RU2737538C2 - Инсектицидные полипептиды, обладающие улучшенным спектром активности, и их применения - Google Patents
Инсектицидные полипептиды, обладающие улучшенным спектром активности, и их применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2737538C2 RU2737538C2 RU2017116796A RU2017116796A RU2737538C2 RU 2737538 C2 RU2737538 C2 RU 2737538C2 RU 2017116796 A RU2017116796 A RU 2017116796A RU 2017116796 A RU2017116796 A RU 2017116796A RU 2737538 C2 RU2737538 C2 RU 2737538C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- amino acid
- acid substitution
- seq
- specified amino
- specified
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 223
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 211
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 204
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 77
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 35
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title description 41
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 title description 12
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 92
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims abstract description 85
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 63
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 63
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 55
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 263
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 221
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 214
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 145
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 87
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 78
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 77
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 64
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 44
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 36
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 29
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 24
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 24
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 18
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 claims description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 15
- 241000400808 Herpetogramma phaeopteralis Species 0.000 claims description 14
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 14
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 14
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims description 12
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 11
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 10
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 10
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 10
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 9
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 9
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 claims description 8
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 8
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 8
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 6
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 6
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 claims description 6
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 5
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 4
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 claims description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 2
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 claims description 2
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 2
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims 48
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims 47
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims 43
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims 37
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims 35
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims 34
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims 32
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims 31
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 claims 30
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims 24
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims 21
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 claims 8
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 claims 7
- 241000214558 Nemapogon granella Species 0.000 claims 3
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 claims 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 claims 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 claims 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 claims 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 claims 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 27
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 10
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 abstract description 5
- 241000403247 Cerapteryx graminis Species 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 301
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 211
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 209
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 160
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 101
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 99
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 99
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 66
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 52
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 51
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 51
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 47
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 47
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 40
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 36
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 36
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 36
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 25
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 24
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 23
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 22
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 20
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 20
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 19
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 19
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 18
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 18
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 18
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 17
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- -1 s Species 0.000 description 17
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 14
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 14
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 13
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 12
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 12
- 241000254171 Curculionidae Species 0.000 description 11
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 10
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 9
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 9
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 8
- 241001012098 Omiodes indicata Species 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 241000209134 Arundinaria Species 0.000 description 7
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 7
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 7
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 7
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 7
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 7
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 241001414720 Cicadellidae Species 0.000 description 6
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 6
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 6
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 5
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 5
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 5
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 5
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 5
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 5
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 5
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 5
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 5
- 102220633243 Adiponectin receptor protein 1_L428P_mutation Human genes 0.000 description 4
- 240000007241 Agrostis stolonifera Species 0.000 description 4
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 4
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 4
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 4
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 241000508723 Festuca rubra Species 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 4
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 4
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000721621 Myzus persicae Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102220493299 Phosphate-regulating neutral endopeptidase PHEX_E226W_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102220493300 Phosphate-regulating neutral endopeptidase PHEX_R252P_mutation Human genes 0.000 description 4
- 241000753145 Sitotroga cerealella Species 0.000 description 4
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 4
- 241000255632 Tabanus atratus Species 0.000 description 4
- 244000152045 Themeda triandra Species 0.000 description 4
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 4
- 241001414989 Thysanoptera Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 4
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 4
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 244000283070 Abies balsamea Species 0.000 description 3
- 235000007173 Abies balsamea Nutrition 0.000 description 3
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 241000491617 Agropyron desertorum Species 0.000 description 3
- 241001600408 Aphis gossypii Species 0.000 description 3
- 241000254127 Bemisia tabaci Species 0.000 description 3
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 3
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 3
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 3
- 241001465828 Cecidomyiidae Species 0.000 description 3
- 241001465977 Coccoidea Species 0.000 description 3
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 3
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 3
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 3
- 241000995027 Empoasca fabae Species 0.000 description 3
- 241000122098 Ephestia kuehniella Species 0.000 description 3
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000256602 Isoptera Species 0.000 description 3
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 3
- 241000193981 Loxostege sticticalis Species 0.000 description 3
- 241001179564 Melanaphis sacchari Species 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 3
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 3
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 3
- 235000010617 Phaseolus lunatus Nutrition 0.000 description 3
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 3
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 3
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 3
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 3
- 241000258242 Siphonaptera Species 0.000 description 3
- 241000222068 Sporobolomyces <Sporidiobolaceae> Species 0.000 description 3
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 3
- 241001454293 Tetranychus urticae Species 0.000 description 3
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 3
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 3
- 108700010756 Viral Polyproteins Proteins 0.000 description 3
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 3
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 102220322174 rs1554659181 Human genes 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220583875 AMP deaminase 1_S80G_mutation Human genes 0.000 description 2
- 244000101408 Abies amabilis Species 0.000 description 2
- 235000014081 Abies amabilis Nutrition 0.000 description 2
- 241001136249 Agriotes lineatus Species 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 241001626535 Agrostis canina Species 0.000 description 2
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 2
- 244000226021 Anacardium occidentale Species 0.000 description 2
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 2
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 2
- 102220594593 Ankyrin repeat and SOCS box protein 8_R94Y_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241000255978 Antheraea pernyi Species 0.000 description 2
- 241000625764 Anticarsia gemmatalis Species 0.000 description 2
- 241000273311 Aphis spiraecola Species 0.000 description 2
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 2
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 2
- 101100321312 Bacillus subtilis (strain 168) yxeH gene Proteins 0.000 description 2
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000982105 Brevicoryne brassicae Species 0.000 description 2
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 2
- 244000045232 Canavalia ensiformis Species 0.000 description 2
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 2
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 2
- 241001124134 Chrysomelidae Species 0.000 description 2
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 2
- 241001114553 Coreidae Species 0.000 description 2
- 241001481833 Coryphaena hippurus Species 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 235000009847 Cucumis melo var cantalupensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000015001 Cucumis melo var inodorus Nutrition 0.000 description 2
- 240000002495 Cucumis melo var. inodorus Species 0.000 description 2
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 2
- 241001635274 Cydia pomonella Species 0.000 description 2
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241001205778 Dialeurodes citri Species 0.000 description 2
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 2
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 2
- 241000586568 Diaspidiotus perniciosus Species 0.000 description 2
- 241001279823 Diuraphis noxia Species 0.000 description 2
- 241001517923 Douglasiidae Species 0.000 description 2
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 2
- 244000078127 Eleusine coracana Species 0.000 description 2
- 241000086608 Empoasca vitis Species 0.000 description 2
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000002395 Euphorbia pulcherrima Species 0.000 description 2
- 241000234643 Festuca arundinacea Species 0.000 description 2
- 241000410074 Festuca ovina Species 0.000 description 2
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 2
- 240000000047 Gossypium barbadense Species 0.000 description 2
- 235000009429 Gossypium barbadense Nutrition 0.000 description 2
- 235000009432 Gossypium hirsutum Nutrition 0.000 description 2
- 241001147381 Helicoverpa armigera Species 0.000 description 2
- 235000005206 Hibiscus Nutrition 0.000 description 2
- 235000007185 Hibiscus lunariifolius Nutrition 0.000 description 2
- 244000284380 Hibiscus rosa sinensis Species 0.000 description 2
- 244000267823 Hydrangea macrophylla Species 0.000 description 2
- 235000014486 Hydrangea macrophylla Nutrition 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 241000209035 Ilex Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 2
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241001325860 Lacanobia oleracea Species 0.000 description 2
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 2
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 2
- 241000500881 Lepisma Species 0.000 description 2
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 2
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 2
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 2
- 241000966204 Lissorhoptrus oryzophilus Species 0.000 description 2
- 244000100545 Lolium multiflorum Species 0.000 description 2
- 241000721703 Lymantria dispar Species 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000723994 Maize dwarf mosaic virus Species 0.000 description 2
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 2
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 2
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 2
- 241001422926 Mayetiola hordei Species 0.000 description 2
- 241001212755 Metamasius hemipterus Species 0.000 description 2
- 241000257226 Muscidae Species 0.000 description 2
- SUZRRICLUFMAQD-UHFFFAOYSA-N N-Methyltaurine Chemical compound CNCCS(O)(=O)=O SUZRRICLUFMAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000234479 Narcissus Species 0.000 description 2
- 241000615716 Nephotettix nigropictus Species 0.000 description 2
- 241000660989 Nysius Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241001300993 Papilio cresphontes Species 0.000 description 2
- 241000209046 Pennisetum Species 0.000 description 2
- 241000256682 Peregrinus maidis Species 0.000 description 2
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 2
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 2
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 2
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220560060 Phosphoserine phosphatase_R65K_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241001516577 Phylloxera Species 0.000 description 2
- 241000907661 Pieris rapae Species 0.000 description 2
- 241000219843 Pisum Species 0.000 description 2
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 2
- 241000691880 Planococcus citri Species 0.000 description 2
- 244000292693 Poa annua Species 0.000 description 2
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 241000254101 Popillia japonica Species 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 2
- 235000008572 Pseudotsuga menziesii Nutrition 0.000 description 2
- 240000001416 Pseudotsuga menziesii Species 0.000 description 2
- 241001510071 Pyrrhocoridae Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 2
- 241000208422 Rhododendron Species 0.000 description 2
- 241000125167 Rhopalosiphum padi Species 0.000 description 2
- 241000722027 Schizaphis graminum Species 0.000 description 2
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 2
- 241000545593 Scolytinae Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 241000254152 Sitophilus oryzae Species 0.000 description 2
- 101000611441 Solanum lycopersicum Pathogenesis-related leaf protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 241001454295 Tetranychidae Species 0.000 description 2
- 235000006468 Thea sinensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 2
- 240000007313 Tilia cordata Species 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 240000003021 Tsuga heterophylla Species 0.000 description 2
- 235000008554 Tsuga heterophylla Nutrition 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 2
- 241000482268 Zea mays subsp. mays Species 0.000 description 2
- 240000001102 Zoysia matrella Species 0.000 description 2
- 241000314934 Zygogramma exclamationis Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 2
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001887 anti-feedant effect Effects 0.000 description 2
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 244000013123 dwarf bean Species 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 2
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 235000021331 green beans Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000003750 molluscacide Substances 0.000 description 2
- 230000002013 molluscicidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229940072417 peroxidase Drugs 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 239000005014 poly(hydroxyalkanoate) Substances 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 229920000903 polyhydroxyalkanoate Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011253 protective coating Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005316 response function Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 102220218176 rs1060501269 Human genes 0.000 description 2
- 102200062505 rs121909226 Human genes 0.000 description 2
- 102220277088 rs1553366617 Human genes 0.000 description 2
- 102220276775 rs1553622642 Human genes 0.000 description 2
- 102220251280 rs1555165811 Human genes 0.000 description 2
- 102220340494 rs1555191637 Human genes 0.000 description 2
- 102220041598 rs587780630 Human genes 0.000 description 2
- 102220045740 rs587782352 Human genes 0.000 description 2
- 102220261114 rs771741537 Human genes 0.000 description 2
- 102200067661 rs80359214 Human genes 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- LDVVMCZRFWMZSG-OLQVQODUSA-N (3ar,7as)-2-(trichloromethylsulfanyl)-3a,4,7,7a-tetrahydroisoindole-1,3-dione Chemical compound C1C=CC[C@H]2C(=O)N(SC(Cl)(Cl)Cl)C(=O)[C@H]21 LDVVMCZRFWMZSG-OLQVQODUSA-N 0.000 description 1
- TZURDPUOLIGSAF-VCEOMORVSA-N (4S)-4-[[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-aminopropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]acetyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S)-1-[[2-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](Cc1cnc[nH]1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O TZURDPUOLIGSAF-VCEOMORVSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQAINHDHICKHLX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaldehyde Chemical class C1=CC=C2C(C=O)=CC=CC2=C1 SQAINHDHICKHLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220535226 2'-5'-oligoadenylate synthase 1_S83Y_mutation Human genes 0.000 description 1
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- 229940087195 2,4-dichlorophenoxyacetate Drugs 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029103 3-ketoacyl-CoA thiolase Human genes 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102220575588 40S ribosomal protein S16_R65E_mutation Human genes 0.000 description 1
- XDRVGXCIPIURSL-UHFFFAOYSA-N 5,8-diethyl-3,10-dimethyldodec-6-yne-5,8-diol Chemical compound CCC(C)CC(O)(CC)C#CC(O)(CC)CC(C)CC XDRVGXCIPIURSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220618545 7-methylguanosine phosphate-specific 5'-nucleotidase_G76N_mutation Human genes 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N ADP alpha-D-glucoside Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N 0.000 description 1
- 235000004507 Abies alba Nutrition 0.000 description 1
- 235000017894 Abies grandis Nutrition 0.000 description 1
- 235000004710 Abies lasiocarpa Nutrition 0.000 description 1
- 241000824209 Aceria tosichella Species 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- 244000235858 Acetobacter xylinum Species 0.000 description 1
- 235000002837 Acetobacter xylinum Nutrition 0.000 description 1
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001351288 Achroia grisella Species 0.000 description 1
- 241000495828 Acleris gloverana Species 0.000 description 1
- 241000834107 Acleris variana Species 0.000 description 1
- 241001133760 Acoelorraphe Species 0.000 description 1
- 241001014341 Acrosternum hilare Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000253994 Acyrthosiphon pisum Species 0.000 description 1
- 241001465979 Adelgidae Species 0.000 description 1
- 241000663326 Adelphocoris Species 0.000 description 1
- 241000663330 Adelphocoris lineolatus Species 0.000 description 1
- 102220511448 Adenine DNA glycosylase_V72E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220636432 Adiponectin receptor protein 1_G76L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000175828 Adoxophyes orana Species 0.000 description 1
- 241000256111 Aedes <genus> Species 0.000 description 1
- 241000673185 Aeolus Species 0.000 description 1
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241001136265 Agriotes Species 0.000 description 1
- 101100198823 Agrobacterium rhizogenes rolC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000993143 Agromyza Species 0.000 description 1
- 241000209137 Agropyron cristatum Species 0.000 description 1
- 241001184547 Agrostis capillaris Species 0.000 description 1
- 241000566547 Agrotis ipsilon Species 0.000 description 1
- 241000001996 Agrotis orthogonia Species 0.000 description 1
- 241000218475 Agrotis segetum Species 0.000 description 1
- 241001652650 Agrotis subterranea Species 0.000 description 1
- 241000449794 Alabama argillacea Species 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241000254124 Aleyrodidae Species 0.000 description 1
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 1
- 239000004229 Alkannin Substances 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 241001149961 Alternaria brassicae Species 0.000 description 1
- 244000208874 Althaea officinalis Species 0.000 description 1
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 241000238679 Amblyomma Species 0.000 description 1
- 241000238682 Amblyomma americanum Species 0.000 description 1
- 102220484418 Amiloride-sensitive sodium channel subunit delta_L70G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000242266 Amphimallon majalis Species 0.000 description 1
- 241001259789 Amyelois transitella Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 235000001274 Anacardium occidentale Nutrition 0.000 description 1
- 241001198492 Anarsia Species 0.000 description 1
- 241000663922 Anasa tristis Species 0.000 description 1
- 241001641146 Anisota Species 0.000 description 1
- 102220593372 Ankyrin repeat and SOCS box protein 8_R94K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000256186 Anopheles <genus> Species 0.000 description 1
- 241001427556 Anoplura Species 0.000 description 1
- 239000004257 Anoxomer Substances 0.000 description 1
- 241000254175 Anthonomus grandis Species 0.000 description 1
- 241000149536 Anthribidae Species 0.000 description 1
- 241001034871 Antitrogus parvulus Species 0.000 description 1
- 241000682732 Aphanisticus Species 0.000 description 1
- 241001151957 Aphis aurantii Species 0.000 description 1
- 241000952611 Aphis craccivora Species 0.000 description 1
- 241001425390 Aphis fabae Species 0.000 description 1
- 241001095118 Aphis pomi Species 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 241001002469 Archips Species 0.000 description 1
- 241001002470 Archips argyrospila Species 0.000 description 1
- 241001423656 Archips rosana Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000384127 Argyrotaenia Species 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 102220471102 Aryl hydrocarbon receptor_L50D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000968069 Asterolecaniidae Species 0.000 description 1
- 241000668551 Aulacaspis Species 0.000 description 1
- 241001166626 Aulacorthum solani Species 0.000 description 1
- 241000047982 Axonopus Species 0.000 description 1
- 241000047987 Axonopus fissifolius Species 0.000 description 1
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 1
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000124815 Barbus barbus Species 0.000 description 1
- 102220520195 Barrier-to-autointegration factor_L50A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220520196 Barrier-to-autointegration factor_L50K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 241001302798 Bemisia argentifolii Species 0.000 description 1
- KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N Benzenesulfonamide Chemical compound NS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 102220631970 Bestrophin-1_L67V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 235000021533 Beta vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 102220529763 Beta-arrestin-2_P91G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241001629132 Blissus leucopterus Species 0.000 description 1
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 1
- 241001350395 Bonagota Species 0.000 description 1
- 102220505157 Borealin_F74E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000145727 Bouteloua curtipendula Species 0.000 description 1
- 241000320720 Bouteloua dactyloides Species 0.000 description 1
- 241000232315 Bouteloua gracilis Species 0.000 description 1
- 241000339490 Brachyachne Species 0.000 description 1
- 241000255625 Brachycera Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 244000178993 Brassica juncea Species 0.000 description 1
- 244000178924 Brassica napobrassica Species 0.000 description 1
- 235000011297 Brassica napobrassica Nutrition 0.000 description 1
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 241000220243 Brassica sp. Species 0.000 description 1
- 241001643374 Brevipalpus Species 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000743756 Bromus inermis Species 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 241000907223 Bruchinae Species 0.000 description 1
- 241001517925 Bucculatrix Species 0.000 description 1
- 241000320719 Buchloe Species 0.000 description 1
- 241000501044 Buprestidae Species 0.000 description 1
- 101100394003 Butyrivibrio fibrisolvens end1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 241000526185 Cacopsylla Species 0.000 description 1
- 241000726760 Cadra cautella Species 0.000 description 1
- 239000002970 Calcium lactobionate Substances 0.000 description 1
- 241001674345 Callitropsis nootkatensis Species 0.000 description 1
- 235000007575 Calluna vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000906761 Calocoris Species 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- 102220511321 Caprin-1_D95K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000005745 Captan Substances 0.000 description 1
- 239000005746 Carboxin Substances 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000723418 Carya Species 0.000 description 1
- 102220642503 Cation channel sperm-associated protein 4_Q77R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000218645 Cedrus Species 0.000 description 1
- 102220640918 Cell division control protein 6 homolog_S54D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220584250 Cellular tumor antigen p53_A79G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220584249 Cellular tumor antigen p53_A79T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220584245 Cellular tumor antigen p53_A79V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220565610 Cellular tumor antigen p53_G244E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220565609 Cellular tumor antigen p53_G244R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220522428 Cellular tumor antigen p53_L201P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220597129 Cellular tumor antigen p53_S303C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220597131 Cellular tumor antigen p53_S303I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220597125 Cellular tumor antigen p53_S303T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001481710 Cerambycidae Species 0.000 description 1
- 235000013912 Ceratonia siliqua Nutrition 0.000 description 1
- 240000008886 Ceratonia siliqua Species 0.000 description 1
- 241000134426 Ceratopogonidae Species 0.000 description 1
- 241001414824 Cercopidae Species 0.000 description 1
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 1
- 241000902406 Chaetocnema Species 0.000 description 1
- 241000343781 Chaetocnema pulicaria Species 0.000 description 1
- 241001094931 Chaetosiphon fragaefolii Species 0.000 description 1
- 241001463014 Chazara briseis Species 0.000 description 1
- 241000661337 Chilo partellus Species 0.000 description 1
- 241000426497 Chilo suppressalis Species 0.000 description 1
- 241001440924 Chilo terrenellus Species 0.000 description 1
- 241000255930 Chironomidae Species 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000255945 Choristoneura Species 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 1
- 241001367803 Chrysodeixis includens Species 0.000 description 1
- 241000191839 Chrysomya Species 0.000 description 1
- 241001124179 Chrysops Species 0.000 description 1
- 241000034870 Chrysoteuchia culmella Species 0.000 description 1
- 241000931705 Cicada Species 0.000 description 1
- 241000254137 Cicadidae Species 0.000 description 1
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 description 1
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 description 1
- 241001414835 Cimicidae Species 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241001489610 Cixiidae Species 0.000 description 1
- 241000186650 Clavibacter Species 0.000 description 1
- 241000098289 Cnaphalocrocis medinalis Species 0.000 description 1
- 241001415288 Coccidae Species 0.000 description 1
- 241000255749 Coccinellidae Species 0.000 description 1
- 102220636096 Cochlin_G87W_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000540393 Cochylis hospes Species 0.000 description 1
- 241000723377 Coffea Species 0.000 description 1
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 description 1
- 235000007460 Coffea arabica Nutrition 0.000 description 1
- 241001529599 Colaspis brunnea Species 0.000 description 1
- 241000143939 Colias eurytheme Species 0.000 description 1
- 102220538128 Condensin-2 complex subunit H2_G71N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000683561 Conoderus Species 0.000 description 1
- 102220606412 Contactin-5_L70R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001663470 Contarinia <gall midge> Species 0.000 description 1
- 241001663467 Contarinia tritici Species 0.000 description 1
- 241000993412 Corcyra cephalonica Species 0.000 description 1
- 241000218176 Corydalis Species 0.000 description 1
- 235000001543 Corylus americana Nutrition 0.000 description 1
- 240000007582 Corylus avellana Species 0.000 description 1
- 235000007466 Corylus avellana Nutrition 0.000 description 1
- 241000677504 Corythucha Species 0.000 description 1
- 241000693852 Corythucha immaculata Species 0.000 description 1
- 241000123989 Crambidae Species 0.000 description 1
- 241001340508 Crambus Species 0.000 description 1
- 241001214984 Crinum thaianum Species 0.000 description 1
- 101710190853 Cruciferin Proteins 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 1
- 241000242268 Ctenicera Species 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000010071 Cucumis prophetarum Nutrition 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241000256054 Culex <genus> Species 0.000 description 1
- 244000007835 Cyamopsis tetragonoloba Species 0.000 description 1
- 241001587738 Cyclocephala borealis Species 0.000 description 1
- 241001652531 Cydia latiferreana Species 0.000 description 1
- 241001183634 Cylindrocopturus Species 0.000 description 1
- 241001125724 Cylindrotermes Species 0.000 description 1
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 description 1
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 description 1
- 241001090151 Cyrtopeltis Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102220581535 DNA dC->dU-editing enzyme APOBEC-3G_F74W_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101710096830 DNA-3-methyladenine glycosylase Proteins 0.000 description 1
- 102100039128 DNA-3-methyladenine glycosylase Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000004585 Dactylis glomerata Species 0.000 description 1
- 241001516609 Dactylopiidae Species 0.000 description 1
- 241000228648 Dasypyrum Species 0.000 description 1
- 241000567462 Datana Species 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 241001414890 Delia Species 0.000 description 1
- 241001585354 Delia coarctata Species 0.000 description 1
- 241001609607 Delia platura Species 0.000 description 1
- 241001127981 Demodicidae Species 0.000 description 1
- 241001631715 Dendrolimus Species 0.000 description 1
- 241000927667 Deois Species 0.000 description 1
- 241001480793 Dermacentor variabilis Species 0.000 description 1
- 241001124144 Dermaptera Species 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000131287 Dermestidae Species 0.000 description 1
- 241000214908 Dermolepida Species 0.000 description 1
- 241001641949 Desmia funeralis Species 0.000 description 1
- 241000605716 Desulfovibrio Species 0.000 description 1
- 241000489972 Diabrotica barberi Species 0.000 description 1
- 241000489976 Diabrotica undecimpunctata howardi Species 0.000 description 1
- 241000489947 Diabrotica virgifera virgifera Species 0.000 description 1
- 102220559137 Diacylglycerol kinase alpha_Q77F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220559300 Diacylglycerol kinase alpha_Q77Y_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001000394 Diaphania hyalinata Species 0.000 description 1
- 241000832202 Diaphania indica Species 0.000 description 1
- 241001012951 Diaphania nitidalis Species 0.000 description 1
- 241000721027 Diaprepes abbreviatus Species 0.000 description 1
- 241000879145 Diatraea grandiosella Species 0.000 description 1
- 241000122106 Diatraea saccharalis Species 0.000 description 1
- 235000011511 Diospyros Nutrition 0.000 description 1
- 244000236655 Diospyros kaki Species 0.000 description 1
- 241000258963 Diplopoda Species 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102220489009 Dual specificity protein phosphatase 13 isoform A_P73V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000586570 Duplachionaspis divergens Species 0.000 description 1
- 241001581006 Dysaphis plantaginea Species 0.000 description 1
- 241001035625 Dysdercus suturellus Species 0.000 description 1
- 241001348814 Dysmicoccus boninsis Species 0.000 description 1
- 229920005682 EO-PO block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 101150111720 EPSPS gene Proteins 0.000 description 1
- 241000353522 Earias insulana Species 0.000 description 1
- 241001572697 Earias vittella Species 0.000 description 1
- 241001585089 Egira Species 0.000 description 1
- 241000400698 Elasmopalpus lignosellus Species 0.000 description 1
- 241001427543 Elateridae Species 0.000 description 1
- 241001105160 Eleodes Species 0.000 description 1
- 235000007349 Eleusine coracana Nutrition 0.000 description 1
- 235000013499 Eleusine coracana subsp coracana Nutrition 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001585082 Ennomos Species 0.000 description 1
- 241000661448 Eoreuma loftini Species 0.000 description 1
- 241001555556 Ephestia elutella Species 0.000 description 1
- 241000554916 Epidermoptidae Species 0.000 description 1
- 241000462639 Epilachna varivestis Species 0.000 description 1
- 102220557046 Epiplakin_S83T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000738498 Epitrix pubescens Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000473921 Erannis tiliaria Species 0.000 description 1
- 241000539139 Erechthias Species 0.000 description 1
- 241001433310 Eremochloa Species 0.000 description 1
- 241000025852 Eremochloa ophiuroides Species 0.000 description 1
- 241000202844 Eriophorum Species 0.000 description 1
- 241001221110 Eriophyidae Species 0.000 description 1
- 241000917107 Eriosoma lanigerum Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000447838 Eumetopina flavipes Species 0.000 description 1
- 241000060469 Eupoecilia ambiguella Species 0.000 description 1
- 241000483001 Euproctis chrysorrhoea Species 0.000 description 1
- 241000515838 Eurygaster Species 0.000 description 1
- 241001619920 Euschistus servus Species 0.000 description 1
- 241000341889 Euschistus variolarius Species 0.000 description 1
- 241001368778 Euxoa messoria Species 0.000 description 1
- 102220571372 FUN14 domain-containing protein 1_L70H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 235000009419 Fagopyrum esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008620 Fagopyrum esculentum Species 0.000 description 1
- 241000566572 Falco femoralis Species 0.000 description 1
- 241000953886 Fannia canicularis Species 0.000 description 1
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 description 1
- 241000234642 Festuca Species 0.000 description 1
- 241000192306 Festuca longifolia Species 0.000 description 1
- 241000218218 Ficus <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 102220531719 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand_G68P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001451111 Fragaria vesca subsp. americana Species 0.000 description 1
- 102220561159 Furin_V72R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000233732 Fusarium verticillioides Species 0.000 description 1
- 101150062467 GAT gene Proteins 0.000 description 1
- 102220589303 GDNF-inducible zinc finger protein 1_S83A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220595139 GDNF-inducible zinc finger protein 1_S83W_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000255896 Galleria mellonella Species 0.000 description 1
- 241001660203 Gasterophilus Species 0.000 description 1
- 102220498654 General transcription factor IIE subunit 1_P73G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 101710186901 Globulin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220578433 Glycerol kinase 2_G93V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108700037728 Glycine max beta-conglycinin Proteins 0.000 description 1
- 241001645378 Glycyphagidae Species 0.000 description 1
- 244000060234 Gmelina philippensis Species 0.000 description 1
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 1
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 1
- 241001441330 Grapholita molesta Species 0.000 description 1
- 241001219514 Graptostethus Species 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 241001631014 Grypus Species 0.000 description 1
- 241000145313 Gymnocorymbus ternetzi Species 0.000 description 1
- 241000190714 Gymnosporangium clavipes Species 0.000 description 1
- 102220493590 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 3 chain_L67A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001352371 Harrisina americana Species 0.000 description 1
- 102220510886 Heat shock 70 kDa protein 4L_D95S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001515776 Heliothis subflexa Species 0.000 description 1
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 description 1
- 241000122115 Hemileuca Species 0.000 description 1
- 102220627057 Hemoglobin subunit alpha_D95A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000405147 Hermes Species 0.000 description 1
- 241001000403 Herpetogramma licarsisalis Species 0.000 description 1
- 102220633264 Hexokinase-4_G68D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220585096 Histone H2A.Z_G93N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220574854 Homeobox protein cut-like 1_G71V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220529858 Homer protein homolog 2_F74A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000630740 Homoeosoma electellum Species 0.000 description 1
- 241001251909 Hyalopterus pruni Species 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 241000370523 Hypena scabra Species 0.000 description 1
- 241001508564 Hypera punctata Species 0.000 description 1
- 241001531327 Hyphantria cunea Species 0.000 description 1
- 241000257176 Hypoderma <fly> Species 0.000 description 1
- 241001058150 Icerya purchasi Species 0.000 description 1
- 102220466412 Iduronate 2-sulfatase_A79E_mutation Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 1
- 102220642586 Intestine-specific homeobox_V72S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 235000021506 Ipomoea Nutrition 0.000 description 1
- 241000207783 Ipomoea Species 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 241001495069 Ischnocera Species 0.000 description 1
- 241001489720 Issidae Species 0.000 description 1
- 241000545319 Ixodes canisuga Species 0.000 description 1
- 241000922049 Ixodes holocyclus Species 0.000 description 1
- 241000238703 Ixodes scapularis Species 0.000 description 1
- 241000238889 Ixodidae Species 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 241000400431 Keiferia lycopersicella Species 0.000 description 1
- 102220624029 Kin of IRRE-like protein 1_S54T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241001468155 Lactobacillaceae Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241001658023 Lambdina fiscellaria Species 0.000 description 1
- 241001658020 Lambdina fiscellaria lugubrosa Species 0.000 description 1
- 241001470017 Laodelphax striatella Species 0.000 description 1
- 241000219729 Lathyrus Species 0.000 description 1
- 241000238866 Latrodectus mactans Species 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 241001227597 Lepidiota Species 0.000 description 1
- 241000424297 Lepidiota frenchi Species 0.000 description 1
- 241000661348 Leptocorisa acuta Species 0.000 description 1
- 241000661779 Leptoglossus Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001352367 Leucoma salicis Species 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 229920001732 Lignosulfonate Polymers 0.000 description 1
- 241000234280 Liliaceae Species 0.000 description 1
- 241000683448 Limonius Species 0.000 description 1
- 241000272317 Lipaphis erysimi Species 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001261104 Lobesia botrana Species 0.000 description 1
- 240000004296 Lolium perenne Species 0.000 description 1
- 241000215452 Lotus corniculatus Species 0.000 description 1
- 241000238865 Loxosceles reclusa Species 0.000 description 1
- 241000258912 Lygaeidae Species 0.000 description 1
- 241000502639 Lygocoris Species 0.000 description 1
- 241000501345 Lygus lineolaris Species 0.000 description 1
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 description 1
- 101150050813 MPI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000208467 Macadamia Species 0.000 description 1
- 235000018330 Macadamia integrifolia Nutrition 0.000 description 1
- 240000007575 Macadamia integrifolia Species 0.000 description 1
- 241000721714 Macrosiphum euphorbiae Species 0.000 description 1
- 241001414662 Macrosteles fascifrons Species 0.000 description 1
- 241001259998 Macrosteles quadrilineatus Species 0.000 description 1
- 241001515692 Magicicada Species 0.000 description 1
- 241000218378 Magnolia Species 0.000 description 1
- 241001164204 Mahanarva Species 0.000 description 1
- 101710164702 Major outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000255676 Malacosoma Species 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 244000081841 Malus domestica Species 0.000 description 1
- 241000555303 Mamestra brassicae Species 0.000 description 1
- 241000732113 Mamestra configurata Species 0.000 description 1
- 241000256010 Manduca Species 0.000 description 1
- 235000004456 Manihot esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 101000763602 Manilkara zapota Thaumatin-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000763586 Manilkara zapota Thaumatin-like protein 1a Proteins 0.000 description 1
- 241001648788 Margarodidae Species 0.000 description 1
- 241001232130 Maruca testulalis Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102220503549 Meiotic recombination protein REC8 homolog_A53I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220503895 Meiotic recombination protein REC8 homolog_S92V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000868076 Melanaspis glomerata Species 0.000 description 1
- 241001367645 Melanchra picta Species 0.000 description 1
- 241001062280 Melanotus <basidiomycete fungus> Species 0.000 description 1
- 241000771994 Melophagus ovinus Species 0.000 description 1
- 241001414856 Membracidae Species 0.000 description 1
- 241000088587 Meromyza Species 0.000 description 1
- 239000005807 Metalaxyl Substances 0.000 description 1
- 241000168713 Metopolophium dirhodum Species 0.000 description 1
- 241001497125 Migdolus fryanus Species 0.000 description 1
- 241001414825 Miridae Species 0.000 description 1
- 102220501414 Mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim10_P91V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- 241000234295 Musa Species 0.000 description 1
- 101000966653 Musa acuminata Glucan endo-1,3-beta-glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 241000257159 Musca domestica Species 0.000 description 1
- 241000158595 Muscoidea Species 0.000 description 1
- 102220528479 Myelin protein P0_S54P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 description 1
- 102000018463 Myo-Inositol-1-Phosphate Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108091000020 Myo-Inositol-1-Phosphate Synthase Proteins 0.000 description 1
- 241001477931 Mythimna unipuncta Species 0.000 description 1
- 102220631334 NCK-interacting protein with SH3 domain_S92G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001443590 Naganishia albida Species 0.000 description 1
- 241000033319 Naganishia diffluens Species 0.000 description 1
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 1
- 241000133263 Nasonovia ribisnigri Species 0.000 description 1
- 241000255932 Nematocera Species 0.000 description 1
- 241000912288 Neolasioptera Species 0.000 description 1
- 241000359016 Nephotettix Species 0.000 description 1
- 241001671709 Nezara viridula Species 0.000 description 1
- 241001556089 Nilaparvata lugens Species 0.000 description 1
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001102020 Oebalus Species 0.000 description 1
- 241000874574 Oides decempunctatus Species 0.000 description 1
- 235000002725 Olea europaea Nutrition 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000488557 Oligonychus Species 0.000 description 1
- 241000536403 Oligonychus indicus Species 0.000 description 1
- 241001000386 Omiodes accepta Species 0.000 description 1
- 241000258914 Oncopeltus Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241001491890 Operophtera Species 0.000 description 1
- 241001491877 Operophtera brumata Species 0.000 description 1
- 241001465800 Orgyia Species 0.000 description 1
- 241001578834 Orthaga thyrisalis Species 0.000 description 1
- 241001057671 Ortheziidae Species 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 241000238814 Orthoptera Species 0.000 description 1
- 241000975417 Oscinella frit Species 0.000 description 1
- 241001160353 Oulema melanopus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000193418 Paenibacillus larvae Species 0.000 description 1
- 241001310335 Paenibacillus lentimorbus Species 0.000 description 1
- 241001585670 Paleacrita Species 0.000 description 1
- 240000008114 Panicum miliaceum Species 0.000 description 1
- 235000007199 Panicum miliaceum Nutrition 0.000 description 1
- 241000488583 Panonychus ulmi Species 0.000 description 1
