなければならない。受粉制御機序は機械的でも化学的でも遺伝的でもよい。該当植物種が空間的に分離した雌雄花又は分離した雌雄株を有する場合には、機械的なハイブリッド種子生産方法を使用することができる。例えばトウモロコシ植物は植物の先端の花序に雄花を形成し且つ葉柄に沿って葉の葉腋に雌花を形成する花粉を有する。雌性親の雄穂を機械的に除去して自家受粉を阻止することにより異系統交配が確保される。雄穂除去がハイブリッド種子生産に現在使用されているが、この方法は生産性が低いので労働集約的であるのみならず高価でもある。他方、殆どの主要作物植物は同一花の内部に機能的雌雄器官を有するので、除雄は簡単な方法ではない。花粉が落ちる前に花粉形成器官を手で除去することは可能であるが、この形態のハイブリッド種子生産は極めて労働集約的であり、従って高価である。こうして回収した種子の価値及び量が労力を保証する場合にしか種子は生産されない。第２の一般的なハイブリッド種子生産方法は、生育可能な花粉形成を阻止又は妨害する化学物質の使用である。これらの化学物質は殺配偶子剤と呼称され、一時的な雄性不稔を与えるために使用される。殺配偶子剤の使用によるハイブリッド種子の商業的生産は、化学物質の費用及び入手可能性ならびに施用の作用の信頼性及び作用期間により制限されている。開花期間の長い作物ではこれらの化学物質の影響を受けない新しい花が咲くので有効ではない。また、化学物質の繰り返し施用は費用の点から実際的でないという問題もある。農作物の多くの商業的ハイブリッド種子生産システムは遺伝的な受粉制御方法を利用している。雌株として使用する植物は花粉を形成することができないか、花粉を落とすことができないか、又は自家受精を行うことが生化学的に不可能な花粉を形成する。自家受粉が生化学的に不可能な植物を「自家不和合性」（ＳＩ）であるという。自家不和合性系の使用に関連する問題としては、（ｉ）自家不和合性雌性系の入手可能性及び繁殖、並びに（ｉｉ）自家和合性の安定性が挙げられる。自家不和合性を化学的に克服することができる場合や、あるいは花粉を遮断する生化学的機序が起動する前に未成熟な芽を手で授粉できる場合もある。しかしながら、不活化可能な自家不和合性系は多くの場合には、自家受粉の生化学的妨害効果を喪失又は低下させる苛酷な気候条件に対して非常に感受性である。より広汎に商業的種子生産に重要であるのは、花粉制御に基づく遺伝的機序システムによる雄性不稔の誘導である。これらのシステムには、（ａ）１個以上の核遺伝子による花粉形成不全により誘導される核遺伝子雄性不稔と、（ｂ）一般的にはミトコンドリアである細胞質オルガネラの欠陥により花粉形成を阻止又は防止する細胞質遺伝子雄性不稔（一般に「細胞質雄性不稔」又はＣＭＳと呼称される）との２種の一般型がある。核（遺伝子）型不稔は優性でも劣性でもよい。例えばｉｎｖｉｔｒｏクローン繁殖により雌性系の繁殖が可能である場合には、優性不稔しかハイブリッド種子形成に使用することができない。不稔植物と稔性植物が容易に区別されるならば、劣性不稔を使用することができよう。しかしながら、遺伝子不稔系の商業的有用性は自家稔性植物の雌株列のクローン繁殖及びｒｏｕｇｉｎｇの費用により制限されている。ＣＭＳを使用するハイブリダイゼーション法は数種報告されているが、その商業的価値を制限する多数の問題がある。これらのシステムでは、細胞質に位置するミトコンドリアに特定の突然変異があると、適正な核バックグラウンドにある場合に成熟花粉を形成することができない。核バックグラウンドが細胞質突然変異を相殺し、正常な花粉形成が生じる場合もある。ＣＭＳミトコンドリアを有する植物で花粉を形成し得る核形質は回復と呼称され、特定「回復遺伝子」の特性である。一般に、商業的種子生産にＣＭＳを使用するには、雄性不稔系（雌性親）、雄性不稔系と同一遺伝子でありながら完全に機能的なミトコンドリアを含む維持系、及び雄性親系の３種の育種系を使用しなければならない。雄性親系は、「回復系」と通称される特定の回復遺伝子を含み得、該遺伝子はハイブリッド種子に稔性を与える。ハイブリッドからの種子回収が重要ではない蔬菜等の作物では、回復なしにＣＭＳ系を使用することができよう。ハイブリッドの果実又は種子を商業製品とするような作物では、雄性親における特定の回復遺伝子によりハイブリッド種子の稔性を回復しなければならないか、又は雄性不稔ハイブリッドを受粉しなければならない。非回復ハイブリッドの受粉は、低百分率の雄性稔性植物をハイブリッドに加えて受粉を行うことにより達することができる。殆どの種でＣＭＳ形質は（全細胞質オルガネラが卵細胞のみから遺伝されるという理由により）母系遺伝されるので、システムの使用は制限され得る。数種のＣＭＳシステムが報告されているが、雄性不稔植物の生産の解決方法としての利用を阻む制約がある。例えば、トウモロコシにおける特定ＣＭＳ型（Ｔ −細胞質）は特定真菌による感染に対する感受性を付与する。ＣＭＳシステムは多数の作物に使用されているが、長期間使用すると故障する傾向がある。一般に、雄性不稔は１００％未満である。例えば雄性不稔植物を生産するために植物における発生を改変する方法を研究した結果、植物における発生タンパク質の非常に適切なファミリー即ちＱＭファミリーが知見された。本発明の方法及び組成物は、雄性稔性を操作するための新規な核となる基礎を提供する。発明の要約本発明は植物発生を改変するための方法及び組成物に関する。該方法は植物から単離されたＱＭ遺伝子を含む遺伝子構築物を使用する。植物にＱＭ遺伝子が見いだされるとは予期されないことであった。ＱＭ遺伝子は哺乳動物で腫瘍に関連して報告されて、正常細胞で発現されるが、腫瘍細胞では発現されない。この遺伝子は腫瘍（例えばヒトにおけるウィルムス腫瘍）でダウンレギュレーションを受けると思われる。同様の発生異常が生じないことから、哺乳動物腫瘍発生に関連する遺伝子が植物で相同体を有するとは予想されなかった。所定の植物種に発生する腫瘍は知られているが、これらの腫瘍はアグロバクター又は他の病原体等の外来物質による感染に特異的に起因する。ところが、哺乳動物ＱＭ遺伝子のヌクレオチド配列と相同を示すポリヌクレオチドが意外にもトウモロコシゲノムから単離された。トウモロコシからのこのポリヌクレオチドを本明細書中では「ＱＭ_m」と呼称する。ＱＭ遺伝子をタバコでもクローニングした（ＱＭ_T）。トウモロコシポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は発生タンパク質である。発生タンパク質には、調節シグナルに応答して発生中に発現されるタンパク質（例えばホルモン）と、発生経路を調節するタンパク質とがある。従って、植物におけるＱＭ遺伝子は発生、例えば花粉の発生を制御するのに有用である。花粉発生を妨害すると、雄性不稔植物が形成される。発生タンパク質は正常発生構造又は機能の結果を改変する能力により認識される。ＱＭ_mポリヌクレオチドから調製されるｃＤＮＡは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及びフランキング領域を含む８００〜９５０ヌクレオチドから主に構成される。対応する哺乳動物ｃＤＮＡは一般に８００ヌクレオチド未満である。トウモロコシｃＤＮＡにおける単一のオープンリーディングフレームは約２２０アミノ酸のポリペプチドをコードする。他の種では、ヒトから単離したＱＭｃＤＮＡにおけるオープンリーディングフレームが約２１４アミノ酸のＱＭタンパク質のファミリーをコードする。一般に、植物における遺伝子のＱＭファミリー（ＱＭ_p）は約２００〜２５０アミノ酸の一次配列を特徴とするタンパク質をコードし、本明細書中に記載する特性を有する。より詳細に説明すると、ＱＭファミリーの遺伝子は該ファミリーのタンパク質構成員のアミノ酸配列中に３つの保存領域を有することを特徴とするタンパク質ファミリーをコードする。トウモロコシＱＭタンパク質では、第１の保存領域はアミノ末端から最初の１０アミノ酸を含み、第２の保存領域は残基５０〜６０からのアミノ酸配列を含み、ＱＭタンパク質における両親媒性螺旋領域を形成し、第３の保存領域は残基９８〜１３５に位置する。これらの３つの保存領域は、哺乳動物の対応部分に特徴的な対応領域との間に高い相同度を示す。「高い相同度」とは、本明細書中では配列のアミノ末端に関して定義した場合に対応位置においてアミノ酸の少なくとも８０％が同一であることを意味する。哺乳動物の対応部分に対する植物ＱＭアミノ酸配列の全体的相同は一般に少なくとも５０％である。植物と哺乳動物の相違は（Ｎ末端に対して）約１３５位の残基からタンパク質のＣ末端までの領域に存在する。トウモロコシＱＭ遺伝子における保存領域をコードするヌクレオチド配列の位置はＮ末端から約３０〜１００位、２１０〜２５０位及び３３０〜４００位に位置する。これらの領域から調製したハイブリダイゼーションプローブは対応する哺乳動物ＱＭ配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズしよう。保存領域から調製したオリゴヌクレオチドプローブは、例えば３７℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ）を使用する低ストリンジェンシー条件下で植物において新しいＱＭ遺伝子を検出するために有用である。トウモロコシ配列のコーディング領域はヒトＱＭ配列全体に対して約６４％の相同を示す。ヌクレオチド配列中の各コドンの第３位の「変動（ｗｏｂｂｌｅ）」により、ヌクレオチドコーディング領域間の全体の相違を３６％にしながら機能的に類似するタンパク質をコードすることができる。同一種では、少なくとも３つの保存領域をコードする配列が機能的に等価のタンパク質をコードすると予想される。これは、タンパク質機能が種に特徴的な生化学的経路と相関している異種比較には必ずしも当てはまらない。しかしながら、植物及び哺乳動物のいずれのＱＭタンパク質も発生過程に重要な効果を有する。少なくとも２個から６個までのＱＭポリヌクレオチドがトウモロコシ調製物ノーザンブロット分析により区別可能である。トウモロコシに関してＱＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドの１例を図１に示す。図１に対応するアミノ酸配列を図２に示す。この配列から開発したオリゴヌクレオチドプライマーを使用してオープンリーディングフレームにおけるＤＮＡを増幅する。左：５’−ＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＧＣ／右：５’−ＣＡＡＣＧＧＣＡＴＣＧＡＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＣのヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して請求項２に記載のオープンリーディングフレームにおけるＤＮＡを増幅する。