- 241000222051 Papiliotrema laurentii Species 0.000 description 1
- 241000497111 Paralobesia viteana Species 0.000 description 1
- 241000459456 Parapediasia teterrellus Species 0.000 description 1
- 241000218222 Parasponia andersonii Species 0.000 description 1
- 241001668545 Pascopyrum Species 0.000 description 1
- 241001668543 Pascopyrum smithii Species 0.000 description 1
- 241001330453 Paspalum Species 0.000 description 1
- 241001330451 Paspalum notatum Species 0.000 description 1
- 241000044541 Paspalum vaginatum Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000721451 Pectinophora gossypiella Species 0.000 description 1
- 244000038248 Pennisetum spicatum Species 0.000 description 1
- 235000007195 Pennisetum typhoides Nutrition 0.000 description 1
- 241000320508 Pentatomidae Species 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 241001253326 Perkinsiella saccharicida Species 0.000 description 1
- 241000488591 Petrobia Species 0.000 description 1
- 241000316608 Petrobia latens Species 0.000 description 1
- 244000100170 Phaseolus lunatus Species 0.000 description 1
- 101000870887 Phaseolus vulgaris Glycine-rich cell wall structural protein 1.8 Proteins 0.000 description 1
- 241000746983 Phleum pratense Species 0.000 description 1
- 241001057674 Phoenicococcidae Species 0.000 description 1
- 241000257149 Phormia Species 0.000 description 1
- 102220620753 Phosphatidylserine decarboxylase proenzyme, mitochondrial_S54L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220624471 Phospholemman_S83E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000607568 Photobacterium Species 0.000 description 1
- 241001190490 Phryganidia Species 0.000 description 1
- 241001525654 Phyllocnistis citrella Species 0.000 description 1
- 241000720470 Phyllonorycter Species 0.000 description 1
- 241000286134 Phyllophaga crinita Species 0.000 description 1
- 241000788166 Phyllophaga latifrons Species 0.000 description 1
- 241000275069 Phyllotreta cruciferae Species 0.000 description 1
- 241001465981 Phylloxeridae Species 0.000 description 1
- 241000218657 Picea Species 0.000 description 1
- 240000000020 Picea glauca Species 0.000 description 1
- 235000008127 Picea glauca Nutrition 0.000 description 1
- 241000218595 Picea sitchensis Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 241001313099 Pieris napi Species 0.000 description 1
- 235000005205 Pinus Nutrition 0.000 description 1
- 241000218602 Pinus <genus> Species 0.000 description 1
- 235000008593 Pinus contorta Nutrition 0.000 description 1
- 241000218606 Pinus contorta Species 0.000 description 1
- 235000005018 Pinus echinata Nutrition 0.000 description 1
- 235000013264 Pinus jeffreyi Nutrition 0.000 description 1
- 235000016013 Pinus leiophylla var chihuahuana Nutrition 0.000 description 1
- 235000013267 Pinus ponderosa Nutrition 0.000 description 1
- 241000555277 Pinus ponderosa Species 0.000 description 1
- 235000008577 Pinus radiata Nutrition 0.000 description 1
- 241000218621 Pinus radiata Species 0.000 description 1
- 240000007320 Pinus strobus Species 0.000 description 1
- 235000008566 Pinus taeda Nutrition 0.000 description 1
- 241000218679 Pinus taeda Species 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 241001608845 Platynota Species 0.000 description 1
- 241001456328 Platynota stultana Species 0.000 description 1
- 241001105494 Platyptilia Species 0.000 description 1
- 102220492007 Plexin-A2_Q57R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000595629 Plodia interpunctella Species 0.000 description 1
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 1
- 241000136254 Poa compressa Species 0.000 description 1
- 241000209049 Poa pratensis Species 0.000 description 1
- 240000006597 Poa trivialis Species 0.000 description 1
- 241000904003 Poecilocapsus Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 241000143946 Pontia Species 0.000 description 1
- 241000143945 Pontia protodice Species 0.000 description 1
- 102220613591 Potassium voltage-gated channel subfamily D member 3_F74R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000736232 Prosimulium Species 0.000 description 1
- 241000590524 Protaphis middletonii Species 0.000 description 1
- 102220570852 Protein CFAP210_L67E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220571043 Protein CFAP210_L70E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220579432 Protein mono-ADP-ribosyltransferase PARP3_S80Y_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 102220558377 Protocadherin-19_V72G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001657916 Proxenus mindara Species 0.000 description 1
- 235000005805 Prunus cerasus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 241001155137 Pseudacanthotermes militaris Species 0.000 description 1
- 241000721694 Pseudatomoscelis seriatus Species 0.000 description 1
- 241001415279 Pseudococcidae Species 0.000 description 1
- 241000947836 Pseudomonadaceae Species 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 240000001679 Psidium guajava Species 0.000 description 1
- 235000013929 Psidium pyriferum Nutrition 0.000 description 1
- 241000620639 Psoroptes cervinus Species 0.000 description 1
- 241001649231 Psoroptidae Species 0.000 description 1
- 241001414857 Psyllidae Species 0.000 description 1
- 241000736230 Puccinellia distans Species 0.000 description 1
- 241000531582 Pulvinaria <Pelagophyceae> Species 0.000 description 1
- 102220519838 Putative neutrophil cytosol factor 1B_P91A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101710105014 Putative serine protease Proteins 0.000 description 1
- 102220559453 Putative uncharacterized protein TSPEAR-AS2_R94M_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000238704 Pyemotidae Species 0.000 description 1
- 241000255893 Pyralidae Species 0.000 description 1
- 241000932787 Pyrilla Species 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 101150075111 ROLB gene Proteins 0.000 description 1
- 102220510467 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1_L70A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220614628 Ras-related protein Rab-36_Q77L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102220566636 Recombining binding protein suppressor of hairless-like protein_A53H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001124072 Reduviidae Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102220640818 Retinoid isomerohydrolase_L67R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001212525 Rhabdoscelus obscurus Species 0.000 description 1
- 241001633102 Rhizobiaceae Species 0.000 description 1
- 241000158450 Rhodobacter sp. KYW73 Species 0.000 description 1
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000223253 Rhodotorula glutinis Species 0.000 description 1
- 241000167882 Rhopalosiphum maidis Species 0.000 description 1
- 239000004231 Riboflavin-5-Sodium Phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 241000004261 Sabulodes Species 0.000 description 1
- 241001057703 Saccharicoccus sacchari Species 0.000 description 1
- 241000209051 Saccharum Species 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000509418 Sarcoptidae Species 0.000 description 1
- 241001523594 Saturnia <genus> Species 0.000 description 1
- 241000254062 Scarabaeidae Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241001351292 Schizura concinna Species 0.000 description 1
- 241001249129 Scirpophaga incertulas Species 0.000 description 1
- 241001157780 Scutigera coleoptrata Species 0.000 description 1
- 241000131790 Scutigeromorpha Species 0.000 description 1
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001479507 Senecio odorus Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241001138418 Sequoia sempervirens Species 0.000 description 1
- 241000422846 Sequoiadendron giganteum Species 0.000 description 1
- 102220522594 Serine/arginine-rich splicing factor 2_L67D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 240000005498 Setaria italica Species 0.000 description 1
- 235000007226 Setaria italica Nutrition 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 102220574481 Sialidase-1_G68V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000256108 Simulium <genus> Species 0.000 description 1
- 102220533613 Single-strand selective monofunctional uracil DNA glycosylase_G87F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001279827 Sipha Species 0.000 description 1
- 241000180219 Sitobion avenae Species 0.000 description 1
- 241000068648 Sitodiplosis mosellana Species 0.000 description 1
- 241000254179 Sitophilus granarius Species 0.000 description 1
- 241000254154 Sitophilus zeamais Species 0.000 description 1
- 102220506859 Small proline-rich protein 3_L70N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001153342 Smicronyx fulvus Species 0.000 description 1
- 241001153341 Smicronyx sordidus Species 0.000 description 1
- 241000176086 Sogatella furcifera Species 0.000 description 1
- 235000007230 Sorghum bicolor Nutrition 0.000 description 1
- 241000921865 Spanagonicus Species 0.000 description 1
- 241000532885 Sphenophorus Species 0.000 description 1
- 241001201846 Spilonota ocellana Species 0.000 description 1
- 241000253368 Spirillaceae Species 0.000 description 1
- 241000605008 Spirillum Species 0.000 description 1
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 1
- 241000985245 Spodoptera litura Species 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 241000123675 Sporobolomyces roseus Species 0.000 description 1
- 108010039811 Starch synthase Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000298312 Stenchaetothrips Species 0.000 description 1
- 241000349644 Steneotarsonemus Species 0.000 description 1
- 241000044578 Stenotaphrum secundatum Species 0.000 description 1
- 241001494115 Stomoxys calcitrans Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000098292 Striacosta albicosta Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241001575047 Suleima Species 0.000 description 1
- 102220617029 TBC1 domain family member 7_L67W_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000255626 Tabanus <genus> Species 0.000 description 1
- 241000194622 Tagosodes orizicolus Species 0.000 description 1
- 241000254107 Tenebrionidae Species 0.000 description 1
- 241000488607 Tenuipalpidae Species 0.000 description 1
- 241000204046 Termitidae Species 0.000 description 1
- 241000344246 Tetranychus cinnabarinus Species 0.000 description 1
- 241000488577 Tetranychus mcdanieli Species 0.000 description 1
- 241000916142 Tetranychus turkestani Species 0.000 description 1
- 241000822988 Thaumasiovibrio subtropicus Species 0.000 description 1
- 241001231950 Thaumetopoea pityocampa Species 0.000 description 1
- 241000289813 Therioaphis trifolii Species 0.000 description 1
- 241000028627 Thermobia Species 0.000 description 1
- 241000028626 Thermobia domestica Species 0.000 description 1
- 239000005843 Thiram Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102220597909 Thromboxane-A synthase_L70V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 235000008109 Thuja occidentalis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003243 Thuja occidentalis Species 0.000 description 1
- 241000218638 Thuja plicata Species 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 241000333689 Tineola Species 0.000 description 1
- 241000663810 Tingidae Species 0.000 description 1
- 244000002460 Tithonia rotundifolia Species 0.000 description 1
- 241000843170 Togo hemipterus Species 0.000 description 1
- 241001507333 Tomarus gibbosus Species 0.000 description 1
- 241000255901 Tortricidae Species 0.000 description 1
- 244000288561 Torulaspora delbrueckii Species 0.000 description 1
- 235000014681 Torulaspora delbrueckii Nutrition 0.000 description 1
- 241001495125 Torulaspora pretoriensis Species 0.000 description 1
- 241000218234 Trema tomentosa Species 0.000 description 1
- 241000018135 Trialeurodes Species 0.000 description 1
- 241000018137 Trialeurodes vaporariorum Species 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 235000001484 Trigonella foenum graecum Nutrition 0.000 description 1
- 244000250129 Trigonella foenum graecum Species 0.000 description 1
- 241001414858 Trioza Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000722923 Tulipa Species 0.000 description 1
- 241000722921 Tulipa gesneriana Species 0.000 description 1
- 241001389006 Tuta absoluta Species 0.000 description 1
- 241000261594 Tyrophagus longior Species 0.000 description 1
- 241001351286 Udea rubigalis Species 0.000 description 1
- 102220515233 Vacuolar protein sorting-associated protein 4A_L67S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 235000010726 Vigna sinensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000042314 Vigna unguiculata Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001201489 Vitula serratilineella Species 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 1
- 241000064240 Yponomeuta padellus Species 0.000 description 1
- 101001036768 Zea mays Glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit 1, chloroplastic/amyloplastic Proteins 0.000 description 1
- 101001040871 Zea mays Glutelin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000662549 Zea mays Sucrose synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102220625427 Zinc finger protein SNAI1_S92E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001414985 Zygentoma Species 0.000 description 1
- 241000588901 Zymomonas Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000895 acaricidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000642 acaricide Substances 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 108091000039 acetoacetyl-CoA reductase Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012872 agrochemical composition Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008055 alkyl aryl sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 1
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 description 1
- 235000021405 artificial diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 description 1
- 210000000084 barbel Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000001202 beta-cyclodextrine Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- JIJAYWGYIDJVJI-UHFFFAOYSA-N butyl naphthalene-1-sulfonate Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)OCCCC)=CC=CC2=C1 JIJAYWGYIDJVJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220419549 c.148A>T Human genes 0.000 description 1
- 102220353355 c.1537T>C Human genes 0.000 description 1
- 102220347695 c.158C>G Human genes 0.000 description 1
- 102220350127 c.1606A>G Human genes 0.000 description 1
- 102220411547 c.161G>A Human genes 0.000 description 1
- 102220367265 c.161G>T Human genes 0.000 description 1
- 102220350964 c.1754C>T Human genes 0.000 description 1
- 102220377816 c.1819A>G Human genes 0.000 description 1
- 102220411563 c.209T>C Human genes 0.000 description 1
- 102220362560 c.215T>C Human genes 0.000 description 1
- 102220402474 c.221T>G Human genes 0.000 description 1
- 102200089577 c.239G>T Human genes 0.000 description 1
- 102220364503 c.245T>C Human genes 0.000 description 1
- 102220407733 c.248C>T Human genes 0.000 description 1
- 102220360502 c.272C>A Human genes 0.000 description 1
- 102220348247 c.278_279delGCinsTT Human genes 0.000 description 1
- 102220350736 c.475A>G Human genes 0.000 description 1
- 102200105583 c.590T>A Human genes 0.000 description 1
- 102220348047 c.628A>G Human genes 0.000 description 1
- 102220351620 c.71G>T Human genes 0.000 description 1
- 239000004301 calcium benzoate Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940117949 captan Drugs 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- GYSSRZJIHXQEHQ-UHFFFAOYSA-N carboxin Chemical compound S1CCOC(C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 GYSSRZJIHXQEHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000020226 cashew nut Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000001752 chlorophylls and chlorophyllins Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- KWABLUYIOFEZOY-UHFFFAOYSA-N dioctyl butanedioate Chemical compound CCCCCCCCOC(=O)CCC(=O)OCCCCCCCC KWABLUYIOFEZOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 102220500059 eIF5-mimic protein 2_S54V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000004495 emulsifiable concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 231100000290 environmental risk assessment Toxicity 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- YYJNOYZRYGDPNH-MFKUBSTISA-N fenpyroximate Chemical compound C=1C=C(C(=O)OC(C)(C)C)C=CC=1CO/N=C/C=1C(C)=NN(C)C=1OC1=CC=CC=C1 YYJNOYZRYGDPNH-MFKUBSTISA-N 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- SLGWESQGEUXWJQ-UHFFFAOYSA-N formaldehyde;phenol Chemical class O=C.OC1=CC=CC=C1 SLGWESQGEUXWJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000003008 fumonisin Substances 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 230000002140 halogenating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 208000006278 hypochromic anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003621 irrigation water Substances 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 230000000974 larvacidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013490 limbo Nutrition 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000711 locust bean gum Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000001035 marshmallow Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N methyl N-(2,6-dimethylphenyl)-N-(methoxyacetyl)alaninate Chemical compound COCC(=O)N(C(C)C(=O)OC)C1=C(C)C=CC=C1C ZQEIXNIJLIKNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000005609 naphthenate group Chemical group 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001769 paralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052615 phyllosilicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021110 pickles Nutrition 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- QHOQHJPRIBSPCY-UHFFFAOYSA-N pirimiphos-methyl Chemical group CCN(CC)C1=NC(C)=CC(OP(=S)(OC)OC)=N1 QHOQHJPRIBSPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 1
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102220033735 rs104886489 Human genes 0.000 description 1
- 102200006423 rs104894097 Human genes 0.000 description 1
- 102200075063 rs104894696 Human genes 0.000 description 1
- 102200106284 rs1057519989 Human genes 0.000 description 1
- 102200105621 rs1057520007 Human genes 0.000 description 1
- 102220285332 rs1060500685 Human genes 0.000 description 1
- 102200108230 rs1060501210 Human genes 0.000 description 1
- 102220221402 rs1060501866 Human genes 0.000 description 1
- 102220270119 rs1060501866 Human genes 0.000 description 1
- 102220214435 rs1060502010 Human genes 0.000 description 1
- 102220228178 rs1064793016 Human genes 0.000 description 1
- 102220226392 rs1064793291 Human genes 0.000 description 1
- 102220226542 rs1064794826 Human genes 0.000 description 1
- 102220226138 rs1064794906 Human genes 0.000 description 1
- 102220234242 rs1064795256 Human genes 0.000 description 1
- 102220226095 rs1064795914 Human genes 0.000 description 1
- 102220277239 rs1114167752 Human genes 0.000 description 1
- 102220234819 rs1131691026 Human genes 0.000 description 1
- 102220235485 rs1131691363 Human genes 0.000 description 1
- 102200128675 rs1136450 Human genes 0.000 description 1
- 102200057361 rs11583680 Human genes 0.000 description 1
- 102220044703 rs118029772 Human genes 0.000 description 1
- 102200029237 rs118203980 Human genes 0.000 description 1
- 102200079855 rs11862754 Human genes 0.000 description 1
- 102200068156 rs121909498 Human genes 0.000 description 1
- 102200156861 rs121964885 Human genes 0.000 description 1
- 102220282581 rs1227348505 Human genes 0.000 description 1
- 102220257511 rs1251859821 Human genes 0.000 description 1
- 102220344489 rs1332969540 Human genes 0.000 description 1
- 102220268178 rs1342625748 Human genes 0.000 description 1
- 102200090718 rs137852481 Human genes 0.000 description 1
- 102200109061 rs137852792 Human genes 0.000 description 1
- 102200109065 rs137852792 Human genes 0.000 description 1
- 102200010670 rs137853066 Human genes 0.000 description 1
- 102220036834 rs138780791 Human genes 0.000 description 1
- 102220214372 rs138857091 Human genes 0.000 description 1
- 102220124869 rs139283183 Human genes 0.000 description 1
- 102220062547 rs139920308 Human genes 0.000 description 1
- 102220285259 rs139920308 Human genes 0.000 description 1
- 102200061165 rs1441030187 Human genes 0.000 description 1
- 102200096286 rs154774633 Human genes 0.000 description 1
- 102220242992 rs1553178041 Human genes 0.000 description 1
- 102220313179 rs1553259785 Human genes 0.000 description 1
- 102220257281 rs1553350228 Human genes 0.000 description 1
- 102220289163 rs1553352536 Human genes 0.000 description 1
- 102220277085 rs1553366615 Human genes 0.000 description 1
- 102220277206 rs1553408288 Human genes 0.000 description 1
- 102220296976 rs1553411434 Human genes 0.000 description 1
- 102220286247 rs1553413026 Human genes 0.000 description 1
- 102200089630 rs1553619440 Human genes 0.000 description 1
- 102220277448 rs1553620318 Human genes 0.000 description 1
- 102220316839 rs1553642119 Human genes 0.000 description 1
- 102220277722 rs1553653095 Human genes 0.000 description 1
- 102220277689 rs1554067127 Human genes 0.000 description 1
- 102220317885 rs1554069716 Human genes 0.000 description 1
- 102220262997 rs1554425806 Human genes 0.000 description 1
- 102220270046 rs1555496979 Human genes 0.000 description 1
- 102220326942 rs1555496979 Human genes 0.000 description 1
- 102220273057 rs1555593541 Human genes 0.000 description 1
- 102220290526 rs1557084149 Human genes 0.000 description 1
- 102200079913 rs193302885 Human genes 0.000 description 1
- 102220340181 rs193302885 Human genes 0.000 description 1
- 102200079915 rs193302898 Human genes 0.000 description 1
- 102200027507 rs193922373 Human genes 0.000 description 1
- 102200097277 rs199472839 Human genes 0.000 description 1
- 102200097257 rs199472847 Human genes 0.000 description 1
- 102200096805 rs199472928 Human genes 0.000 description 1
- 102200096810 rs199472928 Human genes 0.000 description 1
- 102200096714 rs199472944 Human genes 0.000 description 1
- 102200097245 rs199473420 Human genes 0.000 description 1
- 102200096691 rs199473526 Human genes 0.000 description 1
- 102200031286 rs199475578 Human genes 0.000 description 1
- 102200031489 rs199475608 Human genes 0.000 description 1
- 102220034968 rs199475608 Human genes 0.000 description 1
- 102200031395 rs199475613 Human genes 0.000 description 1
- 102200031396 rs199475632 Human genes 0.000 description 1
- 102220034839 rs199475681 Human genes 0.000 description 1
- 102220082096 rs200135768 Human genes 0.000 description 1
- 102220027072 rs267607757 Human genes 0.000 description 1
- 102220046943 rs267608436 Human genes 0.000 description 1
- 102220046945 rs267608437 Human genes 0.000 description 1
- 102200067511 rs28897701 Human genes 0.000 description 1
- 102200091201 rs28940297 Human genes 0.000 description 1
- 102220215151 rs28940297 Human genes 0.000 description 1
- 102200058025 rs28941782 Human genes 0.000 description 1
- 102220184614 rs34474212 Human genes 0.000 description 1
- 102200118227 rs34579351 Human genes 0.000 description 1
- 102220005528 rs34814612 Human genes 0.000 description 1
- 102200101286 rs366439 Human genes 0.000 description 1
- 102220297471 rs368876169 Human genes 0.000 description 1
- 102220057458 rs370157832 Human genes 0.000 description 1
- 102220240059 rs370958429 Human genes 0.000 description 1
- 102220080264 rs372250472 Human genes 0.000 description 1
- 102220046092 rs377216828 Human genes 0.000 description 1
- 102200112892 rs387907099 Human genes 0.000 description 1
- 102220020162 rs397508045 Human genes 0.000 description 1
- 102220014288 rs397517019 Human genes 0.000 description 1
- 102200026235 rs41295288 Human genes 0.000 description 1
- 102220017759 rs45482691 Human genes 0.000 description 1
- 102200089631 rs5030808 Human genes 0.000 description 1
- 102220088396 rs5030808 Human genes 0.000 description 1
- 102200031319 rs5030847 Human genes 0.000 description 1
- 102220094510 rs550945533 Human genes 0.000 description 1
- 102220194811 rs550945533 Human genes 0.000 description 1
- 102220217511 rs556967140 Human genes 0.000 description 1
- 102220241675 rs561166961 Human genes 0.000 description 1
- 102200084788 rs566417795 Human genes 0.000 description 1
- 102220105326 rs574337291 Human genes 0.000 description 1
- 102200045853 rs587777221 Human genes 0.000 description 1
- 102220026963 rs587778999 Human genes 0.000 description 1
- 102220214547 rs587779098 Human genes 0.000 description 1
- 102220026506 rs587779314 Human genes 0.000 description 1
- 102220037467 rs587780299 Human genes 0.000 description 1
- 102220045036 rs587781777 Human genes 0.000 description 1
- 102220234240 rs587782352 Human genes 0.000 description 1
- 102220045785 rs587782391 Human genes 0.000 description 1
- 102220046377 rs587782877 Human genes 0.000 description 1
- 102220254686 rs60964124 Human genes 0.000 description 1
- 102200031292 rs62508588 Human genes 0.000 description 1
- 102220034922 rs62508588 Human genes 0.000 description 1
- 102220034901 rs62514928 Human genes 0.000 description 1
- 102200031318 rs62644503 Human genes 0.000 description 1
- 102220027068 rs63749924 Human genes 0.000 description 1
- 102200027504 rs63750124 Human genes 0.000 description 1
- 102220276953 rs63750597 Human genes 0.000 description 1
- 102200089407 rs63751005 Human genes 0.000 description 1
- 102200163548 rs63751094 Human genes 0.000 description 1
- 102220258019 rs63751094 Human genes 0.000 description 1
- 102200027407 rs63751656 Human genes 0.000 description 1
- 102220027459 rs63751656 Human genes 0.000 description 1
- 102200101936 rs72554345 Human genes 0.000 description 1
- 102200031398 rs74486803 Human genes 0.000 description 1
- 102220245725 rs745594726 Human genes 0.000 description 1
- 102220226214 rs745772518 Human genes 0.000 description 1
- 102220218616 rs746322193 Human genes 0.000 description 1
- 102220234238 rs749012012 Human genes 0.000 description 1
- 102220215027 rs751894165 Human genes 0.000 description 1
- 102220094059 rs755931648 Human genes 0.000 description 1
- 102220249713 rs755931648 Human genes 0.000 description 1
- 102220101981 rs758382516 Human genes 0.000 description 1
- 102200007394 rs758452450 Human genes 0.000 description 1
- 102220281497 rs761863504 Human genes 0.000 description 1
- 102220258539 rs765014361 Human genes 0.000 description 1
- 102220277242 rs765983691 Human genes 0.000 description 1
- 102220214379 rs766196837 Human genes 0.000 description 1
- 102220272575 rs767681165 Human genes 0.000 description 1
- 102220282910 rs769585673 Human genes 0.000 description 1
- 102220273066 rs771602677 Human genes 0.000 description 1
- 102220058934 rs772052262 Human genes 0.000 description 1
- 102220285447 rs774229223 Human genes 0.000 description 1
- 102220222692 rs775045445 Human genes 0.000 description 1
- 102220077168 rs775407864 Human genes 0.000 description 1
- 102200027929 rs77554925 Human genes 0.000 description 1
- 102200027933 rs77554925 Human genes 0.000 description 1
- 102220061222 rs786201058 Human genes 0.000 description 1
- 102200089579 rs786202787 Human genes 0.000 description 1
- 102220059220 rs786202787 Human genes 0.000 description 1
- 102220058973 rs786202987 Human genes 0.000 description 1
- 102220068351 rs794727480 Human genes 0.000 description 1
- 102220071648 rs794728371 Human genes 0.000 description 1
- 102220071716 rs794728494 Human genes 0.000 description 1
- 102220262583 rs794728494 Human genes 0.000 description 1
- 102220079057 rs797045521 Human genes 0.000 description 1
- 102200136879 rs80338910 Human genes 0.000 description 1
- 102220082942 rs863223870 Human genes 0.000 description 1
- 102220084332 rs863224872 Human genes 0.000 description 1
- 102220215230 rs876658416 Human genes 0.000 description 1
- 102200104397 rs876658714 Human genes 0.000 description 1
- 102220094503 rs876659361 Human genes 0.000 description 1
- 102220094506 rs876659390 Human genes 0.000 description 1
- 102220094474 rs876660707 Human genes 0.000 description 1
- 102220093260 rs876661043 Human genes 0.000 description 1
- 102220098561 rs878853232 Human genes 0.000 description 1
- 102220099521 rs878853821 Human genes 0.000 description 1
- 102220099742 rs878854125 Human genes 0.000 description 1
- 102220099736 rs878854129 Human genes 0.000 description 1
- 102220106575 rs879255355 Human genes 0.000 description 1
- 102220114164 rs886039183 Human genes 0.000 description 1
- 102220118512 rs886042078 Human genes 0.000 description 1
- 102220139845 rs886056142 Human genes 0.000 description 1
- 102200102857 rs967461896 Human genes 0.000 description 1
- 102200102861 rs967461896 Human genes 0.000 description 1
- 102200106287 rs985033810 Human genes 0.000 description 1
- 102200106289 rs985033810 Human genes 0.000 description 1
- 102200106291 rs985033810 Human genes 0.000 description 1
- 102200050421 rs9890841 Human genes 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940071089 sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940080236 sodium cetyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001476 sodium potassium tartrate Substances 0.000 description 1
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GGHPAKFFUZUEKL-UHFFFAOYSA-M sodium;hexadecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O GGHPAKFFUZUEKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NWZBFJYXRGSRGD-UHFFFAOYSA-M sodium;octadecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O NWZBFJYXRGSRGD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- HOWHQWFXSLOJEF-MGZLOUMQSA-N systemin Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)CCC1 HOWHQWFXSLOJEF-MGZLOUMQSA-N 0.000 description 1
- 108010050014 systemin Proteins 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229960002447 thiram Drugs 0.000 description 1
- KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N thiram Chemical compound CN(C)C(=S)SSC(=S)N(C)C KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 235000001019 trigonella foenum-graecum Nutrition 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 210000003135 vibrissae Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 102220502928 von Hippel-Lindau disease tumor suppressor_A122I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220502795 von Hippel-Lindau disease tumor suppressor_S80N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 101150103279 wip1 gene Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
- A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
- A01N37/46—N-acyl derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
- A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
- A01N65/22—Lamiaceae or Labiatae [Mint family], e.g. thyme, rosemary, skullcap, selfheal, lavender, perilla, pennyroyal, peppermint or spearmint
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
- A01N65/40—Liliopsida [monocotyledons]
- A01N65/44—Poaceae or Gramineae [Grass family], e.g. bamboo, lemon grass or citronella grass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к полипептиду Cry1B, который обладает повышенной инсектицидной активностью. Также раскрыты полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид; ДНК-конструкция, содержащая указанный полинуклеотид; клетка-хозяин, экспрессирующая указанный полинуклеотид; трансгенное растение, семя, композиция, содержащие указанный полипептид. Раскрыты способы уничтожения чешуекрылого вредителя; защиты растения от насекомого-вредителя с помощью указанного полипептида; получения указанного полипептида с инсектицидной активностью. Изобретение позволяет эффективно бороться с кукурузной совкой и травяной совкой. 13 н. и 14 з.п. ф-лы, 17 ил., 5 табл., 8 пр.
Description
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
Перечень последовательностей с названием файла ʺ5409WOPCT_SequenceListing.txtʺ, созданный 24 сентября 2015 года, и размером 267 килобайт подается в машиночитаемой форме одновременно с настоящим описанием. Перечень последовательностей является частью настоящего описания и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее раскрытие относится к рекомбинантным нуклеиновым кислотам, которые кодируют пестицидные полипептиды, обладающие инсектицидной активностью против кукурузной совки и/или травяной совки, и/или улучшенным спектром пестицидной активности в отношении насекомых-вредителей. В композициях и способах согласно настоящему раскрытию используются раскрытые нуклеиновые кислоты и кодируемые ими пестицидные полипептиды для контроля вредителей растений.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Насекомые-вредители являются основным фактором, причиняющим ущерб сельскохозяйственным культурам в мире. Например, питание совок, повреждение совкой-ипсилон или повреждение кукурузным мотыльком могут быть опустошительными в экономическом плане для сельскохозяйственных производителей. Связанный с насекомым-вредителем ущерб от нападений кукурузного мотылька только на полевую и сладкую кукурузу достиг приблизительно одного миллиарда долларов в год по издержкам от повреждения и затратам на контроль.
Традиционно, главным способом воздействия на популяции насекомых-вредителей является применение химических инсектицидов широкого спектра действия. Тем не менее, потребители, также как и осуществляющие регулирование правительственные органы становятся все более обеспокоенными риском неблагоприятного воздействия на окружающую среду, связанного с получением и применением синтетических химических пестицидов. Вследствие таких опасений регулирующие органы запретили или ограничили применение некоторых из более опасных пестицидов. Таким образом, разработка альтернативных пестицидов представляет значительный интерес.
Биологический контроль насекомых-вредителей, имеющих сельскохозяйственное значение, с применением микробного агента, такого как грибы, бактерии или другие виды насекомых, представляет собой не оказывающую негативного влияния на окружающую среду и коммерчески привлекательную альтернативу синтетическим химическим пестицидам. В целом можно сказать, что применение биопестицидов приводит к меньшему риску загрязнения и неблагоприятных воздействий на окружающую среду, и биопестициды обеспечивают большую специфичность по отношению к мишени, чем та, которая характерна для традиционных химических инсектицидов широкого спектра действия. Кроме того, зачастую производство биопестицидов стоит дешевле и, вследствие этого, улучшается экономически эффективный выход продукции для широкого спектра сельскохозяйственных культур.
Определенные виды микроорганизмов из рода Bacillus, как известно, обладают пестицидной активностью против широкого спектра насекомых-вредителей, в том числе Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera и других. Bacillus thuringiensis (Bt) и Bacillus papilliae входят в число наиболее успешных средств биологического контроля, обнаруженных к настоящему времени. Патогенность в отношении насекомых также приписывалась штаммам B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus (Harwook, ed., ((1989) Bacillus (Plenum Press), 306), и B. cereus (WO 96/10083). Пестицидная активность, как оказывается, сконцентрирована в параспоральных кристаллических белковых включениях, хотя пестицидные белки также были выделены из Bacillus на вегетативной стадии роста. Несколько генов, кодирующих эти пестицидные белки, были выделены и охарактеризованы (см., например, патенты США №№ 5,366,892 и 5,840,868).
Микробные инсектициды, в частности полученные от штаммов Bacillus, сыграли важную роль в сельском хозяйстве как альтернатива химическому контролю вредителей. Недавно ученые в области сельского хозяйства разработали культурные растения с улучшенной устойчивостью к насекомым при помощи генной инженерии культурных растений с тем, чтобы они продуцировали пестицидные белки, происходящие из Bacillus. Например, с помощью методик генной инженерии были созданы растения кукурузы и хлопчатника для продуцирования пестицидных белков, выделенных из штаммов Bt (см., например, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3):417-425; Schnepf et al. (1998) Microbiol Mol Biol Rev. 62(3):775-806). Эти сельскохозяйственные культуры, разработанные при помощи генной инженерии, в настоящее время широко применяются в американском сельском хозяйстве и предоставляют фермеру не оказывающую негативного влияния на окружающую среду альтернативу традиционным способам контроля насекомых. Кроме того, разновидности картофеля, измененные при помощи генной инженерии таким образом, чтобы они содержали пестицидные Cry токсины, реализовывались американским фермерам. В то время как они были признаны очень коммерчески успешными, эти разработанные при помощи генной инженерии устойчивые к насекомым культурные растения обеспечивают устойчивость только к узкому диапазону экономически важных насекомых-вредителей.
Соответственно, остается потребность в новых токсинах Bt с улучшенным спектром инсектицидной активности против насекомых-вредителей, например, в токсинах с улучшенной активностью против насекомых из отряда Lepidoptera и/или Coleoptera. Кроме того, остается потребность в биопестицидах, обладающих активностью против насекомых-вредителей, и в биопестицидах, которые обладают улучшенной инсектицидной активностью.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предусматриваются композиции и способы для оказания воздействия на насекомых-вредителей. Более конкретно, варианты осуществления настоящего раскрытия относятся к способам оказания воздействия на насекомых с использованием нуклеотидных последовательностей, кодирующих инсектицидные пептиды, способам получения трансформированных микроорганизмов и растений, которые экспрессируют инсектицидный полипептид согласно вариантам осуществления. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности кодируют полипептиды, которые являются пестицидными по меньшей мере для одного насекомого, принадлежащего к отряду Lepidoptera.
В некоторых аспектах предусматривают молекулы нуклеиновой кислоты и их фрагменты и варианты, которые кодируют полипептиды, обладающие пестицидной активностью против насекомых-вредителей (например, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, и SEQ ID NO: 46, и которые кодируют полипептид с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45, соответственно). Нуклеотидная последовательность дикого типа (например, встречающаяся в естественных условиях) согласно вариантам осуществления, которая была получена из Bt, кодирует инсектицидный пептид. Варианты осуществления дополнительно предусматривают фрагменты и варианты раскрытой нуклеотидной последовательности, которые кодируют биологически активные (например, инсектицидные) полипептиды.
В другом аспекте предусматривают вариантные полипептиды Cry1B, кодируемые модифицированной (например, подвергнутой мутагенезу или манипуляции) молекулой нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления. В конкретных примерах пестицидные белки согласно вариантам осуществления включают фрагменты белков и полипептидов полной длины, которые получены из подвергнутых мутагенезу нуклеиновых кислот, сконструированных для введения конкретных аминокислотных последовательностей в полипептиды согласно вариантам осуществления. В конкретных вариантах осуществления полипептиды обладают усиленной пестицидной активностью по сравнению с активностью встречающегося в естественных условиях полипептида, из которого они получены.
В другом аспекте нуклеиновые кислоты согласно вариантам осуществления также можно применять для получения трансгенных (например, трансформированных) однодольных или двудольных растений, которые характеризуются геномами, содержащими по меньшей мере одну стабильно встроенную нуклеотидную конструкцию, содержащую кодирующую последовательность согласно вариантам осуществления, функционально связанную с промотором, который управляет экспрессией кодируемого пестицидного полипептида. Соответственно, также предусматриваются трансформированные растительные клетки, ткани растений, растения и их семена.
В другом аспекте трансформированное растение можно получить с применением нуклеиновой кислоты, которая была оптимизирована для повышенной экспрессии в растении-хозяине. Например, один из пестицидных полипептидов согласно вариантам осуществления может быть восстановлен по полипептидной последовательности с получением нуклеиновой кислоты, содержащей кодоны, оптимизированные для экспрессии в конкретном хозяине, например, в культурном растении, таком как растение кукурузы (Zea mays). Экспрессия кодирующей последовательности таким трансформированным растением (например, двудольным или однодольным) будет приводить в результате к выработке пестицидного полипептида и придавать растению повышенную устойчивость к насекомым. Некоторые варианты осуществления предусматривают трансгенные растения, экспрессирующие пестицидные полипептиды, которые находят применение в способах оказания воздействия на различных насекомых-вредителей.
В другом аспекте предусматривают пестицидные или инсектицидные композиции, содержащие вариантные полипептиды Cry1B согласно вариантам осуществления, при этом композиция может необязательно содержать дополнительные инсектицидные пептиды. Варианты осуществления охватывают применение таких композиций по отношению к среде обитания насекомых-вредителей с целью воздействия на насекомых-вредителей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1a - 1g показано выравнивание аминокислотных последовательностей Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), IP1B-B1 (SEQ ID NO: 3), IP1B-B21 (SEQ ID NO: 5), IP1B-B22 (SEQ ID NO: 7), IP1B-B23 (SEQ ID NO: 9), IP1B-B24 (SEQ ID NO: 11), IP1B-B25 (SEQ ID NO: 13), IP1B-B26 (SEQ ID NO: 15), IP1B-B27 (SEQ ID NO: 17), IP1B-B28 (SEQ ID NO: 19), IP1B-B29 (SEQ ID NO: 21), IP1B-B31 (SEQ ID NO: 23), IP1B-B32 (SEQ ID NO: 25), IP1B-B33 (SEQ ID NO: 27), IP1B-B34 (SEQ ID NO: 29), IP1B-B40 (SEQ ID NO: 31), IP1B-B41 (SEQ ID NO: 33), IP1B-B42 (SEQ ID NO: 35), IP1B-B43 (SEQ ID NO: 37), IP1B-B44 (SEQ ID NO: 39), IP1B-B45 (SEQ ID NO: 41), IP1B-B46 (SEQ ID NO: 43), IP1B-B47 (SEQ ID NO: 45), MP258 (SEQ ID NO: 47), и GS060 (SEQ ID NO: 49) с использованием модуля ALIGNX® программного пакета Vector NTI®. Выделено отличие аминокислотных последовательностей между полипептидами Cry1B.
На фигуре 2a - 2e показана аминокислотная последовательность MP258 с лидерным участком (*), доменом I (#), доменом II (&) и доменом III (!), обозначенными ниже последовательности.
На фигуре 3 показано выравнивание аминокислотных последовательностей с использованием модуля ALIGNX® программного пакета Vector NTI® домена I Cry1Be-типа Cry1Be (аминокислоты 35-276 в SEQ ID NO: 58) и домена I Cry1Be-типа MP258 (аминокислоты 36-276 в SEQ ID NO: 47). Выделено отличие аминокислот в доменах I полипептидов Cry1B.
На фигуре 4 показано выравнивание аминокислотных последовательностей домена III Cry1Ah (SEQ ID NO: 61), Cry1Bd, Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54), и MP258 (SEQ ID NO: 47) с использованием модуля ALIGNX® программного пакета Vector NTI®. Выделено отличие аминокислот в домене III полипептидов Cry1B.
На фигуре 5a - 5c показано выравнивание аминокислотных последовательностей домена I и домена II MP258 (SEQ ID NO: 47), Cry1Be (SEQ ID NO: 58), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54), Cry1Bg (SEQ ID NO: 60), Cry1Bf (SEQ ID NO: 59), Cry1Ba (SEQ ID NO: 55), Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), Cry1Bb (SEQ ID NO: 56), и Cry1Bc (SEQ ID NO: 57) с использованием модуля ALIGNX® пакета Vector NTI®. Выделено отличие аминокислот в домене I и домене II полипептидов Cry1B.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Варианты осуществления настоящего раскрытия направлены на композиции и способы для оказания воздействия на насекомых-вредителей, в частности, на вредителей растений. Более конкретно, выделенная нуклеиновая кислота согласно вариантам осуществления, а также ее фрагменты и варианты содержат нуклеотидные последовательности, которые кодируют пестицидные полипептиды (например, белки). Раскрытые пестицидные белки являются биологически активными (например, пестицидными) против насекомых-вредителей, таких как без ограничения насекомые-вредители отряда Lepidoptera и/или Coleoptera.
Композиции согласно вариантам осуществления предусматривают выделенные нуклеиновые кислоты, а также их фрагменты и варианты, которые кодируют пестицидные полипептиды, кассеты экспрессии, содержащие нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления, выделенные пестицидные белки и пестицидные композиции. Некоторые варианты осуществления предусматривают модифицированные пестицидные полипептиды, обладающие улучшенной инсектицидной активностью против чешуекрылых по сравнению с пестицидной активностью соответствующего белка дикого типа. Варианты осуществления дополнительно предусматривают растения и микроорганизмы, трансформированные этими новыми нуклеиновыми кислотами, и способы, предполагающие применение таких нуклеиновых кислот, пестицидных композиций, трансформированных организмов и продуктов из них при оказании воздействия на насекомых-вредителей.
Нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно применять для трансформации любого организма для выработки кодируемых пестицидных белков. Предусматриваются способы, которые предполагают применение таких трансформированных организмов для воздействия на вредителей растений или для их контроля. Нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно также использовать для трансформации органелл, таких как хлоропласты (McBride et al. (1995) Biotechnology 13: 362-365; и Kota et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1840-1845).
Помимо этого, варианты осуществления относятся к идентификации фрагментов и вариантов встречающейся в естественных условиях кодирующей последовательности, которые кодируют биологически активные пестицидные белки. Нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления находят непосредственное применение в способах оказания воздействия на вредителей, в особенности на насекомых-вредителей, таких как вредители из отряда Lepidoptera. Соответственно, варианты осуществления предусматривают новые подходы к оказанию воздействия на насекомых-вредителей, которые не зависят от применения традиционных синтетических химических инсектицидов. Варианты осуществления предполагают выявление встречающихся в естественных условиях биоразлагаемых пестицидов и генов, которые их кодируют.
Варианты осуществления дополнительно предусматривают фрагменты и варианты встречающейся в естественных условиях кодирующей последовательности, которые также кодируют биологически активные (например, пестицидные) полипептиды. Нуклеиновые кислоты согласно вариантам осуществления охватывают последовательности нуклеиновой кислоты или нуклеотидные последовательности, которые были оптимизированы для экспрессии клетками конкретного организма, например, последовательности нуклеиновой кислоты, которые были восстановлены по полипептидной последовательности (т.е. подвергнуты "обратной трансляции") с использованием предпочтительных для растений кодонов на основе аминокислотной последовательности полипептида с усиленной пестицидной активностью. Варианты осуществления дополнительно предусматривают мутации, которые придают улучшенные или измененные свойства полипептидам согласно вариантам осуществления, см., например, патент США № 7,462,760.
В последующем описании широко применяется ряд выражений. Следующие определения представлены для облегчения понимания вариантов осуществления.
Единицы измерения, приставки и обозначения можно обозначить в форме, принятой в системе СИ. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записаны слева направо в ориентации от 5' к 3'; аминокислотные последовательности записаны, соответственно, слева направо в направлении от аминогруппы к карбоксигруппе. Область числовых значений включает числа, определяющие диапазон. Аминокислоты в данном документе могут быть названы либо по их общеизвестным трехбуквенным обозначениям, либо по однобуквенным обозначениям, рекомендованным комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Нуклеотиды, аналогичным образом, могут быть названы по их общепринятым однобуквенным кодам. Вышеупомянутые термины более полно определены со ссылкой на настоящее описание в целом.
Как используется в данном документе, "нуклеиновая кислота" включает ссылки на дезоксирибонуклеотидный или рибонуклеотидный полимер или в одно-, или в двухнитевой форме и, если не ограничен иным образом, охватывает известные аналоги (например, пептидо-нуклеиновые кислоты), обладающие основными свойствами природных нуклеотидов, заключающимися в том, что они гибридизуются с однонитевыми нуклеиновыми кислотами подобно встречающимся в естественных условиях нуклеотидам.
Используемые в данном документе термины "кодирующий" или "кодируемый", когда они используются в контексте определенной нуклеиновой кислоты, означают, что нуклеиновая кислота содержит необходимую информацию для управления трансляцией нуклеотидной последовательности в определенный белок. Информация, которой кодируется белок, определяется применением кодонов. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок, может содержать нетранслируемые последовательности (например, интроны) в границах транслируемых участков нуклеиновой кислоты или может не содержать такие промежуточные нетранслируемые последовательности (например, как в кДНК).
Используемая в данном документе фраза "последовательность полной длины" в отношении определенного полинуклеотида или кодируемого им белка означает наличие полной последовательности нуклеиновой кислоты или полной аминокислотной последовательности нативной (несинтетической) эндогенной последовательности. Полинуклеотид полной длины кодирует полноразмерную каталитически активную форму определенного белка.
Используемый в данном документе термин "антисмысловая" при использовании в контексте ориентации нуклеотидной последовательности, относится к дуплексной последовательности полинуклеотида, которая функционально связана с промотором в ориентации, при которой транскрибируется антисмысловая нить. Антисмысловая нить в значительной степени комплементарна эндогенному продукту транскрипции, так что трансляция эндогенного продукта транскрипции часто подавляется. Таким образом, в случаях, когда термин ʺантисмысловаяʺ используется в контексте конкретной нуклеотидной последовательности, термин относится к комплементарной нити для эталонного продукта транскрипции.
Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины используют в отношении аминокислотных полимеров, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический аналог соответствующей встречающейся в естественных условиях аминокислоты, а также в отношении встречающихся в естественных условиях аминокислотных полимеров.
Термины "остаток", или "аминокислотный остаток", или "аминокислота" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к аминокислоте, которая встроена в белок, полипептид или пептид (в собирательном значении "белок"). Аминокислота может представлять собой встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, и, если не ограничивается иным образом, она может охватывать известные аналоги природных аминокислот, которые могут функционировать подобно встречающимся в естественных условиях аминокислотам.
Полипептиды согласно вариантам осуществления можно получить либо из нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, либо посредством применения стандартных методик молекулярной биологии. Например, белок согласно вариантам осуществления можно получить путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления в соответствующей клетке-хозяине или, в качестве альтернативы, при помощи комбинации ex vivo процедур.
Используемые в данном документе термины "выделенный" и "очищенный" используются взаимозаменяемо и относятся к нуклеиновым кислотам или полипептидам или их биологически активным частям, которые практически или, по сути, не содержат компонентов, которые в норме сопутствуют или взаимодействуют с нуклеиновой кислотой или полипептидом, когда те находятся в естественном окружении. Таким образом, выделенные или очищенные нуклеиновая кислота или полипептид практически не содержат другой клеточный материал или культуральную среду при получении с помощью рекомбинантных методик, или практически не содержат химических предшественников или других химических продуктов, если они синтезированы химическим способом.
"Выделенная" нуклеиновая кислота обычно не содержит последовательности (такие как, например, последовательности, кодирующие белок), которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, расположенных на 5' и 3' концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. Например, в различных вариантах осуществления выделенные нуклеиновые кислоты могут содержать менее приблизительно 5 т.о., 4 т.о., 3 т.о., 2 т.о., 1 т.о., 0,5 т.о. или 0,1 т.о. нуклеотидных последовательностей, которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновые кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена нуклеиновая кислота.
Используемые в данном документе термины "выделенный" или "очищенный" в случае, когда они используются в отношении полипептида согласно вариантам осуществления, означают, что выделенный белок практически не содержит клеточный материал и включает препараты белка, содержащие менее приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (по сухому весу) загрязняющего белка. Если белок согласно вариантам осуществления или его биологически активная часть являются полученными с помощью методик рекомбинантных ДНК, то культуральная среда представляет менее приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (по сухому весу) химических предшественников или химических продуктов, не являющихся белком, представляющим интерес.
ʺРекомбинантнаяʺ молекула нуклеиновой кислоты (или ДНК) применяется в данном документе для обозначения последовательности нуклеиновой кислоты (или ДНК), которая находится в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления ʺвыделеннаяʺ или ʺрекомбинантнаяʺ нуклеиновая кислота не содержит последовательности (предпочтительно, последовательности, кодирующие белок), которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е., последовательности, расположенные на 5′- и 3′-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. В контексте настоящего раскрытия термины ʺвыделенныеʺ или ʺрекомбинантныеʺ при применении для обозначения молекул нуклеиновой кислоты исключают выделенные хромосомы.
Применяемые в данном документе ʺпоследовательность нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномнойʺ или ʺмолекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномнойʺ относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, которая имеет одно или несколько изменений в последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с нативной или геномной последовательностью нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изменение по отношению к нативной или геномной молекуле нуклеиновой кислоты включает без ограничения: изменения в последовательности нуклеиновой кислоты, обусловленные вырожденностью генетического кода; оптимизацию кодонов последовательности нуклеиновой кислоты для экспрессии в растениях; изменения в последовательности нуклеиновой кислоты для введения по меньшей мере одной аминокислотной замены, вставки, делеции и/или добавления по сравнению с нативной или геномной последовательностью; удаление одного или нескольких интронов, ассоциированных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных интронов; делецию одного или нескольких регуляторных участков, расположенных выше или ниже, ассоциированных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных регуляторных участков, расположенных выше или ниже; делецию 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка, ассоциированного с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку гетерологичного 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка и модификацию сайта полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой кДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты.
Будет понятно, что по всей заявке слово "содержащий" или варианты, такие как "содержит" или "содержащий", подразумевает включение приведенного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, а не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.
Используемый в данном документе термин "воздействие на насекомых-вредителей" относится к осуществлению изменений питания, роста и/или поведения насекомого на любой стадии развития, в том числе без ограничения к уничтожению насекомого; задержке роста; предотвращению возникновения способности к репродукции; антифидантной активности и т.п.
Используемые в данном документе термины "пестицидная активность" и "инсектицидная активность" используются как синонимы и относятся к активности организма или вещества (такого как, например, белок), которую можно измерить, но без ограничения, по смертности вредителя, потере веса вредителем, отпугиванию вредителя и другим изменениям поведения и физических характеристик вредителя после питания и воздействия в течение соответствующего периода времени. Таким образом, организм или вещество с пестицидной активностью оказывает отрицательное воздействие по меньшей мере на один измеряемый параметр приспособляемости вредителя. Например, "пестицидные белки" представляют собой белки, которые проявляют пестицидную активность сами по себе или в комбинации с другими белками.
Используемый в данном документе термин "пестицидно эффективное количество" означает количество вещества или организма, который обладает пестицидной активностью, когда присутствует в среде обитания вредителя. Для каждого вещества или организма пестицидно эффективное количество определяют эмпирически в отношении каждого вредителя, подверженного влиянию в специфической среде. Аналогично, "инсектицидно эффективное количество" может быть использовано для обозначения "пестицидно эффективного количества", когда вредитель представляет собой вредителя-насекомого.
Используемые в данном документе термины "рекомбинантно сконструированный" или ʺсконструированныйʺ означают использование технологии рекомбинантной ДНК для внесения (например, при конструировании) изменения в структуру белка, исходя из понимания механизма действия белка и анализа аминокислот, которые вводят, удаляют или заменяют.
Используемые в данном документе термины ʺмутантная нуклеотидная последовательностьʺ, или ʺмутацияʺ, или "подвергнутая мутагенезу нуклеотидная последовательность" означают нуклеотидную последовательность, которая была подвергнута мутагенезу или изменена таким образом, чтобы она содержала один или несколько нуклеотидных остатков (например, пару оснований), которые не присутствуют в соответствующей последовательности дикого типа. Такой мутагенез или изменение заключаются в одном или нескольких добавлениях, делециях, или заменах, или замещениях остатков нуклеиновой кислоты. Если мутации созданы путем добавления, удаления или замены аминокислоты в сайте протеолитического расщепления, такие добавление, удаление или замена могут присутствовать в пределах мотива протеолитического сайта или прилегать к нему при условии, что цель мутации достигается (т.е. при условии, что протеолиз по данному сайту изменен).
Мутантная нуклеотидная последовательность может кодировать мутантный инсектицидный токсин, проявляющий улучшенную или пониженную инсектицидную активность, или аминокислотную последовательность, которая придает улучшенную или пониженную инсектицидную активность полипептиду, содержащему ее. Используемые в данном документе термины ʺмутантʺ или ʺмутацияʺ в контексте белка, полипептидной или аминокислотной последовательности относятся к последовательности, которая была подвергнута мутагенезу или изменена таким образом, чтобы она содержала один или несколько аминокислотных остатков, которые не присутствуют в соответствующей последовательности дикого типа. Такой мутагенез или изменение заключается в одном или нескольких добавлениях, делециях, или заменах, или замещениях аминокислотных остатков. Мутантный полипептид проявляет улучшенную или пониженную инсектицидную активность или представляет собой аминокислотную последовательность, которая придает улучшенную инсектицидную активность полипептиду, содержащему ее. Таким образом, термины ʺмутантʺ или ʺмутацияʺ относятся к любому из мутантной нуклеотидной последовательности и кодируемых аминокислот или к ним обоим. Мутантов можно использовать отдельно или в любой совместимой комбинации с другими мутантами согласно вариантам осуществления или с другими мутантами. ʺМутантный полипептидʺ может, напротив, проявлять снижение инсектицидной активности. В случае, когда более чем одну мутацию добавляют к конкретной нуклеиновой кислоте или белку, мутации могут быть добавлены одновременно или последовательно; если последовательно, мутации могут быть добавлены в любом подходящем порядке.
Используемые в данном документе термины "улучшенная инсектицидная активность" или ʺулучшенная пестицидная активностьʺ относятся к инсектицидному полипептиду согласно вариантам осуществления, который обладает усиленной инсектицидной активностью по сравнению с активностью соответствующего ему белка дикого типа, и/или к инсектицидному полипептиду, который является эффективным против более широкого спектра насекомых, и/или к инсектицидному полипептиду, характеризующемуся специфичностью по отношению к насекомому, которое не чувствительно к токсичности белка дикого типа. Заключение об улучшенной или усиленной пестицидной активности требует демонстрации повышения пестицидной активности по меньшей мере на 10% против насекомого-мишени или повышения пестицидной активности по меньшей мере на 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 100%, 150%, 200% или 300% или более по сравнению с пестицидной активностью инсектицидного полипептида дикого типа, определенной в отношении такого же насекомого.
Например, улучшенная пестицидная или инсектицидная активность обеспечивается в тех случаях, когда полипептид оказывает воздействие на более широкий или более узкий спектр насекомых по сравнению со спектром насекомых, на которые воздействует Bt токсин дикого типа. Более широкий спектр воздействия может быть желательным в тех случаях, когда необходима универсальность, тогда как более узкий спектр воздействия может быть желателен в тех случаях, когда, например, в иных обстоятельствах полезные насекомые могут подвергнуться воздействию при применении или присутствии токсина. Хотя варианты осуществления не привязаны к какому-либо конкретному механизму действия, улучшенную пестицидную активность также можно обеспечить посредством изменений одной или нескольких характеристик полипептида; например, стабильность или продолжительность существования полипептида в кишечнике насекомого могут быть увеличены по сравнению со стабильностью или продолжительностью существования соответствующего белка дикого типа.
Используемый в данном документе термин ʺтоксинʺ относится к полипептиду, проявляющему пестицидную активность, или инсектицидную активность, или улучшенную пестицидную активность, или улучшенную инсектицидную активность. Токсин ʺBtʺ или ʺBacillus thuringiensisʺ, как предполагается, включает более широкий класс Cry токсинов, обнаруживающихся в различных штаммах Bt, который включает такие токсины, как, например, Cry1s, Cry2s или Cry3s.
Термины ʺсайт протеолитического расщепленияʺ или ʺсайт расщепленияʺ относятся к аминокислотной последовательности, которая придает чувствительность к классу протеаз или конкретной протеазе таким образом, что полипептид, содержащий эту аминокислотную последовательность, расщепляется классом протеаз или конкретной протеазой. Сайт протеолитического расщепления считается ʺчувствительнымʺ к протеазе (протеазам), которая распознает этот сайт. Из уровня техники известно, что эффективность расщепления будет варьировать, и что снижение эффективности расщепления может привести к увеличению стабильности или продолжительности существования полипептида в кишечнике насекомого. Таким образом, протеолитический сайт может придавать чувствительность к более чем одной протеазе или классу протеаз, но эффективность расщепления по этому сайту может варьировать для различных протеаз. Сайты протеолитического расщепления включают, например, сайты для трипсина, сайты для химотрипсина и сайты для эластазы.
Исследование показало, что протеазы кишечника насекомого, относящегося к чешуекрылым, включают трипсины, химотрипсины и эластазы, см., например, Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212; и Hedegus et al. (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53: 30-47. Например, приблизительно 18 различных трипсинов было обнаружено в средней кишке личинки Helicoverpa armigera (см.,Gatehouse et al. (1997) Insect Biochem. Mol. Biol. 27: 929-944). Были выявлены предпочтительные сайты-субстраты для протеолитического расщепления этими протеазами, см., например, Peterson et al. (1995) Insect Biochem. Mol. Biol. 25: 765-774.
Предпринимались попытки понять механизм действия Bt токсинов и сконструировать токсины с улучшенными свойствами. Было показано, что протеазы кишечника насекомого могут оказывать влияние на воздействие Cry белков Bt на насекомое. Некоторые протеазы активируют Cry белки посредством их процессинга из формы ʺпротоксинаʺ в токсичную форму, или ʺтоксинʺ, см., Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42: 1-12; и Carroll et al. (1997) J. Invertebrate Pathology 70: 41-49. Эта активация токсина может включать удаление N- и C-концевых пептидов из белка, а также может включать внутреннее расщепление белка. Другие протеазы могут разлагать Cry белки. См., Oppert, там же.
Сравнение аминокислотных последовательностей Cry токсинов с различной специфичностью выявило пять высококонсервативных блоков последовательностей. В плане структуры токсины содержат три отдельных домена, которые представляют собой, от N- к C-концу: кластер из семи альфа-спиралей, вовлеченных в образовании поры (называемый ʺдоменом Iʺ), три антипараллельных бета-листа, вовлеченных в связывание с клеткой (называемые ʺдоменом 2ʺ), и бета-сэндвич (называемый ʺдоменом 3ʺ). Расположение и свойства этих доменов известны специалисту в данной области техники. см., например, Li et al. (1991) Nature, 305:815-821 и Morse et al. (2001) Structure, 9:409-417. Если упоминается конкретный домен, например, домен I, следует понимать, что точные конечные характеристики домена применительно к конкретной последовательности не являются решающими при условии, что последовательность или ее часть включает в себя последовательность, которая обеспечивает по меньшей мере какую-либо функцию, приписываемую конкретному домену. Таким образом, например, при упоминании ʺдомена Iʺ предполагается, что конкретная последовательность включает в себя кластер из семи альфа-спиралей, но точные конечные показатели последовательности, используемой или упоминаемой применительно к данному кластеру, не являются решающими. Специалисту в данной области техники знакомы определение таких конечных показателей и оценка таких функций.
В попытке улучшить токсины Cry2B была предпринята попытка идентифицировать нуклеотидные последовательности, кодирующие белки кристаллов из выбранных штаммов, которые обладают улучшенной активностью по сравнению с нативным токсином. В зависимости от характеристик данного препарата считается, что демонстрация пестицидной активности иногда требует предварительной обработки трипсином для активации пестицидных белков. Таким образом, понятно, что некоторые пестицидные белки требуют расщепления протеазой (например, трипсином, химотрипсином и т.п.) для активации, тогда как другие белки являются биологически активными (например, пестицидными) в отсутствие активации.
Такие молекулы можно изменять с помощью средств, описанных, например, в патенте США № 7462760. Кроме того, последовательности нуклеиновой кислоты можно сконструировать таким образом, чтобы они кодировали полипептиды, которые содержат дополнительные мутации, придающие улучшенную или измененную пестицидную активность по сравнению с пестицидной активностью встречающегося в естественных условиях полипептида. Нуклеотидные последовательности таких сконструированных нуклеиновых кислот содержат мутации, не обнаруживающиеся в последовательностях дикого типа.
Мутантные полипептиды согласно вариантам осуществления обычно получают с помощью способа, который включает стадии получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид семейства Cry; анализа структуры полипептида для идентификации конкретных сайтов-"мишеней" для мутагенеза лежащей в основе генной последовательности исходя из представлений о предполагаемой функции домена-мишени и механизма действия токсина; введения одной или нескольких мутаций в последовательность нуклеиновой кислоты с получением необходимого изменения в одном или нескольких аминокислотных остатках кодируемой полипептидной последовательности и анализа полученного полипептида в отношении пестицидной активности.
Многие из инсектицидных Bt токсинов являются родственными с различными степенями сходства их аминокислотных последовательностей и третичной структуры, и при этом средства для получения кристаллических структур Bt токсинов являются хорошо известными. Иллюстративные результаты расчета кристаллической структуры с высоким разрешением для полипептидов как Cry3A, так и Cry3B доступны в литературе. Рассчитанная структура Cry3A (Li et al. (1991) Nature 353:815-821) обеспечивает понимание взаимосвязи между структурой и функцией токсина. Совместное рассмотрение опубликованных структурных анализов Bt токсинов и описанной функции, связанной с конкретными структурами, мотивами и т.п., указывает на то, что специфические участки токсина соотносятся с конкретными функциями и отдельными стадиями механизма действия белка. Например, многие токсины, выделенные из Bt, обычно описывают как содержащие три домена: пучок из семи спиралей, который вовлечен в образование поры, домен из трех листов, который вовлечен в связывание с рецептором, и бета-сэндвич мотив (Li et al. (1991) Nature 305: 815-821).
Как описано в патентах США № 7105332 и № 7462760, токсичность белков Cry можно улучшить путем целенаправленного воздействия на участок, расположенный между альфа-спиралями 3 и 4 в домене I токсина. Эта теория основывается на совокупности знаний, имеющих отношение к инсектицидным токсинам, в том числе: 1) о том, что альфа-спирали 4 и 5 в домене I токсинов Cry3A, как сообщалось, встраиваются в липидный бислой клеток, выстилающих среднюю кишку чувствительных насекомых (Gazit et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12289-12294); 2) на знаниях авторов настоящего изобретения о расположении сайтов расщепления трипсином и химотрипсином в аминокислотной последовательности белка дикого типа; 3) на наблюдении, что белок дикого типа был более активным против определенных насекомых после активации in vitro при обработке трипсином или химотрипсином; и 4) на сообщениях о том, что расщепление токсинов с 3' конца приводило в результате к пониженной токсичности в отношении насекомых.
Для создания новых полипептидов с усиленной или измененной пестицидной активностью можно создать ряд мутаций и поместить в различные фоновые последовательности. См., например, патент США № 7462760. Эти мутанты предусматривают без ограничения добавление по меньшей мере одного дополнительного чувствительного к протеазе сайта (например, сайт расщепления для трипсина) в участок, расположенный между спиралями 3 и 4 в домене I; замещение исходного чувствительного к протеазе сайта в последовательности дикого типа отличающимся чувствительным к протеазе сайтом; добавление нескольких чувствительных к протеазе сайтов в конкретном положении; добавление аминокислотных остатков рядом с чувствительным к протеазе сайтом(сайтами) для изменения фолдинга полипептида и, таким образом, усиления расщепления полипептида в чувствительном к протеазе сайте(сайтах); и добавление мутаций для защиты полипептида от разрушающего расщепления, которое снижает токсичность (например, создание ряда мутаций, при которых аминокислота дикого типа заменяется валином для защиты полипептида от расщепления). Мутации можно использовать по отдельности или в любой комбинации для обеспечения полипептидов согласно вариантам осуществления.
Гомологичные последовательности идентифицировали с помощью поиска сходства в неизбыточной (nr) базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) с использованием BLAST и PSI-BLAST. Гомологичные белки состояли из Cry токсинов преимущественно из Bacillus thuringiensis.
Мутация, которая представляет собой дополнительный или альтернативный чувствительный к протеазе сайт, может быть чувствительной к нескольким классам протеаз, таких как сериновые протеазы, которые включают трипсин и химотрипсин, или ферментов, таких как эластаза. Таким образом, мутацию, которая представляет собой дополнительный или альтернативный чувствительный к протеазе сайт, можно сконструировать для того, чтобы сайт легко распознавался и/или расщеплялся категорией протеаз, таких как протеазы млекопитающих или протеазы насекомых. Чувствительный к протеазе сайт также можно сконструировать таким образом, чтобы он расщеплялся конкретным классом ферментов или конкретным ферментом, о котором известно, что он продуцируется в организме, таким как, например, химотрипсин, продуцируемый кукурузной совкой Heliothis zea (Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212). Мутации также могут придавать устойчивость к протеолитическому расщеплению, например, к расщеплению химотрипсином по C-концу пептида.
Наличие дополнительного и/или альтернативного чувствительного к протеазе сайта в аминокислотной последовательности кодируемого полипептида может улучшить пестицидную активность и/или специфичность полипептида, кодируемого нуклеиновыми кислотами согласно вариантам осуществления. Соответственно, нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления могут быть рекомбинантно сконструированными или с ними могут быть произведены манипуляции для получения полипептидов с улучшенной или измененной инсектицидной активностью и/или специфичностью по сравнению с таковыми у немодифицированного токсина дикого типа. Кроме того, мутации, раскрытые в данном документе, можно поместить в другие нуклеотидные последовательности или применять в сочетании с ними для обеспечения улучшенных свойств. Например, чувствительный к протеазе сайт, который легко расщепляется химотрипсином насекомого, например, химотрипсином, обнаруженный у совки Берта или кукурузной совки (Hegedus et al. (2003) Arch. Insect Biochem. Physiol. 53: 30-47; и Lenz et al. (1991) Arch. Insect Biochem. Physiol. 16: 201-212), можно поместить в фоновую последовательность Cry для обеспечения улучшенной токсичности у этой последовательности. Таким образом, варианты осуществления предусматривают токсичные полипептиды с улучшенными свойствами.
Например, подвергнутая мутагенезу нуклеотидная последовательность Cry может предусматривать дополнительные мутанты, содержащие дополнительные кодоны, которые вводят вторую чувствительную к трипсину аминокислотную последовательность (дополнительно к встречающемуся в естественных условиях сайту для трипсина) в кодируемый полипептид. Альтернативный дополнительный мутант согласно вариантам осуществления предусматривает дополнительные кодоны, сконструированные для введения по меньшей мере одного дополнительного отличающегося чувствительного к протеазе сайта в полипептид, например, чувствительного к химотрипсину сайта, расположенного непосредственно в направлении 5' или 3' от встречающегося в естественных условиях сайта для трипсина. В качестве альтернативы, можно создать мутантов с заменой, у которых по меньшей мере один кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует встречающийся в естественных условиях чувствительный к протеазе сайт, разрушен, а альтернативные кодоны введены в последовательность нуклеиновой кислоты с целью обеспечения отличающегося (например, замененного) чувствительного к протеазе сайта. Мутант с замещением также может быть добавлен к последовательности Cry, в которой встречающийся в естественных условиях сайт расщепления для трипсина, присутствующий в кодируемом полипептиде, разрушен, а сайт расщепления для химотрипсина или эластазы введен на его место.
Считается, что можно применять любую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности, которые представляют собой сайты протеолитического расщепления или предполагаемые сайты протеолитического расщепления (например, последовательности, такие как RR или LKM), и что точная идентичность кодонов, используемых для введения любого из этих сайтов расщепления в вариантный полипептид, может варьировать в зависимости от применения, т.е. экспрессии в конкретном виде растений. Также считается, что любую из раскрытых мутаций можно ввести в любую последовательность полинуклеотида согласно вариантам осуществления, которая содержит кодоны для аминокислотных остатков, обеспечивающих нативный сайт расщепления для трипсина, на который целенаправленно воздействует модификация. Соответственно, варианты либо токсинов полной длины, либо их фрагментов можно модифицировать таким образом, чтобы они содержали дополнительные или альтернативные сайты расщепления, и предполагается, что эти варианты осуществления охватываются объемом вариантов осуществления, раскрытых в данном документе.
Специалист в данной области техники поймет, что любую полезную мутацию можно добавить к последовательностям согласно вариантам осуществления при условии, что кодируемые полипептиды сохраняют пестицидную активность. Таким образом, последовательности также можно подвергнуть мутагенезу с тем, чтобы кодируемые полипептиды были устойчивы к протеолитическому расщеплению химотрипсином. Более одного сайта распознавания можно добавить в конкретном положении в любой комбинации, и при этом несколько сайтов распознавания можно добавить к токсину или удалить из него. Таким образом, дополнительные мутации могут содержать три, четыре или более сайтов распознавания. Следует понимать, что несколько мутаций можно сконструировать в любой подходящей последовательности полинуклеотида; соответственно, либо последовательности полной длины, либо их фрагменты можно модифицировать таким образом, чтобы они содержали дополнительные или альтернативные сайты расщепления, а также были устойчивы к протеолитическому расщеплению. Таким образом, варианты осуществления предусматривают Cry токсины, содержащие мутации, которые улучшают пестицидную активность, а также улучшенные композиции и способы оказания воздействия на вредителей с использованием других Bt токсинов.
Мутации могут защищать полипептид от разрушения протеазой, например, путем удаления предполагаемых сайтов протеолитического расщепления, таких как предполагаемые сайты для сериновой протеазы и сайты распознавания для эластазы, из различных областей. Некоторые или все такие предполагаемые сайты можно удалить или изменить с тем, чтобы снизить протеолиз в месте расположения исходного сайта. Изменения протеолиза можно оценить путем сравнения мутантного полипептида с токсинами дикого типа или путем сравнения мутантных токсинов, которые отличаются их аминокислотной последовательностью. Предполагаемые сайты протеолитического расщепления и сайты протеолитического расщепления включают без ограничения следующие последовательности: RR, сайт расщепления для трипсина; LKM, сайт для химотрипсина; и сайт для трипсина. Эти сайты можно изменить путем добавления или удаления любого числа и вида аминокислотных остатков при условии, что пестицидная активность полипептида повышается. Таким образом, полипептиды, кодируемые нуклеотидными последовательностями, содержащими мутации, будут содержать по меньшей мере одно изменение или добавление аминокислоты по сравнению с нативной или фоновой последовательностью или 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, или 280 или более изменений или добавлений аминокислоты. Пестицидную активность полипептида также можно улучшить путем усечения нативной последовательности или последовательности полной длины, как известно из уровня техники.
Композиции согласно вариантам осуществления включают нуклеиновые кислоты, а также их фрагменты и варианты, которые кодируют пестицидные полипептиды. В частности, варианты осуществления предусматривают выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 45, или нуклеотидные последовательности, кодирующие указанную аминокислотную последовательность, например, нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 46, а также их фрагменты и варианты.
В частности, варианты осуществления предусматривают выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8, или нуклеотидные последовательности, кодирующие указанную аминокислотную последовательность, например, нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, и SEQ ID NO: 46, а также их фрагменты и варианты.
Интерес также представляют оптимизированные нуклеотидные последовательности, кодирующие пестицидные белки согласно вариантам осуществления. Используемая в данном документе фраза "оптимизированные нуклеотидные последовательности" относится к нуклеиновым кислотам, которые являются оптимизированными для экспрессии в конкретном организме, например, в растении. Оптимизированные нуклеотидные последовательности можно получить для любого организма, представляющего интерес, с помощью способов, известных из уровня техники. См., например, патент США № 7462760, в котором описывается оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая раскрытый пестицидный белок. В данном примере нуклеотидную последовательность получали посредством "обратной трансляции" аминокислотной последовательности белка и изменения нуклеотидной последовательности с тем, чтобы она содержала предпочтительные для маиса кодоны, при этом все еще кодировала ту же аминокислотную последовательность. Эта процедура более подробно описана в Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. Оптимизированные нуклеотидные последовательности находят применение при повышении экспрессии пестицидного белка в растении, например, в однодольных растениях семейства Gramineae (Poaceae), таких как, например, растение маиса или кукурузы.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45, а также их фрагменты и варианты.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45, а также их фрагменты и варианты.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 29, а также их фрагменты и варианты.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются вариантные полипептиды Cry1B с аминокислотной заменой по сравнению с соответствующим эталонным полипептидом Cry1B, обладающие повышенной инсектицидной активностью против кукурузной совки и/или травяной совки по сравнению с ʺсоответствующим эталонным полипептидом Cry1Bʺ. Под ʺсоответствующим эталонным полипептидом Cry1Bʺ подразумевают полипептид Cry1B дикого типа или нативный или вариантный полипептид Cry1B согласно настоящим вариантам осуществления, который может служить в качестве аминокислотной последовательности, которую подвергают мутагенезу для создания вариантного полипептида Cry1B. В некоторых вариантах осуществления соответствующий эталонный полипептид Cry1B содержит домен I Cry1Be-типа и домен III Cry1Ah-типа. Под ʺдоменом I Cry1Be-типаʺ подразумевают аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или большее идентична последовательности из аминокислот 36-276 с SEQ ID NO: 58 (Cry1Be) или аминокислотами 35-276 с SEQ ID NO: 47. Выравнивание аминокислотной последовательности домена I Cry1Be (SEQ ID NO: 58) и MP258 (SEQ ID NO: 47) показано на фигуре 3. Аналогично, другие нативные полипептиды Cry1B можно выравнивать с Cry1Be (SEQ ID NO: 58) и MP258 (SEQ ID NO: 47) для идентификации других участков домена I Cry1Be-типа. Под ʺдоменом III Cry1Ah-типаʺ подразумевают аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92% по меньшей мере на 93% по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% по меньшей мере 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере на 99% или больше идентична последовательности из аминокислот 483-643 с SEQ ID NO: 61 (Cry1Ah) или 494-655 с SEQ ID NO: 47. Выравнивание аминокислотной последовательности домена III Cry1Ah (SEQ ID NO: 61), Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54) и MP258 (SEQ ID NO: 47) показано на фигуре 4. Аналогично, другие нативные полипептиды Cry1B можно выровнять с Cry1Ah (SEQ ID NO: 61), Cry1Bd, Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54) и/или MP258 (SEQ ID NO: 47) для идентификации других участков домена III Cry1Ah-типа. В некоторых вариантах осуществления соответствующий эталонный полипептид Cry1B содержит домен I и домен II Cry1Ba-типа. Под ʺдоменом I и доменом II Cry1Ba-типаʺ подразумевают аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92% по меньшей мере на 93% по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или больше идентична последовательности из аминокислот 30-489 с SEQ ID NO: 55 (Cry1Ba). Выравнивание аминокислотной последовательности домена I и домена II MP258 (SEQ ID NO: 47), Cry1Be (SEQ ID NO: 58), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54), Cry1Bg (SEQ ID NO: 60), Cry1Bf (SEQ ID NO: 59), Cry1Ba (SEQ ID NO: 55), Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), Cry1Bb (SEQ ID NO: 56), и Cry1Bc (SEQ ID NO: 57) показано на фигуре 5. Аналогично, другие нативные полипептиды Cry1B можно выравнивать с Cry1Ba (SEQ ID NO: 55) и MP258 (SEQ ID NO: 47) для идентификации других участков домена I и домена II Cry1Ba-типа.
В некоторых вариантах осуществления соответствующий эталонный полипептид Cry1B содержит домен I и домен II Cry1Be-типа. Под ʺдоменом I и доменом II Cry1Bе-типаʺ подразумевают аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92% по меньшей мере на 93% по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или больше идентична последовательности из аминокислот 35-494 с SEQ ID NO: 58 (Cry1Be) или аминокислотами 35-493 с SEQ ID NO: 47. Выравнивание аминокислотной последовательности домена I и домена II MP258 (SEQ ID NO: 47), Cry1Be (SEQ ID NO: 58), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54), Cry1Bg (SEQ ID NO: 60), Cry1Bf (SEQ ID NO: 59), Cry1Ba (SEQ ID NO: 55), Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), Cry1Bb (SEQ ID NO: 56), и Cry1Bc (SEQ ID NO: 57) показано на фигуре 5. Аналогично, другие нативные полипептиды Cry1B можно выравнивать с Cry1Be (SEQ ID NO: 58) и MP258 (SEQ ID NO: 47) для идентификации других участков домена I и домена II Cry1Be-типа.
Под "улучшенной активность" или ʺповышенной активностьюʺ подразумевают повышение по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 15%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 25%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 35%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 100%, по меньшей мере на приблизительно 110%, по меньшей мере на приблизительно 120%, по меньшей мере на приблизительно 130%, по меньшей мере на приблизительно 140%, по меньшей мере на приблизительно 150%, по меньшей мере на приблизительно 160%, по меньшей мере на приблизительно 170%, по меньшей мере на приблизительно 180%, по меньшей мере на приблизительно 190%, по меньшей мере на приблизительно 200%, по меньшей мере на приблизительно 210% по меньшей мере на приблизительно 220%, по меньшей мере на приблизительно 230%, по меньшей мере на приблизительно 240%, по меньшей мере на приблизительно 250%, по меньшей мере на приблизительно 260%, по меньшей мере на приблизительно 270%, по меньшей мере на приблизительно 280%, по меньшей мере на приблизительно 290%, по меньшей мере на приблизительно 300%, по меньшей мере на приблизительно 310%, по меньшей мере на приблизительно 320%, по меньшей мере на приблизительно 330%, по меньшей мере на приблизительно 340%, по меньшей мере на приблизительно 350%, по меньшей мере на приблизительно 360%, по меньшей мере на приблизительно 370%, по меньшей мере на приблизительно 380%, по меньшей мере на приблизительно 390%, по меньшей мере на приблизительно 400%, по меньшей мере на приблизительно 410%, по меньшей мере на приблизительно 420%, по меньшей мере на приблизительно 430%, по меньшей мере на приблизительно 440%, по меньшей мере на приблизительно 450%, по меньшей мере на приблизительно 460%, по меньшей мере на приблизительно 470%, по меньшей мере на приблизительно 480%, по меньшей мере на приблизительно 490%, по меньшей мере на приблизительно 500%, по меньшей мере на приблизительно 510%, по меньшей мере на приблизительно 520%, по меньшей мере на приблизительно 530%, по меньшей мере на приблизительно 540%, по меньшей мере на приблизительно 550%, по меньшей мере на приблизительно 560%, по меньшей мере на приблизительно 570%, по меньшей мере на приблизительно 580%, по меньшей мере на приблизительно 590%, по меньшей мере на приблизительно 600%, по меньшей мере на приблизительно 650%, по меньшей мере на приблизительно 700%, по меньшей мере на приблизительно 750%, по меньшей мере на приблизительно 800%, по меньшей мере на приблизительно 850%, по меньшей мере на приблизительно 900%, по меньшей мере на приблизительно 950%, по меньшей мере на приблизительно 1000% или больше, или повышение по меньшей мере в приблизительно 1,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,4 раза или по меньшей мере в приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 5 раз, по меньшей мере в приблизительно 5,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 6 раз, по меньшей мере в приблизительно 6,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 7 раз, по меньшей мере в приблизительно 7,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 8 раз, по меньшей мере в приблизительно 8,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 9 раз, по меньшей мере в приблизительно 9,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 10 раз или больше по сравнению с активностью соответствующего эталонного полипептида Cry1B.
В некоторых вариантах осуществления улучшение заключается в снижении EC50 по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 15%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 25%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 35%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 100%, по меньшей мере на приблизительно 110%, по меньшей мере на приблизительно 120%, по меньшей мере на приблизительно 130%, по меньшей мере на приблизительно 140%, по меньшей мере на приблизительно 150%, по меньшей мере на приблизительно 160%, по меньшей мере на приблизительно 170%, по меньшей мере на приблизительно 180%, по меньшей мере на приблизительно 190%, по меньшей мере на приблизительно 200%, по меньшей мере на приблизительно 210%, по меньшей мере на приблизительно 220%, по меньшей мере на приблизительно 230%, по меньшей мере на приблизительно 240%, по меньшей мере на приблизительно 250%, по меньшей мере на приблизительно 260%, по меньшей мере на приблизительно 270%, по меньшей мере на приблизительно 280%, по меньшей мере на приблизительно 290%, по меньшей мере на приблизительно 300%, по меньшей мере на приблизительно 310%, по меньшей мере на приблизительно 320%, по меньшей мере на приблизительно 330%, по меньшей мере на приблизительно 340%, по меньшей мере на приблизительно 350%, по меньшей мере на приблизительно 360%, по меньшей мере на приблизительно 370%, по меньшей мере на приблизительно 380%, по меньшей мере на приблизительно 390%, по меньшей мере на приблизительно 400%, по меньшей мере на приблизительно 410%, по меньшей мере на приблизительно 420%, по меньшей мере на приблизительно 430%, по меньшей мере на приблизительно 440%, по меньшей мере на приблизительно 450%, по меньшей мере на приблизительно 460%, по меньшей мере на приблизительно 470%, по меньшей мере на приблизительно 480%, по меньшей мере на приблизительно 490%, по меньшей мере на приблизительно 500%, по меньшей мере на приблизительно 510%, по меньшей мере на приблизительно 520%, по меньшей мере на приблизительно 530%, по меньшей мере на приблизительно 540%, по меньшей мере на приблизительно 550%, по меньшей мере на приблизительно 560%, по меньшей мере на приблизительно 570%, по меньшей мере на приблизительно 580%, по меньшей мере на приблизительно 590%, по меньшей мере на приблизительно 600%, по меньшей мере на приблизительно 650%, по меньшей мере на приблизительно 700%, по меньшей мере на приблизительно 750%, по меньшей мере на приблизительно 800%, по меньшей мере на приблизительно 850%, по меньшей мере на приблизительно 900%, по меньшей мере на приблизительно 950%, по меньшей мере на приблизительно 1000% или больше, или по меньшей мере в приблизительно 1,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,4 раза или по меньшей мере в приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 5 раз, по меньшей мере в приблизительно 5,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 6 раз, по меньшей мере в приблизительно 6,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 7 раз, по меньшей мере в приблизительно 7,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 8 раз, по меньшей мере в приблизительно 8,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 9 раз, по меньшей мере в приблизительно 9,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 10 раз или больше снижение EC50 для вариантного полипептида Cry1B по сравнению с пестицидной активностью соответствующего эталонного полипептида Cry1B.
В некоторых вариантах осуществления EC50 вариантного полипептида Cry1B составляет <100 ppm, <90 ppm, <80 ppm, <70 ppm, <60 ppm, <50 ppm, <45 ppm, <40 ppm, <35 ppm, <30 ppm, <25 ppm, <20 ppm, <19 ppm, <18 ppm, <17 ppm, <16 ppm, <15 ppm, <14 ppm, <13 ppm, <12 ppm, <11 ppm, <10 ppm, <9 ppm, <8 ppm, <7 ppm, <6 ppm, <5 ppm, <4 ppm, <3 ppm, <2 ppm, <1 ppm, <0,9 ppm, <0,8 ppm, <0,7 ppm, <0,6 ppm, <0,5 ppm, <0,4 ppm, <0,3 ppm, <0,2 ppm или <0,1 ppm.
В некоторых вариантах осуществления улучшение заключается в повышении среднего значения индекса FAE по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 15%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 25%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 35%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 100%, по меньшей мере на приблизительно 110%, по меньшей мере на приблизительно 120%, по меньшей мере на приблизительно 130%, по меньшей мере на приблизительно 140%, по меньшей мере на приблизительно 150%, по меньшей мере на приблизительно 160%, по меньшей мере на приблизительно 170%, по меньшей мере на приблизительно 180%, по меньшей мере на приблизительно 190%, по меньшей мере на приблизительно 200%, по меньшей мере на приблизительно 210%, по меньшей мере на приблизительно 220%, по меньшей мере на приблизительно 230%, по меньшей мере на приблизительно 240%, по меньшей мере на приблизительно 250%, по меньшей мере на приблизительно 260%, по меньшей мере на приблизительно 270%, по меньшей мере на приблизительно 280%, по меньшей мере на приблизительно 290%, по меньшей мере на приблизительно 300%, по меньшей мере на приблизительно 310%, по меньшей мере на приблизительно 320%, по меньшей мере на приблизительно 330%, по меньшей мере на приблизительно 340%, по меньшей мере на приблизительно 350%, по меньшей мере на приблизительно 360%, по меньшей мере на приблизительно 370%, по меньшей мере на приблизительно 380%, по меньшей мере на приблизительно 390%, по меньшей мере на приблизительно 400%, по меньшей мере на приблизительно 410%, по меньшей мере на приблизительно 420%, по меньшей мере на приблизительно 430%, по меньшей мере на приблизительно 440%, по меньшей мере на приблизительно 450%, по меньшей мере на приблизительно 460%, по меньшей мере на приблизительно 470%, по меньшей мере на приблизительно 480%, по меньшей мере на приблизительно 490%, по меньшей мере на приблизительно 500%, по меньшей мере на приблизительно 510%, по меньшей мере на приблизительно 520%, по меньшей мере на приблизительно 530%, по меньшей мере на приблизительно 540%, по меньшей мере на приблизительно 550%, по меньшей мере на приблизительно 560%, по меньшей мере на приблизительно 570%, по меньшей мере на приблизительно 580%, по меньшей мере на приблизительно 590%, по меньшей мере на приблизительно 600%, по меньшей мере на приблизительно 650%, по меньшей мере на приблизительно 700%, по меньшей мере на приблизительно 750%, по меньшей мере на приблизительно 800%, по меньшей мере на приблизительно 850%, по меньшей мере на приблизительно 900%, по меньшей мере на приблизительно 950%, по меньшей мере на приблизительно 1000% или больше, или по меньшей мере в приблизительно 1,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,4 раза или по меньшей мере в приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 5 раз, по меньшей мере в приблизительно 5,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 6 раз, по меньшей мере в приблизительно 6,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 7 раз, по меньшей мере в приблизительно 7,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 8 раз, по меньшей мере в приблизительно 8,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 9 раз, по меньшей мере в приблизительно 9,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 10 раз или большее повышение среднего значения индекса FAE для вариантного полипептида Cry1B по сравнению с пестицидной активностью соответствующего эталонного полипептида Cry1B.