タバコ相同体の検出に有用なプライマーは、ＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣ及びＧＣＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＴＣＧＡＧＧＡＡＡＧＣＣを含む。ＰＣＲオリゴヌクレオチドを使用して５５℃のハイブリダイゼーション温度でＴａｑポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によりタバコ属（ｘａｎｔｎｉ種）からタバコＱＭ遺伝子を増幅し、増幅産物をＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、０．８ＬＭＡ上で電気泳動にかけ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋にサブクローニングした後、配列決定した。単離及び精製した植物ＱＭトウモロコシタンパク質は約２５ｋＤの推定分子量と約１１．０のＰＩとを有する。組換え法により合成する場合、ｃＤＮＡ配列に由来するタンパク質は他のタンパク質を含まないであろう。単離及び精製ＱＭタンパク質とそのエピトープフラグメントは抗体の製造に有用である。また、これらの抗体は植物における発生上の問題の診断と発生経路の分析に有用である。ＱＭタンパク質の発現位置及びレベルは発生の改変法を決定するのに有用である。例えばＱＭに対する抗体は、タンパク質が植物の特定細胞又は組織で活性化されるか否か、その時期はいつかを決定するために有用である。この情報は、花粉発生に関連する経路を含む発生経路を妨害又は強化する方法を開発するのに有用である。このような情報は例えば優れた植物又は雄性不稔植物を開発するのに有用である。植物における単離及び精製ＱＭタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用を分析するのにも有用である。これらの目的で標識タンパク質プローブが開発される。ＱＭタンパク質を含む融合タンパク質は例えば大腸菌で調製され、単離、標識され、発生過程でのタンパク質相互作用を検出するのに使用される。Ｓｍｉｔｈ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８及びＲｏｎ＆Ｄｒｅｓｓｌｅｒ，１９９２を参照されたい。センス方向、即ち正常ｍＲＮＡが転写され且つ正常ＱＭ遺伝子タンパク質を翻訳するための鋳型及び植物細胞中で前記ＤＮＡの転写を調節することが可能なプロモーターとして使用される方向にＱＭ遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子を調製する。あるいは、該組換えＤＮＡ分子はアンチセンス方向にＱＭ遺伝子をコードしてもよい。この分子は、マイナス即ち非コーディング鎖が転写されるように逆方向にクローニングされたＱＭ遺伝子を含む。ＱＭ遺伝子産物は翻訳されないが、植物自体のＱＭｍＲＮＡの翻訳を妨げるＱＭｍＲＮＡと相補的なＲＮＡ転写物が生成され、こうしてＱＭタンパク質の生成量は減少する。構築物中のプロモーターは、遺伝子が特定細胞又は組織で発現されるように、細胞特異的又は組織特異的プロモーターであり得る。例えば、雄性不稔植物を生産するための方法では、葯特異的又は絨せん組織特異的プロモーターが好適である。本発明の態様であるＴＡ３９プロモーターは適切なプロモーターである。花粉の発生に極めて重要な組織又は細胞の例としては葯組織及び絨せん組織細胞が挙げられる。葯組織は支持細胞及び発生中の花粉粒を含み、成熟花粉を含まない。ＱＭ遺伝子構築物はセンス方向に発現されるかアンチセンス方向に発現されるかに関係なく、発生を改変するのに有効であり得る。ＱＭにより調節されるか又は調節され得る遺伝子及びプロセスが葯組織に存在する場合には、センスＱＭ構築物がＱＭによる調節時期を変えることにより発生に作用するか、又はＱＭタンパク質の過剰発現により発生に作用するであろう。これに対応して、ＱＭ又はＱＭにより調節され得る遺伝子が正常な葯発生に必須であるならば、アンチセンスＱＭ構築物が発現され、正常なＱＭ発現を妨げることにより発生に作用するであろう。構築物中のプロモーターは、構築物中のセンス又はアンチセンス分子の発現をインデューサー暴露により調節できるように誘導プロモーターであり得る。このようなインデューサーの例は、ホルモン感受性プロモーターを制御するために使用される植物ホルモンである。トウモロコシから単離したＱＭプロモーターの部分的配列を図３に示す。発生の改変は雄性不稔植物を生産するために特に有用である。雄性不稔植物を生産するための方法としては、ＱＭ植物タンパク質ではセンス遺伝子を含む組換え分子又はＱＭ遺伝子に対するアンチセンス分子で植物細胞を形質転換させる方法が挙げられる。発生制御のストラテジーに依存して適当なプロモーターを選択する。例えば、葯特異的プロモーターを使用することにより葯組織で選択的にＱＭ遺伝子を過剰発現させるストラテジーを用いる。雄性不稔植物を生産するためには、慣用方法に従って形質転換細胞を植物に再生させる。該当植物種が再生可能である限り、ＱＭ遺伝子構築物で形質転換した培養物から同一構築物を含むトランスジェニック植物を再生させることができる。この関連での「培養物」は培養に適切な細胞凝集物、カルス又はその誘導体を意味する。本明細書に開示する当業者に公知の方法により、形質転換細胞もしくは培養物又は外植片から植物が再生される。方法は植物種により異なる。再生植物から、又は当業者に公知の育種法を使用した再生植物と同一種の適切な植物との交雑から種子が得られる。ＱＭ_mセンス遺伝子又はＱＭ_mアンチセンス構築物で形質転換したタバコの葉の外植片から植物を再生させることにより、雄性不稔タバコ植物を作成した。外来ＱＭ_m遺伝子発現によりタバコ雄性稔性の正常な発生バランスを崩したと説明することができよう。図面の簡単な説明以下、明細書に組み込まれ且つその一部を構成する添付図により、本発明の好適態様を具体的に説明する。以上の一般説明及び以下の好適態様の詳細な説明と共に、以下に詳細に説明する図面により、本発明の原理を明らかにする。図１−トウモロコシＱＭ相同体をコードするｃＤＮＡクローン１０〜１５のヌクレオチド配列及びコード化アミノ酸配列。図２−トウモロコシＱＭ相同体（上段配列）とヒトＱＭアミノ酸配列とのアミノ酸アラインメント分析。図３−トウモロコシからのＱＭプロモーターの部分的ヌクレオチド配列。図４−ＱＭ_mセンス遺伝子を含むプラスミドｐＰＨＩ３６２１のプラスミドマップ。図５−ＱＭ_mに対するアンチセンスを含むプラスミドｐＰＨＩ３６２２のプラスミドマップ。図６−タバコの選択可能な妨害プラスミドであるプラスミドｐＰＨＩ１２８５のプラスミドマップ。図７−ヒトアンチセンス遺伝子を含むプラスミドｐＰＨＩ４７２２のプラスミドマップ。図８−ヒトセンス遺伝子を含むプラスミドｐＰＨＩ４７２３のプラスミドマップ。図９−プラスミドｐＰＨＩ４７１９のプラスミドマップ。図１０−プラスミドｐＰＨＩ４７２０のプラスミドマップ。図１１−プラスミドｐＰＨＩ６８７のプラスミドマップ。図１２−プラスミドｐＰＨＩ６１０のプラスミドマップ。図１３−ｕｉｄＡ遺伝子を含むプラスミドｐＰＨＩ４６０のプラスミドマップ。図１４−ｕｉｄＡ遺伝子を含むプラスミドｐＰＨＩ１９５２のプラスミドマップ。図１５−ｕｉｄＡ遺伝子を含むプラスミドｐＰＨＩ２１２５のプラスミドマップ。図１６−ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＰＨＩ１５２７のプラスミドマップ。図１７−ＱＭ_mセンス遺伝子を含むプラスミドｐＰＨＩ３６２０のプラスミドマップ。図１８−ＧＵＳ遺伝子を含むプラスミドｐＰＨＩ１４９３のプラスミドマップ。図１９−センス遺伝子を含むプラスミドｐＰＨＩ４７４５（ＴＡ３９（１４Ｂ１））のプラスミドマップ。図２０−ＱＭ_mに対するアンチセンスを含むプラスミドＬ６２（ＴＡ３９（１４Ｂ１））のプラスミドマップ。図２１−ＧＵＳ遺伝子を含むプラスミドｐＰＨＩ４８５５（ＴＡ３９（８Ｂ３））のプラスミドマップ。図２２−ＱＭ_mセンス遺伝子を含むプラスミドＬ５９（ＴＡ３９（８Ｂ３））のプラスミドマップ。図２３−ＱＭ_mに対するアンチセンスを含むプラスミドＬ６１（ＴＡ３９（８Ｂ３））のプラスミドマップ。図２４−ＴＡ３９（８Ｂ３）プロモーターのヌクレオチド配列。図２５−ＴＡ３９（１４Ｂ１）プロモーターのヌクレオチド配列。好適態様の詳細な説明本発明は植物における発生を改変するための方法及び組成物に関する。本発明は更に、非腫瘍形成状態の維持に役割を果たすと考えられ且つウィルムス腫瘍形成細胞系中に不在であることが判っているヒトにおいて構成的に発現される遺伝子の植物遺伝子相同体にも関する。ヒト及び齧歯動物に遺伝子ファミリーとして存在するこの遺伝子は、種々多様な哺乳動物種に存在することが立証された。本発明によると、ヒトＱＭタンパク質との間に高い相同度（約６７％）を有するタンパク質をコードする遺伝子をトウモロコシ及びタバコからクローニングした。トウモロコシ遺伝子は２５ｋＤのポリペプチドをコードし、そのうち塩基性残基はタンパク質の２２％を構成する。この遺伝子はノーザンブロット分析により試験した全トウモロコシ組織で発現され、植物遺伝子ファミリーの１員である。本発明は更に雄性不稔植物及びハイブリッド種子の生産方法、雄性不稔形質を与えるために使用される遺伝子材料、並びに前記方法により生産された新規産物、即ち雄性不稔形質を有する遺伝的に形質転換した植物、雄性不稔植物及び、雄性稔性植物からの花粉を前記植物に受粉させることにより生産したハイブリッド種子に関する。図１はクローン１０〜１５のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示す。ｃＤＮＡクローンは９３６ヌクレオチド長であり、２５，１３８ダルトンのポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含んでいた。このポリペプチドは強塩基性であり、１１．０のｐＩ計算値を有しており、塩基性残基はタンパク質全体に分布している。従来特徴付けられている他の遺伝子との相同の調査では、クローン１０〜１５によりコードされるアミノ酸配列を使用して、ＧｅｎｅｔｉｃＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ，Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４）のＴＦＡＳＴＡプログラムによりＧｅｎＢａｎｋデータベースを検索した。この分析によると、ヒトＱＭ遺伝子の得点は７１６であった。クローン１０〜１５によりコードされるアミノ酸配列をヒト遺伝子のアミノ酸配列と整列させると（図２）、数個の重要な領域が注目される。第１の領域は高保存度のアミノ末端領域であり、最初の１０個のアミノ酸残基が保存されている。