"Среднее значение индекса FAE" (MFI) относится к среднему значению для множества FAEGN, среднему арифметическому значению FAEGN. Как используется в данном документе, "среднее значение показателя отклонения" относится к среднему арифметическому значению для множества показателей отклонения.
В некоторых вариантах осуществления улучшение заключается в повышении среднего значения показателя отклонения по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 15%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 25%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 35%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 100%, по меньшей мере на приблизительно 110%, по меньшей мере на приблизительно 120%, по меньшей мере на приблизительно 130%, по меньшей мере на приблизительно 140%, по меньшей мере на приблизительно 150%, по меньшей мере на приблизительно 160%, по меньшей мере на приблизительно 170%, по меньшей мере на приблизительно 180%, по меньшей мере на приблизительно 190%, по меньшей мере на приблизительно 200%, по меньшей мере на приблизительно 210%, по меньшей мере на приблизительно 220%, по меньшей мере на приблизительно 230%, по меньшей мере на приблизительно 240%, по меньшей мере на приблизительно 250%, по меньшей мере на приблизительно 260%, по меньшей мере на приблизительно 270%, по меньшей мере на приблизительно 280%, по меньшей мере на приблизительно 290%, по меньшей мере на приблизительно 300%, по меньшей мере на приблизительно 310%, по меньшей мере на приблизительно 320%, по меньшей мере на приблизительно 330%, по меньшей мере на приблизительно 340%, по меньшей мере на приблизительно 350%, по меньшей мере на приблизительно 360%, по меньшей мере на приблизительно 370%, по меньшей мере на приблизительно 380%, по меньшей мере на приблизительно 390%, по меньшей мере на приблизительно 400%, по меньшей мере на приблизительно 410%, по меньшей мере на приблизительно 420%, по меньшей мере на приблизительно 430%, по меньшей мере на приблизительно 440%, по меньшей мере на приблизительно 450%, по меньшей мере на приблизительно 460%, по меньшей мере на приблизительно 470%, по меньшей мере на приблизительно 480%, по меньшей мере на приблизительно 490%, по меньшей мере на приблизительно 500%, по меньшей мере на приблизительно 510%, по меньшей мере на приблизительно 520%, по меньшей мере на приблизительно 530%, по меньшей мере на приблизительно 540%, по меньшей мере на приблизительно 550%, по меньшей мере на приблизительно 560%, по меньшей мере на приблизительно 570%, по меньшей мере на приблизительно 580%, по меньшей мере на приблизительно 590%, по меньшей мере на приблизительно 600%, по меньшей мере на приблизительно 650%, по меньшей мере на приблизительно 700%, по меньшей мере на приблизительно 750%, по меньшей мере на приблизительно 800%, по меньшей мере на приблизительно 850%, по меньшей мере на приблизительно 900%, по меньшей мере на приблизительно 950%, по меньшей мере на приблизительно 1000% или больше, или по меньшей мере в приблизительно 1,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,4 раза или по меньшей мере в приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 5 раз, по меньшей мере в приблизительно 5,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 6 раз, по меньшей мере в приблизительно 6,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 7 раз, по меньшей мере в приблизительно 7,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 8 раз, по меньшей мере в приблизительно 8,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 9 раз, по меньшей мере в приблизительно 9,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 10 раз или большем повышении среднего значения показателя отклонения для вариантного полипептида Cry1B по сравнению с пестицидной активностью соответствующего эталонного полипептида Cry1B.
В некоторых вариантах осуществления активность вариантного полипептида Cry1B является улучшенной по сравнению с пестицидной активностью SEQ ID NO: 1 (Cry1Bd), SEQ ID NO: 47 (MP258), SEQ ID NO: 52 (Cry1Bh), SEQ ID NO: 54 (Cry1Bi), SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45.
В конкретных вариантах осуществления пестицидные белки согласно вариантам осуществления предполагают инсектицидные полипептиды полной длины, фрагменты инсектицидных полипептидов полной длины и вариантные полипептиды, которые получены из подвергнутых мутагенезу нуклеиновых кислот, сконструированных для введения конкретных аминокислотных последовательностей в полипептиды согласно вариантам осуществления. В конкретных вариантах осуществления аминокислотные последовательности, которые вводят в полипептиды, содержат последовательность, которая обеспечивает сайт расщепления для фермента, такого как протеаза.
Из уровня техники известно, что пестицидная активность Bt токсинов, как правило, активируется при расщеплении пептида в кишечнике насекомого различными протеазами. Поскольку пептиды не всегда могут расщепляться в кишечнике насекомого с полной эффективностью, фрагменты токсина полной длины могут обладать усиленной пестицидной активностью по сравнению с самим токсином полной длины. Таким образом, некоторые из полипептидов согласно вариантам осуществления включают фрагменты инсектицидного полипептида полной длины, и некоторые из фрагментов, вариантов и мутаций полипептида будут характеризоваться усиленной пестицидной активностью по сравнению с активностью встречающегося в естественных условиях инсектицидного полипептида, из которого они получены, в особенности, если встречающийся в естественных условиях инсектицидный полипептид не активируется in vitro протеазой перед скринингом в отношении активности. Таким образом, настоящим изобретением охватываются усеченные варианты или фрагменты последовательностей.
Мутации можно поместить в любую фоновую последовательность, в том числе в такие усеченные полипептиды при условии, что полипептид сохраняет пестицидную активность. Специалист в данной области техники может легко сравнить два или более белков в отношении пестицидной активности с помощью анализов, известных из уровня техники или описанных в других местах в данном документе. Следует понимать, что полипептиды согласно вариантам осуществления можно получить либо путем экспрессии нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, либо путем применения стандартных методик молекулярной биологии.
Считается, что пестицидные белки могут быть олигомерными и будут отличаться по молекулярному весу, числу остатков, составляющим пептидам, активности против конкретных вредителей и другим характеристикам. Тем не менее, с помощью способов, изложенных в данном документе, можно выделить и охарактеризовать белки, активные против ряда вредителей. Пестицидные белки согласно вариантам осуществления можно применять в комбинации с другими Bt токсинами или другими инсектицидными белками для расширения спектра насекомых-мишеней. Более того, применение пестицидных белков согласно вариантам осуществления в комбинации с другими Bt токсинами или другими инсектицидными активными компонентами отличной природы является особенно полезным для предотвращения и/или сдерживания развития устойчивости у насекомых. Другие инсектицидные средства включают ингибиторы протеаз (как серинового, так и цистеинового типов), α-амилазы и пероксидазы.
Фрагменты и варианты нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и полипептидов, кодируемых ими, также охватываются вариантами осуществления. Используемый в данном документе термин "фрагмент" относится к части нуклеотидной последовательности полинуклеотида или к части аминокислотной последовательности полипептида согласно вариантам осуществления. Фрагменты нуклеотидной последовательности могут кодировать фрагменты белка, которые сохраняют биологическую активность нативного белка или соответствующего белка полной длины и, следовательно, обладают пестицидной активностью. Таким образом, считается, что некоторые из последовательностей полинуклеотидов и аминокислотных последовательностей согласно вариантам осуществления можно справедливо называть и фрагментами, и мутантами.
Следует понимать, что термин "фрагмент" в том значении, в котором он используется по отношению к последовательностям нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления, также охватывает последовательности, которые являются полезными в качестве гибридизационных зондов. Нуклеотидные последовательности из этого класса обычно не кодируют фрагменты белков, сохраняющие биологическую активность. Таким образом, фрагменты нуклеотидной последовательности могут варьировать в диапазоне от по меньшей мере приблизительно 20 нуклеотидов, приблизительно 50 нуклеотидов, приблизительно 100 нуклеотидов и до нуклеотидной последовательности полной длины, кодирующей белки согласно вариантам осуществления.
Фрагмент нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления, который кодирует биологически активную часть пестицидного белка согласно вариантам осуществления, будет кодировать по меньшей мере 15, 25, 30, 50, 100, 200, 250 или 300 смежных аминокислот или до общего числа аминокислот, присутствующих в пестицидном полипептиде согласно вариантам осуществления (например, 651 аминокислота для SEQ ID NO: 3). Таким образом, следует понимать, что вариантами осуществления также охватываются полипептиды, которые представляют собой фрагменты иллюстративных пестицидных белков согласно вариантам осуществления и имеют длину по меньшей мере 15, 25, 30, 50, 100, 200, 250 или 300 смежных аминокислот или до общего числа аминокислот, присутствующих в пестицидном полипептиде согласно вариантам осуществления (например, 651 аминокислота для SEQ ID NO: 3). От фрагментов нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления, которые являются полезными в качестве гибридизационных зондов или ПЦР-праймеров обычно не требуется, чтобы они кодировали биологически активную часть пестицидного белка. Таким образом, фрагмент нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления может кодировать биологически активную часть пестицидного белка, или он может представлять собой фрагмент, который можно применять в качестве гибридизационного зонда или ПЦР-праймера с использованием способов, раскрытых в данном документе. Биологически активную часть пестицидного белка можно получить путем выделения части одной из нуклеотидных последовательностей согласно вариантам осуществления, экспрессии кодируемой части пестицидного белка (например, путем рекомбинантной экспрессии in vitro) и оценки активности кодируемой части пестицидного белка.
Нуклеиновые кислоты, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления, содержат по меньшей мере 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 850, 900 или 950 нуклеотидов или до числа нуклеотидов, присутствующих в нуклеотидной последовательности, раскрытой в данном документе (например, 1953 нуклеотидов для SEQ ID NO: 4). Конкретные варианты осуществления предусматривают фрагменты, происходящие из (например, полученные из) первой нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления, где фрагмент кодирует усеченный токсин, обладающий пестицидной активностью. Усеченные полипептиды, кодируемые полинуклеотидными фрагментами согласно вариантам осуществления, обладают пестицидной активностью, которая является либо эквивалентной, либо улучшенной по сравнению с активностью соответствующего полипептида полной длины, кодируемого первой нуклеиновой кислотой, из которой происходит фрагмент. Предусматривается, что такие фрагменты нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления могут быть усеченными по 3' концу нативной кодирующей последовательности или соответствующей кодирующей последовательности полной длины. Фрагменты нуклеиновой кислоты также могут быть усеченными как по 5′-, так и по 3′ концу нативной кодирующей последовательности или соответствующей кодирующей последовательности полной длины.
Термин "варианты" используется в данном документе для обозначения практически сходных последовательностей. Для нуклеотидных последовательностей консервативные варианты включают те последовательности, которые из-за вырожденности генетического кода кодируют аминокислотную последовательность одного из пестицидных полипептидов согласно вариантам осуществления. Специалисты в данной области техники легко поймут, что вследствие вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих, белки согласно настоящему раскрытию.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, отличающуюся от геномной. Используемые в данном документе "последовательность нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной", или "молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной", или "полинуклеотид, отличающийся от геномного" относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, которая имеет одно или несколько изменений в последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с нативной или геномной последовательностью нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изменение по отношению к нативной или геномной молекуле нуклеиновой кислоты включает без ограничения: изменения в последовательности нуклеиновой кислоты, обусловленные вырожденностью генетического кода; оптимизацию кодонов последовательности нуклеиновой кислоты для экспрессии в растениях; изменения в последовательности нуклеиновой кислоты для введения по меньшей мере одной аминокислотной замены, вставки, делеции и/или добавления по сравнению с нативной или геномной последовательностью; удаление одного или нескольких интронов, ассоциированных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных интронов; делецию одного или нескольких регуляторных участков, расположенных выше или ниже, ассоциированных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных регуляторных участков, расположенных выше или ниже; делецию 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка, ассоциированного с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку гетерологичного 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка и модификацию сайта полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой кДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты.
При необходимости нуклеиновую кислоту можно оптимизировать для повышения экспрессии в организме-хозяине. Таким образом, если организм-хозяин является растением, для улучшенной экспрессии можно синтезировать синтетические нуклеиновые кислоты с использованием кодонов, предпочтительных для растений. См., например,Campbell и Gowri, (1990) Plant Physiol. 92:1-11 в отношении обсуждения использования кодонов, предпочтительных для хозяина. Например, хотя последовательности нуклеиновых кислот согласно вариантам осуществления могут экспрессироваться у видов как однодольных, так и двудольных растений, последовательности можно модифицировать с учетом специфических предпочтений в отношении кодонов и предпочтений по содержанию GC у однодольных или двудольных, если было показано, что предпочтения отличаются (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Таким образом, кодон, предпочтительный для маиса, для конкретной аминокислоты можно установить из известных генных последовательностей маиса. Использование кодонов маисом для 28 генов из растений маиса приведено в таблице 4 из Murray, et al., выше. Из уровня техники доступны способы синтеза генов, предпочтительных для растений. См., например, патенты США №№ 5,380,831, и 5,436,391 и Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, и Liu H et al. Mol Bio Rep 37:677-684, 2010, включенные в данный документ посредством ссылки. Таблицу использования кодонов Zea maize также можно найти на сайте kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4577, доступ к которому можно получить с применением префикса www.
Таблица использования кодонов Glycine max показана в виде таблицы 3, и ее также можно найти на сайте kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=3847&aa=1&style=N, доступ к которому можно получить с применением префикса www.
К тому же, специалист в данной области техники поймет, что изменения можно вводить путем мутирования последовательностей нуклеиновой кислоты, что ведет к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемого полипептида без изменения биологической активности белков. Таким образом, вариантные молекулы нуклеиновой кислоты можно создавать путем введения одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений и/или делеций в соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе, так что одна или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций вводятся в кодируемый белок. Мутации можно вводить при помощи стандартных методик, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие вариантные последовательности нуклеиновой кислоты также охватываются настоящим раскрытием.
Встречающиеся в природе аллельные варианты, такие как эти, можно идентифицировать с применением хорошо известных методик молекулярной биологии, таких как, например, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методики гибридизации, как изложено в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, отличающуюся от геномной.
Вариантные нуклеотидные последовательности также включают синтетически полученные нуклеотидные последовательности, такие как полученные, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза, но которые все еще кодируют пестицидный белок согласно вариантам осуществления, такой как мутантный токсин. В целом, варианты конкретной нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления будут иметь последовательность, по меньшей мере на приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную конкретной нуклеотидной последовательности при определении с помощью программ для выравнивания последовательностей, описанных в других местах в данном документе, с использованием параметров по умолчанию. Вариант нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления может отличаться от данной последовательности лишь 1-15 нуклеотидами, лишь 1-10, как например, 6-10, лишь 5, лишь 4, 3, 2 или даже 1 нуклеотидом.
Варианты конкретной нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления (т.е. иллюстративной нуклеотидной последовательности) также можно оценивать путем сравнения процентной идентичности последовательности для полипептида, кодируемого вариантной нуклеотидной последовательностью, и полипептида, кодируемого эталонной нуклеотидной последовательностью. Таким образом, например, раскрыты выделенные нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептид с указанной процентной идентичностью последовательности по отношению к полипептидам с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45. Процентную идентичность последовательности для любых двух полипептидов можно рассчитать с помощью программ для выравнивания последовательностей, описанных в других местах в данном документе, с использованием параметров по умолчанию. При оценке любой заданной пары полинуклеотидов согласно вариантам осуществления путем сравнения процентной идентичности последовательности, общей для двух полипептидов, которые они кодируют, последовательности двух кодируемых полипептидов идентичны по меньшей мере на приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, обычно по меньшей мере на приблизительно 75%, 80%, 85%, по меньшей мере на приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или по меньшей мере на приблизительно 98%, 99% или более.
Используемый в данном документе термин "вариантный белок" охватывает полипептиды, которые получены из нативного белка: путем делеции (так называемого усечения) или добавления одной или нескольких аминокислот на N-конце и/или C-конце нативного белка; делеции или добавления одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах в нативном белке или замены одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах в нативном белке. Соответственно, термин ʺвариантный белокʺ охватывает биологически активные фрагменты нативного белка, которые содержат достаточное число смежных аминокислотных остатков для сохранения биологической активности нативного белка, т.е. для того, чтобы он обладал пестицидной активностью. Такая пестицидная активность может быть отличающейся или улучшенной по сравнению с нативным белком, или она может быть неизменной при условии, что пестицидная активность сохраняется.
Вариантные белки, охватываемые вариантами осуществления, являются биологически активными, то есть они продолжают обладать необходимой биологической активностью нативного белка, то есть пестицидной активностью, как описано в данном документе. Такие варианты могут быть результатом, например, генетического полиморфизма или манипуляции, осуществляемой человеком. Биологически активные варианты нативного пестицидного белка согласно вариантам осуществления будут иметь последовательность, по меньшей мере на приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную аминокислотной последовательности для нативного белка при определении с помощью программ для выравнивания последовательностей, описанных в других местах в данном документе, с использованием параметров по умолчанию. Биологически активный вариант белка согласно вариантам осуществления может отличаться от данного белка лишь 1-15 аминокислотными остатками, лишь 1-10, как например, 6-10, лишь 5, лишь 4, 3, 2 или даже 1 аминокислотным остатком.
В некотором варианте осуществления инсектицидный полипептид характеризуется последовательностью, которая по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45.
В некоторых вариантах осуществления полипептид характеризуется модифицированным физическим свойством. Применяемый в данном документе термин ʺфизическое свойствоʺ относится к какому-либо параметру, который подходит для описания физико-химических характеристик белка. Применяемые в данном документе термины ʺфизическое свойство, представляющее интересʺ и ʺсвойство, представляющее интересʺ применяются взаимозаменяемо для обозначения физических свойств белков, которые исследуются и/или модифицируются. Примеры физических свойств включают без ограничения суммарный поверхностный заряд и распределение зарядов на поверхности белка, суммарную гидрофобность и распределение гидрофобных остатков на поверхности белка, плотность поверхностного заряда, плотность гидрофобности поверхности, общее число поверхностных ионизируемых групп, поверхностное натяжение, размер белка и его распределение в растворе, температуру плавления, теплоемкость и второй вириальный коэффициент. Примеры физических свойств также включают без ограничения растворимость, фолдинг, стабильность и усвояемость. В некоторых вариантах осуществления полипептид характеризуется повышенной перевариваемостью фрагментов, полученных в результате протеолитического расщепления, в кишечнике насекомого. В некоторых вариантах осуществления полипептид обладает повышенной стабильностью в кишечнике насекомого. Модели для переваривания при помощи искусственного желудочного сока известны специалисту в данной области техники (Fuchs, R.L. и J.D. Astwood. Food Technology 50: 83-88, 1996; Astwood, J.D., et al Nature Biotechnology 14: 1269-1273, 1996; Fu TJ et al J. Agric Food Chem. 50: 7154-7160, 2002).
Кроме того, вариантами осуществления охватывается микроорганизм, который трансформирован по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой согласно вариантам осуществления, кассетой экспрессии, содержащей нуклеиновую кислоту, или вектором, содержащим кассету экспрессии. В некоторых вариантах осуществления микроорганизм представляет собой микроорганизм, размножающийся на растениях. Вариант осуществления настоящего раскрытия относится к инкапсулированному пестицидному белку, который содержится в трансформированном микроорганизме, способном к экспрессии по меньшей мере одного пестицидного белка согласно вариантам осуществления.
Варианты осуществления предусматривают пестицидные композиции, содержащие трансформированный микроорганизм согласно вариантам осуществления. В таких вариантах осуществления трансформированный микроорганизм обычно присутствует в пестицидной композиции в пестицидно эффективном количестве вместе с подходящим носителем. Вариантами осуществления также охватываются пестицидные композиции, содержащие выделенный белок согласно вариантам осуществления, отдельно или в комбинации с трансформированным организмом согласно вариантам осуществления, и/или инкапсулированный пестицидный белок согласно вариантам осуществления в инсектицидно эффективном количестве вместе с подходящим носителем.
Варианты осуществления дополнительно предусматривают способ расширения спектра насекомых-мишеней путем применения пестицидного белка согласно вариантам осуществления в комбинации по меньшей мере с одним другим или ʺвторымʺ пестицидным белком. В способах согласно вариантам осуществления можно использовать любой пестицидный белок, известный из уровня техники. Такие пестицидные белки включают без ограничения Bt токсины, ингибиторы протеаз, α-амилазы и пероксидазы.
Вариантами осуществления также охватываются трансформированные или трансгенные растения, содержащие по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность согласно вариантам осуществления. В некоторых вариантах осуществления растение является стабильно трансформированным нуклеотидной конструкцией, содержащей по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность согласно вариантам осуществления, функционально связанную с промотором, который управляет экспрессией в растительной клетке. Используемые в данном документе термины "трансформированное растение" и "трансгенное растение" относятся к растению. которое содержит в своем геноме гетерологичный полинуклеотид. В целом, гетерологичный полинуклеотид стабильно интегрирован в геном трансгенного или трансформированного растения таким образом, что полинуклеотид передается последующим поколениям. Гетеролигичный полинуклеотид может быть интегрирован в геном сам или как часть рекомбинантной кассеты экспрессии.
Следует понимать, что используемый в данном документе термин "трансгенный" включает любую клетку, клеточную линию, каллюс, ткань, часть растения или растение, генотип которого был изменен в результате присутствия гетерологичной нуклеиновой кислоты, в том числе такие трансгенные объекты, которые исходно изменены таким образом, а также такие трансгенные объекты, которые созданы путем половых скрещиваний или бесполого размножения из исходного трансгенного объекта. Используемый в данном документе термин ʺтрансгенныйʺ не охватывает изменение генома (хромосомного или внехромосомного) с помощью традиционных способов селекции растений или встречающихся в природе трансгенных объектов, например, случайное перекрестное опыление, инфекция, вызванная нерекомбинантным вирусом, трансформация нерекомбинантными бактериями, нерекомбинационная транспозиция или спонтанная мутация.
Используемый в данном документе термин "растение" включает целые растения, органы растений (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена, растительные клетки и потомство таковых. Части трансгенных растений находятся в пределах объема вариантов осуществления и предусматривают, например, растительные клетки, растительные протопласты, тканевые культуры растительных клеток, из которых можно регенерировать растения, растительные каллюсы, скопления растительных клеток и растительные клетки, которые являются интактными в растениях или частях растений, таких как зародыши, пыльца, семяпочки, семена, листья, цветки, ветви, плоды, зерна, колоски, стержни початков, шелуха, стебли, корни, верхушки корней, пыльники и т.п., происходящих из трансгенных растений или их потомства, ранее трансформированных молекулой ДНК согласно вариантам осуществления и, таким образом, по меньшей мере частично состоящих из трансгенных клеток. Класс растений, которые можно применять в способах согласно вариантам осуществления обычно настолько же широк, как и класс высших растений, поддающихся методикам трансформации, включающий как однодольные, так и двудольные растения.
Хотя варианты осуществления не зависят от конкретного биологического механизма повышения устойчивости растения к вредителю растений, экспрессия нуклеотидных последовательностей согласно вариантам осуществления в растении может приводить в результате к выработке пестицидных белков согласно вариантам осуществления и к повышению устойчивости растения к вредителю растений. Растения согласно вариантам осуществления находят применение в сельском хозяйстве в способах оказания воздействия на насекомых-вредителей. Определенные варианты осуществления предусматривают трансформированные культурные растения, такие как, например, растения маиса, которые находят применение в способах оказания воздействия на насекомых-вредителей растения, таких как, например, чешуекрылые вредители.
ʺИсследуемое растение или растительная клеткаʺ представляют собой растение или растительную клетку, в которых генетическое изменение, такое как трансформация, затронуло ген, представляющий интерес, или представляют собой растение или растительную клетку, которые происходят от растения или клетки, измененных таким образом, и которые содержат изменение. ʺКонтрольʺ, или ʺконтрольное растениеʺ, или ʺконтрольная растительная клеткаʺ обеспечивают точку отсчета для измерения изменений фенотипа исследуемого растения или растительной клетки.
Контрольное растение или растительная клетка могут представлять собой, например, (a) растение или клетку дикого типа, т.е. с таким же генотипом, что и у исходного материала для генетического изменения, который дал в результате исследуемое растение или клетку; (b) растение или растительную клетку с таким же генотипом, что и у исходного материала, но которые были трансформированы нуль-конструкцией (т.е. конструкцией, которая не оказывает известного влияния на признак, представляющий интерес, такой как конструкция, содержащая маркерный ген); (c) растение или растительную клетку, которые являются нетрансформированным сегрегантом среди потомства исследуемых растения или растительной клетки; (d) растение или растительную клетку, генетически идентичные исследуемым растению или растительной клетке, но которые не были подвергнуты воздействию условий или стимулов, которые будут индуцировать экспрессию гена, представляющего интерес, или (e) исследуемое растение или растительную клетку, как таковые, в условиях, при которых ген, представляющий интерес, не экспрессируется.
Специалист в данной области техники легко поймет, что достижения в области молекулярной биологии, такие как сайт-специфический и неспецифический мутагенез, методики полимеразной цепной реакции и методики белковой инженерии, обеспечивают богатый набор инструментов и протоколов, подходящих для применения с целью изменения или конструирования как аминокислотной последовательности, так и лежащих в основе генных последовательностей белков, представляющих интерес с точки зрения сельского хозяйства.
Таким образом, белки согласно вариантам осуществления можно изменять различными способами, включая аминокислотные замены, делеции, усечения и вставки. Способы осуществления таких манипуляций, как правило, известны из уровня техники. Например, варианты аминокислотных последовательностей пестицидных белков можно получить путем введения мутаций в синтетическую нуклеиновую кислоту (например, молекулу ДНК). Способы мутагенеза и внесения изменений в нуклеиновую кислоту хорошо известны из уровня техники. Например, сконструированные изменения можно вводить с использованием методики опосредованного олигонуклеотидами сайт-направленного мутагенеза. См., например, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; патент США № 4,873,192; Walker и Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) и источники, цитируемые в этом документе.
Подвергнутые мутагенезу нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно модифицировать с тем, чтобы изменить приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 или более из аминокислот, присутствующих в первичной последовательности кодируемого полипептида. В качестве альтернативы, можно вводить даже еще большее количество изменений по отношению к нативной последовательности таким образом, чтобы у кодируемого белка по меньшей мере приблизительно 1% или 2%, или приблизительно 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, или даже приблизительно 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, или 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, или 25%, 30%, 35%, или 40%, или более кодонов могли быть измененными или иным образом модифицированными по сравнению с соответствующим белком дикого типа. Таким же образом, у кодируемого белка может быть по меньшей мере приблизительно 1% или 2%, или приблизительно 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, или даже приблизительно 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, или 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, или 25%, 30%, 35%, или 40% или больше дополнительных кодонов по сравнению с соответствующим белком дикого типа. Следует понимать, что подвергнутые мутагенезу нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления, как предполагается, охватывают биологически функциональные эквивалентные пептиды, которые обладают пестицидной активностью, такой как улучшенная пестицидная активность, которую определяют по антифидантным свойствам в отношении личинок кукурузного мотылька. Такие последовательности могут возникнуть как следствие избыточности кодонов и функциональной эквивалентности, которые, как известно, встречаются в естественных условиях в последовательностях нуклеиновой кислоты и кодируемых таким образом белках.
Специалист в данной области техники поймет, что добавления аминокислот и/или аминокислотные замены обычно основываются на относительном сходстве заместителей в боковой цепи аминокислот, например, их гидрофобности, заряда, размера и т.п. Иллюстративные группы аминокислотных замен, в которых принимаются во внимание несколько из вышеизложенных характеристик, хорошо известны специалисту в данной области техники и включают: аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серин и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.
Руководство по соответствующим аминокислотным заменам, которые не влияют на биологическую активность белка, представляющего интерес, можно найти в модели Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), включенной в данный документ посредством ссылки. Могут быть произведены консервативные замены, такие как замещение одной аминокислоты другой с аналогичными свойствами.
Таким образом, гены и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления включают как встречающиеся в естественных условиях последовательности, так и мутантные формы. Аналогично, белки согласно вариантам осуществления охватывают как встречающиеся в естественных условиях белки и варианты (например, усеченные полипептиды), так и их модифицированные (например, мутантные) формы. Такие варианты будут продолжать обладать необходимой пестицидной активностью. Очевидно, что мутации, которые будут произведены в нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант, не должны выводить последовательность из рамки считывания и, в целом, не будут создавать комплементарные участки, которые могут образовать вторичную структуру мРНК. См. публикацию заявки на европейский патент №75444.
Ожидается, что делеции, вставки и замены в белковых последовательностях, охватываемые данным документом, не произведут радикальных изменений в характеристиках белка. Тем не менее, если трудно предсказать точный эффект замены, делеции и вставки перед ее осуществлением, специалист в данной области техники поймет, что данный эффект будет оценен посредством обычных скрининговых анализов, таких как анализы с кормлением насекомых. См., например, Marrone et al. (1985) J. Econ. Entomol. 78: 290-293 и Czapla и Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485, включенный в данный документ посредством ссылки.
Вариантные нуклеотидные последовательности и белки также охватывают последовательности и белки, полученные в результате мутагенной и рекомбиногенной процедуры, такой как ДНК-шаффлинг. При такой процедуре можно производить манипуляции с одной или несколькими различными кодирующими последовательностями для создания нового пестицидного белка, обладающего необходимыми свойствами. Таким образом, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов создают из популяции родственных по последовательностям полинуклеотидов, содержащих участки последовательностей, которые характеризуются значительной идентичностью последовательности и могут подвергаться гомологичной рекомбинации in vitro или in vivo. Например, с применением этого подхода кодирующие последовательности полной длины, мотивы в последовательностях, кодирующих домен, представляющий интерес, или любой фрагмент нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления можно перетасовать между нуклеотидными последовательностями согласно вариантам осуществления и соответствующими частями других известных нуклеотидных последовательностей Cry с получением нового гена, кодирующего белок с улучшенным свойством, представляющим интерес.
Свойства, представляющие интерес, включают без ограничения пестицидную активность на единицу пестицидного белка, стабильность белка и токсичность в отношении видов, не являющихся мишенью, в особенности людей, домашнего скота, а также растений и микробов, которые экспрессируют пестицидные полипептиды согласно вариантам осуществления. Варианты осуществления не связываются конкретной стратегией шаффлинга, нужно только, чтобы по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность согласно вариантам осуществления или ее часть была задействована в такой стратегии шаффлинга. В шаффлинге могут быль задействованы только нуклеотидные последовательности, раскрытые в данном документе, или он может дополнительно предусматривать шаффлинг других нуклеотидных последовательностей, известных из уровня техники. Стратегии ДНК-шаффлинга известны из уровня техники. См., например, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; и патенты США №№ 5,605,793 и 5,837,458.
Нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления также можно применять для выделения соответствующих последовательностей из других организмов, в частности, из других бактерий и более конкретно из других штаммов Bacillus. Таким образом, такие способы как ПЦР, гибридизация и т.п., можно применять для идентификации таких последовательностей на основе гомологии их последовательности с последовательностями, изложенными в данном документе. Вариантами осуществления охватываются последовательности, выбранные на основе идентичности последовательности с полными последовательностями, изложенными в данном документе, или их фрагментами. Такие последовательности включают последовательности, которые являются ортологами раскрытых последовательностей. Термин "ортологи" относится к генам, происходящим от общего предкового гена и выявляемым у различных видов вследствие видообразования. Гены, обнаруживаемые у различных видов, считаются ортологами, если их нуклеотидные последовательности и/или кодируемые ими белковые последовательности имеют существенную степень идентичности, как определено в других разделах в данном документе. Функции ортологов часто являются высококонсервативными среди видов.
В случае подхода, основанного на ПЦР, олигонуклеотидные праймеры можно сконструировать для применения в ПЦР-реакциях для амплификации соответствующих последовательностей ДНК исходя из кДНК или геномной ДНК, извлеченных из какого-либо организма, представляющего интерес. Способы конструирования ПЦР-праймеров и ПЦР-клонирования, в целом, известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), именуемом далее в данном документе как "Sambrook". См. Также Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis и Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); и Innis и Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Известные способы ПЦР включают без ограничений способы с использованием парных праймеров, гнездовых праймеров, одиночных специфичных праймеров, вырожденных праймеров, ген-специфических праймеров, вектор-специфических праймеров, частично несовпадающих праймеров и им подобных.
При гибридизационных методиках всю известную нуклеотидную последовательность или ее часть применяют в качестве зонда, который избирательно гибридизируется с другими соответствующими нуклеотидными последовательностями, присутствующими в популяции клонированных фрагментов геномной ДНК или фрагментов кДНК (т.е., геномные библиотеки или библиотеки кДНК) из выбранного организма. Гибридизационные зонды могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды, и их можно пометить выявляемой группой, такой как 32P, или любым другим выявляемым маркером. Таким образом, например, зонды для гибридизации можно получить с помощью мечения синтетических олигонуклеотидов на основе последовательностей согласно вариантам осуществления. Способы получения зондов для гибридизации и для построения библиотек кДНК и геномных библиотек, как правило, известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook.
Например, полную последовательность, раскрытую в данном документе, или одну или несколько ее частей можно применять в качестве зонда, способного специфично гибридизироваться с соответствующими последовательностями и матричными РНК. Для обеспечения специфической гибридизации в различных условиях такие зонды включают последовательности, которые являются уникальными по отношению к последовательностям согласно вариантам осуществления и обычно имеют длину по меньшей мере приблизительно 10 или 20 нуклеотидов. Такие зонды можно применять для амплификации соответствующих последовательностей Cry из выбранного организма с помощью ПЦР. Эту методику можно применять для выделения дополнительных кодирующих последовательностей из требуемого организма или в качестве диагностического анализа для определения присутствия кодирующих последовательностей в организме. Методики гибридизации включают гибридизационный скрининг высеянных на чашку Петри библиотек ДНК (бляшек или колоний; см., например, Sambrook).
Гибридизацию таких последовательностей можно проводить в жестких условиях. Используемые в данном документе термины "жесткие условия" или "жесткие условия гибридизации" относятся к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью в явно большей степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза, в 5 раз или в 10 раз больше по сравнению с фоном). Жесткие условия являются зависимыми от последовательности и будут отличаться при различных обстоятельствах. Путем контроля жесткости условий гибридизации и/или отмывки можно идентифицировать целевые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). В качестве альтернативы, условия жесткости можно отрегулировать так, чтобы они допускали некоторое несовпадение в последовательностях с тем, чтобы выявлять более низкие степени сходства (гетерологичное зондирование). Обычно зонд имеет длину менее приблизительно 1000 или 500 нуклеотидов.
Как правило, жесткие условия будут такими, при которых концентрация соли составляет менее приблизительно 1,5M ионов Na, как правило, концентрация ионов Na (или других солей) составляет приблизительно 0,01-1,0M при pH 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°C для длинных зондов (например, более 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты с помощью добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Иллюстративные условия низкой жесткости включают гибридизацию с буферным раствором 30-35% формамида, 1 M NaCl, 1% SDS (додецилсульфат натрия) при 37°С и отмывкой 1Х - 2Х SSC (20X SSC=3,0 М NaCl/0,3 М тринатрия цитрат) при 50-55°С. Иллюстративные условия умеренной жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М NaCl, 1% SDS при 37°С и отмывку в 0,5X-1X SSC при 55-60°C. Иллюстративные условия высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 M NaCl, 1% SDS при 37°C и окончательную отмывку в 0,1X SSC при 60-65°C в течение по меньшей мере приблизительно 20 минут. Необязательно, отмывочные буферы могут содержать от приблизительно 0,1% до приблизительно 1% SDS. Длительность гибридизации, в целом, составляет менее приблизительно 24 часов, обычно от приблизительно 4 до приблизительно 12 часов.
Следующие термины применяют для описания родства последовательностей между двумя или более нуклеиновыми кислотами или полинуклеотидами: (a) "эталонная последовательность", (b) "окно сравнения", (c) "идентичность последовательностей", (d) "процентная идентичность последовательностей" и (e) "существенная идентичность".
(a) Как применяется в данном документе, "эталонная последовательность" является заданной последовательностью, применяемой в качестве основы для сравнения последовательностей. Эталонная последовательность может представлять собой сокращенную версию или полную форму определенной последовательности; например, в виде сегмента кДНК полной длины или последовательности гена, или полной кДНК или последовательности гена.
(b) Используемое в данном документе "окно сравнения" относится к непрерывному и точно определенному сегменту в последовательности полинуклеотида, причем последовательность полинуклеотида в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Как правило, длина окна сравнения составляет по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов и необязательно может составлять 30, 40, 50, 100 или больше. Специалисты в данной области техники понимают, что во избежание высокого сходства с эталонной последовательностью, вследствие включения гэпов в последовательность полинуклеотида, как правило, вводится штраф за гэп, и его вычитают из количества совпадений.
Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны из уровня техники. Таким образом, определение процентной идентичности последовательностей между любыми двумя последовательностями можно выполнить с использованием математического алгоритма. Неограничивающими примерами таких математических алгоритмов являются алгоритм по Myers и Miller (1988) CABIOS 4:11-17; алгоритм локального выравнивания по Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; алгоритм глобального выравнивания по Needleman и Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; способ поиска локального выравнивания по Pearson и Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; алгоритм из Karlin и Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, который модифицирован в Karlin и Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.
Для сравнения последовательностей можно использовать компьютерные реализации данных математических алгоритмов для того, чтобы определить идентичность последовательностей. Такие реализации включают без ограничений CLUSTAL в программе PC/Gene (доступна от Intelligenetics, Маунтин-Вью, Калифорния); программу ALIGN (версия 2.0) и GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA и TFASTA в GCG Wisconsin Genetics Software Package, версия 10 (доступны от Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, Сан-Диего, Калифорния, США). Выравнивания при помощи этих программ могут быть выполнены с использованием параметров по умолчанию. Программа CLUSTAL хорошо описана в Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; и Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. Программа ALIGN основана на алгоритме из Myers and Miller (1988), упоминаемом выше. При сравнении аминокислотных последовательностей в программе ALIGN можно применять таблицу весов замен остатков PAM120, штраф за продолжение гэпа 12 и штраф за открытие гэпа 4. Программы BLAST из Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 основаны на алгоритме Karlin и Altschul (1990), упоминаемом выше. Поиски нуклеотидных последовательностей в BLAST можно выполнять с помощью программы BLASTN при параметрах вес выравнивания=100, длина слова=12 с получением нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеотидной последовательности, кодирующей белок согласно вариантам осуществления. Поиски белковых последовательностей в BLAST можно выполнять с помощью программы BLASTX при параметрах вес выравнивания=50, длина слова=3 с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных белку или полипептиду согласно вариантам осуществления. Для получения выравнивания с введением гэпов с целью сравнения можно использовать Gapped BLAST (в BLAST 2.0), как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. В качестве альтернативы, можно использовать PSI-BLAST (в BLAST 2.0) для выполнения итерированного поиска, который обнаруживает отдаленные взаимосвязи между молекулами. См., Altschul et al. (1997) выше. При использовании BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ (например, BLASTN для нуклеотидных последовательностей, BLASTX для белков). См. веб-сайт Национальной центра биотехнологической информации в сети Интернет по адресу ncbi.hlm.nih.gov. Выравнивание также можно проводить вручную путем просмотра.
(c) Как используется в данном документе, "идентичность последовательностей" или "идентичность" в контексте двух последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептидных последовательностей относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании на максимальное соответствие в пределах определенного окна сравнения. Если процентную идентичность последовательностей используют применительно к белкам, подразумевается, что положения остатков, которые не являются идентичными, часто отличаются консервативными аминокислотными заменами, при этом аминокислотные остатки заменены другими аминокислотными остатками с аналогичными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью) и, следовательно, не изменяют функциональные свойства молекулы. Если последовательности отличаются консервативными заменами, то процентную идентичность последовательностей можно повысить с тем, чтобы внести поправку на консервативную природу замены. Говорят, что последовательности, которые отличаются такими консервативными заменами, характеризуются "сходством последовательностей" или "сходством". Средства для осуществления такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области техники. Как правило, она предусматривает оценку в баллах консервативной замены как частичного, а не полного несовпадения, что, таким образом, увеличивает процентную идентичность последовательностей. Таким образом, например, если идентичной аминокислоте присваивается балл 1, а неконсервативной замене присваивается балл ноль, то консервативной замене присваивается балл от нуля до 1. Оценку консервативных замен в баллах рассчитывают, например, как реализовано в программе PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).
(d) Как используется в данном документе, "процентная идентичность последовательностей" означает значение, определяемое с помощью сравнения двух последовательностей с оптимальным выравниванием в пределах окна сравнения, где часть последовательности полинуклеотида в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток встречаются в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100 с получением процентной идентичности последовательности.
(e)(i) Термин "существенная идентичность" последовательностей полинуклеотидов означает, что полинуклеотид содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 80%, 90% или 95% или более идентична при сравнении с эталонной последовательностью с помощью одной из описанных программ для выравнивания с использованием стандартных параметров. Специалист в данной области техники поймет, что данные значения можно соответствующим образом скорректировать для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями с учетом вырожденности кодона, аминокислотного сходства, расположения рамки считывания и т.п. Существенная идентичность аминокислотных последовательностей для данных целей обычно означает, что последовательности идентичны по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% или более.