第２の領域も両タンパク質で保存されており、推定される両親媒性螺旋を形成する残基５０〜６１の間に位置する。残基９８〜１３５の第３の保存領域も存在する。上記３つの保存領域については、５９残基長の高度に保存されたアミノ酸が存在することから、タンパク質のこれらの領域内に保存された機能があると予想される。カルボキシ末端の保存度は低く、タンパク質の機能に重要でないと思われる。トウモロコシの７日目の苗木からの葉及び根組織から単離したＲＮＡのノーザンブロット分析によると、クローン１０〜１５からのｃＤＮＡはどちらでも発現され、根及び葉はほぼ同一の発現レベルを示す。別のノーザンブロットでは、この遺伝子は葯及び穂新芽で発現されることが判明した。サザンブロット分析によると、トウモロコシ相同体はトウモロコシにおいて約４〜６員の小さいファミリーの１員である。以下の実施例は本発明を実施する方法を示す。但し、本発明の範囲はこれらに示された実施態様に制限されない。実施例１：ＱＭ_m遺伝子による形質転換のタバコ植物正常発育に対する妨害タバコ種子（ｃｖ．ｘａｎｔｈｉ）を無菌条件下で発芽させた。明所において２８℃で約７〜１０日後に、子葉と第一葉を無菌状態で採取し、４つ（約１〜２ｍｍ²断片）に切り、０．２５Ｍソルビトールを含む培地を満たした無菌円形濾紙上に置いた。円形濾紙を暗所において２８℃で一晩インキュベートした。翌朝、組織断片にＱＭｍ構築物（ｐＰＨＩ３６２１−センス構築物（図４）またはｐＰＨ１３６２２−アンチセンス構築物（図５））と選択可能マーカー（ＢＡＲ遺伝子）を含むプラスミドとの等量混合物をbiolistics装置によって打込み（bomb ard）、細胞を形質転換した。０．１μｇの全ＤＮＡを５回の打込みによって送達した。打込み後、組織を暗所において２８℃でインキュベートした。４８時間後、打込みした組織を選択培地（ＢＡＳＴＡ）に移し、２８℃の明所に置いた。約２週間すると小さなコロニーが出現し始め、それが約１週間続いた。葉片を再生培地に移し、葉と苗を形成させた。植物形成後、幼苗を発根培地に移し、根を形成させた。約１〜２週間後、植物を定植のために温室に移した。センス構築物ｐＨＩ３６２１（図４）は対照（選択可能マーカーのみ）ほど多くのコロニーを生じなかった。実際、多くのコロニーが形成されたが、その後死滅した。生存したものでも、成長は対照よりはるかに遅かった。これらのコロニーから生成された生存カルスのほとんどは植物を生じなかった。植物を生じたもののほとんどは、カルスの別個の部分の成長からそうなったもので、これは復帰細胞セクター（プラスミドの損失）を示している。ＰＣＲ分析によると、得られた植物はトウモロコシ遺伝子陰性であった。カルスの観察から、それらが植物を生成するための分裂組織を形成または構成する上で問題を有したことが判る。ある植物はプラスミド陽性であると判断されたが、それでも植物を生成した。この植物の成長は極めて遅く、温室に移行するときでもまだ根を生じておらず、温室内でも一時期（約１カ月）かなりゆっくり成長したが、その後は正常速度で成長し、正常と見られた。該植物は開花し、正常植物と同様に種子を結んだが、生成された種子は異常を呈し、発芽試験においては、正常種子が４〜６日であるのに対して発芽までに２週間以上を要した。アンチセンス（ｐＰＨＩ３６２２）（図５）打込み組織から誘導されたカルスは全く異なる成長特性を示した。幾つかの場合でカルスはかなり加速された速度で成長し、多大な栄養成長を行った。これらのカルスはほぼ正常な速度で植物を生成した。苗を再生及び発根培地に移すと、対照より速い速度で発根した。得られた植物は正常に見え、正常に開花し、種子を結んだ。生成された種子は正常に発芽したので、植物は正常と見られる。上記結果から、ＱＭ遺伝子は発生において一役を担うことが判る。形質転換タバコにおいて、その存在は恐らく分裂組織形成を妨害または阻害する。発現したとき、ＱＭは細胞を特定の発生段階に「固定」し得る。該遺伝子が出現してからは細胞はもはや分化しない。タバコカルスにおける該遺伝子の過剰発現により、植物を生成するための分裂組織の形成は阻害された。過剰発現はより高い濃度では致死的となり得る。アンチセンス分子を含む構築物を備えた植物細胞は場合によっては加速速度で成長し得た。かかる結果は、アンチセンス分子がタバコＱＭ遺伝子産物の作用を停止させ、分化をより迅速に生じさせ、カルスに見られた多くの普通葉を与えたと解釈される。実験は３回繰り返したが、基本的には各実験で同様の観察がなされた。かかる結果は、ＱＭがリプレッサー分子として機能し得るという知見と一致する。Ｍｏｎｔｅｃｌａｒｏら，１９９３参照。実施例２： in situハイブリダイゼーションによる小胞子特異的遺伝子発現の証明この実施例では、単離したＤＮＡが小胞子特異的発現を示す遺伝子を含むことを示す方法を記載する。特にここでの結果は、特定のタバコｃＤＮＡクローンに対するｍＲＮＡの発現がタバコ葯の小胞子に局在していることを証明するものである。本明細書において使用される「小胞子特異的」とは、花粉発生に不可欠な細胞または組織における遺伝子発現を指す。葯及びタペートはこのような細胞または組織の例である。ＴＡ３９と称された葯特異的タバコｃＤＮＡクローンをｔｈｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ，カリフォルニアのＤｒ．ＲｏｂｅｒｔＢ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇから入手した。該クローンを使用し、ＱＭ遺伝子に使用するＴＡ３９プロモーターを回収した（実施例３参照）。このｃＤＮＡはタバコ葯由来のｍＲＮＡにはハイブリダイズするが、雌ずい、花弁、葉または茎由来のｍＲＮＡにはハイブリダイズしない（Ｋｏｌｔｕｎｏｗら，１９９０）。ｃＤＮＡの長さは、４２塩基のポリＡ＋テールを含む４９０塩基である。このｃＤＮＡは、葯から単離したＲＮＡのノーザンブロットにおいて５５０塩基及び６８０塩基の２つの転写物にハイブリダイズする。ＲＮＡドットブロットからは、ＴＡ３９関連転写物は、全てがタペート内に局在する５種類の他の葯特異的転写物と同じ時間的順序で蓄積及び分解することが判っている（Ｋｏｌｔｕｎｏｗら，１９９０）。Ｎｉｃｏｔｉｎｉａｔｏｂａｃｕｍ（ｃｖＫｙ１７）の葯を四分子期で回収し、標準細胞学的技法（Ｂｅｒｌｙｎら，１９７６）によって操作した。葯をｔ−ブタノール中で脱水し、パラフィン中に埋込み、厚さ８μｍの断片に切断し、スライドに固定した。クローンＴＡ３９と別のｃＤＮＡクローン（ＬＡ２：表皮特異的ｍＲＮＡ）のＤＮＡフラグメントをプラスミドから切り出し、ゲル電気泳動によって精製し、製造業者指示に従ってＢｉｏＮｉｃｋＬａｂｅｌｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＢＲＬ）を使用し、ビオチン−１４−ｄＡＴＰを用いてニックトランスレーションによって標識した。固定した葯断片をビオチン標識プローブを用いてin situハイブリダイゼーションさせ、ＢＲＬのＤＮＡ検出系を使用して検出した。この系においては、ストレプトアビジンがビオチニル化プローブＤＮＡ及びビオチニル化アルカリ性ホスファターゼを結合し、プローブが標的核酸にハイブリダイズした細胞内にニトロブルーテトラゾリウムが沈殿する結果となる。上記のin situハイブリダイゼーションの分析調査から、試験試料の葯子房室は四分子期の小胞子を含んでいたことが判った。ＴＡ３９ＤＮＡでプローブした葯断片においては四分子のみがテトラゾリウム染料を蓄積した。これに対して、対照ＤＮＡ（ＬＡ２）でプローブした葯断片は表皮層中に染料を蓄積した。この組織特異的対照から、ＴＡ３９ＤＮＡでプローブした葯断片の小胞子中に染料沈殿が認められたのは、小胞子によるＤＮＡ及び検出系成分の非特異的保持によるものではないことが判る。実施例３小胞子特異的ｍＲＮＡに相同な配列：Ｔ３９プロモーターを含むＴ３９ゲノムクローンの単離この実施例は、核酸プローブが使用可能である任意の小胞子特異的ｍＲＮＡに相同な配列を含むゲノムＤＮＡクローンの単離方法を与える。記載の方法は、かかる使用可能なプローブに相同な小胞子特異的ｍＲＮＡを有する任意の植物種由来の小胞子特異的調節配列を単離するのに有用である。タバコ葯特異的ｃＤＮＡクローンＴＡ３９をＵＣＬＡのＤｒ．ＲｏｂｅｒｔＧｏｌｄｂｅｒｇから入手した。ＴＡ３９は、幾つかのタペート特異的転写物に見られるのと同様の時間的パターンで、葯由来のｍＲＮＡにハイブリダイズする（Ｋｕｌｔｕｎｏｗら，１９９０）。その場ハイブリダイゼーションから、ＴＡ３９は−１〜＋１期には小胞子及び結合組織中に低レベルで存在し、１〜６期にはタペート中に高レベルで存在することが判った（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら，１９９３）。特定の植物のゲノムライブラリー、例えばＮ．ｔａｂａｃｕｍ変種ＮＫ３２６由来のＤＮＡフラグメントの市販のライブラリー（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ.，ＰａｌｏＡｌｔｏ，カリフォルニア；カタログＦＬ１０７０Ｄ）をＭｂｏＩで部分消化し、プラスミドＥＭＢＬ−３中にクローニングにし、ｃＤＮＡクローンＴＡ３９に対する相同性を有するクローンをスクリーニングした。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９に記載のごとき標準ハイブリダイゼーション方法を使用した。プラークをピックアップし、再度平板培養し、ＴＡ３９ｃＤＮＡ挿入物で再度プローブするというサイクルを、一貫してハイブリダイズするプラークが精製されるかまたは存在しないことが判るまで３回以上行い、候補クローンを精製した。各々が各ファミリー内の２つの重複クローンによって代表される、２種の区別可能なＴＡ３９ｃＤＮＡ関連ゲノムタバコＤＮＡクローンファミリーを同定した。各ファミリーの一方のクローンを精密特性分析用に選択し、クローン８Ｂ３（図２４）及び１４Ｂ１（図２５）と称した。これらのゲノムクローンの各々のＴＡ３９に相同の領域、並びにかかる相同領域の直ぐ上流及び下流の領域のマップを制限酵素切断分析及びＤＮＡハイブリダイゼーションによって作成した。かかるコーディング配列と付随する５′推定調節領域をサブクローンとして単離し、配列決定するために更にサブクローニングした。即ち、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによってキットで提供されているｅｘｏIII及びヤエナリヌクレアーゼを使用することにより、各ゲノムクローンにネストした（nest ed）欠失部を生成した。アイオワ州立大学のＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＦａｃｉｌｉｔｙにおいて自動ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３Ａ）を使用し、ネストした欠失部の配列をＳａｎｇｅｒのジデオキシ鎖成長終結法によって決定した。