Другим показателем того, что нуклеотидные последовательности являются существенно идентичными, является то, что две молекулы гибридизируются друг с другом в жестких условиях. Обычно, жесткие условия выбирают так, чтобы температура была приблизительно на 5°C ниже Tm для конкретной последовательности при определенной ионной силе и pH. Тем не менее, жесткие условия охватывают температуры в диапазоне от приблизительно 1°C до приблизительно 20°C ниже Tm в зависимости от необходимой степени жесткости, что в ином случае оговорено в данном документе. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизируются друг с другом в жестких условиях, все еще являются существенно идентичными, если полипептиды, которые они кодируют, являются существенно идентичными. Это может иметь место, например, если копия нуклеиновой кислоты создана с использованием максимальной вырожденности кодона, допускаемой генетическим кодом. Одним показателем того, что две последовательности нуклеиновой кислоты существенно идентичны, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно-реагирующим с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой.
(e)(ii) Термин "существенная идентичность" в контексте пептида указывает на то, что пептид содержит последовательность, по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более идентичную эталонной последовательности в пределах определенного окна сравнения. Оптимальное выравнивание для этих целей можно провести с использованием алгоритма глобального выравнивания по Needleman and Wunsch (1970), выше. Признаком того, что две пептидные последовательности являются существенно идентичными, является то, что один пептид иммунологически реагирует с антителами ко второму пептиду. Таким образом, пептид является существенно идентичным второму пептиду, например, где два пептида отличаются только по консервативному замещению. Пептиды, которые являются "существенно сходными", имеют общие последовательности, как отмечалось выше, за исключением того, что положения остатков, которые не идентичны, могут отличаться по консервативным аминокислотным изменениям.
Применение термина "нуклеотидные конструкции" в данном документе не предназначено ограничивать варианты осуществления нуклеотидными конструкциями, содержащими ДНК. Специалисты в данной области техники поймут, что нуклеотидные конструкции, в частности полинуклеотиды и олигонуклеотиды, состоящие из рибонуклеотидов и комбинаций рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, также можно применять в способах, раскрытых в данном документе. Нуклеотидные конструкции, нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления дополнительно охватывают все комплементарные формы таких конструкций, молекул и последовательностей. Кроме того, нуклеотидные конструкции, нуклеотидные молекулы и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления охватывают все нуклеотидные конструкции, молекулы и последовательности, которые можно использовать в способах согласно вариантам осуществления для трансформации растений, в том числе, без ограничения, состоящие из дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и их комбинаций. Такие дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды имеют в составе как встречающиеся в природе молекулы, так и синтетические аналоги. Нуклеотидные конструкции, нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления также охватывают все формы нуклеотидных конструкций, в том числе без ограничения однонитевые формы, двунитевые формы, шпильки, структуры "стебель-и-петля" и т.п.
Дополнительный вариант осуществления относится к трансформированному организму, такому как организм, выбранный из группы, состоящей из растительных клеток или клеток насекомых, бактерий, дрожжей, бакуловируса, простейших, нематод и водорослей. Трансформированный организм содержит молекулу ДНК согласно вариантам осуществления, кассету экспрессии, содержащую указанную молекулу ДНК, или вектор, содержащий указанную кассету экспрессии, которые могут быть стабильно встроенными в геном трансформированного организма.
Последовательности согласно вариантам осуществления предусмотрены в составе конструкций ДНК для экспрессии в организме, представляющем интерес. Конструкции будут включать 5' и 3' регуляторные последовательности, функционально связанные с последовательностью согласно вариантам осуществления. Применяемый в данном документе термин "функционально связанные" относится к функциональной связи между промотором и второй последовательностью, где последовательность промотора инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Как правило, функционально связанный означает, что связанные последовательности нуклеиновых кислот являются смежными и, где необходимо для соединения двух кодирующих белок областей, смежными и в той же рамке считывания. Конструкция может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген, подлежащий введению в организм путем котрансформации. В качестве альтернативы, дополнительный ген (гены) могут предусматриваться в нескольких конструкциях ДНК.
Такая ДНК-конструкция снабжена несколькими сайтами рестрикции для вставки последовательности Cry токсина, транскрипция которой будет регулироваться регуляторными участками. ДНК-конструкция может дополнительно содержать гены селектируемых маркеров.
В направлении транскрипции 5' - 3' ДНК-конструкция будет включать участок инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), последовательность ДНК согласно вариантам осуществления и участок терминации транскрипции и трансляции (т.е. участок терминации), функционирующие в организме, служащем хозяином. Участок инициации транскрипции (т.е. промотор) может быть нативным, аналогичным, чужеродным или гетерологичным относительно организма-хозяина и/или последовательности согласно вариантам осуществления. Кроме того, промотор может быть природной последовательностью или, в качестве альтернативы, синтетической последовательностью. Применяемый в данном документе термин "чужеродный" указывает на то, что промотор не найден в нативном организме, в который введен промотор. Если промотор является "чужеродным" или "гетерологичным" относительно последовательности согласно вариантам осуществления, предполагается, что промотор не является нативным или встречающимся в природе промотором для функционально связанной последовательности согласно вариантам осуществления. Используемый в данном документе химерный ген содержит кодирующую последовательность, функционально связанную с участком инициации транскрипции, который является гетерологичным для кодирующей последовательности. Если промотор является нативной или природной последовательностью, экспрессия функционально связанной последовательности изменена по сравнению с экспрессией дикого типа, что приводит к изменению фенотипа.
Участок терминации может быть нативным относительно участка инициации транскрипции, может быть нативным относительно функционально связанной последовательности ДНК, представляющей интерес, может быть нативным относительно растения-хозяина или может быть получен из другого источника (т.e. чужеродный или гетерологичный для промотора, последовательности, представляющей интерес, растения-хозяина или какой-либо их комбинации).
Подходящие участки терминации доступны из Ti-плазмиды A. tumefaciens, такие как участки терминации генов октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. Также Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; и Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
При необходимости нуклеиновую кислоту можно оптимизировать для повышения экспрессии в организме-хозяине. Таким образом, если организм-хозяин является растением, для улучшенной экспрессии можно синтезировать синтетические нуклеиновые кислоты с использованием кодонов, предпочтительных для растений. См., например, Campbell и Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 в отношении обзора использования кодонов, предпочтительных для хозяина. Например, хотя последовательности нуклеиновых кислот согласно вариантам осуществления могут экспрессироваться у видов как однодольных, так и двудольных растений, последовательности можно модифицировать с учетом специфических предпочтений в отношении кодонов и предпочтений по содержанию GC у однодольных или двудольных, если было показано, что предпочтения отличаются (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Таким образом, кодон, предпочтительный для маиса, для конкретной аминокислоты можно установить из известных генных последовательностей маиса. Данные о частоте использования кодонов у маиса для 28 генов из растений маиса приведены в таблице 4 в Murray et al., выше. Из уровня техники доступны способы синтеза генов, предпочтительных для растений. См., например, патенты США №№ 5,380,831, и 5,436,391, и Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, включенные в данный документ посредством ссылки.
Известны дополнительные модификации последовательности для усиления экспрессии гена у клеточного хозяина. Они включают устранение последовательностей, кодирующих ложные сигналы полиаденилирования, сигналы сайта сплайсинга экзонов и интронов, транспозон-подобные повторы и другие хорошо изученные последовательности, которые могут быть вредны для экспрессии гена. Содержание GC в последовательности можно скорректировать до уровней, средних для данного клеточного хозяина, рассчитываемых с учетом известных генов, экспрессируемых в клетке-хозяине. Применяемый в данном документе термин "клетка-хозяин" относится к клетке, которая содержит вектор и которая поддерживает репликацию и/или экспрессию предполагаемых векторов экспрессии. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками, такими как E. coli, или эукариотическими клетками, такими как клетки дрожжей, насекомых, амфибий или млекопитающих, или клетками однодольных или двудольных растений. Примером клетки-хозяина, относящейся к однодольному растению, является клетка-хозяин маиса. Если возможно, последовательность модифицируют для того, чтобы избежать образования прогнозируемых шпилечных вторичных структур мРНК.
Кассеты экспрессии могут дополнительно содержать 5'-лидерные последовательности. Такие лидерные последовательности могут способствовать усилению трансляции. Лидерные последовательности трансляции известны из уровня техники и включают лидерные последовательности пикорнавирусов, например, лидерную последовательность (5'-некодирующий участок вируса энцефаломиокардита) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); лидерные последовательности потивирусов, например, лидерную последовательность TEV (вирус гравировки табака) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233-238), лидерную последовательность MDMV (вирус карликовой мозаики кукурузы), белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина человека (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 90-94); нетранслируемую лидерную последовательность из мРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625); лидерную последовательность вируса табачной мозаики (TMV) (Gallie et al. (1989) в Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); и лидерную последовательность вируса хлорозной мозаичности маиса (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385). См. Также, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968.
При получении кассеты экспрессии с различными фрагментами ДНК можно проводить манипуляции так, чтобы получить последовательности ДНК в надлежащей ориентации и, при необходимости, в надлежащей рамке считывания. С этой целью для соединения фрагментов ДНК можно использовать адаптеры или линкеры, или можно задействовать другие манипуляции для обеспечения подходящих сайтов рестрикции, удаления избыточной ДНК, удаления сайтов рестрикции и т.п. С этой целью можно задействовать мутагенез in vitro, репарацию с помощью праймеров, рестрикцию, гибридизацию, повторные замены, например, транзиции и трансверсии.
При практическом осуществлении вариантов осуществления можно применять ряд промоторов. Промоторы можно выбирать исходя из необходимого результата. Нуклеиновые кислоты можно объединять с конститутивными, тканепредпочтительными, индуцируемыми или другими промоторами для экспрессии в организме-хозяине. Подходящие конститутивные промоторы для использования в растительной клетке-хозяине включают, например, коровый промотор промотора Rsyn7 и другие конститутивные промоторы, раскрытые в документе WO 99/43838 и патенте США № 6072050; коровый промотор 35S CaMVр (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); актиновый промотор риса (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); убиквинтиновый промотор (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 и Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); промотор ALS (патент США № 5,659,026) и т. п. Другие конститутивные промоторы включают, например, раскрытые в патентах США №№ 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; и 6,177,611.
В зависимости от требуемого результата, может быть полезно экспрессировать ген при помощи индуцируемого промотора. Особый интерес для регуляции экспрессии нуклеотидных последовательностей согласно вариантам осуществления у растений представляют собой индуцируемые ранением промоторы. Такие индуцируемые ранением промоторы могут реагировать на повреждение, вызванное питанием насекомого, и они включают промотор гена ингибитора протеиназы картофеля (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28: 425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 494-498); промоторы генов wun1 и wun2, патент США № 5428148; промоторы генов win1 и win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215: 200-208); промотор гена системина (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570-1573); промотор гена WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73-76); промотор гена MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2): 141-150); и т. п., включенные в данный документ посредством ссылки.
Кроме того, в способах и нуклеотидных конструкциях согласно вариантам осуществления можно использовать индуцируемые патогеном промоторы. Такие индуцируемые патогеном промоторы включают промоторы из генов, связанных с патогенезом белков (PR белков), которые индуцируются после инфицирования патогеном; например, PR-белков, SAR-белков, бета-1,3-глюканазы, хитиназы и т. д. См., например, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; и Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116. См. Также WO 99/43819, включенные в данный документ посредством ссылки.
Представляют интерес промоторы, которые экспрессируются локально в месте заражения патогеном или рядом с ним. См., например, Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; и Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. См. Также, Chen et al. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968; патент США № 5,750,386 (индуцируемый нематодой) и источники, цитируемые в этих документах. Особый интерес представляет индуцируемый промотор для гена маиса PRms, экспрессия которого индуцируется патогеном Fusarium moniliforme (см., например, Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).
Регулируемые химическими веществами промоторы можно применять для модуляции экспрессии гена в растении посредством внесения экзогенного химического регулятора. В зависимости от цели, промотор может быть индуцируемым химическим веществом промотором, в этом случае применение химического вещества индуцирует экспрессию гена, или репрессируемым химическим веществом промотором, в этом случае применение химического вещества подавляет экспрессию гена. Индуцируемые химическими веществами промоторы известны из уровня техники, и они включают без ограничения промотор In2-2 маиса, который активируется антидотами к бензолсульфонамидным гербицидам, промотор GST маиса, который активируется гидрофобными электрофильными соединениями, которые применяются в качестве предвсходовых гербицидов, и промотор PR-1a табака, который активируется салициловой кислотой. Другие регулируемые химическими веществами промоторы, представляющие интерес, включают чувствительные к стероидам промоторы (см., например, индуцируемый глюкокортикоидами промотор в Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 и McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257) и индуцируемые тетрациклином и репрессируемые тетрациклином промоторы (см., например, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, и патенты США №№ 5,814,618 и 5,789,156), включенные в данный документ посредством ссылки.
Тканепредпочтительные промоторы можно использовать для целенаправленного усиления экспрессии пестицидного белка в пределах конкретной ткани растения. Тканепредпочтительные промоторы включают промоторы, обсуждаемые в Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; и Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. В случае необходимости, такие промоторы можно модифицировать с получением слабой экспрессии.
Промоторы, активные преимущественно в листьях, известны из уровня техники. См., например, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; и Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.
Известны промоторы, активные преимущественно в корнях, или промоторы, специфичные по отношению к корню, и их можно выбирать из многих доступных из литературы или выделенных de novo из различных совместимых видов. См., например, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (специфичные по отношению к корню сои ген глутаминсинтетазы);Keller и Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (специфичный по отношению к корню регуляторный элемент в гене GRP 1.8 фасоли);Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (специфичный по отношению к корню промотор гена маннопин-синтазы (MAS) из Agrobacterium tumefaciens);и Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (кДНК-клон полной длины, кодирующий цитозольную глутаминсинтетазу (GS), которая экспрессируется в корнях и корневых клубеньках сои). См. Также Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7):633-641, где описаны два специфичных по отношению к корню промотора, выделенные из генов гемоглобина азотфиксирующего, не относящегося к бобовым растения Parasponia andersonii, и родственного, не относящегося к азотфиксирующим и не относящегося к бобовым растения Trema tomentosa. Промоторы этих генов были связаны с репортерным геном β-глюкуронидазы и введены как в Nicotiana tabacum, не относящийся к бобовым, так и в бобовое Lotus corniculatus, и при этом в обоих случаях активность промотора, специфичная по отношению к корню, сохранялась. Leach и Aoyagi (1991) описывают свой анализ промоторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии генов rolC и rolD Agrobacterium rhizogenes, индуцирующих разрастание корней (см. Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Они пришли к выводу, что в этих промоторах энхансер и тканепредпочтительные ДНК-детерминанты разделены. Teeri et al. (1989) использовали слияние гена с lacZ для того, чтобы показать, что ген из T-ДНК Agrobacterium, кодирующий октопинсинтазу, является особенно активным в эпидермисе кончика корня, и что ген TR2' является специфичным по отношению к корню в интактном растении и стимулируется при ранении ткани листа, что является особенно желательной комбинацией характеристик для использования с инсектицидным или ларвицидным геном (см. EMBO J. 8(2):343-350). Ген TR1', слитый с nptII (неомицинфосфотрансфераза II), продемонстрировал аналогичные характеристики. Дополнительные промоторы, активные преимущественно в корнях, включают промотор гена VfENOD-GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772); и промотор rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. См. Также патенты США №№ 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732; и 5,023,179.
Промоторы, ʺактивные преимущественно в семениʺ, включают как промоторы, ʺспецифичные по отношению к семениʺ (промоторы, которые активны во время развития семени, такие как промоторы запасных белков семени), так и промоторы ʺпрорастания семениʺ (промоторы, которые активны во время прорастания семени). См. Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108, включенный в данный документ посредством ссылки. Такие промоторы, активные преимущественно в семени, включают без ограничения промоторы генов Cim1 (индуцируемый цитокинином транскрипт); cZ19B1 (19 кДа зеин маиса) и milps (мио-инозитол-1-фосфатсинтаза); (см. патент США № 6225529, включенный в данный документ посредством ссылки). Промоторы генов гамма-зеина и Glob-1 представляют собой промоторы, специфичные по отношению к эндосперму. У двудольных растений промоторы, специфичные по отношению к семени, включают без ограничения промоторы генов β-фазеолина фасоли, напина, β-конглицинина, лектина сои, круциферина и т.п. У однодольных растений промоторы, специфичные по отношению к семени, включают без ограничения промоторы генов 15 кДа зеина, 22 кДа зеина, 27 кДа зеина, g-зеина, waxy, shrunken 1, shrunken 2, глобулина 1 маиса и т.д. См. также включенный в данный документ посредством ссылки документ WO 00/12733, где раскрыты промоторы, активные преимущественно в семени, из генов end1 и end2. Промотор, который имеет ʺпреимущественнуюʺ экспрессию в конкретной ткани, экспрессируется в такой ткани в большей степени, чем по меньшей мере в одной другой растительной ткани. Для некоторых промоторов, активных преимущественно в определенной ткани, показана экспрессия почти исключительно в конкретной ткани.
Если требуется низкий уровень экспрессии, будут применяться слабые промоторы. Как правило, применяемый в данном документе термин "слабый промотор" относится к промотору, который управляет экспрессией кодирующей последовательности на низком уровне. Под низким уровнем экспрессии подразумевают уровни от приблизительно 1/1000 транскриптов до приблизительно 1/100000 транскриптов, до приблизительно 1/500000 транскриптов. В качестве альтернативы, понятно, что термин ʺслабые промоторыʺ также охватывает промоторы, которые управляют экспрессией только в небольшом количестве клеток и не управляют в других, при этом обеспечивается общий низкий уровень экспрессии. Если промотор управляет экспрессией с неприемлемо высокими уровнями, части промоторной последовательности можно удалить или модифицировать для снижения уровней экспрессии.
Такие слабые конститутивные промоторы включают, например, коровый промотор промотора Rsyn7 (WO 99/43838 и патент США № 6,072,050), коровый промотор 35S CaMV и им подобные. Другие конститутивные промоторы включают, например, раскрытые в патентах США №№ 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; и 6,177,611; включенных в данный документ посредством ссылки.
Как правило, кассета экспрессии будет содержать ген селектируемого маркера для отбора трансформированных клеток. Гены селектируемых маркеров используют для отбора трансформированных клеток или тканей. Гены маркеров включают в себя гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам, такие как гены, кодирующие неомицин-фосфотрансферазу II (NEO) и гигромицин-фосфотрансферазу (HPT), а также гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидным соединениям, таким как глуфосинат аммония, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-D). Дополнительные примеры генов подходящих селектируемых маркеров включают без ограничения гены, кодирующие устойчивость к хлорамфениколу (Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992); метотрексату (Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; и Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); стрептомицину (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); спектиномицину (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137); блеомицину (Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); сульфонамиду (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); бромоксинилу (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); глифосату (Shaw et al. (1986) Science 233:478-481; и патенты США №№ 7,709,702; и 7,462,481); фосфинотрицину (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518). см. в общем, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley et al. (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48: 555-566; Brown et al. (1987) Cell 49: 603-612; Figge et al. (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) докторская диссертация, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) докторская диссертация, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); и Gill et al. (1988) Nature 334: 721-724. Такие раскрытия включены в данный документ посредством ссылки.
Приведенный выше перечень генов селектируемых маркеров не предназначен для ограничения. Любой ген селектируемого маркера можно применять в вариантах осуществления.
Способы согласно вариантам осуществления включают введение полипептида или полинуклеотида в растение. Как подразумевается, "введение" означает представление растению полинуклеотида или полипептида таким образом, что последовательность попадает внутрь клетки растения. Способы согласно вариантам осуществления не зависят от конкретного способа введения полинуклеотида или полипептида в растение, нужно только, чтобы полинуклеотид или полипептиды проникали внутрь по меньшей мере одной клетки растения. Из уровня техники известны способы введения полинуклеотида или полипептидов в растения, в том числе без ограничений способы стабильной трансформации, способы временной трансформации и способы трансформации, опосредованной вирусами.
Подразумевается, что "стабильная трансформация" означает, что нуклеотидный конструкция, вводимая в растение, интегрируется в геном растения и может быть унаследована его потомками. Подразумевается, что "временная трансформация" означает, что полинуклеотид вводится в растение и не интегрируется в геном растения, или в растение вводится полипептид.
Протоколы трансформации, а также протоколы для введения нуклеотидных последовательностей в растения могут изменяться в зависимости от типа растения или растительной клетки, т.е. однодольных или двудольных, на которые нацелена трансформация. Подходящие способы введения нуклеотидных последовательностей в клетки растений и последующей вставки в геном растения включают микроинъекцию (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334), электропорацию (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606), трансформацию, опосредованную Agrobacterium (патенты США №№ 5,563,055 и 5,981,840), прямой перенос гена (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722) и баллистическое ускорение частиц (см., например, патенты США №№ 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; и 5,932,782; Tomes et al. (1995) в Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg и Phillips (Springer-Verlag, Berlin); и McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); и трансформацию гена Lecl (WO 00/28058). Что касается трансформации картофеля, см.Tu et al. (1998) Plant Molecular Biology 37: 829-838 и Chong et al. (2000) Transgenic Research 9: 71-78. Дополнительные методики трансформации можно найти в Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (лук); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (соя); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (соя); Finer и McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (соя); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (соя); Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (рис); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (маис); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (маис); патентах США №№ 5,240,855; 5,322,783 и 5,324,646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (маис); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (маис); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763-764; патенте США № 5,736,369 (зерновые злаки); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (пыльца); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 и Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (опосредованная нитевидными кристаллами трансформация); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (электропорация); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 и Christou и Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (рис); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (маис при участии Agrobacterium tumefaciens); все из которых включены в данный документ посредством ссылки.
В конкретных вариантах осуществления последовательности согласно вариантам осуществления можно предоставлять растению с применением ряда способов временной трансформации. Такие способы временной трансформации включают без ограничения введение белка Cry токсина или его вариантов и фрагментов непосредственно в растение или введение транскрипта Cry токсина в растение. Такие способы включают, например, микроинъекцию или бомбардировку частицами. См., например, Crossway et al. (1986) Mol Gen. Genet. 202: 179-185; Nomura et al. (1986) Plant Sci. 44: 53-58; Hepler et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 2176-2180 и Hush et al. (1994) The Journal of Cell Science 107: 775-784, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. В качестве альтернативы, растение можно временно трансформировать полинуклеотидом Cry токсина с использованием методик, известных из уровня техники. Такие методики включают применение вирусной векторной системы и осаждение полинуклеотида таким способом, который исключает последующее высвобождение ДНК. Таким образом, может происходить транскрипция ДНК, связанной с частицами, но частота, с которой она высвобождается для интеграции в геном, в значительной степени снижена. Такие способы включают применение частиц, покрытых полиэтиленимином (PEI; № по кат. Sigma P3143).
Из уровня техники известны способы нацеленной вставки полинуклеотида в специфическое местоположение в геноме растения. В одном варианте осуществления вставку полинуклеотида в требуемое местоположение в геноме выполняют с использованием системы сайт-специфичной рекомбинации. См., например, WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855, и WO99/25853, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Вкратце, полинуклеотид согласно вариантам осуществления может содержаться в кассете для переноса, фланкированной двумя неидентичными сайтами рекомбинации. Кассету для переноса вводят в растение, имеющее в своем геноме стабильно встроенный целевой сайт, фланкированный двумя неидентичными сайтами рекомбинации, которые соответствуют сайтам кассеты для переноса. Обеспечивают подходящую рекомбиназу, и кассета для переноса интегрируется в целевой сайт. Полинуклеотид, представляющий интерес, таким образом, интегрируется в конкретное хромосомное положение в геноме растения.
Из клеток, которые были трансформированы, можно вырастить растения в соответствии с традиционными способами. См., например, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Эти растения затем можно выращивать и опылять либо с использованием такого же трансформированного штамма, либо других штаммов и идентифицировать полученный гибрид с конститутивной или индуцируемой экспрессией требуемой фенотипической характеристики. Можно вырастить два или более поколений для того, чтобы убедиться в том, что экспрессия требуемой фенотипической характеристики стабильно поддерживается и наследуется, а затем собрать семена, чтобы убедиться в том, что экспрессия требуемой фенотипической характеристики была достигнута.
Нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно обеспечить в растении путем приведения растения в контакт с вирусом или вирусными нуклеиновыми кислотами. Как правило, такие способы включают встраивание нуклеотидной конструкции, представляющей интерес, в вирусную молекулу ДНК или РНК. Понятно, что рекомбинантные белки согласно вариантам осуществления могут первоначально синтезироваться как часть вирусного полипротеина, который позже может процессироваться путем протеолиза in vivo или in vitro с образованием необходимого пестицидного белка. Также понятно, что такой вирусный полипротеин, содержащий по меньшей мере часть аминокислотной последовательности пестицидного белка согласно вариантам осуществления, может обладать необходимой пестицидной активностью. Такие вирусные полипротеины и нуклеотидные последовательности, которые их кодируют, охвачены вариантами осуществления. Способы получения растений с нуклеотидными конструкциями и продукции кодируемых белков в растениях, которые включают вирусные молекулы ДНК или РНК, известны из уровня техники. См., например, патенты США №№ 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367; и 5,316,931, включенные в данный документ посредством ссылки.
Варианты осуществления дополнительно относятся к материалу для размножения трансформированного растения согласно вариантам осуществления, в том числе без ограничения семенам, клубням, клубнелуковицам, луковицам, листьям и черенкам корней и побегов.
Варианты осуществления можно применять для трансформации любых видов растений, в том числе без ограничения однодольных и двудольных. Примеры растений, представляющих интерес, включают без ограничений кукурузу (Zea mays), Brassica sp. (например, B. napus, B. rapa, B. juncea), в частности виды Brassica, пригодные в качестве источников масла из семян растений, люцерну (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), рожь (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), просо (например, пеннисетум рогозовидный (Pennisetum glaucum), просо культурное (Panicum miliaceum), щетинник итальянский (Setaria italica), просо пальчатое (Eleusine coracana)), подсолнечник (Helianthus annuus), сафлор (Carthamus tinctorius), пшеницу (Triticum aestivum), сою (Glycine max), табак (Nicotiana tabacum), картофель (Solanum tuberosum), арахис (Arachis hypogaea), хлопчатник (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), батат (Ipomoea batatus), маниок (Manihot esculenta), кофейное дерево(Coffea spp.), кокосовую пальму (Cocos nucifera), ананас (Ananas comosus), цитрусовые деревья (Citrus spp.), шоколадное дерево (Theobroma cacao), чайный куст (Camellia sinensis), банан (Musa spp.), авокадо (Persea americana), инжир (Ficus casica), гуаву (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), маслину (Olea europaea), папайю (Carica papaya), кешью (Anacardium occidentale), макадамию (Macadamia integrifolia), миндаль (Prunus amygdalus), сахарную свеклу (Beta vulgaris), сахарный тростник (Saccharum spp.), разновидности овса, ячмень, овощи, декоративные растения и хвойные растения.
Овощи включают томаты (Lycopersicon esculentum), латук (например, Lactuca sativa), зеленую фасоль (Phaseolus vulgaris), лимскую фасоль (Phaseolus limensis), разновидности гороха (Lathyrus spp.) и представителей рода Cucumis, таких как огурец (C. sativus), канталупа (C. cantalupensis) и дыня мускусная (C. melo). Декоративные растения включают азалию (Rhododendron spp.), гортензию (Macrophylla hydrangea), гибискус (Hibiscus rosasanensis), розы (Rosa spp.), тюльпаны (Tulipa spp.), нарциссы (Narcissus spp.), петунии (Petunia hybrida), гвоздику (Dianthus caryophyllus), пуансеттию (Euphorbia pulcherrima) и хризантему. Хвойные деревья, которые могут быть использованы в реализации настоящего изобретения на практике, включают, например, виды сосны, такие как сосна ладанная (Pinus taeda), сосна Эллиота (Pinus elliotii), сосна желтая (Pinus ponderosa), скрученная широкохвойная сосна(Pinus contorta) и сосна лучистая (Pinus radiata); лжетсугу тиссолистую (Pseudotsuga menziesii); тсугу западную (Tsuga canadensis); ель ситхинскую (Picea glauca); калифорнийское мамонтово дерево (Sequoia sempervirens); истинные ели, такие как пихта белая(Abies amabilis) и пихта бальзамическая (Abies balsamea); и кедры, такие как туя(Thuja plicata) и аляскинский желтый кедр (Chamaecyparis nootkatensis). Растения согласно вариантам осуществления включают культурные растения, в том числе без ограничения кукурузу, люцерну, подсолнечник, Brassica spp., сою, хлопчатник, сафлор, арахис, сою, пшеницу, просо, табак, сахарный тростник и т. д.
Разновидности газонной травы включают без ограничения мятлик однолетний (Poa annua); райграс однолетний (Lolium multiflorum); мятлик сплюснутый (Poa compressa); овсяницу красную Чуинга (Festuca rubra); полевицу тонкую (Agrostis tenuis); полевицу болотную(Agrostis palustris); житняк пустынный (Agropyron desertorum); житняк гребенчатый(Agropyron cristatum); овсяницу длиннолистную (Festuca longifolia); мятлик луговой (Poa pratensis); ежу сборную (Dactylis glomerata); плевел многолетний (Lolium perenne); овсяницу красную(Festuca rubra); полевицу белую (Agrostis alba); мятлик обыкновенный (Poa trivialis); овсяницу овечью (Festuca ovina); костер безостый (Bromus inermis); овсяницу тростниковую (Festuca arundinacea); тимофеевку луговую (Phleum pratense); полевицу собачью (Agrostis canina); бескильницу расставленную(Puccinellia distans); пырей Смита (Agropyron smithii); свинорой пальчатый (Cynodon spp.); узкобороздник однобокий (Stenotaphrum secundatum); зойсию (Zoysia spp.); гречку заметную (Paspalum notatum); аксонопус афинский (Axonopus affinis); эремохлою змеехвостую(Eremochloa ophiuroides); кикуйю (Pennisetum clandesinum); паспалум влагалищный(Paspalum vaginatum); москитную траву (Bouteloua gracilis); бизонову траву (Buchloe dactyloids); боковой овес (Bouteloua curtipendula).
Растения, представляющие интерес, включают зерновые растения, которые дают семена, представляющие интерес, масличные растения и бобовые растения. Семена, представляющие интерес, включают семена зерновых культур, таких как кукуруза, пшеница, ячмень, рис, сорго, рожь, просо и т. д. Масличные растения включают хлопчатник, сою, сафлор, подсолнечник, Brassica, маис, люцерну, пальму, кокосовую пальму, лен, клещевину, маслину и т. д. Бобовые растения включают разновидности бобов и разновидности гороха. Бобы включают гуар, рожковое дерево, пажитник, сою, разновидности обыкновенной фасоли, вигну китайскую, золотистую фасоль, лимскую фасоль, стручковую фасоль, разновидности чечевицы, турецкий горох и т. д.
В определенных вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления можно пакетировать с любой комбинацией представляющих интерес последовательностей полинуклеотидов для создания растений с необходимым фенотипом. Например, полинуклеотиды согласно вариантам осуществления можно пакетировать с любыми другими полинуклеотидами, кодирующими полипептиды с пестицидной и/или инсектицидной активностью, такими как другие токсичные белки Bt (описанные в патентах США №№ 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; и Geiser et al. (1986) Gene 48:109), пентин (описан в патенте США № 5981722) и им подобные. Полученные комбинации также могут включать несколько копий любого представляющего интерес полинуклеотида. Полинуклеотиды согласно вариантам осуществления можно также пакетировать с любым другим геном или комбинацией генов для получения растений с разнообразными комбинациями необходимых признаков, в том числе без ограничений с признаками, желательными для использования для питания животных, такими как гены, обуславливающие высокое содержание масла (например, патент США № 6,232,529); сбалансированное содержание аминокислот (например, хордотионины (патенты США №№ 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802; и 5,703,049); ячмень с высоким содержанием лизина (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165: 99-106; и WO 98/20122) и белки с высоким содержанием метионина (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71: 359; и Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); повышенную усвояемость (например, модифицированные запасные белки (патент США № 6,858,778); и гены тиоредоксинов (патент США № 7,009,087), раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки.
Полинуклеотиды согласно вариантам осуществления также можно пакетировать с признаками, желательными для устойчивости к заболеваниям или гербицидам (например, гены детоксикации фумонизина (патент США № 5,792,931); гены авирулентности или устойчивости к заболеваниям (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262: 1432; и Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); мутанты по ацетолактат-синтазе (ALS), которые обуславливают устойчивость к гербицидам, как например, мутации S4 и/или Hra; устойчивости к ингибиторам глутамин-синтазы, таким как фосфинотрицин или basta (например, ген bar); и обуславливающие устойчивость к глифосату (ген EPSPS и ген GAT, которые раскрыты в патентах США №№ 7709702 и 7462481; и с признаками, желательными для обработки или переработки продуктов, такими как высокое содержание масла (например, патент США № 6,232,529); модифицированные масла (например, гены десатуразы жирных кислот (патент США № 5,952,544; WO 94/11516)); модифицированные крахмалы (например, ADPG-пирофосфорилазы (AGPаза), крахмал-синтазы (SS), крахмал-ветвящие ферменты (SBE) и крахмал-деветвящие ферменты (SDBE)); и с полимерами или биопластмассами (например, патент США № 5602321; бета-кетотиолаза, полигидроксибутиратсинтаза и ацетоацетил-CoA-редуктаза (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170: 5837-5847), с признаками, облегчающими экспрессию полигидроксиалканоатов (PHA)), раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки. Также можно комбинировать полинуклеотиды согласно вариантам осуществления с полинуклеотидами, обеспечивающими агрономические признаки, такие как мужская стерильность(см. в общем патент США № 5,583,210), прочность стебля, время цветения, или признаки, связанные с технологией трансформации, такие как регуляция клеточного цикла или целенаправленное воздействие на гены (например. WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки.
В некотором варианте осуществления пакетированный признак может представлять собой признак или трансгенный объект, который получил разрешение контролирующих органов, которые хорошо известны специалисту в данной области техники и их можно найти на сайте Центра оценки риска для окружающей среды (cera-gmc.org/?action=gm_crop_database, доступ к которому можно получить с использованием префикса www) и на сайте Международной службы по приобретению агробиотехнологических приложений (isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp, доступ к которому можно получить с применением префикса www).
Эти пакетированные комбинации можно создавать любым способом, в том числе без ограничений перекрестным скрещиванием растений с помощью любой традиционной методики, или методики TOPCROSS®, или генетической трансформации. Если признаки пакетированы с помощью генетической трансформации растений, то представляющие интерес последовательности полинуклеотидов можно комбинировать в любое время и в любом порядке. Например, трансгенное растение, содержащее один или несколько требуемых признаков, можно применять в качестве мишени для введения дополнительных признаков с помощью последовательной трансформации. Признаки можно вводить одновременно в протоколе котрансформации с представляющими интерес полинуклеотидами, представленными любой комбинацией кассет трансформации. Например, если будут вводиться две последовательности, то эти две последовательности могут содержаться в отдельных кассетах для трансформации (транс) или содержаться в одной кассете для трансформации (цис). Экспрессия этих последовательностей может управляться одним и тем же промотором или различными промоторами. В определенных случаях может потребоваться введение кассеты для трансформации, которая будет подавлять экспрессию представляющего интерес полинуклеотида. Ее можно комбинировать с любой комбинацией других кассет супрессии или кассет сверхэкспрессии для получения требуемой комбинации признаков в растении. Кроме того, считается, что полинуклеотидные последовательности можно пакетировать в требуемом местоположении в геноме с применением системы для сайт-специфичной рекомбинации. См., например, WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 и WO99/25853, все из которых включены в данный документ посредством ссылки.
Композиции согласно вариантам осуществления находят разнообразные применения в защите растений, семян и растительных продуктов. Например, композиции можно использовать в способе, который предполагает помещение эффективного количества пестицидной композиции в среду обитания вредителя с помощью процедуры, выбранной из группы, состоящей из опрыскивания, опыливания, разбрасывания или нанесения покрытия на семена.
Перед продажей материала для размножения растений (плода, клубня, луковицы, клубнелуковиц, зерен, семени), в особенности семени, в качестве коммерческого продукта, его в обычном порядке обрабатывают с использованием защитного покрытия, содержащего гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскоциды или смеси некоторых из этих препаратов, при необходимости, вместе с дополнительными носителями, поверхностно-активными веществами или способствующими нанесению вспомогательными веществами, обычно применяемыми в области получения составов для обеспечения защиты от повреждения, вызванного бактериальными, грибковыми вредителями или животными-вредителями. Для того чтобы обработать семя, защитное покрытие можно применять по отношению к семенам либо путем пропитки клубней или зерен жидким составом, либо путем нанесения на них покрытия из комбинированного влажного или сухого состава. Кроме того, в особых случаях возможны другие способы применения по отношению к растениям, например, обработка, направленная на почки или плоды.
Семя растения согласно вариантам осуществления, содержащее нуклеотидную последовательность, кодирующую пестицидный белок согласно вариантам осуществления, можно обрабатывать защитным покрытием для семян, содержащим соединение для обработки семян, такое как, например, каптан, карбоксин, тирам, металаксил, пиримифос-метил и другие, которые обычно применяются в обработке семян. В одном варианте осуществления защитное покрытие для семян, содержащих пестицидную композицию согласно вариантам осуществления, используют отдельно или в комбинации с одним из защитных покрытий для семян, обычно применяемых в обработке семян.
Считается, что гены, кодирующие пестицидные белки, можно использовать для трансформации организмов, патогенных для насекомых. Такие организмы включают бакуловирус, грибы, простейших, бактерий и нематод.
Ген, кодирующий пестицидный белок согласно вариантам осуществления, можно вводить с помощью подходящего вектора в микроорганизм-хозяин, а указанного хозяина применять по отношению к окружающей среде, или растениям, или животным. Термин ʺвведенныйʺ в контексте вставки нуклеиновой кислоты в клетку означает ʺтрансфекциюʺ, или ʺтрансформациюʺ, или ʺтрансдукциюʺ и включает ссылку на встраивание нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, где нуклеиновая кислота может встраиваться в геном клетки (например, хромосому, плазмиду, пластидную или митохондриальную ДНК), превращаться в автономный репликон или временно экспрессироваться (например, трансфицированная мРНК).
Могут быть выбраны микроорганизмы-хозяева, которые, как известно, заселяют "фитосферу" (филлоплан, филлосферу, ризосферу и/или ризоплан) одной или нескольких сельскохозяйственных культур, представляющих интерес. Эти микроорганизмы выбирают таким образом, чтобы они могли успешно конкурировать в конкретной среде с микроорганизмами дикого типа, обеспечивать стабильное поддержание и экспрессию гена, экспрессирующего пестицидный белок, и, желательно, обеспечивать улучшенную защиту пестицида от разрушения и инактивации в окружающей среде.
Такие микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют микроорганизмы, такие как бактерии, например, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, и Alcaligenes, грибы, в частности, дрожжи, например, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие виды бактерий фитосферы как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli и Azotobacter vinelandii, а также виды дрожжей фитосферы, такие как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.
Доступен ряд способов для введения гена, экспрессирующего пестицидный белок, в микроорганизм-хозяин в условиях, которые создают возможность для стабильного сохранения и экспрессии данного гена. Например, можно конструировать кассеты экспрессии, которые содержат нуклеотидные конструкции, представляющие интерес, функционально связанные с сигналами регуляции транскрипции и трансляции для экспрессии нуклеотидных конструкций, и нуклеотидную последовательность, гомологичную последовательности в организме-хозяине, при помощи которой будет происходить внедрение, и/или систему репликации, функционирующую в хозяине, при помощи которой будет происходить внедрение или стабильное поддержание.
Сигналы регуляции транскрипции и трансляции включают в себя без исключения промоторы, старт-сайты инициации транскрипции, операторы, активаторы, энхансеры, другие регуляторные элементы, сайты связывания рибосом, кодон инициации, сигналы терминации и т.п. См., например, патенты США №№ 5,039,523 и 4,853,331; EPO 0480762A2; Sambrook; Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Davis et al., eds. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) и источники, цитируемые в этом документе.