ＴＡ３９のｃＤＮＡ挿入物の配列も比較のために決定した。小胞子特異的ｍＲＮＡのＴＡ３９ｃＤＮＡに相同の領域において、ゲノムクローン８Ｂ３はＴＡ３９と完全に相同であるが、ゲノムクローン１４Ｂ１の対応部分はＴＡ３９に約９０％相同である。１４Ｂ１及び８Ｂ３ゲノムクローンの転写開始部位のマップを、推定翻訳開始部位の８３塩基上流にある単一ヌクレオチドに対するプライマー伸長実験によって作成した。各クローンにおいて、マッピングされた転写開始部位の３１ｂｐ上流に完全なＴＡＴＡボックスが現れ、両クローンの転写開始部位の下流（即ち転写開始部位に対して「＋８３」と表わされる位置）で、１１０個のアミノ酸からなる主要読み取り枠が無傷である。両クローンはそれぞれクローン１４Ｂ１及び８Ｂ３の翻訳停止コドンの２９ｂｐ及び３７ｂｐ下流にポリアデニル化認識部位を有する。実施例４：小胞子特異的遺伝子制御配列を含むＤＮＡセグメントの単離プローブに適した新規のｃＤＮＡクローンは、ＴＡ３９配列の一部分を含むオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに対してクローンをスクリーニングし、次いでハイブリダイズしたクローンの配列を決定し、その全配列とｃＤＮＡクローンＴＡ３９との一致の程度を決定することにより同定し得る。この目的のためにはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。ストリンジェントなハイブリダイゼーションは当分野において公知の種々の条件（例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９参照）に従って本発明に対して実施し得るが、具体的な制御配列を単離するのに使用されているストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の１つは、６×ＳＳＰ，０．１％ＳＤＳ溶液中で約６５℃で初期ハイブリダイゼーション反応を約１２時間行い、次いで１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ％溶液を用いて約６５℃で洗浄し、更に０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ溶液を用いて室温で洗浄することからなる。タバコ以外の植物から単離されたｃＤＮＡのようにクローンＴＡ３９と一部しか相同でないｃＤＮＡクローンに対しては、新規のｃＤＮＡが誘導されるｍＲＮＡが小胞子特異的ｍＲＮＡであるかどうかは、雄花組織のｍＲＮＡの発現を時間的及び最も正確には空間的に分析することにより決定し得る。例えばＫｕｌｔｏｎｏｗら（１９９０）；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｕｓ）由来の葯特異的ｃＤＮＡを開示しているＤｏｍｏｎら（１９９０）；小胞子を発生させる上で特異的に発現されると言われているＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｍＲＮＡを記載しているＲｏｂｅｒｔｓら（１９９１）；タペート特異的及び小胞子特異的ｃＤＮＡクローンの単離を含む、葯を発生させることから作製されたｃＤＮＡライブラリーを記載しているＳｃｏｔｔら（１９９１）；及び、小胞子発生初期に活性化されるＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ由来の花粉特異的遺伝子ファミリーを記載しているＡｌｂａｎｉら（１９９０）の分析方法が参照される。クローンＴＡ３９に関連する小胞子特異的ｍＲＮＡに対する特定の形態のプローブは、ＴＡ３９によってコードされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子を用いてハイブリダイズするのに必要な物理的特性を有する任意の形態のポリヌクレオチド、即ち一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む。サイズ、塩基構成及び相同度を含む有効な核酸プローブの一般的必要条件は当分野において良く知られており、明記されている。例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）参照。しかしながら、特にプローブ配列と同一でないヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメントを探す場合に好ましいプローブは、小胞子特異的ｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡの少なくとも一方の鎖の全配列を含むプローブである。このような全長プローブは、ｍＲＮＡ誘導配列の一部しか含まないプローブよりも、一部相同のＤＮＡ分子を検出し得る可能性が高い。関連遺伝子が、ｍＲＮＡが生じたのと同じ植物種から誘導されていようと、他の種から誘導されていようと、所与のｍＲＮＡ配列のある部分は、そのｍＲＮＡ配列の他の部分より、関連小胞子特異的遺伝子内で保存されていないかもしれない。小胞子特異的遺伝子制御配列を含むＤＮＡセグメントを単離する方法は更に、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの標準条件下で上記核酸プローブにハイブリダイズするゲノム植物ＤＮＡの１つ以上のフラグメントを単離するステップを含む。これらのフラグメントは、プローブ関連ｍＲＮＡが生じたのと同じ植物種から得てもよいし、別の被子植物種から得てもよい。本発明の小胞子特異的遺伝子制御配列を単離する該方法を実施するのに適した特定の植物は、単子葉類（特にトウモロコシなどの穀類）及び双子葉類（例えばＣａｎｏｌａ及びヒマワリ）の両方を含む。小胞子特異的制御配列について検査すべきＤＮＡフラグメントは通常は、読み取り枠及び関連調節配列を含む大ゲノムＤＮＡフラグメントをスクリーニングするのに適したベクター中にクローニングすることにより製造される。例えば、Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ由来の遺伝子を記載しているＡｌｂａｎｉら，１９９１；Ｏｅｎｏｔｈｅｒａｏｒｇａｎｅｓｉｓ由来の遺伝子を記載しているＢｒｏｗｎら，１９９０；トウモロコシ遺伝子を開示しているＧｕｅｒｒｅｒｏら，１９９０及びＨａｍｉｌｔｏｎら，１９８９；または、トマト由来の葯特異的遺伝子を記載しているＴｗｅｌｌら，１９８９のいずれかに記載のごとく、ゲノム植物ＤＮＡライブラリーの作製及びハイブリダイゼーションスクリーニングをこの目的で実施することができる。或いは、市販の植物ゲノムＤＮＡクローンライブラリーを入手し、スクリーニングしてもよい。本発明のプローブにハイブリダイズした任意の植物ゲノムＤＮＡの単離フラグメントのヌクレオチド配列は、標準ＤＮＡ配列決定法によって確定される。次いでこの配列を精査し、全読み取り枠の少なくとも５′末端をコードする第１セグメントの配列でプローブにハイブリダイズする第１ＤＮＡフラグメントを含むかどうかを決定する。読み取り枠の５′末端は、読み取り枠を含む配列が後ろに続く翻訳開始コドンによって同定され、本発明方法のプローブにハイブリダイズする。小胞子特異的制御配列の単離に適したゲノムＤＮＡフラグメントは更に、プローブにハイブリダイズする全読み取り枠の５′末端に隣接する配列を含む第２ＤＮＡセグメントを含む。この点で、「完全な読み取り枠の５′末端に隣接する」配列は、本発明のゲノムＤＮＡフラグメント内の読み取り枠の上流にある配列の任意の部分を含む。一般に、隣接する読み取り枠の発現を調節する制御配列は該読み取り枠の数百塩基対内に位置するが、場合によっては、読み取り枠に隣接するある種の制御エレメントは読み取り枠から数キロ塩基離れたところに位置し得る。いずれの場合も、本発明のゲノムＤＮＡフラグメントの小胞子特異的ｍＲＮＡ関連配列に隣接することにより、かかるゲノムＤＮＡフラグメントの第２セグメントの配列は推定小胞子制御配列を構成する。小胞子特異的制御配列を含むＤＮＡセグメントを単離する方法は更に、第２ＤＮＡセグメントに操作的に結合されているＤＮＡ配列の小胞子特異的発現の誘導に対して、ゲノムＤＮＡフラグメントの各第２ＤＮＡセグメントを試験するステップを含む。推定小胞子特異的制御配列を含むセグメントの試験は、本発明のトランスジェニック植物において異種配列の小胞子特異的制御を操作するのに適した機能性小胞子特異的遺伝子制御配列を含むＤＮＡセグメントを同定する役割を果たす。推定小胞子特異的制御配列の試験は、小胞子及び他の植物組織の推定小胞子特異的制御配列に操作的に結合されている都合の良い「リポーター」配列の発現を測定することにより行われる。このリポーター配列の一般的必要条件は、小胞子及び誘導組織（例えば花粉）並びに、小胞子特異的制御配列が操作的に結合されたリポーター配列の発現を誘導しない他の組織（例えば葉）においてこの配列の発現レベルを容易に確定し得ることである。実施例５：ゲノムＤＮＡクローンの推定制御配列に操作的に結合された異種遺伝子の小胞子特異的発現試験本実施例は、一時的遺伝子発現アッセイにおいて異種リポーター遺伝子の発現を小胞子特異的に制御するための、ゲノムＤＮＡクローン由来の小胞子特異的調節領域の使用を示す。８Ｂ３（図２４）及び１４Ｂ１（図２５）の推定プロモーターをそれぞれ、ジャガイモ由来のプロテイナーゼII（ｐｉｎII）遺伝子の３′未翻訳領域が後ろに続くβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするリポーター遺伝子（ｕｉｄＡ）の読み取り枠に融合した。１つの態様においては、「翻訳可能」融合を行い、各プロモーターを、使用可能な上流の配列の最初からヌクレオチド＋８３にある翻訳開始部位までクローニングした。「転写可能」融合と称した別態様においては各プロモーターを、使用可能な上流の配列の最初からヌクレオチド＋４にある転写開始部位のすぐ後ろまでクローニングした。後者の構築物は、プロモーター配列とｕｉｄＡ配列の間にタバコモザイクウイルス（ω）の非翻訳先行配列を含んでいた。ＧＵＳリポーター遺伝子を含むものと類似の翻訳可能遺伝子融合体も別のモデル遺伝子、ホタルルシフェラーゼコーディング遺伝子に対して構築した。１．８μｍのタングステンビーズ上に付着させたＤＮＡを粒子ガンによって打込んだ、タバコ（ｃｖ．ＰｅｔｉｔｅＨａｖａｎａ）の３〜４期の葯薄片における一時的発現アッセイにおいてｕｉｄＡ遺伝子融合体を試験した。例えばＴｗｅｌｌら１９８９参照。各ショットは０．５μｇのＤＮＡを含んでいた。葯薄片上の個々の小胞子中には暗青色の染色斑が認められ、小胞子中でＧＵＳ遺伝子の一時的発現が起こったことが判る。葯表面にときおり見られる斑点源は、葯細胞から生じたのか混入した小胞子から生じたのか区別できなかった。しかしながら、単離した小胞子及び葉による追加試験において、ｕｉｄＡ及びルシフェラーゼ遺伝子融合体の小胞子中での一時的発現が確認された。葉片におけるルシフェラーゼ構築物の一時的アッセイでは、使用可能な最も高感度の試験（ルシフェラーゼ触媒発光検出）を使用しても、葉における小胞子特異的制御配列の遺伝子発現活性は認められなかった。実施例６：昆虫防除または雄性不稔用遺伝子の小胞子特異的発現のための遺伝子構築物の作製本実施例は、トランスジェニック植物において昆虫防除または雄性不稔を行う遺伝子のごとき異種遺伝子の小胞子特異的遺伝子発現を与える構築物を生成する遺伝子操作方法を示す。所望のタンパク質をコードする遺伝子、例えば特定の昆虫防除遺伝子または雄性不稔遺伝子の小胞子特異的発現用の構築物を与えるため、特定の異種遺伝子に適当な翻訳及び転写制御を与えるべく、本発明の小胞子特異的調節配列を含むＤＮＡセグメントを異種遺伝子、及び必要であれば３′末端非翻訳配列に操作的に結合する。例えば異種遺伝子の読み取り枠の開始を制限酵素切断部位を含むよう変性することにより、調節配列を異種遺伝子配列に融合する。この切断部位は、かかる部位の配列はＡＴＧ翻訳開始コドンを含むが故に、ＮｃｏＩ部位または、ＮｃｏＩ部位との連結反応に適合する別の部位であるのが有利である。ｘａｎｔｈｉタバコを発芽１０日の段階で形質転換する本実施例には種々の遺伝子型を使用した。構築物を以下に記載する： -- ｐＰＨＩ３６２１（図４）＋ｐＰＨＩ１２８５（図６）［ＱＭ，トウモロコシセンス＋ＢＡＲ］ -- ｐＰＨＩ３６２２（図５）＋ｐＰＨＩ１２８５（図６）［ＱＭ，トウモロコシアンチセンス＋ＢＡＲ］ -- ｐＰＨＩ４７２２（図７）＋ｐＰＨＩ１２８５（図６）［ＱＭ，ヒトセンス＋ＢＡＲ］ -- ｐＰＨＩ４７２３（図８）＋ｐＰＨＩ１２８５（図６）［ＱＭ，ヒトセンス＋ＢＡＲ］ -- ｐＰＨＩ２６５＋ｐＰＨＩ１２８５［ＧＵＳ＋ＢＡＲ］ -- ｐＰＨＩ１２８５［ＢＡＲ］形質転換を行うため、粒子ガン打込みを使用した（ＧＥヘリウムガン及び６５０ＰＳＩ破裂ディスク）。１試料当たり１回、合計で０．１μｇの打込みを行った。２７２培地においてin vitroでタバコを発芽させ、１０〜１４日間観察してから、次のステップを実施した。実験の前日、子葉及び第一葉を半分に切り、１．５ｍｌの５３０培地＋０．２５Ｍソルビトールを含む無菌フィルター上に置き、暗所において２８℃で一晩インキュベートした。葉材は乾燥を防ぐために液体溶媒下で切断した。１プレート当たり８つの葉片を培養したが、５つのプレートはＱＭ形質転換によって作製し、３つのプレートは対照形質転換によって作製した。打込み後、全ての試料を元のフィルター上に２日間維持してから、選択培地に移した。４８時間後、組織を５２６＋Ｂａｓｔａ（５２６Ｈ）培地に移したが、葉組織はフィルター上に残した。打込み後２〜３週間でコロニーはほぼ回復した。４週間後、子葉／コロニーを５２８Ｓ培地に移した。形質転換コロニー由来の苗を基にあるカルスから切断し、２２７Ｎ培地に移して根を形成させた。根が十分に生えたら、植物を成熟のために温室に移した。結果は以下の通りであった：本実験の全てのＤＮＡ処理から１２６個のコロニーを回収した。各ＤＮＡ処理から１２個ずつランダムに抽出し、全部で５０個のコロニーにＰＣＲ分析を実施した。この分析で得られたデータを下記に示す。打込みの６週間後、成長速度に差が認められた。最も顕著なことは、ｐＰＨＩ３６２１／ｐＰＨＩ１２８５及びｐＰＨＩ３６２２／ｐＰＨＩ１２８５、特にＰＨＩ３６２２／ｐＰＨＩ１２８５を用いた形質転換体由来から回収されたコロニーが明らかなコロニー死を示したことである。対照であるｐＰＨＩ２６５／ｐＰＨＩ１２８５コロニーと比較したときに他の形質転換体においては成長に顕著な差は見られなかった。実施例７：センス及びアンチセンス配向及びＧＲＰ／ＧＲＥ誘導性遺伝子系におけるＱＭ遺伝子の作用及び発現を評価するための安定なＢＭＳ形質転換使用した遺伝子型はトウモロコシ懸濁液中のＢＭＳ−３８であった。ＤＮＡ構築物は、ｐＰＨＩ４７１９（図９）＋ｐＰＨＩ１２８５（図６）［３５Ｓ−ＱＭセンス＋３５Ｓ−ＢＡＲ］ｐＰＨＩ４７２０（図１０）＋ｐＰＨＩ１２８５（図６）［３５Ｓ−ＱＭアンチセンス＋３５Ｓ−ＢＡＲ］であった。粒子ガン打込みを使用した（ＧＥヘリウムガン及び６５０ＰＳＩ破裂ディスク）。１試料当たり１回の打込みを行った。培養の１日後、液体を細胞から吸い取り、２ｇの材料を２０ｍｌの２３７＋０．２５Ｍソルビトール培地に再浮遊させた。細胞を振盪装置上で２８℃で２〜４時間インキュベートした。０．５ｍｌの細胞を、１．５ｍｌの２３７＋０．２５Ｍソルビトール培地で湿らせた二層のＷｈａｔｍａｎフィルター上で平板培養した。１プレート当たりの細胞密度は約５０ｍｇであった。打込みしていない２つの対照試料を含み、各ＤＮＡ処理に対して６つの試料を作製した。打込み後、細胞を含むフィルターを１１５培地に移し、２８℃の暗所に４８時間戻した。４８時間後、細胞をフィルターから掻き取ることにより細胞を３６０Ｅ選択培地に移し、２ｍｌの２３７培地中に再浮遊させ、各試料について１プレート当たり１ｍｌに塗り広げた。コロニーの回復をモニターした。コロニーが同定された時点で他のものから分離し、独自性を維持した。トランスジェニックコロニーにおける遺伝子の存在をＰＣＴ分析により確認した後、誘導アッセイを実施することができる。この実施例においては全ての形質転換体からコロニーが回復したが、回復したものの大半はｐＰＨＩ１２８５陽性対照処理されたものに由来するものであった。コロニー回復についてのデータを下記に示す。ＱＭ遺伝子の３５Ｓセンス及びアンチセンスの両構築物がＢＭＳコロニー回復に対して毒性であった。実施例８：トウモロコシタペータム特異的プロモーターの形質転換への使用試験設計反復１、２及び５：目的：タペータム特異的なＳＧＢ６ｇ１プロモーターによってドライブされるＧＵＳを発現させる、Ｂａｓｔａ／Ｂｉａｌａｐｈｏｓに耐性であるトウモロコシのトランスジェニックコロニー、植物個体及び子孫の取得。遺伝子型：５４−６８−５Ｂ１−１（反復１）または５４−６８−５１６１Ｆ３（反復２）、５４−６８−５１６１Ｆ４（反復５）培地：２３７；トウモロコシ用液体懸濁培地１１５；トウモロコシ用カルス維持培地１１５Ｅ；５ｍｇ／ｌのＢａｓｔａを含有するカルス選択培地１１５Ｂ；３ｍｇ／ｌのＢｉａｌａｐｈｏｓを含有するカルス選択培地組織処理： ―細胞を継代培養から１日後に７１０μｍメッシュで篩い分ける ―２３７＋３％ＰＥＧ中に５０ｍｇ／ｍｌのプレート密度で再懸濁させる ―３％ＰＥＧ中で一晩インキュベートする ―１ｍｌの２３７＋３％ＰＥＧ培地で湿らせたＷｈａｔｍａｎフィルター上に重ねたガラスフィルター９３４ ―ＡＨ上に細胞を、プレート当たり０．５ｍｌの量で植え込む ―撃ち込み後、ガラスフィルター上の細胞を１１５培地に移すパーティクルガン撃ち込み：ＤｕＰｏｎｔヘリウムガン（反復１及び５）６５０ＰＳＩ破裂ディスク（反復１及び５）ＤｕＰｏｎｔＰＤＳ−１０００ガン（反復２）０．２３０″停止プレート、Ａｃｅｔｙｌマクロ発射体（反復２）１試料当たり１回の撃ち込み（反復１及び５）１試料当たり２回の撃ち込み（反復２）Ｐｉｏｎｅｅｒタングステン改良型ＤＮＡプロトコール、各ガンに特定的ＤＮＡ：ｐＰＨＩ６８７（図１１）＋ｐＰＨＩ６１０（図１２）ｐＰＨＩ４６０（図１３）＋ｐＰＨＩ６１０（図１２）ｐＰＨＩ１９５２（図１４）＋ｐＰＨＩ６１０（図１２）ｐＰＨＩ２１２５（図１５）＋ｐＰＨＩ６１０（図１２）撃ち込み後の処理／アッセイ： ―撃ち込みから２４〜４８時間後にＲ遺伝子発現を探す ―撃ち込みから４８時間後に試料を１１５Ｅ（反復１）に移す。撃ち込みから７日後に試料を１１５Ｂ（反復２及び５）に移す ―選択培地への移転から２週間後に細胞をフィルターから離す ―植物再生前のリポーター遺伝子に関してコロニーをＰＣＲアッセイする ―試料を暗所で２８℃に維持する反復１：５ｍｇ／ｌＢａｓｔａ選択培地上で回収した十六の独立コロニーについてＰＣＲアッセイを遂行した。＃９プレート１ＣＺ、ｐＰＨＩ６１０＋ｐＰＨＩ２１２５の一つのコロニーはＧＵＳ（ｐＰＨＩ２１２５）に関してＰＣＲ陽性であった。いずれのコロニーもタイプＩ表現型であったが、選択しなかった陽性対照もタイプＩ表現型となった。この表現型は５４−６８−５Ｂ１−１系に共通する傾向を有する。５ｍｇ／ｌＢａｓｔａ選択から１２週間後に総てのＰＣＲ陰性コロニーを、残存する総ての非胚発生組織と共に廃棄した。試料＃９プレート１由来のコロニー２は２８８Ｅ（再生培地＋５ｍｇ／ｌＢａｓｔａ）に移した。八つのコロニーが残り、これらをＧＵＳ遺伝子の存在に関してＰＣＲアッセイした。これら八つのコロニーのうちの三つは、翻訳融合部（ｐＰＨＩ２１２５）由来のＧＵＳまたは転写融合部（ｐＰＨＩ１９５２）由来のＧＵＳに関して陽性であった。反復５：３ｍｇ／ｌＢｉａｌａｐｈｏｓ選択培地上で回収した九つの独立コロニーについてＰＣＲアッセイを遂行した。総てのコロニーが、ｐＰＨＩ２１２５またはｐＰＨＩ１９５２の存在を示すＧＵＳ遺伝子に関してＰＣＲ陽性であった。この実験で用いた遺伝子対照（ｐＰＨＩ４６０）は、いずれもＧＵＳ細胞化学アッセイにおいて青く染まる領域を有する９個の安定な形質転換体をもたらした。増殖は遺伝子対照の方が、ＳＧＢ６ｇ１：ＧＵＳ構築物から回収されたトランスジェニックよりはるかに急速であった。選択下に１２週間経過後、急速に増殖した胚発生コロニーのみを維持し、他の物質は総て廃棄した。ＰＣＲ陽性を試験するコロニーを、植物再生のための再生培地に移した。これらのコロニーの一部にいついてＢａｓｔａ酵素アッセイを遂行した。得られた結果は、Ｂａｓｔａに対する耐性を示す高度のトランスジェニック活性を示唆しない。以前の研究、及びこのアッセイについての他の研究者の経験から、形質転換をより正確に測定することによって、回収したコロニーの細胞形態変化が非選択対照のものに近似するかどうかが決定され、また回収コロニーが示す増殖速度の比較が行なわれている。実施例９：トウモロコシＱＭ遺伝子を有するプラスミドの構築センス配向のＱＭ遺伝子を発現するプラスミドｐＰＨＩ３６２１（図４）を、一方の親としてｐＰＨＩ１５２７を用いて構築した。ｐＰＨＩ１５２７（図１６）はバックボーンとしてプラスミドｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等，１９８５）を有し、このプラスミドはクローン化に必要な制限部位、及び選択可能なマーカーとしてのアンピシリン耐性遺伝子を有する。このプラスミドはまた、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター及びエンハンサー配列（Ｇａｒｄｎｅｒ等，１９８１）、タバコモザイクウイルス先導配列、Ｏ′（Ｇａｌｌｉｅ等，１９８７）、ホタルルシフェラーゼリポーター遺伝子（Ｏｗ等，１９８６）及びＰｉｎII転写終結配列（Ｈｙｎｈｅｕｎｇ等，１９８９）も有する。