Подходящие клетки-хозяева, где клетки, содержащие пестицидный белок, будут обрабатывать для продления активности пестицидных белков в клетке в случае, когда обработанную клетку вносят в среду обитания вредителя-мишени(вредителей-мишеней), могут включать либо прокариотов, либо эукариотов, при этом они обычно ограничены теми клетками, которые не вырабатывают веществ, токсичных для высших организмов, таких как млекопитающие. Тем не менее, организмы, которые вырабатывают вещества, токсичные для высших организмов, можно применять в том случае, когда токсин является нестабильным или уровень применения является весьма низким, чтобы избежать любой возможности токсичности в отношении млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев особый интерес будут представлять прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы. Иллюстративные прокариоты, как грамотрицательные, так и грамположительные включают Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella, и Proteus; Bacillaceae; Rhizobiaceae, такие как Rhizobium; Spirillaceae, такие как Рhotobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, такие как Pseudomonas и Acetobacter; Azotobacteraceae и Nitrobacteraceae. Среди эукариот представлены грибы, такие как Phycomycetes и Ascomycetes, которые включают дрожжи, такие как Saccharomyces и Schizosaccharomyces; и дрожжи из отдела Basidiomycetes, такие как Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces и т.п.
Характеристики, представляющие особый интерес при выборе клетки-хозяина с целью выработки пестицидного белка, включают простоту введения гена пестицидного белка в хозяина, доступность систем экспрессии, эффективность экспрессии, стабильность белка в хозяине и наличие сопутствующих генетических возможностей. Характеристики, представляющие интерес для применения в виде пестицидной микрокапсулы, включают защитные свойства для пестицида, такие как толстые клеточные стенки, пигментация и внутриклеточная упаковка или образование телец включений; сродство к листьям; отсутствие токсичности для млекопитающих; привлекательность для поглощения вредителями; простота уничтожения и усвоение без повреждения токсина и т.п. Другие соображения включают легкость составления и обращения, экономичность, стабильность при хранении и т.п.
Организмы-хозяева, представляющие особый интерес, включают дрожжи, такие как Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp. (такие как S. cerevisiae), Sporobolomyces spp., организмы филлоплана, такие как Pseudomonas spp. (такие как P. aeruginosa, P. fluorescens), Erwinia spp. и Flavobacterium spp., а также другие такие организмы, в том числе Bt, E. coli, Bacillus subtilis и т.п.
Гены, кодирующие пестицидные белки согласно вариантам осуществления, можно вводить в микроорганизмы, которые размножаются на растениях (эпифиты) для доставки пестицидных белков к потенциальным вредителям-мишеням. Эпифиты, например, могут представлять собой грамположительные или грамотрицательные бактерии.
Бактерии, колонизирующие корни, например, можно выделять из растений, представляющих интерес, при помощи способов, известных из уровня техники. А именно, штамм Bacillus cereus, который колонизирует корни, можно выделять из корней растения (см., например, Handelsman et al. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 56:713-718). Гены, кодирующие пестицидные белки согласно вариантам осуществления, можно вводить в Bacillus cereus, колонизирующую корни, при помощи стандартных способов, известных из уровня техники.
Гены, кодирующие пестицидные белки, можно вводить, например, в Bacillus, колонизирующую корни, посредством электротрансформации. В частности, гены, кодирующие пестицидные белки, можно клонировать в челночный вектор, например, pHT3101 (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218. При помощи челночного вектора pHT3101, содержащего кодирующую последовательность конкретного гена пестицидного белка, можно, например, трансформировать Bacillus, колонизирующую корни, посредством электропорации (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211-218).
Системы экспрессии можно разрабатывать таким образом, чтобы пестицидный белки секретировались за пределы цитоплазмы грам-отрицательных бактерий, таких как, например, E. coli. Преимущества секреции пестицидных белков являются следующими: (1) возможность избежать потенциальных цитотоксических эффектов экспрессируемого белка и (2) улучшение эффективности очистки пестицидного белка, в том числе без ограничения повышение эффективности выделения и очистки белка в расчете на объем клеточного бульона и снижение времени и/или затрат на извлечение и очистку в пересчете на единицу белка.
Пестицидные белки можно создать таким образом, чтобы они секретировались в E. coli, например, путем слияния подходящего сигнального пептида E. coli с амино-концом пестицидного белка. Сигнальные пептиды, распознаваемые E. coli, можно найти в белках, которые, как уже известно, секретируются у E. coli, например, белок OmpA (Ghrayeb et al. (1984) EMBO J, 3:2437-2442). OmpA представляет собой главный белок внешней мембраны E. coli, и, таким образом, полагают, что его сигнальный пептид является эффективным в процессе транслокации. Также сигнальный пептид OmpA не нужно модифицировать перед процессингом, что может иметь место в случае других сигнальных пептидов, например, сигнального пептида липопротеинов (Duffaud et al. (1987) Meth. Enzymol. 153: 492).
Пестицидные белки согласно вариантам осуществления можно ферментировать в бактерии-хозяине, а полученные бактерии обрабатывать и использовать в виде микробных распыляемых растворов тем же способом, что и штаммы Bt, которые применялись в виде инсектицидных распыляемых растворов. В случае пестицидного белка (белков), которые секретируются из Bacillus, сигнал секреции удаляют или подвергают мутации с применением методик, известных из уровня техники. Такие мутации и/или делеции предотвращают секрецию пестицидного белка (белков) в ростовую среду во время процесса ферментации. Пестицидные белки остаются в пределах клетки, и клетки затем обрабатывают для получения инкапсулированных пестицидных белков. Для этой цели можно применять любой подходящий микроорганизм. Pseudomonas применяли для экспрессии Bt токсинов в виде инкапсулированных белков, а полученные клетки подвергали обработке и распылению в качестве инсектицида (Gaertner et al. (1993), в: Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim).
В качестве альтернативы, пестицидные белки вырабатываются при введении гетерологичного гена в клеточного хозяина. Экспрессия гетерологичного гена приводит, прямо или опосредованно, к выработке и сохранению пестицида внутри клетки. Эти клетки затем обрабатывают при условиях, которые продлевают активность токсина, вырабатываемого в клетке, когда осуществляют применение клетки по отношению к среде целевого вредителя(вредителей). Полученный продукт сохраняет токсичность токсина. Эти инкапсулированные естественным образом пестицидные белки можно затем составлять в соответствии с традиционными методиками для применения по отношению к среде пребывания вредителя-мишени, например, почва, вода и листва растений. См., например, документ EP0192319 и источники, цитируемые в этом документе.
В вариантах осуществления трансформированный микроорганизм (который включает целые организмы, клетки, спору(споры), пестицидный белок (белки), пестицидный компонент(компоненты), оказывающий воздействие на вредителя компонент(компоненты), мутант(мутанты), живые или мертвые клетки и клеточные компоненты, в том числе смеси живых и мертвых клеток и клеточных компонентов, и в том числе разрушенные клетки и клеточные компоненты) или выделенный пестицидный белок можно составить с приемлемым носителем в пестицидную композицию (композиции), которая представляет собой, например, суспензию, раствор, эмульсию, распыляемый порошок, диспергируемые гранулы или пеллеты, смачиваемый порошок и эмульгируемый концентрат, аэрозоль или распыляемый раствор, пропитанные гранулы, вспомогательное вещество, наносимую в качестве покрытия пасту, коллоид, а также инкапсулированные формы, например, в полимерных веществах. Такие составленные композиции можно получать с помощью таких общепринятых способов, как высушивание, лиофилизация, гомогенизация, экстракция, фильтрование, центрифугирование, седиментация или концентрирование культуры клеток, содержащих полипептид.
Такие композиции, раскрытые выше, можно получать с помощью добавления поверхностно-активного средства, инертного носителя, консерванта, увлажнителя, стимулятора поедания, аттрактанта, средства для инкапсуляции, связующего, эмульгатора, красителя, защитного средства от УФ, буфера, средства, повышающего текучесть, или удобрения, донора питательных микроэлементов или других препаратов, которые влияют на рост растения. Один или несколько агрохимикатов, в том числе без ограничения гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскоциды, акарициды, регуляторы роста растений, вспомогательные средства для сбора урожая и удобрения, можно комбинировать с носителями, поверхностно-активными веществами или вспомогательными средствами, традиционно используемыми в области составления, или другими компонентами для облегчения обращения с продуктом и его применения по отношению к конкретным целевым вредителям. Подходящие носители и вспомогательные средства могут быть твердыми или жидкими и соответствуют веществам, обычно используемым в технологии составления, например, природным или регенерированным минеральным веществам, растворителям, диспергирующим веществам, смачивающим средствам, веществам, придающим клейкость, связующим или удобрениям. Активные ингредиенты согласно вариантам осуществления обычно применяют в виде композиций и их можно применять по отношению к возделываемой площади, растению или семени, подлежащим обработке. Например, композиции согласно вариантам осуществления можно применять по отношению к зерну при подготовке к хранению или во время хранения в зерновом бункере или элеваторе и т.д. Композиции можно применять одновременно или последовательно с другими соединениями. Способы применения активного ингредиента согласно вариантам осуществления или агрохимической композиции согласно вариантам осуществления, которая содержит по меньшей мере один из пестицидных белков, вырабатываемых штаммами бактерий согласно вариантам осуществления, включают без ограничения внекорневое применение, нанесение покрытия на семена и применение по отношению к почве. Количество применений и норма применения зависят от интенсивности поражения соответствующим вредителем.
Подходящие поверхностно-активные средства включают без ограничений анионные соединения, такие как карбоксилат, например, металла; карбоксилат длинноцепочечной жирной кислоты; N-ацилсаркозинат; сложные моно- или диэфиры фосфорной кислоты с этоксилатами жирных спиртов или соли таких сложных эфиров; сульфаты жирных спиртов, такие как додецилсульфат натрия, октадецилсульфат натрия или цетилсульфат натрия; сульфаты этоксилированных жирных спиртов; этоксилированные алкилфенолсульфаты; лигнинсульфонаты; нефтяные сульфонаты; алкиларилсульфонаты, такие как алкил-бензолсульфонаты или низшие алкилнафталинсульфонаты, например, бутилнафталинсульфонат; соли сульфированных нафталин-формальдегидных конденсатов; соли сульфированных фенол-формальдегидных конденсатов; более сложные сульфонаты, такие как сульфонаты амидов, например, сульфированный продукт конденсации олеиновой кислоты и N-метилтаурина; или диалкилсульфосукцинаты, например, сульфонат натрия или диоктилсукцинат. Неионогенные средства включают продукты конденсации сложных эфиров жирных кислот, жирных спиртов, амидов жирных кислот или жирных алкил- или алкенилзамещенных фенолов с этиленоксидом, сложные эфиры жирной кислоты и эфиров многоатомных спиртов, например, сложные эфиры сорбита и жирных кислот, продукты конденсации таких сложных эфиров с этиленоксидом, например, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, ацетиленовые гликоли, такие как 2,4,7,9-тетраэтил-5-децин-4,7-диол, или этоксилированные ацетиленовые гликоли. Примеры катионного поверхностно-активного средства включают, к примеру, алифатический моно-, ди- или полиамин, такой как ацетат, нафтенат или олеат; или кислородсодержащий амин, такой как аминоксид полиоксиэтиленалкиламина; амины с амидными связями, полученные путем конденсации карбоновой кислоты с ди- или полиамином; или соль четвертичного аммония.
Примеры инертных материалов включают без ограничений неорганические минеральные вещества, такие как каолин, филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты, или растительные материалы, такие как пробка, измельченные в порошок стержни кукурузных початков, шелуха арахиса, шелуха риса и скорлупа грецких орехов.
Композиции согласно вариантам осуществления могут находиться в форме, подходящей для непосредственного применения, или в виде концентрата первичной композиции, для которого требуется разведение подходящим количеством воды или другого разбавителя перед применением. Концентрация пестицида будет варьировать в зависимости от природы конкретного состава, в частности от того, является ли он концентратом или должен применяться непосредственно. Композиция содержит 1-98% твердого или жидкого инертного носителя и 0-50% или 0,1-50% поверхностно-активного вещества. Эти композиции будут вводить в обозначенной норме для коммерческого продукта, например, от приблизительно 0,01 фунта до 5,0 фунтов на акр при применении в сухой форме и при от приблизительно 0,01 пинты до 10 пинт на акр при применении в жидкой форме.
В дополнительном варианте осуществления композиции, а также трансформированные микроорганизмы и пестицидные белки согласно вариантам осуществления можно обрабатывать перед составлением для продления пестицидной активности при применении по отношению к среде обитания вредителя-мишени при условии, что предварительная обработка не оказывает вредное воздействие на пестицидную активность. Такие обработки можно осуществлять с помощью химических и/или физических средств при условии, что обработка не влияет отрицательно на свойства композиции(композиций). Примеры химических реактивов включают без ограничения галогенирующие средства; альдегиды, такие как формальдегид и глутаровый альдегид; антибактериальные средства, такие как зефиран хлорид; спирты, такие как изопропанол и этанол; и фиксирующие смеси для гистологических препаратов, такие как фиксирующая смесь Буэна и фиксирующая смесь Хелли (см., например, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman and Co.).
В других вариантах осуществления преимущество будет иметь обработка полипептидов Cry токсинов протеазой, например трипсином, для активации белка перед применением композиции с пестицидным белком согласно вариантам осуществления по отношению к среде обитания вредителя-мишени. Способы активации протоксина сериновой протеазой хорошо известны из уровня техники. См., например, Cooksey (1968) Biochem. J. 6:445-454 и Carroll и Ellar (1989) Biochem. J. 261:99-105, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки. Например, подходящий протокол активации включает без ограничения объединение полипептида, который нужно активировать, например, очищенного нового Cry полипептида (например, с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8, и трипсина в весовом соотношении белок/трипсин 1/100 в 20 нМ NaHCO3, pH 8, и расщепление образца при 36°C в течение 3 часов.
Композиции (в том числе трансформированные микроорганизмы и пестицидные белки согласно вариантам осуществления) можно применять по отношению к среде обитания насекомого-вредителя, например, при помощи опрыскивания, мелкодисперсного распыления, опыливания, разбрасывания, нанесения покрытия или поливания, введения в почву или на нее, введения в поливную воду, при помощи обработки семян или общего применения или опыливания во время, когда вредитель начал появляться, или перед появлением вредителей в качестве меры защиты. Например, пестицидный белок и/или трансформированные микроорганизмы согласно вариантам осуществления можно смешивать с зерном для защиты зерна во время хранения. В целом, важно обеспечивать хороший контроль вредителей на ранних стадиях роста растений, поскольку как раз в это время растение может повреждаться наиболее сильно. В целях удобства композиции согласно вариантам осуществления могут содержать другой инсектицид, если это считается необходимым. В одном варианте осуществления композицию применяют непосредственно по отношению к почве, во время высаживания, в гранулярной форме композиции носителя и мертвых клеток штамма Bacillus или трансформированного микроорганизма согласно вариантам осуществления. Другим вариантом осуществления является гранулярная форма композиции, содержащей агрохимикат, такой как, например, гербицид, инсектицид, удобрение, инертный носитель и мертвые клетки штамма Bacillus или трансформированного микроорганизма согласно вариантам осуществления.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что не все соединения в равной степени эффективны против всех вредителей. Соединения согласно вариантам осуществления проявляют активность против насекомых-вредителей, которые могут включать экономически важных агрономических, лесных, тепличных вредителей, вредителей питомников, декоративных растений, пищи и тканей, здоровья людей и животных, домашней и коммерческой инфраструктуры, домашнего хозяйства и подвергающихся хранению продуктов. Насекомые-вредители включают насекомых, выбранных из отрядов Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera и т.д., в частности, Coleoptera и Lepidoptera.
Насекомые из отряда Lepidoptera включают без ограничения совок, подгрызающих совок, пядениц и гелиотин семейства Noctuidae: Agrotis ipsilon Hufnagel (совка-ипсилон);A. orthogonia Morrison (совка прямоугольная);A. segetum Denis & Schiffermüller (совка озимая);A. subterranea Fabricius (совка зернистая); Alabama argillacea Hübner (совка хлопковая американская);Anticarsia gemmatalis Hübner (гусеница бархатных бобов);Athetis mindara Barnes and McDunnough (шершавая совка);Earias insulana Boisduval (совка хлопковая египетская);E. vittella Fabricius (совка пятнистая); Egira (Xylomyges) curialis Grote (цитрусовая совка); Euxoa messoria Harris (чернобокая гусеница совки); Helicoverpa armigera Hübner (совка щетинконогая резедовая); H. zea Boddie (совка кукурузная или хлопковая совка); Heliothis virescens Fabricius (табачная листовертка); Hypena scabra Fabricius (совка клеверная); Mamestra configurata Walker (совка Берта); M. brassicae Linnaeus (совка капустная); Melanchra picta Harris (совка); Pseudaletia unipuncta Haworth (совка луговая); Pseudoplusia includens Walker (соевая совка); Richia albicosta Smith (личинка западной бобовой совки);Spodoptera frugiperda JE Smith (совка травяная); S. exigua Hübner (совка малая); S. litura Fabricius (табачная совка, гусеница, пожирающая соцветия); Trichoplusia ni Hübner (совка ни); огневки, чехлоноски, бабочки, строящие паутинные гнезда, конусные бабочки и вредители, скелетирующие листья, из семейств Pyralidae и Crambidae, такие как Achroia grisella Fabricius (малая восковая моль); Amyelois transitella Walker (гусеница, повреждающая рубчики цитрусовых); Anagasta kuehniella Zeller (огневка мельничная); Cadra cautella Walker (огневка сухофруктовая);Chilo partellus Swinhoe (огневка кукурузная стеблевая); C. suppressalis Walker (желтая рисовая огневка);C. terrenellus Pagenstecher (огневка тростниковая стеблевая);Corcyra cephalonica Stainton (огневка рисовая); Crambus caliginosellus Clemens (огневка кукурузная);C. teterrellus Zincken (огневка мятликовая); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (листовертка рисовая);Desmia funeralis Hübner (виноградная листовертка); Diaphania hyalinata Linnaeus (дынная огневка); D. nitidalis Stoll (огневка огурцов-пикули); Diatraea grandiosella Dyar (огневка кукурузная юго-западная), D. saccharalis Fabricius (тростниковая огневка); Elasmopalpus lignosellus Zeller (малый кукурузный мотылек); Eoreuma loftini Dyar (мексиканская рисовая огневка); Ephestia elutella Hübner (огневка табачная (шоколадная)); Galleria mellonella Linnaeus (большая восковая моль); Hedylepta accepta Butler (тростниковая листовертка); Herpetogramma licarsisalis Walker (луговой мотылек); Homoeosoma electellum Hulst (огневка-травянка); Loxostege sticticalis Linnaeus (луговой мотылек); Maruca testulalis Geyer (огневка акациевая); Orthaga thyrisalis Walker (чайная моль); Ostrinia nubilalis Hübner (кукурузный мотылек); Plodia interpunctella Hübner (моль индийская мучная); Scirpophaga incertulas Walker (огневка рисовая стеблевая); Udea rubigalis Guenée (огневка ржаво-коричневая); и листовертки, листовертки-почкоеды, плодожорки и гусеницы-вредители плодов семейства Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (западная черноголовая листовертка); A. variana Fernald (восточная черноголовая листовертка); Adoxophyes orana Fischer von Rösslerstamm (листовертка сетчатая); Archips spp., в том числе A. argyrospilaWalker (листовертка плодовых деревьев) and A. rosana Linnaeus (европейская листовертка); Argyrotaenia spp.;Bonagota salubricola Meyrick (листовертка бразильская яблочная); Choristoneura spp.; Cochylis hospes Walsingham (полосатая подсолнечниковая моль);Cydia latiferreana Walsingham (лещинная плодожорка);C. pomonella Linnaeus (яблонная плодожорка);Endopiza viteana Clemens (листовертка виноградная);Eupoecilia ambiguella Hübner (листовертка гроздевая);Grapholita molesta Busck (плодожорка восточная персиковая); Lobesia botrana Denis & Schiffermüller (листовертка европейская виноградная);Platynota flavedana Clemens (листовертка изменчивая); P. stultana Walsingham (листовертка всеядная); Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (листовертка почковая); and Suleima helianthana Riley (листовертка подсолнечниковая).
Другие выбранные сельскохозяйственные вредители из отряда Lepidoptera включают без ограничения Alsophila pometaria Harris (осенний плодовый червь); Anarsia lineatella Zeller (моль фруктовая полосатая); Anisota senatoria J.E. Smith (сатурния оранжевая дубовая); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (китайский дубовый шелкопряд); Bombyx mori Linnaeus (тутовый шелкопряд); Bucculatrix thurberiella Busck (кривоусая хлопковая моль); Colias eurytheme Boisduval (люцерновая желтушка); Datana integerrima Grote & Robinson (хохлатка ореховая); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (сибирский шелкопряд), Ennomos subsignaria Hübner (пяденица вязовая); Erannis tiliaria Harris (пяденица липовая); Erechthias flavistriata Walsingham (листовертка почковая тростниковая); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (шелкопряд золотистый); Harrisina americana Guérin-Méneville (пироморфида американская); Heliothis subflexa Guenée; Hemileuca oliviae Cockrell (гусеница бабочки-сатурнии); Hyphantria cunea Drury (американская белая бабочка); Keiferia lycopersicella Walsingham (томатная моль); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (пяденица гемлоковая восточная); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (пяденица гемлоковая западная); Leucoma salicis Linnaeus (волнянка ивовая); Lymantria dispar Linnaeus (непарный шелкопряд); Malacosoma spp.; Manduca quinquemaculata Haworth (бражник пятиточечный, томатный бражник); M. sexta Haworth (томатный бражник, табачный бражник); Operophtera brumata Linnaeus (пяденица зимняя); Orgyia spp.; Paleacrita vernata Peck (пяденица весенняя); Papilio cresphontes Cramer (парусник кресфонтес, «апельсиновая собака»); Phryganidia californica Packard (коконопряд кольчатый калифорнийский); Phyllocnistis citrella Stainton (цитрусовая мушка-минер); Phyllonorycter blancardella Fabricius (моль-пестрянка плодовая нижнесторонняя); Pieris brassicae Linnaeus (белянка капустная большая); P. rapae Linnaeus (белянка капустная малая); P. napi Linnaeus (белянка брюквенная); Platyptilia carduidactyla Riley (пальцекрылка артишоковая); Plutella xylostella Linnaeus (моль капустная); Pectinophora gossypiella Saunders (розовый коробочный червь); Pontia protodice Boisduval & Leconte (клетчатая белянка); Sabulodes aegrotata Guenée (всеядная пяденица); Schizura concinna J.E. Smith (хохлатка); Sitotroga cerealella Olivier (моль ячменная ангумуазская); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (походный шелкопряд сосновый); Tineola bisselliella Hummel (моль комнатная); Tuta absoluta Meyrick (томатная моль) и Yponomeuta padella Linnaeus (горностаевая моль плодовая).
Представляют интерес личинки и имаго из отряда Coleoptera, в том числе долгоносики из семейств Anthribidae, Bruchidae и Curculionidae, в том числе без ограничения: Anthonomus grandis Boheman (долгоносик хлопковый); Cylindrocopturus adspersus LeConte (долгоносик подсолнечниковый стеблевой); Diaprepes abbreviatus Linnaeus (скосарь люцерновый); Hypera punctata Fabricius (долгоносик точечный); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (долгоносик рисовый водяной); Metamasius hemipterus hemipterus Linnaeus (долгоносик западно-индийский тростниковый); M. hemipterus sericeus Olivier (долгоносик тростниковый); Sitophilus granarius Linnaeus (долгоносик амбарный); S. oryzae Linnaeus (долгоносик рисовый); Smicronyx fulvus LeConte (красный долгоносик подсолнечниковый); S. sordidus LeConte (серый долгоносик подсолнечниковый); Sphenophorus maidis Chittenden (долгоносик маисовый); Rhabdoscelus obscurus Boisduval (долгоносик новогвинейский тростниковый); земляные блошки, блошки, корневые черви, листоеды, картофельные жуки и листовые минеры из семейства Chrysomelidae, в том числе без ограничения: Chaetocnema ectypa Horn (блошка стеблевая хлебная); C. pulicaria Melsheimer (земляная кукурузная блошка); Colaspis brunnea Fabricius (листоед виноградный); Diabrotica barberi Smith & Lawrence (северный кукурузный жук); D. undecimpunctata howardi Barber (блошка 11-точечная Говарда); D. virgifera virgifera LeConte (западный кукурузный жук); Leptinotarsa decemlineata Say (колорадский жук); Oulema melanopus Linnaeus (пьявица красногрудая); Phyllotreta cruciferae Goeze (блошка крестоцветная); Zygogramma exclamationis Fabricius (подсолнечниковый листоед); жуки из семейства Coccinellidae, в том числе без ограничения: Epilachna varivestis Mulsant (мексиканская фасолевая коровка); хрущи и другие жуки из семейства Scarabaeidae, в том числе без ограничения: Antitrogus parvulus Britton (личинка жука, поедающая сахарный тростник); Cyclocephala borealis Arrow (дупляк северный, хрущ); C. immaculata Olivier (дупляк южный, хрущ); Dermolepida albohirtum Waterhouse (сероспинный жук, поедающий сахарный тростник); Euetheola humilis rugiceps LeConte (тростниковый жук); Lepidiota frenchi Blackburn (личинка Lepidiota, поедающая сахарный тростник); Tomarus gibbosus De Geer (жук морковный); T. subtropicus Blatchley (личинка жука, поедающая сахарный тростник); Phyllophaga crinita Burmeister (хрущ); P. latifrons LeConte (июньский хрущ); Popillia japonica Newman (хрущик японский); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (нехрущ майский); кожееды из семейства Dermestidae; проволочники из семейства Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp., в том числе M. communis Gyllenhal (проволочник); Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; короеды из семейства Scolytidae и жуки из семейства Tenebrionidae; жуки из семейства Cerambycidae, такие как, но без ограничения, Migdolus fryanus Westwood (усач); и жуки из семейства Buprestidae, в том числе, но без ограничения, Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger (минирующая листья узкозлатка).
Представляют интерес имаго и незрелые особи отряда Diptera, в том числе минирующие мушки Agromyza parvicornis Loew (кукурузная минирующая мушка); галлицы в том числе без ограничения: Contarinia sorghicola Coquillett (галлица сорговая); Mayetiola destructor Say (гессенская муха); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (подсолнечниковая галлица); Sitodiplosis mosellana Géhin (оранжевая зерновая галлица); плодовые мушки (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (плодовые мушки); личинки, в том числе без ограничения: Delia spp., в том числе Delia platura Meigen (муха ростковая); D. coarctata Fallen (муха озимая);Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (малые комнатные мухи); Meromyza americana Fitch (американская меромиза); Musca domestica Linnaeus (комнатные мухи); Stomoxys calcitrans Linnaeus (жигалка осенняя)); мухи полевые, жигалки, мухи мясные,Chrysomya spp.; Phormia spp.; и другие мухи-вредители надсемейства Muscoidea, слепни Tabanus spp.; носоглоточные оводы Gastrophilus spp.; Oestrus spp.; бычьи оводы Hypoderma spp.; пестряки Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (рунец овечий); и другие Brachycera, комары Aedes spp.; Anopheles spp.; Culex spp.; мошки Prosimulium spp.; Simulium spp.; мокрецы, москиты, сциариды и другие Nematocera.
В качестве насекомых, представляющих интерес включены насекомые из отряда Hemiptera, такие как без ограничения следующие семейства: Adelgidae, Aleyrodidae, Aphididae, Asterolecaniidae, Cercopidae, Cicadellidae, Cicadidae, Cixiidae, Coccidae, Coreidae, Dactylopiidae, Delphacidae, Diaspididae, Eriococcidae, Flatidae, Fulgoridae, Issidae, Lygaeidae, Margarodidae, Membracidae, Miridae, Ortheziidae, Pentatomidae, Phoenicococcidae, Phylloxeridae, Pseudococcidae, Psyllidae, Pyrrhocoridae и Tingidae.
Важные с точки зрения сельского хозяйства представители отряда Hemiptera включают без ограничения: Acrosternum hilare Say (клоп-щитник зеленый); Acyrthisiphon pisum Harris (тля гороховая); Adelges spp. (хермесы); Adelphocoris rapidus Say (клоп люцерновый); Anasa tristis De Geer (клоп-ромбовик печальный); Aphis craccivora Koch (тля люцерновая); A. fabae Scopoli (тля свекловичная); A. gossypii Glover (тля хлопковая, тля бахчевая); A. maidiradicis Forbes (тля кукурузная корневая); A. pomi De Geer (тля яблонная); A. spiraecola Patch (тля зеленая цитрусовая); Aulacaspis tegalensis Zehntner (щитовка тростниковая); Aulacorthum solani Kaltenbach (тля картофельная обыкновенная); Bemisia tabaci Gennadius (белокрылка табачная, белокрылка хлопковая); B. argentifolii Bellows & Perring (белокрылка магнолиевая); Blissus leucopterus leucopterus Say (клоп-черепашка пшеничный североамериканский); Blostomatidae spp.; Brevicoryne brassicae Linnaeus (тля капустная); Cacopsylla pyricola Foerster (медяница грушевая); Calocoris norvegicus Gmelin (клопик картофельный); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (тля земляничная американская); Cimicidae spp.; Coreidae spp.; Corythuca gossypii Fabricius (клоп хлопковый); Cyrtopeltis modesta Distant (клоп томатный); C. notatus Distant (слепняк); Deois flavopicta Stål (слюнявица); Dialeurodes citri Ashmead (белокрылка цитрусовая); Diaphnocoris chlorionis Say (клоп-вредитель гледичии); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (тля ячменная); Duplachionaspis divergens Green (щитовка); Dysaphis plantaginea Paaserini (тля яблонно-подорожниковая); Dysdercus suturellus Herrich-Schäffer (красноклоп хлопковый); Dysmicoccus boninsis Kuwana (серый тростниковый мучнистый червец); Empoasca fabae Harris (цикадка картофельная); Eriosoma lanigerum Hausmann (тля кровяная); Erythroneoura spp. (цикадки виноградные); Eumetopina flavipes Muir (цикадка островная тростниковая); Eurygaster spp.; Euschistus servus Say (щитник коричневый); E. variolarius Palisot de Beauvois (клоп однопятнистый); Graptostethus spp.(комплекс клопов-наземников); and Hyalopterus pruni Geoffroy (тля мучнистая сливовая); Icerya purchasi Maskell (червец желобчатый австралийский); Labopidicola allii Knight (жук-вредитель растений лука); Laodelphax striatellus Fallen (темная цикадка); Leptoglossus corculus Say (сосновый семенной клоп); Leptodictya tabida Herrich-Schaeffer (клоп тростниковый); Lipaphis erysimi Kaltenbach (тля горчичная листовая); Lygocoris pabulinus Linnaeus (зеленый слепняк); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (клоп луговой); L. Hesperus Knight (клоп луговой западный); L. pratensis Linnaeus (клоп травяной); L. rugulipennis Poppius (клоп полевой); Macrosiphum euphorbiae Thomas (тля картофельная большая); Macrosteles quadrilineatus Forbes (цикадка астровая); Magicicada septendecim Linnaeus (цикада семнадцатилетняя); Mahanarva fimbriolata Stål (слюнявица тростниковая); Melanaphis sacchari Zehntner (тля тростниковая); Melanaspis glomerata Green (червец черный); Metopolophium dirhodum Walker (тля розанно-злаковая); Myzus persicae Sulzer (тля оранжерейная, тля персиковая зеленая); Nasonovia ribisnigri Mosley (тля цикориево-смородиновая); Nephotettix cinticeps Uhler (цикадка зеленая); N. nigropictus Stål (цикадка рисовая); Nezara viridula Linnaeus (зеленый овощной клоп); Nilaparvata lugens Stål (бурая цикадка); Nysius ericae Schilling (низиус вересковый); Nysius raphanus Howard (низиус); Oebalus pugnax Fabricius (клоп-щитник рисовый); Oncopeltus fasciatus Dallas (ластовневый клоп); Orthops campestris Linnaeus; Pemphigus spp. (тли корневые и тли галловые); Peregrinus maidis Ashmead (цикадка кукурузная); Perkinsiella saccharicida Kirkaldy (дельфацида тростниковая); Phylloxera devastatrix Pergande (филлоксера гикори); Planococcus citri Risso (мучнистый червец цитрусовый); Plesiocoris rugicollis Fallen (клоп яблонный); Poecilocapsus lineatus Fabricius (клоп четырехполосный травяной); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (хлопковый слепняк); Pseudococcus spp. (другие мучнистые червецы); Pulvinaria elongata Newstead (червец пушицевый); Pyrilla perpusilla Walker (цикадка тростниковая); Pyrrhocoridae spp.; Quadraspidiotus perniciosus Comstock (щитовка калифорнийская); Reduviidae spp.; Rhopalosiphum maidis Fitch (тля сорговая); R. padi Linnaeus (тля черемуховая обыкновенная); Saccharicoccus sacchari Cockerell (тростниковый мучнистый червец); Schizaphis graminum Rondani (тля злаковая обыкновенная); Sipha flava Forbes (тля сахарного тростника желтая); Sitobion avenae Fabricius (тля злаковая); Sogatella furcifera Horvath (цикадка белоспинная); Sogatodes oryzicola Muir (дельфацида рисовая); Spanagonicus albofasciatus Reuter (слепняк белокрапчатый); Therioaphis maculata Buckton (пятнистая люцерновая тля); Tinidae spp.; Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (тля померанцевая); и T. citricida Kirkaldy (тля цитрусовая); Trialeurodes abutiloneus (белокрылка полосатокрылая) и T. vaporariorum Westwood (белокрылка тепличная); Trioza diospyri Ashmead (листоблошка хурмовая); и Typhlocyba pomaria McAtee (цикадка яблонная).
Также включены имаго и личинки из отряда Acari (клещи), такие как Aceria tosichella Keifer (галловый клещ пшеничный); Panonychus ulmi Koch (красный плодовый клещ); Petrobia latens Müller (петробия многоядная); Steneotarsonemus bancrofti Michael (клещ, повреждающий стебель сахарного тростника); клещики паутинные и клещики красные семейства Tetranychidae, Oligonychus grypus Baker & Pritchard, O. indicus Hirst (клещ листовой тростниковый), O. pratensis Banks (травяной клещ Бэнкса), O. stickneyi McGregor (клещ паутинный тростниковый); Tetranychus urticae Koch (клещ паутинный двупятнистый); T. mcdanieli McGregor (клещик МакДэниела); T. cinnabarinus Boisduval (красный паутинный клещик); T. turkestani Ugarov & Nikolski (туркестанский паутинный клещик); плоские клещи семейства Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (оранжевый клещ); ржавчинные и почковые клещи семейства Eriophyidae и другие клещи, питающиеся листьями, и клещи, важные для здоровья человека и животных, т. е., пылевые клещи семейства Epidermoptidae, железницы семейства Demodicidae, зерновые клещи семейства Glycyphagidae, иксодовые клещи отряда Ixodidae. Ixodes scapularis Say (черноногий клещ); I. holocyclus Neumann (австралийский паралитический клещ); Dermacentor variabilis Say (клещ иксодовый собачий); Amblyomma americanum Linnaeus (иксодовый клещ Amblyomma) и конские и чесоточные клещи семейств Psoroptidae, Pyemotidae и Sarcoptidae.
Представляющими интерес насекомыми-вредителями из отряда Thysanura являются, например, Lepisma saccharina Linnaeus (чешуйница); Thermobia domestica Packard (термобия).
Дополнительные охваченные вредители-артроподы включают: пауков из отряда Araneae, таких как Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik (бурый паук-отшельник) и Latrodectus mactans Fabricius (черная вдова), и многоножек из отряда Scutigeromorpha, таких как Scutigera coleoptrata Linnaeus (обыкновенная мухоловка). Кроме того, интерес представляют насекомые-вредители из отряда Isoptera, в том числе из семейства Termitidae, такие как, но без ограничения, Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren и Pseudacanthotermes militaris Hagen (тростниковый термит). Интерес также представляют насекомые из отряда Thysanoptera, в том числе без ограничения трипсы, такие как Stenchaetothrips minutus van Deventer (тростниковый трипс).
Пестицидную активность композиций согласно вариантам осуществления можно тестировать на насекомых-вредителях на ранних стадиях развития, например, в виде личинок или других незрелых форм. Насекомых можно разводить в полной темноте при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 30°C и при относительной влажности от приблизительно 30% до приблизительно 70%. Биологические анализы можно осуществлять, как описано в Czapla и Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83(6): 2480-2485. Способы разведения личинок насекомых и проведения биологических анализов хорошо известны специалисту в данной области техники.
Специалисту в данной области техники известен широкий спектр методик биологических анализов. Общие процедуры включают добавление экспериментального соединения или организма к источнику пищи в закрытом контейнере. Пестицидную активность можно измерить, но без ограничения, по изменениям смертности, потери веса, привлечения, отпугивания, а также другим изменениям поведения и физическим изменениям после поедания и воздействия в течение соответствующего периода времени. Биологические анализы, описанные в данном документе можно использовать с любым питающимся насекомым-вредителем на стадии личинки или имаго.
Следующие примеры представлены в качестве иллюстрации, а не для ограничения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Пример 1 - получение вариантов Cry1B с улучшенным спектром инсектицидной активности
Инсектицидный белок Cry1Bd, содержащий аминокислоту с SEQ ID NO: 1 (US 8692065), обладает высокой инсектицидной активностью (ILC50=1 ppm) против личинки кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), но низкой инсектицидной активностью (ILC50 > 1000 ppm и ~ 400 ppm, соответственно) против кукурузной совки (Helicoverpa zea) и травяной совки (Spodoptera frugiperda). Инсектицидный белок Cry1B, называемый MP258 (порядковый номер PCT/US14/49923), содержащий аминокислоту с SEQ ID NO: 47, обладает высокой инсектицидной активностью (ILC50=4 ppm) против личинки кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis), но низкой инсектицидной активностью (ILC50 24 ppm и 62 ppm, соответственно) против кукурузной совки (Helicoverpa zea) и травяной совки (Spodoptera frugiperda). Серии вариантных полипептидов Cry1B, полученных из Cry1Bd (SEQ ID NO: 1) и MP258, конструировали для улучшения инсектицидной активности против кукурузной совки (CEW) и/или травяной совки (FAW) в сравнении с Cry1Bd (SEQ ID NO: 1) и/или MP258 (SEQ ID NO: 47), сохраняя при этом инсектицидную активность в отношении ECB. Вариантные полипептиды Cry1B, обладающие улучшенной инсектицидной активностью, которые были получены, включают указанные в таблице 1. Инсектицидную активностью вариантов Cry1B определяли как описано в примере 4, и результаты по инсектицидной активности показаны в таблице 3. Выравнивание аминокислотной последовательности вариантных полипептидов Cry1B показано на фигуре 1.
Таблица 1
ID клона | Полипептид | Полинуклеотид |
Cry1Bd | SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 2 |
IP1B-B1 | SEQ ID NO: 3 | SEQ ID NO: 4 |
IP1B-B21 | SEQ ID NO: 5 | SEQ ID NO: 6 |
IP1B-B22 | SEQ ID NO: 7 | SEQ ID NO: 8 |
IP1B-B23 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 10 |
IP1B-B24 | SEQ ID NO: 11 | SEQ ID NO: 12 |
IP1B-B25 | SEQ ID NO: 13 | SEQ ID NO: 14 |
IP1B-B26 | SEQ ID NO: 15 | SEQ ID NO: 16 |
IP1B-B27 | SEQ ID NO: 17 | SEQ ID NO: 18 |
IP1B-B28 | SEQ ID NO: 19 | SEQ ID NO: 20 |
IP1B-B29 | SEQ ID NO: 21 | SEQ ID NO: 22 |
IP1B-B31 | SEQ ID NO: 23 | SEQ ID NO: 24 |
IP1B-B32 | SEQ ID NO: 25 | SEQ ID NO: 26 |
IP1B-B33 | SEQ ID NO: 27 | SEQ ID NO: 28 |
IP1B-B34 | SEQ ID NO: 29 | SEQ ID NO: 30 |
IP1B-B40 | SEQ ID NO: 31 | SEQ ID NO: 32 |
IP1B-B41 | SEQ ID NO: 33 | SEQ ID NO: 34 |
IP1B-B42 | SEQ ID NO: 35 | SEQ ID NO: 36 |
IP1B-B43 | SEQ ID NO: 37 | SEQ ID NO: 38 |
IP1B-B44 | SEQ ID NO: 39 | SEQ ID NO: 40 |
IP1B-B45 | SEQ ID NO: 41 | SEQ ID NO: 42 |
IP1B-B46 | SEQ ID NO: 43 | SEQ ID NO: 44 |
IP1B-B47 | SEQ ID NO: 45 | SEQ ID NO: 46 |
MP258 | SEQ ID NO: 47 | SEQ ID NO: 48 |
GS060 | SEQ ID NO: 49 | SEQ ID NO: 50 |
Значения в процентах идентичности аминокислотных последовательностей вариантных полипептидов Cry1B, рассчитанные с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша, реализованного в программе Needle (набор инструментов EMBOSS), показаны в виде матричной таблице в таблицах 2a - 2b. Пустая часть матричной таблицы не показана.