ｐＰＨＩ３６２１の第二の親は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ中に配置されたトウモロコシＱＭ遺伝子を有するｐＰＨＩ３６２０（図１７）とした。ｐＰＨＩ３６２０及びｐＰＨＩ１５２７を両方ともＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、低融点（ＬＭＰ）アガロースゲル上の、ｐＰＨＩ３６２０由来の挿入部のバンド及びｐＰＨＩ１５２７由来のより大きいプラスミドのバンドを単離することによってｐＰＨＩ３６２１を調製した。この操作ではルシフェラーゼ遺伝子をトウモロコシＱＭ遺伝子で置換した。上記バンドをプールし、断片同士を連結してｐＰＨＩ３６２１を構築した。トウモロコシＱＭ遺伝子のアンチセンスを発現するｐＰＨＩ３６２２（図５）も、親としてｐＰＨＩ１５２７及びｐＰＨＩ３６２０を用いて、ただし前記両親の消化はＳａｌＩ及びＳａｃＩで行なって構築した。ＬＭＰアガロースゲルからｐＰＨＩ３６２０由来の挿入部のバンド及びｐＰＨＩ１５２７由来のより大きいプラスミドのバンドを単離し、断片をプールし、かつ連結した。この操作でもルシフェラーゼ遺伝子を、アンチセンス配向のトウモロコシＱＭ遺伝子で置換した。組織特異的発現ベクターを上記と同様に、ただしＣａＭＶ構成性プロモーターをＴＡ３９葯特異的プロモーター１４Ｂ１及び８Ｂ３（Ｇａｒｎａａｔ等，１９９１）に替えて構築した。１４Ｂ１プロモーターを有するｐＰＨＩ１４９３（図１８）をＮｃｏＩ及びＮｓｉＩで、ｐＰＨＩ３６２１（親２）と同様に消化した。ｐＰＨＩ３６２１由来の小さい挿入部のバンドと、より大きいプラスミドのバンドとをＬＭＰアガロースゲル電気泳動によって単離してプールし、断片同士を連結した。それによって、センス配向のトウモロコシＱＭ遺伝子を１４Ｂ１プロモーターと共に有するｐＰＨＩ４７４５（図１９）を得た。ｐＰＨＩ４７４５をＳｍａＩ及びＮｓｉＩで消化し、ｐＰＨＩ３６２２をＳａｌＩ（クレノウフラグメントで満たされたもの）及びＮｓｉＩで消化することによって、トウモロコシＱＭアンチセンス構築物を調製した。ｐＰＨＩ４７４５由来の大型プラスミドのバンド、及びｐＰＨＩ３６２２由来の挿入部のバンドをＬＭＰゲルによって単離してプールし、断片同士を連結した。それによってプラスミドＬ６２（ＴＡ３９１４Ｂ１）を得た（図２０）。８Ｂ３葯特異的プロモーターを有する発現ベクターを、ｐＰＨＩ４８５５（図２１）をＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化することによって構築した。ｐＰＨＩ４８５５は上述の配列の総てを、β−グルクロニダーゼ遺伝子をコードする付加的配列（Ｗａｌｄｅｎ及びＳｃｈｅｌｌ，１９９０）と共に有した。他方の親ｐＰＨＩ４７４５もＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化した。ｐＰＨＩ４８５５由来の大型プラスミドのバンド、及びｐＰＨＩ４７４５由来の挿入部のバンドをＬＭＰアガロースから精製してプールし、断片同士を連結した。得られたプラスミドＬ５９（図２２）は、葯特異的プロモーター８Ｂ３によってドライブされるセンス配向のトウモロコシＱＭを有した。ｐＰＨＩ４８５５をＳｍａＩ及びＮｓｉＩで消化し、ｐＰＨＩ３６２２をＳａｌＩ（クレノウフラグメントで満たされたもの）及びＮｓｉＩで消化することによってアンチセンス構築物を調製した。ｐＰＨＩ４８５５由来の大型プラスミドのバンド、及びｐＰＨＩ３６２２由来の挿入部のバンドをＬＭＰアガロースゲルから単離してプールし、断片同士を連結した。それによってＬ６１（図２３）を得、その際トウモロコシＱＭ遺伝子のアンチセンス配向は８Ｂ３プロモーターの制御下に有った。実施例１０：センス及びアンチセンスＱＭ遺伝子での形質転換による雄性不稔性タバコ植物の作製タバコ葉外植体に、３５Ｓ：：ＢＡＲ（ｐＰＨＩ１２８５）と次のプラスミドのうちの一つとを共に撃ち込んだ。Ｌ５９：ＴＡ３９（８Ｂ３）：ＱＭＬ６１：ＴＡ３９（８Ｂ３）：アンチセンスＱＭＬ６２：ＴＡ３９（１４Ｂ１）：アンチセンスＱＭ４７４５：ＴＡ３９（１４Ｂ１）：ＱＭタバコ葉外植体への撃ち込みにはＢｉｏＲａｄヘリウムバイオリスティックス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）ガン（ＤｕＰｏｎｔ）を用いた。ＢＡＲ遺伝子は、いずれの細胞がプラスミドを受容したかを決定するための選択可能マーカーとして用いた。上記４種のプラスミドのいずれにもタバコ葯プロモーター（ＴＡ３９）を用いた。これはタペータム特異的プロモーターである。“８Ｂ３”及び“１４Ｂ１” はＴＡ３９の隔離集団であった。Ｌ５９プラスミド（図２２）はＬ６１プラスミド（図２３）と、Ｌ５９プラスミドがトウモロコシ由来のＱＭセンス遺伝子を有し、Ｌ６１プラスミドはトウモロコシＱＭ遺伝子に対するアンチセンス遺伝子を有する点以外同等である。Ｌ６２プラスミド（図２０）はｐＰＨＩ４７４５遺伝子と、ｐＰＨＩ４７４５プラスミドがトウモロコシ由来のＱＭセンス遺伝子を有し、Ｌ６２プラスミドはトウモロコシＱＭ遺伝子に対するアンチセンス遺伝子を有する点以外同等である。外植体の、ＢＡＲ遺伝子の組み込みを示した部分において葉の打ち抜き片を製造した。当業者に良く知られているポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、タバコ細胞に組み込まれたトウモロコシＱＭ遺伝子を増幅した。Ｂｉａｌｏｐｈｏｓ耐性カルスからＰＣＲ⁺細胞を選択し、この細胞を用いてタバコ植物を再生させた（実施例１参照）。再生植物の稔性を、１）花粉放出、及び自家受精能力を調べることによって決定した。後段に示す雄性不稔性植物のいずれにおいても、上記両基準を満足した。明らかに、雄性不稔性植物はＬ６２で形質転換した細胞及びｐＰＨＩ４７４５で形質転換した細胞に由来した。Ｌ５９で形質転換した細胞からはタバコ植物は発生せず、Ｌ６１で形質転換した植物は２本のみが発生した。これら２種のプラスミドに関連する雄性稔性植物の不在は、撃ち込みの成功頻度が低いことに起因する実験の失敗によって説明できる。雄性不稔性タバコ植物は、トウモロコシＱＭ遺伝子と、トウモロコシＱＭ遺伝子に対するアンチセンスとの両方の存在に関連した。これについては、正常な発生にはＱＭ遺伝子発現のバランスが必要であるということで説明が着こう。酵母では、ＱＭバランスは正常な発現に必須であると考えられる。トウモロコシＱＭ遺伝子の存在下にＱＭ発現が過剰に生起する恐れが有り、トウモロコシ遺伝子由来の発現産物はタバコ細胞内では破壊的な突然変異体となりかねず、あるいはまたトウモロコシＱＭ遺伝子は発生の不適当な時点に発現しかねない。トウモロコシＱＭアンチセンス遺伝子産物は、タバコＱＭ遺伝子に結合してこの遺伝子を発生の決定的時点に無効とする恐れが有る。タバコ及びトウモロコシ遺伝子のＱＭヌクレオチド配列の解析は、一方の遺伝子に対するアンチセンス産物が他方の遺伝子とも結合し得るという十分な相同性が存在し得ることを示唆している。材料及び方法センス配向のＱＭ遺伝子の使用：トウモロコシまたは他の植物ソースから単離したＱＭ遺伝子のヌクレオチド断片をその上流側（５′）末端において、特定の標的植物細胞におけるセンス鎖の発現を可能にするプロモーターと融合させ、またその下流側（３′）末端では、前記細胞において機能することが知られている適当な転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルと融合させる。好ましいプロモーターには、きわめて様々な種類の植物細胞における発現を導くことが知られているＣａＭＶ由来の３５Ｓなどの“構成性”プロモーター及びユビキチン遺伝子由来のプロモーターを含めた、所望の標的細胞における発現を導くことが知られているプロモーターが含まれる。３５Ｓはトウモロコシなどの単子葉類における発現も、タバコ及びｃａｎｏｌａなどの双子葉類における発現も導くと考えられる。しかし、タバコのためのユビキチンプロモーターは好ましくは双子葉類ソースに由来する。トウモロコシなどの単子葉類に用いるユビキチンプロモーターは、好ましくは単子葉類ソースに由来する。他の適当なプロモーターには、特定の化学的処理、例えば除草剤に応答するなどの特定条件下に誘導され得ることが知られているものが含まれる。ターミネーター／ポリアデニル化シグナルには、重要な標的細胞において機能することが知られているものが含まれる。好ましいのは、双子葉類及びトウモロコシなどの単子葉類のものを含めたきわめて様々な種類の植物細胞において機能することが知られている、ＰｉｎII（ジャガイモ由来のプロテイナーゼインヒビターII）などの遺伝子またはＯＣＳやＮＯＳといったＴ− ＤＮＡ遺伝子に由来するシグナルである。標的細胞がトウモロコシなどの単子葉類に由来する場合はプロモーターとＱＭ遺伝子との間に単子葉類遺伝子由来のイントロンを挿入することが好ましいが、これは必須ではない。イントロンは、例えばトウモロコシのＡｄｈ１遺伝子由来のイントロン（イントロン１または６など）とする。具体的な一例では、ＱＭ遺伝子のヌクレオチド断片をその上流側（５′）末端において、花粉の発生にとって重要である組織もしくは細胞に対して特異的であること、またはそのような組織もしくは細胞においてきわめて優先的に発現することが知られているプロモーターと融合させる。上記のような組織の一例に葯が有る。適当な細胞は、例えばタペート細胞や発生中の小胞子などである。上記断片の下流側（３′）末端は、やはり上記のような細胞において機能することが知られている適当な転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルと融合させる。好ましいプロモーターは、トウモロコシのためにはＳＧＢ６、双子葉類のためにはＴＡ３９（タバコ由来）、及びクローンＬ４のプロモーターＢｐ４Ａ（Ｂ．ｎａｐｕｓ由来；国際特許出願公開第９０／０８８２８号）である。アンチセンス配向のＱＭ遺伝子の使用：ＱＭ遺伝子のアンチセンス形態をその上流側（５′）末端において、特定の標的細胞における発現を導くプロモーターと融合させ、またその下流側（３′）末端では、やはり前記細胞において機能することが知られている適当な転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルと融合させる。この場合の標的細胞の一例に、ＱＭ遺伝子、またはＱＭ遺伝子と高度に相同である遺伝子が発現し、従ってアンチセンスが有効に機能することが知られている細胞が有る。好ましいプロモーターは、所望の標的細胞における発現を導くことが知られているプロモーターを包含し、適当な候補には、きわめて様々な種類の植物細胞における発現を導くことが知られている、ＣａＭＶ由来の３５Ｓなどの“構成性”プロモーター及びユビキチン遺伝子由来のプロモーターが含まれる。