Таблица 2a
. | GS060 | IP1B-B1 | IP1B-B21 | IP1B-B22 | IP1B-B23 | IP1B-B24 | IP1B-B25 | IP1B-B26 | IP1B-B27 | IP1B-B28 | IP1B-B29 |
Cry1Bd | 65,6 | 95,4 | 84,3 | 82,6 | 82,5 | 84,3 | 84,3 | 84,2 | 83,7 | 83,7 | 83,7 |
GS060 | - | 67,0 | 60,1 | 60,2 | 60,1 | 60,1 | 60,2 | 60,1 | 60,0 | 59,9 | 60,1 |
IP1B-B1 | - | - | 83,4 | 82,6 | 84,5 | 83,4 | 83,4 | 83,2 | 82,9 | 82,9 | 82,9 |
IP1B-B21 | - | - | - | 95,4 | 96,9 | 99,7 | 99,7 | 99,5 | 99,1 | 99,1 | 99,1 |
IP1B-B22 | - | - | - | - | 95,4 | 95,1 | 95,1 | 95,0 | 94,5 | 94,8 | 94,8 |
IP1B-B23 | - | - | - | - | - | 96,6 | 96,6 | 96,5 | 96,0 | 96,0 | 96,0 |
IP1B-B24 | - | - | - | - | - | - | 99,4 | 99,2 | 98,8 | 98,8 | 98,8 |
IP1B-B25 | - | - | - | - | - | - | - | 99,8 | 99,4 | 99,4 | 99,4 |
IP1B-B26 | - | - | - | - | - | - | - | - | 99,5 | 99,2 | 99,2 |
IP1B-B27 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 99,4 | 99,4 |
IP1B-B28 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 99,8 |
Таблица 2b
. | IP1B-B31 | IP1B-B32 | IP1B-B33 | IP1B-B34 | IP1B-B40 | IP1B-B41 | IP1B-B42 | IP1B-B43 | IP1B-B44 | IP1B-B45 | IP1B-B46 | IP1B-B47 | MP258 |
Cry1Bd | 80,4 | 80,4 | 81,0 | 82,0 | 83,7 | 83,9 | 83,9 | 83,9 | 83,9 | 83,9 | 83,9 | 83,9 | 82,3 |
GS060 | 66,6 | 66,9 | 66,3 | 65,5 | 59,8 | 59,9 | 60,1 | 60,1 | 60,1 | 60,1 | 59,9 | 59,9 | 59,9 |
IP1B-B1 | 83,6 | 83,0 | 82,7 | 81,6 | 82,8 | 82,9 | 83,1 | 83,1 | 83,1 | 83,1 | 83,1 | 83,1 | 80,9 |
IP1B-B21 | 71,6 | 71,5 | 71,8 | 71,8 | 99,1 | 99,1 | 99,2 | 99,2 | 99,2 | 99,2 | 99,2 | 99,2 | 96,9 |
IP1B-B22 | 70,7 | 70,4 | 70,7 | 71,0 | 94,7 | 94,7 | 94,7 | 94,7 | 94,7 | 94,7 | 94,8 | 94,8 | 97,6 |
IP1B-B23 | 72,5 | 72,3 | 72,6 | 72,3 | 96,0 | 96,0 | 96,2 | 96,2 | 96,2 | 96,2 | 96,2 | 96,2 | 96,0 |
IP1B-B24 | 71,6 | 71,5 | 71,8 | 71,8 | 98,8 | 98,9 | 98,9 | 98,9 | 98,9 | 98,9 | 98,9 | 98,9 | 96,6 |
IP1B-B25 | 71,8 | 71,6 | 71,9 | 71,9 | 99,4 | 99,4 | 99,5 | 99,5 | 99,5 | 99,5 | 99,5 | 99,5 | 96,6 |
IP1B-B26 | 71,6 | 71,5 | 71,8 | 71,8 | 99,5 | 99,2 | 99,4 | 99,4 | 99,4 | 99,4 | 99,4 | 99,4 | 96,5 |
IP1B-B27 | 71,3 | 71,2 | 71,5 | 71,3 | 99,2 | 98,9 | 99,7 | 99,5 | 99,5 | 99,5 | 99,2 | 99,2 | 96,0 |
IP1B-B28 | 71,3 | 71,2 | 71,5 | 71,3 | 99,1 | 99,1 | 99,4 | 99,2 | 99,2 | 99,2 | 99,5 | 99,5 | 96,3 |
IP1B-B29 | 71,3 | 71,2 | 71,5 | 71,3 | 99,1 | 99,1 | 99,4 | 99,2 | 99,2 | 99,2 | 99,4 | 99,4 | 96,3 |
IP1B-B31 | - | 99,4 | 99,1 | 98,0 | 71,3 | 71,6 | 71,5 | 71,5 | 71,5 | 71,5 | 71,5 | 71,5 | 69,2 |
IP1B-B32 | - | - | 99,2 | 98,0 | 71,2 | 71,5 | 71,3 | 71,3 | 71,3 | 71,3 | 71,3 | 71,3 | 69,1 |
IP1B-B33 | - | - | - | 98,0 | 71,5 | 71,8 | 71,6 | 71,6 | 71,6 | 71,6 | 71,6 | 71,6 | 69,4 |
IP1B-B34 | - | - | - | - | 71,5 | 71,8 | 71,5 | 71,5 | 71,5 | 71,5 | 71,5 | 71,5 | 69,7 |
IP1B-B40 | - | - | - | - | - | 99,7 | 99,1 | 99,1 | 99,1 | 99,2 | 99,2 | 99,4 | 96,2 |
IP1B-B41 | - | - | - | - | - | - | 99,1 | 99,1 | 99,1 | 99,2 | 99,2 | 99,4 | 96,2 |
IP1B-B42 | - | - | - | - | - | - | - | 99,8 | 99,8 | 99,7 | 99,5 | 99,4 | 96,2 |
IP1B-B43 | - | - | - | - | - | - | - | - | 99,8 | 99,8 | 99,5 | 99,5 | 96,2 |
IP1B-B44 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 99,7 | 99,7 | 99,4 | 96,2 |
IP1B-B45 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 99,4 | 99,7 | 96,2 |
IP1B-B46 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 99,7 | 96,3 |
IP1B-B47 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | 96,3 |
Пример 2 - насыщающий мутагенез в выбранных положениях MP258 и IP-1B вариантных полипептидов Cry1B
Полинуклеотиды с SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 42, кодирующие MP258, IP1B-B21, IP1B-B25 и IP1B-B45 (SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 41, соответственно), использовали в качестве матриц для насыщающего мутагенеза в выбранных положениях аминокислот. Сконструировали обратный праймер для мутагенеза и комплементарный прямой праймер для мутагенеза для получения необходимой(необходимых) аминокислотной(аминокислотных) замены(замен) в сайте(сайтах), представляющих интерес. Как правило, праймер для мутагенеза имел длину от 30 до 45 оснований, причем с двумя или большим количеством оснований, обычно 10-15, по обеим сторонам от сайта, представляющего интерес. Для осуществления насыщающего мутагенеза использовали вырожденные праймеры, которые охватывают все возможные аминокислотные остатки. Реакции мутагенеза осуществляли с использованием набора Agilent's QuikChange™ Lightening Site-Directed Mutagenesis. Материалы, предоставленные в наборе, представляют собой QuikChange™ Lightening Enzyme, 10X QuikChange™ Lightning Buffer, смесь dNTP, реактив QuikSolution™ и фермент рестрикции Dpnl, согласно инструкциям производителя.
ПЦР-амплификацию, как правило, осуществляли с использованием Expand™ High Fidelity PCR system (Roche, Швейцария) в 50 мкл, содержащих 50-100 нг матриц, 0,4-2 мкМ пары праймеров, 200 мкМ дНТФ и 2 единицы ДНК-полимеразы. Реакцию мутагенеза инициировали путем предварительного нагревания реакционной смеси до 94°C в течение 3 мин., с последующими 16 циклами следующей программы амплификации: 94°C в течение 1 мин., 52°C в течение 1 мин. и 68°C в течение 8, 12, 16 или 24 мин. в зависимости от длины матрицы. Реакцию мутагенеза завершали посредством инкубации при 68°C в течение 1 ч. Продукты ПЦР-амплификации оценивали при помощи электрофореза в агарозном геле. Продукты ПЦР очищали с использованием набора QIAquick™ PCR purification (Qiagen, Германия) и дополнительно обрабатывали ферментом рестрикции Dpnl. Аликвотой 1 мкл продукта ПЦР, как правило, трансформировали клетки BL21 (DE3) и инокулировали чашки Петри со средой Луриа-Бертани (LB), содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Отбирали приблизительно 48 или более колоний для насыщающего мутагенеза и выделяли плазмидную ДНК для секвенирования. Использовали двухстадийное секвенирование, вначале для определенного (определенных) сайта (сайтов) мутации с использованием одного праймера для секвенирования, с последующим подтверждением последовательности полной длины с использованием нескольких праймеров для секвенирования. После того, как все 19 аминокислотных мутаций подтверждали путем секвенирования, эти мутантные гены были усовершенствованы для экспрессии и очистки белка.
В случае мутаций, проведенных для охвата всего домена III IP1B-B25, охватывающего с T495 по E655, из каждого сайта брали 48 мутантных клонов и подвергали скринингу в отношении активности CEW, как описано в примере 4. Для секвенирования этих мутантных клонов с целью определения мутированных аминокислот среди 151 аминокислотных остатков, подвергнутых мутагенезу, секвенировали 103 сайта на основе числа мутаций, повышающих активность, и мутаций, понижающих активность. Сайты, содержащие мутанты, не проявляющие значительного изменения активности, не секвенировали.
Пример 3 - очищение вариантных инсектицидных белков cry1B
Гены вариантного инсектицидного белка cry1B экспрессировали в модифицированном векторе pMAL (№ кат. E8000S от New England Biolabs) в виде слияния с MBP (белок, связывающий мальтозу). Вектор pMAL модифицировали для присоединения 6X His-метки к N-N-концу MBP после метионина в положении 1. Плазмиду, содержащую ген инсектицидного белка клонировали в E. coli BL21 (DE3). Клетки BL21 выращивали на MagicMedia™ (Life Technologies), либо в планшетах в формате 96 глубоких лунок, либо в колбах на шейкере, работающем при 250 об./мин. при 37°C в течение 8 ч., затем при 16°C в течение 64 ч. В ходе инкубации при 16°C белок слияния MBP-токсин накапливался в клетках BL21 в виде растворимого белка.
Для очистки белка слияния клетки E. coli собирали посредством центрифугирования и обрабатывали раствором лизоцима, состоящим из 2 мг/мл лизоцима в 50 мл натрий-фосфатного буфера при pH 8, содержащего 300 мМ NaCl, 2 ед./мл эндонуклеазы (Epicentre) и 5 мМ MaCl2, в течение 3 ч. при 37°C при осторожном встряхивании. Затем обработанные лизоцимом клетки E. coli разрушали с использованием 1% Triton X100, и прозрачный лизат, содержащий белки IP-1B, получали путем центрифугирования при 4000 об./мин., 30 мин. (96-луночные планшеты) или 9000 об./мин. (образцы, полученные из колбы). His-меченые белки MBP-токсин выделяли из прозрачного лизата при помощи аффинной хроматографии с использованием агарозы NiNTA от Qiagen™ в соответствии со стандартной методикой от производителя. Для этих образцов из прозрачного лизата, полученных в 96-луночных планшетах, планшеты от Pall Corporation™ (25 Harbor Park Drive Port Вашингтон, Нью-Йорк 11050) с 96 глубокими лунками использовали в качестве колонок для аффинной хроматографии. Очищенные белки-токсины, элюированные из агарозы NiNTA, пропускали через Sephadex G25 с заменой фосфатного буфера на 25 мМ HEPES-NaOH, pH 8, и использовали в биологическом анализе с использованием насекомых для определения инсектицидной активности. MBP расщепляли при помощи 1/100 (вес/вес) Factor Xa (New England Biolabs) при 25°C в течение ночи и удаляли из белков IP-1B при помощи колоночной хроматографии на Superdex 200 с использованием различия по размеру и слабой аффинности MBP к Superdex.
Концентрации белка определяли при помощи капиллярного электрофореза с использованием устройства LabChip™ GXII (Caliper LifeSciences). Анализ белка повторяли по меньшей мере 3 раза до тех пор, пока конечные концентрации не считались надежными в пределах предварительно определенного отклонения, составляющего менее 10%.
Пример 4 - определение инсектицидной активности вариантных белков IP-1B
Активность вариантов полипептида Cry1B против основных вредителей кукурузы, кукурузного мотылька (ECB, Ostrinia nubilalis), кукурузной совки (ECW, Helicoverpa zea) и травяной совки (FAW, Spodoptera frugiperda) определяли посредством анализа с кормлением, описанного в Cong, R., et al. Proceedings of the 4th Pacific Rim Conferences on Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its environmental impact, pp.118-123, под редакцией R. J. Akhurst, C. E. Beard и P. Hughes, опубликованного в 2002, Canberra, Australia. Вкратце, анализы проводили на искусственном рационе, содержащем инсектицидные белки. Инсектицидные белки получали, как описано в примере 1, и 10 мкл образцов белка смешивали с 40 мкл расплавленного искусственного рациона для насекомых (40-50°C), полученного на основе Southland Premix, составленного для насекомых из отряда чешуекрылых (Southland Products, Лейк-Виллидж, Арканзас) с использованием агарозы с низкой температурой плавления. Смесь рацион-инсектицидный белок помещали в каждую лунку 96-луночного титрационного микропланшета. Одну или несколько новорожденных личинок насекомых помещали в каждую лунку для кормления в течение 4 дней для CEW и FAW и 5 дней для ECB при 28°C.
В качестве альтернативы, яйца или личинки насекомых сортировали посредством проточной цитометрии больших частиц с использованием COPAS™ (Complex Object Parametric Analyzer and Sorter), полученного от Union Biometrica (Holliston, Массачусетс), с помещением одного яйца или личинки в лунку 96-луночного титрационного микропланшета, который содержал затвердевший искусственный рацион для насекомых. Если яйца использовали для размещения в планшетах для анализа, то через 16 часов для сбора данных анализа использовали только те лунки, которые содержали вылупившихся личинок. Как правило, в результате эффективной сортировки COPAS получали уровни вылупливания 90-95%. После определенных периодов скармливания ответ насекомых на белки оценивали с использованием системы с оценкой в баллах 0-3 с учетом размера и смертности личинок в каждой лунке. Если не наблюдали ответа (или рост был нормальным), то присваивали балл 0. Если рост был несколько замедлен, то присваивали балл 1. Балл 2 означал, что у личинки значительно замедлился рост (был близким к размеру новорожденной). Балл 3 означал гибель всех личинок в лунке. Ответ в процентах (ответ) для каждой обработки рассчитывали путем деления общего балла, суммы баллов по параллельным лункам для каждой обработки на максимально возможные баллы. Например, если одна обработка (один образец, одна доза) имела 6 параллельных лунок, то общий максимальный возможный балл составлял 3×6=18.
Для идентификации вариантных полипептидов Cry1B, обладающих повышенными уровнями активности против данных вредителей кукурузы, значительно более высокими, чем активность эталонного белка, такого как немутированный эталонный белок дикого типа (например, MP258 с SEQ ID NO: 47). Вариантные полипептиды в определенных концентрациях анализировали вместе с 4 дозами эталонного белка в пределах одного 96-луночного планшета для анализа. Концентрации инсектицидных белков находились в пределах значений концентрации эталонного белка для 4 доз, предпочтительно вблизи средней точки значений концентрации для 4 доз. Каждый планшет с образцом содержал эталонный белок в значительном числе лунок, например, в 16 лунках в 4 отдельных дозах. Также каждый планшет включал до 80 мутантных белков для сравнения активности с эталонным белком. Из планшета с образцами, при помощи многоканальной пипетки, из каждой лунки отбирали 10 мкл образцов и переносили в один планшет для анализа, содержащий в каждой лунке 40 мкл расплавленного рациона, и перемешивали на шейкере. Данный процесс подготовки планшета для анализа повторяли 6 раз или более для получения требуемого числа планшета для анализа. После затвердения рациона и охлаждения до 4°C новорожденные личинки насекомых помещали в каждую лунку, закрытую перфорированной пленкой Mylar, и инкубировали в термостате при постоянной температуре 28°C. После определенного времени скармливания ответы насекомых оценивали под увеличительным стеклом. Значения сигмоидальной функции доза-ответ (значения ответа) преобразовывали в значения линейной функции доза-ответ, построенной методом пробит, при помощи SAS-JMP®, обобщенная линейная модель, биномиальное распределение ответа, пробит). Значение ответа для каждого белка в параллелях суммировали и сравнивали с кривой доза-ответ, построенной методом пробит, для активности эталонного белка, получая новое число, называемое расчетным показателем FAE (быстрая оценка активности). Например, если мутантные белок показывал определенное пробит-значение при 40 ppm и фактическая доза с таким же пробит-значением для эталонного белка составляла 100 ppm; тогда значение FAE составляло 2,5 (100/40). Это означает, что мутантный белок в 2,5 раза более эффективен, чем эталонный белок. Данный анализ проводили с 2 разными дозами мутантных белков за раз и повторяли 3 раза, получая 6 точек измерения расчетного показателя FAE для каждого мутанта. Средний расчетный показатель FAE называли индексом FAE. Для каждого белка рассчитывали значение двустороннего t-критерия при сравнении 6 расчетных показателей FAE. Поправку Бонферрони использовали для оценки p-значений (число новых белков/альфа) для определения статистической значимости индекса FAE.
Еще одним способом скрининга, используемым в данной заявке на патент, был анализ с высокими дозами (HDA, High Dose Assay). В этом способе исследуемые белки в высоких концентрациях (выше EC50) помещали в планшеты для анализа насекомых, как описано выше, вместе с одним или более эталонным белком с известным уровнем активности при аналогичной концентрации. Данный HDA часто использовали в многоуровневых скринингах для быстрого исключения белков с низкой или отсутствующей активностью.
Еще одним используемым способом скрининга являлся высокопроизводительный функциональный анализ (HFA, High throughput Functional Assay). Данный анализ был аналогичен FAE, но в нем использовали только одну дозу вместо 2 доз. В остальном HFA, особенно способ расчета индекса, был идентичен FAE. Следовательно, индекс HFA имел такое же значение, что и индекс FAE.
Прогнозируемая точка с 50% ответом в схеме подсчета баллов называется ILC50, поскольку она представляет собой комбинацию подавления роста или питания и летальные ответы. Для определения значений ILC50 каждую обработку (одна доза) повторяли 6 раз или более, обычно 24 раза. Инсектицидная активность вариантов Cry1B показана в таблице 3.
В таблице 4 показана инсектицидная активностью против кукурузной совки для аминокислотных замен, обладающих повышенной активностью (значение FAE ≥ 1,2) по сравнению с эталонным полипептидом MP258 (SEQ ID NO: 47), IP1B-B21 (SEQ ID NO: 5), IP1B-B25 (SEQ ID NO: 13), или IP1B-B45 (SEQ ID NO: 41). В таблице 4 показаны номер положения и аминокислота, соответствующая положениям 50-651 MP258 (SEQ ID NO: 47); предсказанная вторичная структура и присвоение; оценка в баллах воздействия растворителя; выравнивание аминокислотной последовательности MP258 (SEQ ID NO: 47); IP1B-B21 (SEQ ID NO: 5), IP1B-B25 (SEQ ID NO: 13), IP1B-B45 (SEQ ID NO: 41), IP1B-B21 (SEQ ID NO: 5), Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), и Cry1Bi (SEQ ID NO: 54); остов полипептида, из которого был получен вариант; вариант аминокислотной замены (например, L50R); и значение инсектицидной FAE в отношении хлопковой совки по сравнению с остовом соответствующего полипептида (MP258 - SEQ ID NO: 47, IP1B-B21 - SEQ ID NO: 5, IP1B-B25 - SEQ ID NO: 13, или IP1B-B45 - SEQ ID NO: 41).
Таблица 3
ID клона | Полипептид с SEQ ID NO | ECB | CEW | FAW |
Cry1Bd | SEQ ID NO: 1 | ILC50=1 ppm | ILC50=>1000 ppm | ILC50=~400 ppm |
IP1B-B1 | SEQ ID NO: 3 | ILC50=1,3 ppm | ILC50=21 ppm | ILC50=34,3 ppm |
IP1B-B21 | SEQ ID NO: 5 | ILC50=22,4 ppm | ||
IP1B-B22 | SEQ ID NO: 7 | ILC50=27,1 ppm | ||
IP1B-B23 | SEQ ID NO: 9 | ILC50=29,2 ppm | ||
IP1B-B24 | SEQ ID NO: 11 | ILC50=12,6 ppm | ||
IP1B-B25 | SEQ ID NO: 13 | ILC50=11,91 ppm | ||
IP1B-B26 | SEQ ID NO: 15 | ILC50=8,36 ppm | ||
IP1B-B27 | SEQ ID NO: 17 | ILC50=7,99 ppm | ||
IP1B-B28 | SEQ ID NO: 19 | ILC50=7,74 ppm | ||
IP1B-B29 | SEQ ID NO: 21 | ILC50=8,45 ppm | ||
IP1B-B31 | SEQ ID NO: 23 | ILC50=2,8 ppm | ||
IP1B-B32 | SEQ ID NO: 25 | ILC50=2,9 ppm | ||
IP1B-B33 | SEQ ID NO: 27 | ILC50=3,0 ppm | ||
IP1B-B34 | SEQ ID NO: 29 | ILC50=2,9 ppm | ||
IP1B-B40 | SEQ ID NO: 31 | ILC50=5,78 ppm | ||
IP1B-B41 | SEQ ID NO: 33 | ILC50=4,54 ppm | ||
IP1B-B42 | SEQ ID NO: 35 | ILC50=6,2 ppm | ||
IP1B-B43 | SEQ ID NO: 37 | ILC50=6,7 ppm | ||
IP1B-B44 | SEQ ID NO: 39 | ILC50=6,9 ppm | ||
IP1B-B45 | SEQ ID NO: 41 | ILC50=5,7 ppm | ||
IP1B-B46 | SEQ ID NO: 43 | ILC50=8 ppm | ||
IP1B-B47 | SEQ ID NO: 45 | ILC50=6,1 ppm | ||
MP258 | SEQ ID NO: 47 | ILC50=4 ppm | ILC50=24 ppm | ILC50=62 ppm |
В таблице 5 показана инсектицидная активностью против кукурузной совки для аминокислотных замен со значением FAE ≤ 1,2 по сравнению с остовом полипептида MP258 (SEQ ID NO: 47), IP1B-B21 (SEQ ID NO: 5), IP1B-B25 (SEQ ID NO: 13) или IP1B-B45 (SEQ ID NO: 41). В таблице 5 показаны номер положения и аминокислота, соответствующая положениям 50-651 MP258 (SEQ ID NO: 47); остов полипептида, из которого был получен вариант; вариант аминокислотной замены (например, L50R) и значение инсектицидной FAE в отношении кукурузной совки по сравнению с остовом соответствующего полипептида (MP258 - SEQ ID NO: 47, IP1B-B21 - SEQ ID NO: 5, IP1B-B25 - SEQ ID NO: 13 или IP1B-B45 - SEQ ID NO: 41.
Таблица 4 | ||||||||||||||||||||||
Положение MP 258 |
a.к. | 2D-структ. | 2D --присв. | Ож. раст. |
MP 258 |
B21 | B25 | B45 | Bd | Bh | Bi | Ос тов |
Вариант | FAE | Вариант | FAE | Вариант | FAE | Вариант | FAE | Вариант | FAE |
50 | L | Клубок | 90 | L | L | L | L | L | F | F | B45 | L50R | 1,72 | L50I | 1,52 | L50D | 1,5 | L50A | 1,43 | L50H | 1,42 | |
L50Y | 1,42 | L50S | 1,38 | L50F | 1,38 | L50V | 1,37 | L50K | 1,34 | |||||||||||||
L50N | 1,26 | |||||||||||||||||||||
51 | V | Спираль | a1 | 37 | V | V | V | V | V | V | V | |||||||||||
52 | S | Спираль | 20 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
53 | A | Спираль | 67 | A | A | A | A | A | A | A | B45 | A53R | 1,79 | A53Y | 1,72 | A53K | 1,7 | A53H | 1,45 | A53P | 1,42 | |
A53V | 1,35 | A53Q | 1,31 | A53D | 1,25 | A53E | 1,23 | A53G | 1,22 | |||||||||||||
A53T | 1,21 | |||||||||||||||||||||
54 | S | Спираль | 47 | S | S | S | S | S | S | S | B45 | S54P | 1,6 | S54K | 1,4 | S54G | 1,39 | S54A | 1,36 | S54I | 1,25 | |
S54R | 1,21 | |||||||||||||||||||||
55 | T | Спираль | 0 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
56 | V | Спираль | 5 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
57 | Q | Спираль | 75 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | B45 | Q57V | 1,76 | Q57R | 1,71 | Q57L | 1,54 | Q57N | 1,53 | Q57G | 1,38 | |
Q57D | 1,3 | |||||||||||||||||||||
58 | T | Спираль | 33 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
59 | G | Спираль | 4 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
60 | I | Спираль | 3 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
61 | N | Спираль | 27 | N | N | N | N | N | N | S | ||||||||||||
62 | I | Спираль | 3 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
63 | A | Спираль | 19 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
64 | G | Спираль | 4 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
65 | R | Спираль | 42 | R | R | R | R | R | R | R | B45 | R65Q | 1,54 | R65A | 1,53 | R65S | 1,48 | R65G | 1,36 | |||
66 | I | Спираль | 4 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
67 | L | Спираль | 27 | L | L | L | L | L | L | L | B45 | L67M | 2,03 | L67F | 1,41 | L67I | 1,27 | |||||
68 | G | Спираль | 113 | G | G | G | G | G | G | G | B45 | G68A | 1,83 | G68R | 1,3 | G68F | 1,27 | |||||
69 | V | Спираль | 6 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
70 | L | Виток | 1 | L | L | L | L | L | L | L | B45 | L70E | 1,51 | L70W | 1,3 | L70H | 1,23 | |||||
71 | G | Виток | 8 | G | G | G | G | G | G | G | B45 | G71S | 1,33 | |||||||||
72 | V | Клубок | 22 | V | V | V | V | V | V | V | B45 | V72G | 1,87 | |||||||||
73 | P | Клубок | 46 | P | P | P | P | P | P | P | B45 | P73S | 1,27 | P73G | 1,35 | |||||||
74 | F | Клубок | 94 | F | F | F | F | F | F | F | B45 | F74I | 1,92 | F74E | 1,91 | F74S | 1,64 | F74R | 1,33 | F74V | 1,25 | |
F74D | 1,24 | |||||||||||||||||||||
75 | A | Спираль | a2 | 33 | A | A | A | A | A | A | A | B45 | A75S | 2,23 | A75P | 1,67 | A75E | 1,28 | ||||
76 | G | Спираль | 115 | G | G | G | G | G | G | G | B45 | G76T | 2,01 | G76S | 1,76 | G76Y | 1,6 | G76V | 1,6 | G76D | 1,41 | |
G76R | 1,4 | |||||||||||||||||||||
77 | Q | Спираль | 53 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | B45 | Q77N | 1,86 | Q77D | 1,82 | Q77G | 1,78 | Q77L | 1,76 | Q77I | 1,69 | |
Q77H | 1,64 | Q77P | 1,63 | Q77A | 1,59 | Q77T | 1,58 | Q77M | 1,39 | |||||||||||||
Q77C | 1,38 | Q77S | 1,22 | |||||||||||||||||||
78 | L | Спираль | 8 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
79 | A | Спираль | 36 | A | A | A | A | A | A | A | B45 | A79S | 1,83 | A79V | 1,78 | A79T | 1,71 | A79L | 1,69 | A79R | 1,65 | |
A79I | 1,55 | A79P | 1,5 | A79N | 1,32 | A79Q | 1,31 | A79K | 1,23 | |||||||||||||
80 | S | Спираль | 61 | S | S | S | S | S | S | S | B45 | S80Q | 2,06 | S80K | 1,97 | S80G | 1,93 | S80E | 1,86 | S80R | 1,84 | |
S80M | 1,77 | S80N | 1,66 | S80C | 1,56 | S80W | 1,45 | S80Y | 1,44 | |||||||||||||
S80D | 1,29 | |||||||||||||||||||||
81 | F | Спираль | 4 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
82 | Y | Спираль | 4 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | B45 | Y82F | 1,41 | |||||||||
83 | S | Спираль | 85 | S | S | S | S | S | S | S | B45 | S83E | 1,97 | S83D | 1,91 | S83G | 1,89 | S83A | 1,87 | S83K | 1,8 | |
S83H | 1,7 | S83R | 1,51 | S83Y | 1,39 | S83L | 1,32 | |||||||||||||||
84 | F | Спираль | 54 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
85 | I | Спираль | 5 | I | I | I | I | L | L | I | ||||||||||||
86 | V | Спираль | 22 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
87 | G | Спираль | 101 | G | G | G | G | G | G | G | B45 | G87D | 1,95 | G87K | 1,65 | G87N | 1,44 | G87C | 1,42 | G87W | 1,28 | |
G87H | 1,24 | |||||||||||||||||||||
88 | E | Спираль | 19 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
89 | L | Спираль | 2 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
90 | W | Клубок | 11 | W | W | W | W | W | W | W | ||||||||||||
91 | P | Клубок | 44 | P | P | P | P | P | P | P | B45 | P91S | 1,64 | P91Y | 1,49 | P91T | 1,46 | P91D | 1,28 | |||
92 | S | Клубок | 93 | S | S | S | S | S | S | K | B45 | S92E | 2,54 | S92G | 1,88 | S92F | 1,72 | S92V | 1,72 | S92L | 1,71 | |
S92T | 1,47 | |||||||||||||||||||||
93 | G | Клубок | 140 | G | G | G | G | G | G | G | B45 | G93H | 1,68 | G93D | 1,53 | G93I | 1,28 | |||||
94 | R | Клубок | 97 | R | R | R | R | R | R | R | B45 | R94L | 2,27 | R94H | 2,19 | R94T | 1,7 | R94S | 1,35 | |||
95 | D | Клубок | 35 | D | D | D | D | D | D | D | B45 | D95G | 1,86 | D95Q | 1,67 | D95V | 1,55 | D95F | 1,2 | |||
96 | P | Спираль | a2 | 18 | P | P | P | P | P | P | Q | |||||||||||
97 | W | Спираль | 2 | W | W | W | W | W | W | W | ||||||||||||
98 | E | Спираль | 35 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
99 | I | Спираль | 29 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
100 | F | Спираль | 1 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
101 | L | Спираль | 4 | L | M | M | M | L | L | M | ||||||||||||
102 | E | Спираль | 40 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
103 | H | Спираль | 0 | H | H | H | H | H | H | H | ||||||||||||
104 | V | Спираль | 0 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
105 | E | Спираль | 16 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
106 | Q | Спираль | 75 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | B45 | Q106I | 2,16 | Q106A | 1,77 | Q106F | 1,74 | Q106G | 1,71 | |||
Q106H | 1,67 | Q106C | 1,52 | Q106K | 1,43 | Q106V | 1,32 | Q106R | 1,29 | |||||||||||||
Q106S | 1,25 | |||||||||||||||||||||
107 | L | Спираль | 0 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
108 | V | Спираль | 5 | V | V | V | V | I | I | V | B45 | V108L | 1,92 | V108M | 1,55 | V108T | 1,29 | |||||
109 | R | Виток | 94 | R | R | R | R | R | R | R | 258 | R109S | 1,35 | R109V | 1,28 | R109N | 1,23 | |||||
110 | Q | Клубок | 54 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | 258 | Q110T | 1,93 | Q110R | 1,51 | Q110V | 1,32 | Q110F | 1,26 | Q110H | 1,24 | |
111 | Q | Клубок | 87 | Q | Q | Q | H | Q | Q | Q | 258 | Q111H | 4,5 | Q111L | 2,97 | Q111S | 2,37 | Q111M | 2,16 | Q111R | 2,14 | |
Q111A | 1,99 | Q111K | 1,8 | Q111E | 1,54 | |||||||||||||||||
112 | I | Клубок | 0 | I | I | I | I | V | V | I | B45 | I112L | 2,03 | |||||||||
113 | T | Клубок | 80 | T | T | T | T | T | T | T | B45 | T113L | 1,44 | T113V | 1,4 | T113S | 1,34 | T113N | 1,29 | T113K | 1,25 | |
114 | E | Спираль | a3 | 73 | E | E | E | M | E | E | A | 258 | E114L | 2,67 | E114T | 2,29 | E114M | 2,11 | E114H | 2,03 | E114Y | 1,94 |
E114A | 1,73 | E114S | 1,67 | E114V | 1,54 | E114F | 1,39 | |||||||||||||||
115 | N | Спираль | 116 | N | N | N | N | N | N | N | B45 | N115P | 1,39 | |||||||||
116 | A | Спираль | 11 | A | A | A | A | T | T | A | ||||||||||||
117 | R | Спираль | 18 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
118 | N | Спираль | 79 | N | N | N | N | N | N | N | B45 | N118V | 2,16 | N118T | 1,84 | N118E | 1,72 | N118D | 1,4 | N118F | 1,37 | |
N118G | 1,22 | |||||||||||||||||||||
119 | T | Спираль | 55 | T | T | T | T | T | T | T | B45 | T119A | 2,3 | T119M | 2,08 | T119S | 1,89 | T119K | 1,76 | T119H | 1,69 | |
T119E | 1,66 | T119R | 1,65 | T119V | 1,44 | |||||||||||||||||
120 | A | Спираль | 5 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
121 | L | Спираль | 20 | L | L | L | L | I | I | L | ||||||||||||
122 | A | Спираль | 87 | A | A | A | A | A | A | A | B45 | A122R | 1,38 | A122I | 1,32 | A122F | 1,27 | A122N | 1,26 | A122G | 1,23 | |
A122T | 1,23 | |||||||||||||||||||||
123 | R | Спираль | 55 | R | R | R | R | R | R | R | B45 | R123K | 1,81 | |||||||||
124 | L | Спираль | 6 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
125 | Q | Спираль | 58 | Q | Q | Q | Q | E | E | Q | B45 | Q125N | 1,83 | Q125R | 1,58 | Q125E | 1,48 | |||||
126 | G | Спираль | 103 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
127 | L | Спираль | 9 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
128 | G | Спираль | 0 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
129 | A | Спираль | 96 | A | A | A | A | R | R | D | B45 | A129K | 1,69 | A129W | 1,56 | A129L | 1,38 | A129P | 1,32 | A129V | 1,23 | |
130 | S | Спираль | 37 | S | S | S | S | G | G | S | ||||||||||||
131 | F | Спираль | 2 | F | F | F | F | Y | Y | F | ||||||||||||
132 | R | Спираль | 95 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
133 | A | Спираль | 49 | A | A | A | A | S | S | A | ||||||||||||
134 | Y | Спираль | 1 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
135 | Q | Спираль | 24 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | ||||||||||||
136 | Q | Спираль | 77 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | B45 | Q136I | 1,52 | Q136F | 1,34 | Q136I | 1,31 | |||||
137 | S | Спираль | 5 | S | S | S | S | A | A | S | ||||||||||||
138 | L | Спираль | 10 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
139 | E | Спираль | 55 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
140 | D | Спираль | 77 | D | D | D | D | T | T | D | B45 | D140E | 1,65 | |||||||||
141 | W | Спираль | 6 | W | W | W | W | W | W | W | ||||||||||||
142 | L | Спираль | 67 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
143 | E | Спираль | 76 | E | E | E | E | D | D | E | B45 | E143S | 2,18 | E143R | 1,78 | E143G | 1,64 | E143Y | 1,62 | E143M | 1,62 | |
E143Q | 1,58 | E143L | 1,55 | E143W | 1,55 | E143T | 1,5 | E143A | 1,48 | |||||||||||||
E143N | 1,37 | E143P | 1,34 | |||||||||||||||||||
144 | N | Клубок | 62 | N | N | N | N | N | N | N | B45 | N144M | 1,81 | N144A | 1,56 | N144T | 1,21 | |||||
145 | R | Клубок | 67 | R | R | R | R | R | R | R | B45 | R145N | 1,81 | R145P | 1,55 | R145A | 1,45 | R145L | 1,44 | R145S | 1,23 | |
146 | D | Клубок | 85 | D | D | D | D | N | N | N | B45 | D146W | 1,53 | D146T | 1,3 | D146H | 1,22 | D146V | 1,21 | |||
147 | D | Клубок | 31 | D | N | N | N | D | D | D | B45 | N147V | 1,77 | N147R | 1,65 | N147D | 1,42 | N147S | 1,37 | |||
148 | A | Спираль | a4 | 64 | A | A | A | A | A | A | A | B45 | A148F | 2,22 | A148W | 1,83 | A148P | 1,75 | A148N | 1,74 | A148L | 1,73 |
149 | R | Спираль | 80 | R | R | R | R | R | R | R | B45 | R149V | 2,2 | R149A | 1,89 | R149S | 1,88 | R149L | 1,49 | |||
150 | T | Спираль | 22 | T | T | T | T | S | S | T | ||||||||||||
151 | R | Спираль | 57 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
152 | S | Спираль | 93 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
153 | V | Спираль | 65 | V | V | V | V | I | I | V | ||||||||||||
154 | L | Спираль | 0 | L | L | L | L | I | I | L | ||||||||||||
155 | Y | Спираль | 42 | Y | Y | Y | Y | L | L | Y | ||||||||||||
156 | T | Спираль | 77 | T | T | T | T | E | E | T | ||||||||||||
157 | Q | Спираль | 31 | Q | Q | Q | Q | R | R | Q | ||||||||||||
158 | Y | Спираль | 3 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | B45 | Y158F | 1,7 | |||||||||
159 | I | Спираль | 31 | I | I | I | I | V | V | I | B45 | I159V | 1,37 | |||||||||
160 | A | Спираль | 72 | A | A | A | A | A | A | A | B45 | A160V | 1,65 | |||||||||
161 | L | Спираль | 0 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
162 | E | Спираль | 13 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
163 | L | Спираль | 87 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
164 | D | Спираль | 29 | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||
165 | F | Спираль | 2 | F | F | F | F | I | I | F | ||||||||||||
166 | L | Спираль | 89 | L | L | L | L | T | T | L | B45 | L166V | 1,67 | L166E | 1,62 | L166C | 1,34 | L166I | 1,28 | L166T | 1,25 | |
167 | N | Спираль | 56 | N | N | N | N | T | T | N | B45 | N167T | 1,43 | N167M | 1,37 | N167Q | 1,3 | N167L | 1,29 | N167A | 1,22 | |
168 | A | Спираль | 16 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
169 | M | Спираль | 10 | M | M | M | M | I | I | M | ||||||||||||
170 | P | Спираль | 70 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
171 | L | Спираль | 30 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
172 | F | Виток | 4 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
173 | A | Клубок | 48 | A | A | A | A | R | R | A | B45 | A173F | 1,56 | A173T | 1,56 | |||||||
174 | I | Клубок | 45 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
175 | N | Виток | 118 | N | N | N | N | R | R | R | ||||||||||||
176 | N | Виток | 112 | N | N | N | N | N | N | E | ||||||||||||
177 | Q | Клубок | 12 | Q | Q | Q | Q | E | Q | Q | B45 | Q177C | 1,78 | Q177S | 1,48 | Q177T | 1,3 | Q177P | 1,21 | |||
178 | Q | Виток | 16 | Q | Q | Q | Q | E | E | E | B45 | Q178K | 1,69 | |||||||||
179 | V | Виток | 21 | V | V | V | V | V | V | V | B45 | V179I | 2,06 | V179L | 1,67 | |||||||
180 | P | Виток | 2 | P | P | P | P | P | P | P | B45 | P180A | 1,7 | P180S | 1,51 | P180L | 1,51 | P180M | 1,38 | |||
181 | L | Виток | 3 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
182 | L | Спираль | a5 | 0 | L | L | L | L | L | L | L | |||||||||||
183 | M | Спираль | 1 | M | M | M | M | M | M | M | ||||||||||||
184 | V | Спираль | 1 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
185 | Y | Спираль | 6 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
186 | A | Спираль | 0 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
187 | Q | Спираль | 2 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | ||||||||||||
188 | A | Спираль | 1 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
189 | A | Спираль | 0 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
190 | N | Спираль | 1 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
191 | L | Спираль | 5 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
192 | H | Спираль | 0 | H | H | H | H | H | H | H | ||||||||||||
193 | L | Спираль | 1 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
194 | L | Спираль | 5 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
195 | L | Спираль | 0 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
196 | L | Спираль | 0 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
197 | R | Спираль | 7 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
198 | D | Спираль | 0 | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||
199 | A | Спираль | 2 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
200 | S | Спираль | 10 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
201 | L | Спираль | 16 | L | L | L | L | L | L | L | B45 | L201V | 1,27 | |||||||||
202 | F | Спираль | 9 | F | F | F | F | F | F | Y | ||||||||||||
203 | G | Виток | 0 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
204 | S | Виток | 101 | S | S | S | S | S | S | R | ||||||||||||
205 | E | Виток | 66 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
206 | F | Виток | 3 | F | F | F | F | W | W | F | B45 | F206L | 2,37 | F206I | 1,47 | F206T | 1,46 | F206W | 1,45 | |||
207 | G | Виток | 88 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
208 | L | Клубок | 12 | L | L | L | L | M | T | L | ||||||||||||
209 | T | Клубок | 87 | T | T | T | T | A | A | T | B45 | T209E | 1,86 | T209R | 1,7 | T209D | 1,66 | T209L | 1,59 | T209V | 1,3 | |
T209C | 1,22 | |||||||||||||||||||||
210 | S | Спираль | a6 | 126 | S | S | S | S | S | S | S | B45 | S210P | 2,15 | S210T | 1,78 | S210I | 1,46 | S210R | 1,25 | ||
211 | Q | Спираль | 95 | Q | Q | Q | Q | S | S | Q | B45 | Q211I | 1,9 | Q211R | 1,74 | Q211G | 1,55 | Q211T | 1,44 | Q211P | 1,33 | |
Q211L | 1,22 | |||||||||||||||||||||
212 | E | Спираль | 40 | E | E | E | E | D | D | E | ||||||||||||
213 | I | Спираль | 35 | I | I | I | I | V | V | I | B45 | I213V | 1,71 | I213T | 1,66 | I213L | 1,64 | I213M | 1,53 | I213Q | 1,5 | |
I213N | 1,28 | I213G | 1,21 | |||||||||||||||||||
214 | Q | Спираль | 58 | Q | Q | Q | Q | N | N | Q | B21 | Q214W | 3,46 | |||||||||
215 | R | Спираль | 82 | R | R | R | R | Q | Q | R | ||||||||||||
216 | Y | Спираль | 1 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
217 | Y | Спираль | 17 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