３５Ｓはトウモロコシなどの単子葉類における発現も、タバコ及びｃａｎｏｌａなどの双子葉類における発現も導くと考えられる。しかし、タバコのためのユビキチンプロモーターは好ましくは双子葉類ソースに由来し、トウモロコシなどの単子葉類に用いるユビキチンプロモーターは、好ましくは単子葉類ソースに由来する。他の好ましいプロモーターには、特定の化学的処理、例えば除草剤に応答するなどの特定条件下に誘導され得ることが知られているものが含まれる。アンチセンス構築物はＱＭ遺伝子の全体を含むか、または該遺伝子の５′末端からの少なくとも数百ヌクレオチドを含むことが好ましい。ＱＭ遺伝子のアンチセンス形態のヌクレオチド断片をその上流側（５′）末端において、花粉の発生にとって重要である組織もしくは細胞に対して特異的であること、またはそのような組織もしくは細胞においてきわめて優先的に発現することが知られているプロモーターと融合させる。適当な組織の一例に葯が有る。適当な細胞は、例えばタペート細胞や発生中の小胞子などである。上記断片の下流側（３′）末端は、やはり上記のような細胞もしくは組織において機能することが知られている適当な転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルと融合させる。標的細胞は、ＱＭ遺伝子、またはＱＭ遺伝子と高度に相同である遺伝子が発現し、従ってアンチセンスが有効に機能することが知られている細胞とする。形質転換法：双子葉類のための形質転換法には、ＤＮＡを直接送り込む幾つかの異なる公知方法が含まれる。好ましいのは、葉外植体への粒子バイオリスティックス撃ち込みである。他の方法に、外植体へのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ送達；プロトプラストのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ共培養（ｃｏｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）；エレクトロポレーション；ＰＥＧ取り込み、またはＤＮＡをプロトプラストへ直接送達する他の方法等が含まれる。トウモロコシなどの単子葉類にとって好ましい方法は、処理した細胞へＤＮＡを撃ち込みによって送達するものであるが、エレクトロポレーションなど他の方法を用いることも可能である。植物の細胞は、本発明の異種ＤＮＡ配列で通常のように形質転換される。形質転換するべき植物にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染の疑いが有る場合、無毒化したＴｉプラスミドである、異種ＤＮＡ配列を有するベクターを用いることが好ましい。形質転換は、例えばヨーロッパ特許第０１１６７１８号及び同第０２７０８２２号に記載されている操作を用いて行ない得る。好ましいＴｉプラスミドベクターは異種ＤＮＡ配列をボーダー配列間に、または少なくとも右側のボーダー配列の上流に有する。直接遺伝子移入（例えばヨーロッパ特許第０２３７３５６号、国際特許出願公開第８５／０１８５６号及びヨーロッパ特許第０２７５０６９号参照）；例えば米国特許第４，６８４，６１１号に開示されているｉｎｖｉｔｒｏプロトプラスト形質転換；例えばヨーロッパ特許第００６７５５３号及び米国特許第４，４０７，９５６号に教示されている植物ウイルス媒介形質転換；並びに、特に米国特許第４，５３６，４７５号に開示されているリポソーム媒介形質転換などの操作を用いれば、植物細胞の形質転換に上記以外のベクターを用いることが可能である。形質転換するべき植物がトウモロコシである場合、Ｆｒｏｍｍ等，１９９０及びＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ等，１９９０がトウモロコシの幾つかの系統について述べている方法などの、最近開発された形質転換方法が適当である。形質転換するべき植物がイネである場合は、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ等，１９９０、Ｄａｔｔａ等，１９９０、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ等，１９９１及びＬｅｅ等，１９９１がイネの幾つかの系統について述べている方法などの、最近開発された形質転換方法を用い得る。形質転換するべき植物がコムギである場合は、トウモロコシやイネに関する上記方法に類似の方法を用い得る。単子葉植物、特にイネ、トウモロコシまたはコムギといった穀類の形質転換には好ましくは、バイオリスティック形質転換法やエレクトロポレーションなどの直接ＤＮＡ移入法を用いる。このような直接移入法を用いる場合、移入するＤＮＡを、実質的に本発明のＤＮＡ配列、すなわちＱＭトウモロコシ遺伝子及び関連する調節領域のみが植物ゲノムに組み込まれるように最小限に留めることが好ましい。このような観点から、本発明のＤＮＡ配列を細菌性宿主生物のプラスミド中に構築し、かつ増幅させるのであれば、植物をＤＮＡ配列で形質転換する前に、複製起点の配列、宿主生物選択のための抗生物質耐性遺伝子等といった、細菌性宿主生物への導入に必要なプラスミド配列を、プラスミドの異種ＤＮＡ配列保有部分から分離することが好ましい。ＤｕＰｏｎｔヘリウムガンのためのタングステン／ＤＮＡプロトコル（粒子バイオリスティック撃ち込み形質転換法）６０ｍｇの１．８μｍタングステンを計量して１５ｍｌ容の遠心管に入れ、２ｍｌの０．１ＭＨＮＯ₃を添加し、氷上で２０分間音波処理し、ＨＮＯ₃を廃棄し、１ｍｌの滅菌脱イオン水を添加して試料を２ｍｌ容のＳａｒｓｔｅｄｔ管に移す。手短に音波処理し、遠心して粒子状とし、Ｈ₂Ｏを廃棄し、１ｍｌの１００％ＥｔＯＨを添加−手短に音波処理し、遠心して粒子状とし、Ｈ₂Ｏを廃棄し、１ｍｌの１００％ＥｔＯＨを添加−手短に音波処理し、遠心して粒子状とし、ＥｔＯＨを廃棄する。１ｍｌの滅菌脱イオン水を添加する。音波処理する。２５０μｌの懸濁液をピペットで４ｍｌ容、２ｍｌ容の管に移す。各管に７５０μｌの滅菌脱イオンＨ₂Ｏを添加する。タングステン試料を使用の間凍結する。５０μｌのタングステン／Ｈ₂Ｏ懸濁液をピペットで１．５ｍｌ容の管に移し（最初に音波処理）、１０μｇのＤＮＡを添加し、混合し、５０μ１の２．５ＭＣａＣｌ₂を添加し、混合し、２０μｌの０．１Ｍスペルミジンを添加する。混合し、手短に音波処理する。１０，０００ｒｐｍで１０秒間遠心する。上清を廃棄する。２５０μｌの１００％ＥｔＯＨを添加する。手短に音波処理する。１０，０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、上清を廃棄する。６０μｌの１００％ＥｔＯＨを添加する。安定な遺伝子導入植物を回復するためのトウモロコシの形質転換用プロトコル１日目細胞を液体培地に入れ、篩分する（710μm）。細胞100〜200mgを3.5cm の領域上の5.5cmガラス繊維フィルター上で捕集する。細胞を培地に移し、一晩インキュベートする。３日目フィルター及び細胞を培地から除去し、乾燥して、衝撃を与える。フィルター及び細胞を培地に戻す。５日目フィルター上の細胞を選択培地（３mgのBialophos）に移す。 12日目フィルター上の細胞を新鮮な選択培地に移す。 19日目細胞をフィルターからかきだし、8.6％低融点寒天を含む選択培地５ml 中に分散する。細胞及び培地をgel-rite固化培地20mlを含む２個の100mm×15mm プレートの表面上にひろげる。 40日目推定形質転換細胞をプレートから取り出す。 61日目プレートを新規なコロニーについて検査する。ＲＮＡ分析： Chomczynski及びSacchi（1987）のプロトコルに従って植えてから７日後に、Ｂ７３苗木から全細胞性ＲＮＡを調製した。PolyAtract 1000系（Promega）を用いて葉のホモジネートからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。先に記載したノーザン法（Thomas，1980）を実施した。側面に位置する領域のキャラクタリゼーション McKnight法（1982）に従うＲＮＡ５′末端のプライマー延長マッピング。プライマー延長反応に用いたオリゴヌクレオチドは、５′であり、ぞれぞれ、開始コドンの最後のヌクレオチドから31ヌクレオチドまで及び開始コドンの下流の79から122までのヌクレオチドのＴＡ39ｃＤＮＡとの相同性を有する標識32マー及び44マーであった。Chomcynski及びSacchi（1987）のグイニジナムイソチオシアネート（guinid inum isothiocyanate）法を用いてタバコのヤクからＲＮＡを分離し、オリゴｄＴカラムを用いて精製した。プラスミド特定部位の突然変異誘発（Su及びE1-Gewely，1988）を用いて、オリゴヌクレオチド５′ＣＴＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＴＣＴＴＧＣ３′に関しては開始コドンにあるＮｃｏＩ部位を、またオリゴヌクレオチド５′ＧＴＴＴＡＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＴＡＴＣ３ ′に関しては推定転写開始の下流にあるＰｓｔＩ部位５塩基を形成した。ｕｉｄＡリポーターの構築物には、ジャガイモ（ＰＩ−II）のプロテアーゼ阻害遺伝子由来の３′転写処理シグナルを用いてＮｃｏＩ部位で５′ｆｌａｎｋｉｎｇ領域をｕｉｄＡ解読わくと融合させるか、又は５′ｆｌａｎｋｉｎｇ領域をＰｓｔＩ部位でＴＷＶ非翻訳リーダーΩ′、ｕｉｄＡ解読わく及びＰＩ−IIと融合させた。Ω′を含むｕｉｄＡリポーター構築物をＴｉバイナリーベクターｐＡＬＬＴＫＲｅｐに挿入した。ｐＡＬＬＴＫＲｅｐは、ＣａＭＣ３５Ｓプロモーターがノパリン（ｎｏｐａｌｉｎ）シンターゼプロモーターの代わりにＮＰＴＩＩ選択マーカーを動かすという点で、ｐＢＩ１０１．１とは異なっている。トマトの花粉特異的プロモーター及びｕｉｄＡリポーター遺伝子を含むプラスミドｐＬＡＴ５２−７は、カリフォルニア州アルバニーに所在するUSDA-ARS Plant Gene Expression CenterのDr．Sheila McCormickが親切にも提供してくれたものであった。ＬＡＴ５２又はＴＡ３９ゲノムクローンの５′側面領域をＮｃｏＩ部位でＰＩ −II３′を含むホタルのルシフェラーゼ遺伝子と融合させることによりｌｃｆリポータープラスミドを形成した。引用文献以下に列記した参考文献は、それらが本明細書中に記載されている方法、技術又は組成物を補足、説明し、その背景を提供するか又はそれらを教示する範囲で参考として本明細書に含まれている。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９４年１０月４日【補正内容】請求の範囲１．図１に記載のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡ。２．請求項１に記載のｃＤＮＡによりコードされるタンパク質。３．前記タンパク質がさらに図２に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。４．請求項１に記載のｃＤＮＡと、操作可能に結合し且つ活性であるときには植物細胞中の前記ＤＮＡの転写を調節し得るプロモーターとを含む組換え体ＤＮＡ分子。５．プロモーターがＱＭトウモロコシプロモーターである請求項４に記載の組換え体ＤＮＡ分子。６．プロモーターが組織特異的プロモーターである請求項４に記載の組換え体ＤＮＡ分子。７．プロモーターが細胞特異的プロモーターである請求項４に記載の組換え体ＤＮＡ分子。８．組織又は細胞が花粉の産生に極めて重要である請求項６又は７に記載の組換え体ＤＮＡ分子。９．組織がヤクの組織である請求項８に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１０．前記細胞特異的プロモーターがタペート細胞において発現する請求項７に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１１．プロモーターがｃＤＮＡの過剰発現を引き起こす請求項４に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１２．プロモーターが誘発性プロモーターである請求項４に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１３．そのＲＮＡ転写物が請求項１に記載のｃＤＮＡの転写物との相補性を有する単離ＤＮＡ分子。１４．植物発生タンパク質をコードし、緊縮条件下に哺乳類のＱＭ遺伝子とハイブリダイズする組換え体ポリヌクレオチド配列を用いて植物細胞を形質転換することを含む雄性の不稔性植物を生産する方法。１５．植物発生タンパク質をコードし、緊縮条件下に哺乳類のＱＭ遺伝子とハイブリダイズする組換え体ポリヌクレオチド配列を用いて植物を形質転換することを含む植物の正常な発生を変化させる方法。１６．植物発生タンパク質をコードし、緊縮条件下に哺乳類のＱＭ遺伝子とハイブリダイズする組換え体ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子導入植物。１７．植物におけるＱＭ遺伝子の発現を調節する、トウモロコシから分離されたプロモーター。１８．図３に記載のヌクレオチド配列による請求項１７に記載のプロモーター。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年３月２７日【補正内容】請求の範囲１．図１に記載のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡ。２．第１の保存領域がタンパク質のアミノ末端から最初の10個のアミノ酸残基を含み、第２の保存領域が約51〜60位のアミノ酸残基を含み、前記配列が両親媒性ヘリックスを形成し、第３の保存領域が98〜135位のアミノ酸残基を含む請求項１に記載のｃＤＮＡによりコードされるタンパク質。３．さらに図２に記載のアミノ酸配列を特徴とするように定義される請求項２に記載のタンパク質。４．請求項１に記載のｃＤＮＡと、操作可能に結合し且つ活性であるときには植物細胞中の前記ＤＮＡの転写を調節し得るプロモーターとを含む組換え体ＤＮＡ分子。５．プロモーターが組織特異的プロモーターである請求項４に記載の組換え体ＤＮＡ分子。６．プロモーターが細胞特異的プロモーターである請求項４に記載の組換え体ＤＮＡ分子。７．組織又は細胞が花粉の産生に極めて重要である請求項５又は６に記載の組換え体ＤＮＡ分子。８．組織がヤクの組織である請求項７に記載の組換え体ＤＮＡ分子。９．前記細胞特異的プロモーターがタペート細胞中において発現する請求項６に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１０．プロモーターがｃＤＮＡの過剰発現を引き起こす請求項４に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１１．プロモーターが誘発性プロモーターである請求項４に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１２．そのＲＮＡ転写物が請求項１に記載のｃＤＮＡの転写物と相補的である単離ＤＮＡ分子。１３雄性の不稔性植物を生産する方法であって、哺乳類のＱＭタンパク質との比較において保存された領域を含み、ＱＭタンパク質をコードする哺乳類のポリヌクレオチド分子と高緊縮条件下にハイブリダイズし且つＱＭタンパク質をコードするトウモロコシのポリヌクレオチド分子と低緊縮条件下にハイブリダイズして前記植物細胞から植物を再生させる植物発生タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド分子を含む組換え体分子を用いて植物細胞を形質転換することを含む方法。１４．植物の正常な発生を変化させる方法であって、哺乳類のＱＭタンパク質との比較において保存された領域を含み、ＱＭタンパク質をコードする哺乳類のポリヌクレオチド分子と高緊縮条件下にハイブリダイズし且つＱＭタンパク質をコードするトウモロコシのポリヌクレオチド分子と低緊縮条件下にハイブリダイズして前記植物細胞から植物を再生させる植物発生タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド分子を含む組換え体分子を用いて植物を形質転換することを含む方法。１５．哺乳類のＱＭタンパク質との比較において植物発生タンパク質をコードし、ＱＭタンパク質をコードする哺乳類のポリヌクレオチド分子と高緊縮条件下にハイブリダイズし且つＱＭタンパク質をコードするトウモロコシのポリヌクレオチド分子と低緊縮条件下にハイブリダイズして植物細胞から植物を再生させる単離ポリヌクレオチド分子を含む組換え体分子を含む遺伝子導入植物。１６．図３に記載のヌクレオチド配列によるプロモーター。１７．組換え体ポリヌクレオチド配列がトウモロコシのＱＭ遺伝子配列である請求項１３に記載の雄性の不稔性植物を生産する方法。１８．ポリヌクレオチド分子が請求項１に記載のｃＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項１３に記載の雄性の不稔性植物を生産する方法。１９．組換え体ポリヌクレオチド分子が請求項４から１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子である請求項１３に記載の雄性の不稔性植物を生産する方法。２０．組換え体分子が請求項４に記載のものである請求項１４に記載の植物の正常な発生を変化させる方法。２１．植物細胞がトウモロコシの植物細胞ではない請求項１３又は１４に記載の方法。２２．植物細胞がタバコの細胞である請求項２１に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ピアス，ドロシー・エイアメリカ合衆国、アイオワ・50322、アーバンデイル、ハモンツリー・アベニユー・ 9124 (72)発明者ギガン，アンドリユー・エムアメリカ合衆国、アイオワ・50021、デス・モイネス、ノース・ウエスト・シツクステイエイス・アベニユー・875

Claims

【特許請求の範囲】１．植物中の発生タンパク質をコードし且つ哺乳類のＱＭ遺伝子とハイブリダイズし得る単離ポリヌクレオチド分子。２．哺乳類のＱＭタンパク質と相同性を有するポリペプチド用の単一の解読わくを含む実質的に800〜950のヌクレオチドからなるｃＤＮＡ。３．前記解読わくが、それぞれ哺乳類のＱＭ遺伝子の特徴を示す対応領域との高度の相同性を示す三つのコード領域を含む請求項２に記載のｃＤＮＡ。４．前記ポリペプチドが哺乳類のＱＭタンパク質と少なくとも50％の相同性を示す請求項２に記載のｃＤＮＡ。５．前記保存領域が、前記ｃＤＮＡのＮ末端に関して、それぞれ30〜100、210〜 250及び330〜400位のヌクレオチド配列を含む請求項３に記載のｃＤＮＡ。６．前記ヌクレオチドの配列が図１に記載のものである請求項２に記載のｃＤＮＡ。７．約25kDの予想分子量を有する単離且つ精製されたタンパク質、ヒトのＱＭタンパク質のアミノ酸配列との相同性を有するアミノ酸配列、第１、第２及び第３の保存アミノ酸配列領域及び約11.0のＰＩ。８．第１の保存領域がアミノ末端の最初の10個のアミノ酸を含む配列であり、第２の保存領域が約51〜60個の残基を含むアミノ酸配列であり、前記配列が両親媒性ヘリックスを形成し、且つ第３の領域が98〜135個の残基を含む請求項７に記載のタンパク質。９．さらに図２に記載のアミノ酸配列を特徴とするように定義される請求項７に記載のタンパク質。１０．請求項２のｃＤＮＡ及び植物細胞中で前記ＤＮＡの転写を調節し得るプロモーターを含む組換え体ＤＮＡ分子。１１．プロモーターが組織特異的プロモーターである請求項１０に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１２．プロモーターがＱＭトウモロコシプロモーターである請求項１１に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１３．プロモーターが細胞特異的プロモーターである請求項１０に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１４．組織又は細胞が花粉の産生に極めて重要である請求項１１又は１２に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１５．組織がヤクの組織である請求項１１に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１６．前記細胞特異的プロモーターがタペート細胞において発現する請求項１２に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１７．プロモーターがｃＤＮＡの過剰発現を引き起こす請求項１０に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１８．プロモーターが誘発性プロモーターである請求項１０に記載の組換え体ＤＮＡ分子。１９．そのＲＮＡ転写物が請求項２に記載のｃＤＮＡの転写物との相補性を有する単離ＤＮＡ分子。２０．請求項１０に記載の組換え体分子を用いて植物細胞を形質転換することを含む雄性の不稔性植物を生産する方法。２１．請求項１０に記載の組換え体分子を用いて植物を形質転換することを含む植物の正常な発生を変化させる方法。２２．請求項１０に記載の組換え体分子を含む遺伝子導入植物。２３．植物中でＱＭ遺伝子の発現を調節する、トウモロコシから分離されたプロモーター。２４．図３のヌクレオチド配列による請求項２３に記載のプロモーター。