218 | E | Спираль | 86 | E | E | E | E | Q | Q | E | B45 | E218T | 1,76 | E218A | 1,65 | E218H | 1,62 | E218S | 1,55 | E218I | 1,51 | |
E218V | 1,33 | E218Y | 1,29 | E218W | 1,21 | E218D | 1,21 | |||||||||||||||
219 | R | Спираль | 28 | R | R | R | R | E | E | R | B21 | R219N | 1,63 | |||||||||
220 | Q | Спираль | 6 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | ||||||||||||
221 | A | Спираль | 66 | A | A | A | A | I | I | V | B45 | A221L | 2,21 | A221Y | 1,86 | A221V | 1,84 | A221K | 1,81 | A221I | 1,62 | |
A221D | 1,48 | A221G | 1,43 | A221H | 1,42 | A221W | 1,3 | A221R | 1,28 | |||||||||||||
A221T | 1,25 | |||||||||||||||||||||
222 | E | Спираль | 70 | E | E | E | E | R | R | E | B45 | E222G | 1,89 | E222M | 1,75 | E222K | 1,72 | E222T | 1,67 | E222D | 1,39 | |
E222I | 1,36 | |||||||||||||||||||||
223 | K | Спираль | 16 | K | K | K | K | Y | Y | R | ||||||||||||
224 | T | Спираль | 33 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
225 | R | Спираль | 67 | R | R | R | R | E | E | R | B45 | R225V | 4,65 | R225Q | 2,37 | R225M | 2,32 | R225F | 2,07 | R225L | 2,04 | |
R225G | 1,58 | R225I | 1,58 | R225Y | 1,55 | R225C | 1,54 | R225N | 1,46 | |||||||||||||
226 | E | Спираль | 66 | E | E | E | E | E | E | D | B45 | E226D | 2,17 | E226S | 2,13 | E226V | 1,68 | E226C | 1,52 | E226Y | 1,46 | |
E226R | 1,33 | E226A | 1,24 | |||||||||||||||||||
227 | Y | Спираль | 3 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
228 | S | Спираль | 11 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
229 | D | Спираль | 31 | D | D | D | D | N | N | D | ||||||||||||
230 | Y | Спираль | 17 | Y | Y | Y | Y | H | H | H | B45 | Y230A | 2,65 | Y230L | 1,83 | Y230S | 1,22 | |||||
231 | C | Спираль | 1 | C | C | C | C | C | C | C | ||||||||||||
232 | A | Спираль | 27 | A | A | A | A | V | V | V | ||||||||||||
233 | R | Спираль | 87 | R | R | R | R | Q | Q | Q | B45 | R233K | 2,13 | R233D | 1,96 | R233Q | 1,91 | R233G | 1,56 | R233I | 1,41 | |
R233A | 1,26 | R233Y | 1,2 | |||||||||||||||||||
234 | W | Спираль | 31 | W | W | W | W | W | W | W | B45 | W234V | 2,15 | W234M | 2,15 | W234L | 2,06 | W234I | 1,87 | W234A | 1,55 | |
W234R | 1,55 | W234F | 1,52 | W234Y | 1,48 | W234S | 1,22 | |||||||||||||||
235 | Y | Спираль | 12 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
236 | N | Спираль | 71 | N | N | N | N | N | N | N | B45 | N236E | 2,2 | N236K | 1,87 | N236S | 1,43 | N236T | 1,41 | N236L | 1,41 | |
237 | T | Спираль | 50 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
238 | G | Спираль | 8 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
239 | L | Спираль | 19 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
240 | N | Спираль | 100 | N | N | N | N | N | N | N | B45 | N240Y | 1,77 | N240A | 1,56 | N240M | 1,53 | N240S | 1,5 | N240T | 1,49 | |
N240G | 1,46 | N240K | 1,46 | N240F | 1,36 | N240L | 1,28 | N240R | 1,26 | |||||||||||||
N240W | 1,22 | N240C | 1,22 | |||||||||||||||||||
241 | N | Спираль | 92 | N | N | N | N | N | N | N | B45 | N241S | 1,7 | N241I | 1,68 | N241W | 1,62 | N241M | 1,57 | N241K | 1,48 | |
N241Y | 1,47 | N241V | 1,33 | N241L | 1,27 | N241C | 1,21 | |||||||||||||||
242 | L | Спираль | 13 | L | L | L | L | L | L | L | B45 | L242P | 2,07 | L242V | 1,44 | |||||||
243 | R | Клубок | 76 | R | R | R | R | R | R | R | B45 | R243M | 2,3 | R243V | 2 | R243T | 1,84 | R243C | 1,75 | R243K | 1,72 | |
R243I | 1,68 | R243S | 1,59 | R243Q | 1,54 | |||||||||||||||||
244 | G | Клубок | 46 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
245 | T | Клубок | 107 | T | T | T | T | T | T | T | B45 | T245Q | 2,71 | T245Y | 2,46 | T245K | 2,4 | T245G | 2,13 | T245A | 2,03 | |
T245I | 1,96 | T245W | 1,95 | T245H | 1,91 | T245S | 1,89 | T245M | 1,82 | |||||||||||||
T245D | 1,82 | T245N | 1,77 | T245V | 1,66 | T245R | 1,64 | T245F | 1,34 | |||||||||||||
246 | N | Клубок | 57 | N | N | N | N | N | N | N | B45 | N246T | 1,73 | N246S | 1,69 | N246G | 1,66 | N246Q | 1,63 | |||
247 | A | Спираль | a7 | 0 | A | A | A | A | A | A | A | B45 | A247E | 1,73 | A247S | 1,73 | A247G | 1,57 | A247P | 1,53 | ||
248 | E | Спираль | 60 | E | E | E | E | E | E | E | B45 | E248S | 2,17 | E248N | 1,55 | E248T | 1,53 | E248L | 1,49 | E248Y | 1,49 | |
E248V | 1,42 | E248R | 1,42 | E248F | 1,24 | |||||||||||||||||
249 | S | Спираль | 58 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
250 | W | Спираль | 1 | W | W | W | W | W | W | W | ||||||||||||
251 | L | Спираль | 31 | L | L | L | L | L | V | V | ||||||||||||
252 | R | Спираль | 67 | R | R | R | R | R | R | R | B45 | R252N | 1,47 | R252A | 1,4 | R252F | 1,24 | |||||
253 | Y | Спираль | 20 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
254 | N | Спираль | 0 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
255 | Q | Спираль | 37 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | ||||||||||||
256 | F | Спираль | 0 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
257 | R | Спираль | 23 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
258 | R | Спираль | 2 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
259 | D | Спираль | 7 | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||
260 | L | Спираль | 0 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
261 | T | Спираль | 20 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
262 | L | Спираль | 2 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
263 | G | Спираль | 13 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
264 | V | Виток | 0 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
265 | L | Спираль | 15 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
266 | D | Спираль | 6 | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||
267 | L | Спираль | 6 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
268 | V | Спираль | 3 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
269 | A | Спираль | 7 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
270 | L | Виток | 9 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
271 | F | Виток | 0 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
272 | P | Спираль | 29 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
273 | S | Спираль | 2 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
274 | Y | Спираль | 0 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
275 | D | Клубок | 22 | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||
276 | T | Виток | 30 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
277 | R | Виток | 58 | R | R | R | R | R | R | R | B45 | R277Q | 1,35 | R277G | 1,27 | R277V | 1,23 | |||||
278 | I | Виток | 44 | I | I | I | I | T | T | T | ||||||||||||
279 | Y | Клубок | 4 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
280 | P | Клубок | 30 | P | P | P | P | P | P | P | B45 | P280H | 1,54 | P280C | 1,32 | P280T | 1,29 | |||||
281 | I | Клубок | 39 | I | I | I | I | I | I | I | B45 | I281Q | 2,16 | I281M | 1,93 | I281R | 1,46 | I281K | 1,35 | I281S | 1,31 | |
I281H | 1,29 | I281A | 1,23 | |||||||||||||||||||
282 | N | Клубок | 42 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
283 | T | Лист | 0 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
284 | S | Лист | 72 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
285 | A | Клубок | 8 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
286 | Q | Клубок | 6 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | ||||||||||||
287 | L | Клубок | 9 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
288 | T | Клубок | 2 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
289 | R | Клубок | 8 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
290 | E | Лист | b1 | 11 | E | E | E | E | E | E | E | |||||||||||
291 | I | Лист | 1 | I | I | I | I | I | V | V | ||||||||||||
292 | Y | Лист | 7 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
293 | T | Клубок | 8 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
294 | D | Клубок | 24 | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||
295 | P | Клубок | 4 | P | P | P | P | P | A | A | ||||||||||||
296 | I | Клубок | 3 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
297 | G | Клубок | 15 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
298 | R | Клубок | 16 | R | R | R | R | R | T | A | ||||||||||||
299 | T | Клубок | 48 | T | T | T | T | T | V | T | ||||||||||||
300 | N | Клубок | 59 | N | N | N | N | N | H | G | ||||||||||||
301 | A | Клубок | 109 | A | A | A | A | A | P | V | ||||||||||||
302 | P | Клубок | 63 | P | P | P | P | P | S | N | ||||||||||||
303 | S | Клубок | 0 | S | S | S | S | S | Q | - | 258 | S303N | 1,28 | S303P | 1,24 | |||||||
304 | G | Клубок | 67 | G | G | G | G | G | A | - | ||||||||||||
305 | F | Клубок | 78 | F | F | F | F | F | F | M | ||||||||||||
306 | A | Клубок | 31 | A | A | A | A | A | A | A | 258 | A306G | 1,47 | |||||||||
307 | S | Клубок | 11 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
308 | T | Клубок | 29 | T | T | T | T | T | T | M | ||||||||||||
309 | N | Клубок | 20 | N | N | N | N | N | T | N | ||||||||||||
310 | W | Спираль | 5 | W | W | W | W | W | W | W | ||||||||||||
311 | F | Спираль | 8 | F | F | F | F | F | F | Y | ||||||||||||
312 | N | Спираль | 48 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
313 | N | Клубок | 60 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
314 | N | Клубок | 96 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
315 | A | Клубок | 0 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
316 | P | Клубок | 33 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
317 | S | Клубок | 65 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
318 | F | Спираль | a8 | 6 | F | F | F | F | F | F | F | |||||||||||
319 | S | Спираль | 96 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
320 | A | Спираль | 58 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
321 | I | Спираль | 4 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
322 | E | Спираль | 39 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
323 | A | Спираль | 98 | A | A | A | A | A | A | T | ||||||||||||
324 | A | Спираль | 52 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
325 | V | Спираль | 18 | V | I | I | I | I | V | V | ||||||||||||
326 | I | Клубок | 24 | I | F | F | F | F | I | I | ||||||||||||
327 | R | Клубок | 11 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
328 | P | Клубок | 77 | P | P | P | P | P | P | S | ||||||||||||
329 | P | Клубок | 53 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
330 | H | Клубок | 21 | H | H | H | H | H | H | H | ||||||||||||
331 | L | Клубок | 17 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
332 | L | Клубок | 3 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
333 | D | Лист | 21 | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||
334 | F | Лист | 6 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
335 | P | Лист | 13 | P | P | P | P | P | P | L | ||||||||||||
336 | E | Клубок | 19 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
337 | Q | Лист | b2 | 48 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | |||||||||||
338 | L | Лист | 11 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
339 | T | Лист | 13 | T | T | T | T | T | T | K | ||||||||||||
340 | I | Лист | 0 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
341 | F | Лист | 30 | F | Y | Y | Y | Y | Y | F | ||||||||||||
342 | S | Лист | 5 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
343 | V | Лист | 29 | V | A | A | A | A | T | A | ||||||||||||
344 | L | Лист | 88 | L | S | S | S | S | L | S | ||||||||||||
345 | S | Лист | 39 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
346 | R | Лист | 67 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
347 | W | Лист | 41 | W | W | W | W | W | W | W | ||||||||||||
348 | S | Виток | L1 | 51 | S | S | S | S | S | S | S | |||||||||||
349 | N | Виток | 113 | N | S | S | S | S | N | N | ||||||||||||
350 | T | Виток | 78 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
351 | Q | Лист | b3 | 36 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | R | |||||||||||
352 | Y | Лист | 45 | Y | H | H | H | H | F | H | ||||||||||||
353 | M | Лист | 0 | M | M | M | M | M | M | M | ||||||||||||
354 | N | Лист | 19 | N | N | N | N | N | N | T | ||||||||||||
355 | Y | Лист | 4 | Y | Y | Y | Y | Y | I | Y | ||||||||||||
356 | W | Лист | 1 | W | W | W | W | W | W | W | ||||||||||||
357 | V | Клубок | 9 | V | V | V | V | V | A | R | ||||||||||||
358 | G | Лист | 0 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
359 | H | Лист | 0 | H | H | H | H | H | H | H | ||||||||||||
360 | R | Лист | 61 | R | R | R | R | R | R | T | B21 | R360S | 1,68 | R360N | 1,57 | R360T | 1,38 | R360Y | 1,29 | R360M | 1,23 | |
361 | L | Лист | 13 | L | L | L | L | L | L | I | ||||||||||||
362 | E | Лист | 20 | E | N | N | N | N | E | Q | B21 | N362Y | 2,25 | N362H | 1,79 | N362W | 1,64 | N362K | 1,57 | N362I | 1,57 | |
N362D | 1,45 | N362V | 1,45 | N362A | 1,32 | N362L | 1,3 | N362G | 1,26 | |||||||||||||
N362E | 1,26 | |||||||||||||||||||||
363 | S | Лист | 8 | S | F | F | F | F | S | S | ||||||||||||
364 | R | Лист | 40 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
365 | T | Лист | 10 | T | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
366 | I | Виток | 1 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
367 | R | Виток | 70 | R | G | G | G | G | A | R | B21 | G367H | 3,17 | G367Q | 2,72 | G367N | 1,97 | G367W | 1,84 | G367T | 1,62 | |
G367L | 1,58 | G367Y | 1,45 | G367I | 1,37 | G367A | 1,36 | |||||||||||||||
368 | G | Клубок | 21 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
369 | S | Клубок | 116 | S | T | T | T | T | S | A | ||||||||||||
370 | L | Лист | b4 | 37 | L | L | L | L | L | L | L | |||||||||||
371 | S | Лист | 117 | S | N | N | N | N | N | I | ||||||||||||
372 | T | Лист | 29 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
373 | S | Лист | 45 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
374 | T | Лист | 63 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
375 | H | Лист | 29 | H | H | H | H | Q | Q | H | ||||||||||||
376 | G | Лист | 23 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
377 | N | Клубок | 80 | N | A | A | A | L | S | N | ||||||||||||
378 | T | Клубок | 24 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
379 | N | Клубок | 106 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
- | - | - | - | - | - | N | - | - | ||||||||||||||
380 | T | Клубок | 74 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
381 | S | Клубок | 124 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
382 | I | Клубок | 20 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
383 | N | Лист | b5 | 76 | N | N | N | N | N | N | N | |||||||||||
384 | P | Лист | 66 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
385 | V | Лист | 42 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
386 | T | Лист | 99 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
387 | L | Лист | 5 | L | L | L | L | L | L | F | ||||||||||||
388 | Q | Лист | 109 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | ||||||||||||
389 | F | Клубок | 3 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
390 | T | Виток | 66 | T | T | T | T | T | T | P | ||||||||||||
391 | S | Виток | 56 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
392 | R | Клубок | 28 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
393 | D | Лист | 3 | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||
394 | V | Лист | 1 | V | V | V | V | V | I | V | ||||||||||||
395 | Y | Клубок | 8 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
396 | R | Лист | b6 | 31 | R | R | R | R | R | R | R | |||||||||||
397 | T | Лист | 6 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
398 | E | Лист | 35 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
399 | S | Лист | 3 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
400 | Y | Лист | 35 | Y | Y | Y | Y | N | L | Y | ||||||||||||
401 | A | Лист | 1 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
402 | G | Лист | 0 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
403 | I | Лист | 0 | I | I | I | I | T | L | V | ||||||||||||
404 | N | Лист | 0 | N | N | N | N | N | N | L | ||||||||||||
405 | I | Лист | 53 | I | I | I | I | I | I | L | ||||||||||||
406 | L | Клубок | L2 | 38 | L | L | L | L | L | F | W | 258 | L406M | 1,65 | ||||||||
- | - | - | - | - | - | - | - | G | ||||||||||||||
- | - | - | - | - | - | - | - | I | ||||||||||||||
407 | L | Клубок | 114 | L | L | L | L | F | I | Y | 258 | L407W | 1,99 | |||||||||
408 | T | Клубок | 107 | T | T | T | T | T | T | L | ||||||||||||
409 | T | Клубок | 50 | T | T | T | T | T | Q | E | ||||||||||||
410 | P | Лист | 1 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
411 | V | Лист | 12 | V | V | V | V | V | V | I | ||||||||||||
412 | N | Лист | 3 | N | N | N | N | N | N | H | ||||||||||||
413 | G | Лист | 0 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
414 | V | Клубок | 0 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
415 | P | Клубок | 6 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
416 | W | Лист | b7 | 21 | W | W | W | W | W | W | T | |||||||||||
417 | A | Лист | 1 | A | A | A | A | A | V | V | ||||||||||||
418 | R | Лист | 42 | R | R | R | R | R | R | R | B21 | R418K | 1,26 | R418T | 1,24 | |||||||
419 | F | Лист | 2 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
420 | N | Лист | 17 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
421 | W | Лист | 4 | W | W | W | W | F | W | F | ||||||||||||
422 | R | Лист | 17 | R | R | R | R | I | R | R | ||||||||||||
423 | N | Лист | 18 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
424 | P | Виток | 23 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
425 | L | Виток | 96 | L | L | L | L | Q | L | Q | B21 | L425P | 1,94 | L425G | 1,31 | |||||||
426 | N | Виток | 50 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
427 | S | Виток | 71 | S | S | S | S | I | S | T | B21 | S427Y | 1,44 | |||||||||
428 | L | Лист | b8 | 104 | L | L | L | L | Y | L | F | |||||||||||
429 | R | Лист | 57 | R | R | R | R | E | R | E | B21 | R429I | 1,36 | |||||||||
- | - | - | - | - | - | R | - | R | ||||||||||||||
430 | G | Лист | 71 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
431 | S | Лист | 56 | S | S | S | S | A | S | T | B21 | S431L | 1,63 | S431H | 1,63 | S431G | 1,42 | S431A | 1,3 | |||
432 | L | Лист | 42 | L | L | L | L | T | L | A | ||||||||||||
433 | L | Лист | 39 | L | L | L | L | T | L | N | ||||||||||||
434 | Y | Лист | 4 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
435 | T | Лист | 54 | T | T | T | T | S | T | S | B21 | T435Y | 2,14 | T435H | 1,43 | T435L | 1,21 | |||||
436 | I | Клубок | 21 | I | I | I | I | Q | I | Q | ||||||||||||
437 | G | Клубок | 75 | G | G | G | G | P | G | P | B21 | G437S | 1,57 | G437N | 1,57 | G437A | 1,43 | G437K | 1,34 | G437R | 1,34 | |
438 | Y | Клубок | 5 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | G437Q | 1,33 | ||||||||||
439 | T | Клубок | 60 | T | T | T | T | Q | T | E | B21 | T439M | 1,22 | T439Q | 1,21 | |||||||
440 | G | Клубок | 77 | G | G | G | G | G | G | S | ||||||||||||
441 | V | Клубок | 13 | V | V | V | V | V | V | P | ||||||||||||
442 | G | Лист | b9 | 67 | G | G | G | G | G | G | G | |||||||||||
443 | T | Лист | 37 | T | T | T | T | I | T | L | ||||||||||||
444 | Q | Лист | 39 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | ||||||||||||
445 | L | Лист | 87 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
446 | F | Лист | 31 | F | F | F | F | F | Q | K | ||||||||||||
447 | D | Лист | 41 | D | D | D | D | D | D | D | B21 | D447N | 1,55 | D447V | 1,52 | D447I | 1,47 | D447S | 1,34 | D447L | 1,33 | |
D447A | 1,31 | D447E | 1,3 | D447M | 1,21 | |||||||||||||||||
448 | S | Спираль | 2 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
449 | E | Спираль | 31 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
450 | T | Спираль | 76 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
451 | E | Спираль | 15 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
452 | L | Клубок | 2 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
453 | P | Клубок | 14 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
454 | P | Клубок | 21 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
455 | E | Клубок | 38 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
456 | T | Клубок | 45 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
457 | T | Клубок | 119 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
458 | E | Клубок | 95 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
459 | R | Клубок | 75 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
460 | P | Клубок | 32 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
461 | N | Спираль | 34 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
462 | Y | Спираль | 41 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
463 | E | Спираль | 57 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
464 | S | Спираль | 2 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
465 | Y | Клубок | 3 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
466 | S | Клубок | 0 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
467 | H | Лист | b10 | 1 | H | H | H | H | H | H | H | |||||||||||
468 | R | Лист | 3 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
469 | L | Лист | 13 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
470 | S | Клубок | 1 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
471 | N | Лист | 2 | N | N | N | N | H | H | H | ||||||||||||
472 | I | Лист | 7 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
473 | R | Лист | 15 | R | R | R | R | G | G | G | B21 | R473T | 12,6 | R473G | 5,48 | R473A | 4,94 | R473S | 3,04 | R473M | 1,94 | |
R473N | 1,43 | R473K | 1,42 | R473D | 1,39 | R473Y | 1,22 | R473N | 1,43 | |||||||||||||
474 | L | Лист | 1 | L | L | L | L | L | L | I | ||||||||||||
475 | I | Лист | 20 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
476 | S | Клубок | L3 | 2 | S | I | I | I | I | S | L | B21 | I476Y | 1,71 | I476H | 1,55 | I476G | 1,48 | I476L | 1,32 | I476S | 1,28 |
I476F | 1,25 | I476M | 1,23 | |||||||||||||||||||
477 | G | Виток | 126 | G | G | G | G | G | S | Q | B21 | G477S | 2,35 | G477A | 1,29 | |||||||
478 | N | Виток | 105 | N | N | N | G | N | S | T | B21 | N478G | 2,96 | N478K | 1,23 | |||||||
479 | T | Клубок | 31 | T | T | T | T | T | H | R | B21 | T479V | 2,16 | |||||||||
480 | L | Клубок | 16 | L | L | L | L | L | V | L | ||||||||||||
481 | R | Клубок | 22 | R | R | R | R | R | R | N | ||||||||||||
482 | A | Лист | b11 | 4 | A | A | A | A | A | A | V | |||||||||||
483 | P | Лист | 0 | P | P | P | P | P | L | P | ||||||||||||
484 | V | Лист | 3 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
485 | Y | Лист | 1 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
486 | S | Лист | 0 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
487 | W | Лист | 1 | W | W | W | W | W | W | W | ||||||||||||
488 | T | Лист | 1 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
489 | H | Лист | 8 | H | H | H | H | H | H | H | ||||||||||||
490 | R | Виток | 39 | R | R | R | R | R | R | R | 258 | R490Q | 3,53 | |||||||||
491 | S | Виток | 2 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
492 | A | Клубок | 0 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
493 | D | Клубок | 30 | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||
494 | R | Клубок | 20 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
495 | T | Клубок | 49 | T | T | T | T | T | T | T | B25 | T495N | 1,54 | |||||||||
496 | N | Клубок | 5 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
497 | T | Лист | 60 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
498 | I | Лист | 9 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
499 | A | Клубок | 68 | A | A | A | A | G | G | G | B25 | A499R | 1,69 | A499S | 1,56 | A499G | 1,52 | A499M | 1,5 | A499C | 1,49 | |
A499V | 1,42 | A499P | 1,28 | A499W | 1,26 | |||||||||||||||||
500 | T | Клубок | 41 | T | T | T | T | P | P | P | ||||||||||||
501 | N | Клубок | 103 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
502 | I | Клубок | 16 | I | I | I | I | R | R | R | B25 | I502K | 2,45 | I502V | 2,26 | I502A | 1,97 | I502T | 1,96 | I502N | 1,83 | |
I502E | 1,83 | I502L | 1,71 | I502Q | 1,61 | I502P | 1,58 | I502H | 1,57 | |||||||||||||
I502R | 1,54 | I502F | 1,48 | I502S | 1,42 | I502Y | 1,37 | |||||||||||||||
503 | I | Лист | b13 | 0 | I | I | I | I | I | I | I | |||||||||||
504 | T | Лист | 5 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
505 | Q | Лист | 8 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | ||||||||||||
506 | I | Лист | 12 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
507 | P | Лист | 3 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
508 | A | Спираль | 0 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
509 | V | Спираль | 8 | V | V | V | V | V | V | V | B25 | V509T | 1,26 | |||||||||
510 | K | Спираль | 0 | K | K | K | K | K | K | K | ||||||||||||
511 | G | Клубок | 0 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
512 | N | Клубок | 13 | N | N | N | N | R | R | N | 258 | N512Y | 1,75 | N512P | 1,71 | N512M | 1,42 | N512R | 1,41 | N512K | 1,34 | |
N512G | 1,31 | N512Q | 1,26 | N512I | 1,21 | N512W | 1,21 | |||||||||||||||
513 | F | Лист | b14 | 47 | F | F | F | F | F | F | L | B25 | F513G | 1,84 | F513V | 1,71 | F513P | 1,67 | F513L | 1,56 | F513H | 1,44 |
514 | L | Лист | 23 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
515 | F | Клубок | 29 | F | F | F | F | F | F | F | B25 | F515H | 2,24 | |||||||||
516 | N | Клубок | 125 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
517 | G | Клубок | 13 | G | G | G | G | G | G | G | B25 | G517A | 2,22 | G517H | 1,58 | G517S | 1,44 | |||||
518 | S | Клубок | 37 | S | S | S | S | S | S | S | B25 | S518D | 3,21 | S518A | 2,55 | S518Y | 2,53 | S518K | 2,39 | S518V | 2,37 | |
S518L | 2,36 | S518G | 2,26 | S518H | 2,25 | S518E | 2,24 | S518R | 2,18 | |||||||||||||
S518T | 2,08 | S518C | 1,76 | |||||||||||||||||||
519 | V | Лист | 7 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
520 | I | Лист | 34 | I | I | I | I | I | I | I | B25 | I520V | 3,39 | I520R | 2,18 | I520Y | 2,08 | I520C | 2,05 | I520K | 1,93 | |
I520M | 1,74 | I520E | 1,67 | I520L | 1,49 | I520F | 1,34 | I520S | 1,31 | |||||||||||||
I520A | 1,25 | |||||||||||||||||||||
521 | S | Клубок | 110 | S | S | S | S | S | S | S | B25 | S521G | 2,71 | S521L | 2,52 | S521V | 2,47 | S521A | 2,34 | S521D | 2,09 | |
S521I | 1,73 | S521Q | 1,56 | S521F | 1,54 | S521P | 1,52 | S521N | 1,44 | |||||||||||||
S521M | 1,4 | |||||||||||||||||||||
522 | G | Клубок | 2 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
523 | P | Клубок | 4 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
524 | G | Клубок | 46 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
525 | F | Клубок | 11 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
526 | T | Клубок | 0 | T | T | T | T | T | T | T | B25 | T526L | 1,23 | |||||||||
527 | G | Клубок | 13 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
528 | G | Клубок | 2 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
529 | D | Клубок | 47 | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||
530 | L | Лист | b15 | 8 | L | L | L | L | V | V | L | |||||||||||
531 | V | Лист | 2 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
532 | R | Лист | 50 | R | R | R | R | R | R | R | B25 | R532K | 2,58 | R532C | 1,98 | R532W | 1,63 | R532S | 1,59 | R532L | 1,53 | |
R532V | 1,49 | R532H | 1,37 | R532G | 1,24 | |||||||||||||||||
533 | L | Лист | 6 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
534 | N | Клубок | 52 | N | N | N | N | N | N | N | B25 | N534S | 2,2 | N534Y | 1,95 | N534Q | 1,9 | N534W | 1,78 | N534E | 1,58 | |
N534H | 1,51 | N534D | 1,49 | N534L | 1,48 | |||||||||||||||||
535 | N | Клубок | 62 | N | N | N | N | R | R | N | B25 | N535M | 2,96 | N535Q | 2,26 | N535E | 1,88 | N535F | 1,68 | N535K | 1,68 | |
N535L | 1,48 | N535R | 1,48 | N535A | 1,43 | N535S | 1,29 | N535I | 1,23 | |||||||||||||
N535D | 1,21 | |||||||||||||||||||||
536 | S | Клубок | 50 | S | S | S | S | N | N | S | ||||||||||||
537 | G | Лист | 92 | G | G | G | G | N | N | G | 258 | G537W | 2,23 | G537E | 2,02 | G537F | 1,9 | G537A | 1,77 | G537K | 1,69 | |
G537S | 1,48 | G537Q | 1,48 | G537Y | 1,43 | G537R | 1,4 | G537D | 1,33 | |||||||||||||
G537V | 1,33 | G537N | 1,3 | G537H | 1,3 | G537T | 1,25 | |||||||||||||||
538 | N | Лист | 72 | N | N | N | N | G | G | N | 258 | N538G | 2,22 | N538T | 2 | N538S | 1,95 | N538V | 1,57 | N538W | 1,5 | |
N538L | 1,47 | N538H | 1,43 | N538Q | 1,42 | N538I | 1,41 | N538D | 1,32 | |||||||||||||
N538V | 1,57 | N538W | 1,5 | N538L | 1,47 | N538Q | 1,42 | N538I | 1,4 | |||||||||||||
N538E | 1,3 | N538P | 1,25 | N538A | 1,23 | N538M | 1,2 | |||||||||||||||
539 | N | Клубок | 4 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
540 | I | Лист | b16 | 2 | I | I | I | I | I | I | I | |||||||||||
541 | Q | Лист | 50 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | 258 | Q541Y | 2,48 | Q541W | 1,35 | Q541F | 1,27 | |||||
542 | N | Лист | 23 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
543 | R | Лист | 35 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
544 | G | Лист | 38 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
545 | Y | Лист | 37 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | 258 | Y545F | 1,3 | |||||||||
546 | L | Лист | 8 | L | I | I | I | I | I | L | ||||||||||||
547 | E | Клубок | 101 | E | E | E | E | E | E | E | 258 | E547A | 1,88 | E547S | 1,82 | E547G | 1,72 | E547I | 1,25 | E547M | 1,24 | |
E547Q | 1,21 | |||||||||||||||||||||
548 | V | Клубок | 4 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
549 | P | Клубок | 50 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
550 | I | Клубок | 7 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
551 | Q | Клубок | 90 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | B25 | Q551C | 2,51 | Q551R | 2,17 | Q551A | 1,98 | Q551S | 1,76 | Q551D | 1,54 | |
Q551Y | 1,34 | |||||||||||||||||||||
552 | F | Клубок | 103 | F | F | F | F | F | F | F | B25 | F552T | 1,72 | F552V | 1,69 | F552W | 1,57 | |||||
553 | I | Клубок | 75 | I | I | I | I | T | T | T | B25 | I553Q | 2,41 | I553D | 2,15 | I553R | 1,96 | I553E | 1,83 | I553A | 1,78 | |
I553F | 1,71 | I553L | 1,69 | I553P | 1,65 | I553G | 1,5 | I553W | 1,49 | |||||||||||||
I553S | 1,49 | I553T | 1,47 | |||||||||||||||||||
554 | S | Клубок | 120 | S | S | S | S | S | S | S | B25 | S554K | 1,87 | S554R | 1,56 | S554D | 1,45 | S554H | 1,43 | S554N | 1,25 | |
S554G | 1,22 | |||||||||||||||||||||
555 | T | Клубок | 79 | T | T | T | T | T | T | T | B25 | T555V | 2,13 | T555M | 1,64 | T555I | 1,32 | T555W | 1,3 | |||
556 | S | Клубок | 24 | S | S | S | S | S | S | S | B25 | S556A | 2,65 | S556W | 2,25 | S556G | 2,05 | S556D | 1,6 | S556C | 1,41 | |
S556P | 1,27 | |||||||||||||||||||||
557 | T | Клубок | 21 | T | T | T | T | T | T | T | B25 | T557I | 1,75 | T557R | 1,61 | T557G | 1,55 | T557S | 1,39 | T557Q | 1,38 | |
T557M | 1,31 | T557V | 1,28 | T557A | 1,27 | T557C | 1,26 | |||||||||||||||
558 | R | Лист | b17 | 65 | R | R | R | R | R | R | R | B25 | R558Y | 2,16 | R558K | 2,01 | R558T | 1,95 | R558L | 1,83 | R558N | 1,79 |
R558G | 1,75 | R558S | 1,59 | R558E | 1,53 | R558I | 1,43 | R558D | 1,4 | |||||||||||||
R558F | 1,37 | R558P | 1,27 | R558V | 1,26 | R558M | 1,23 | R558H | 1,22 | |||||||||||||
559 | Y | Лист | 1 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | B25 | Y559W | 1,26 | |||||||||
560 | R | Лист | 38 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
561 | V | Лист | 7 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
562 | R | Лист | 21 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
563 | V | Лист | 5 | V | V | V | V | V | V | V | B25 | V563N | 4,65 | V563L | 2,56 | V563I | 2,1 | V563A | 1,39 | |||
564 | R | Лист | 7 | R | R | R | R | R | R | R | B25 | R564H | 4,11 | R564V | 3,28 | R564W | 3,03 | R564I | 3,02 | R564K | 2,71 | |
R564C | 1,79 | R564S | 1,42 | R564A | 1,36 | |||||||||||||||||
565 | Y | Лист | 5 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | B25 | Y565F | 3,4 | |||||||||
566 | A | Лист | 55 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
567 | S | Лист | 2 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
568 | V | Клубок | 29 | V | V | V | V | V | V | V | B25 | V568C | 2,44 | V568A | 2,31 | V568E | 1,81 | V568F | 1,8 | V568R | 1,65 | |
V568G | 1,54 | V568L | 1,52 | V568S | 1,5 | V568W | 1,39 | V568N | 1,31 | |||||||||||||
569 | T | Клубок | 33 | T | T | T | T | T | T | T | B25 | T569I | 1,75 | T569M | 1,67 | T569G | 1,29 | T569S | 1,2 | |||
570 | P | Клубок | 69 | P | P | P | P | S | S | P | 258 | P570M | 2,08 | P570F | 1,6 | P570W | 1,45 | P570T | 1,38 | |||
571 | I | Лист | b18 | 4 | I | I | I | I | I | I | I | B25 | I571G | 4,18 | I571V | 3,13 | I571T | 3,07 | I571C | 2,72 | I571L | 2,2 |
572 | Q | Лист | 32 | Q | Q | R | R | E | E | H | 258 | Q572H | 2,51 | Q572P | 2,29 | Q572R | 2,03 | Q572I | 1,96 | Q572K | 1,69 | |
Q572F | 1,65 | Q572S | 1,54 | Q572A | 1,38 | Q572V | 1,35 | Q572W | 1,3 | |||||||||||||
Q572M | 1,28 | |||||||||||||||||||||
573 | L | Лист | 7 | L | L | L | L | L | L | L | B25 | L573A | 3,14 | L573T | 3,09 | L573G | 2,12 | |||||
574 | S | Лист | 21 | S | S | S | S | N | N | S | 258 | S574R | 1,22 | |||||||||
575 | V | Лист | 11 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
576 | N | Лист | 26 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
577 | W | Лист | 6 | W | W | W | W | L | W | W | 258 | W577R | 3,24 | W577F | 2,01 | W577K | 1,74 | W577M | 1,72 | W577V | 1,63 | |
W577A | 1,56 | W577T | 1,47 | W577H | 1,33 | W577G | 1,28 | W577I | 1,24 | |||||||||||||
578 | G | Виток | 109 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
579 | N | Виток | 120 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
580 | S | Клубок | 66 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
581 | N | Клубок | 85 | N | N | N | N | S | S | N | 258 | N581S | 1,83 | N581K | 1,57 | |||||||
582 | I | Клубок | 14 | I | I | I | I | I | I | I | B25 | I582V | 1,69 | |||||||||
583 | F | Лист | b19 | 3 | F | F | F | F | F | F | F | B25 | F583S | 2,8 | ||||||||
584 | S | Лист | 71 | S | S | S | S | T | T | S | B21 | S584R | 1,21 | |||||||||
585 | S | Лист | 33 | S | S | S | S | N | N | S | 258 | S585R | 3,33 | S585T | 2,53 | S585K | 2,17 | S585H | 2,14 | S585Q | 2,04 | |
S585L | 1,86 | S585W | 1,69 | S585N | 1,59 | S585M | 1,3 | S585F | 1,3 | |||||||||||||
S585I | 1,27 | |||||||||||||||||||||
586 | I | Лист | 73 | I | I | I | I | T | T | T | 258 | I586M | 4,11 | I586Y | 2,77 | I586P | 2,19 | I586A | 1,97 | I586S | 1,84 | |
I586K | 1,83 | I586R | 1,77 | I586F | 1,73 | I586G | 1,65 | I586V | 1,6 | |||||||||||||
I586Q | 1,48 | I586N | 1,41 | I586L | 1,35 | I586W | 1,32 | I586T | 1,26 | |||||||||||||
587 | V | Лист | 17 | V | V | V | V | L | L | V | 258 | V587H | 2,82 | V587C | 2,28 | V587N | 1,97 | V587S | 1,85 | V587D | 1,76 | |
V587R | 1,7 | V587A | 1,7 | V587T | 1,65 | V587K | 1,57 | V587E | 1,43 | |||||||||||||
V587W | 1,4 | V587L | 1,4 | V587Y | 1,4 | V587F | 1,37 | |||||||||||||||
588 | P | Клубок | 77 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
589 | A | Клубок | 38 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
590 | T | Клубок | 6 | T | T | T | T | T | T | T | B25 | T590A | 1,8 | T590D | 1,56 | T590F | 1,54 | T590S | 1,3 | T590G | 1,26 | |
591 | A | Клубок | 42 | A | A | A | A | A | A | A | 258 | A591H | 2,82 | A591V | 2,28 | A591N | 1,97 | A591T | 1,85 | A591D | 1,76 | |
A591R | 1,7 | A591S | 1,7 | A591K | 1,65 | A591C | 1,65 | A591E | 1,43 | |||||||||||||
A591W | 1,4 | A591L | 1,4 | A591Y | 1,4 | A591F | 1,37 | A591P | 1,26 | |||||||||||||
A591Q | 1,2 | |||||||||||||||||||||
592 | T | Клубок | 87 | T | T | T | T | A | A | A | 258 | T592Q | 2,9 | T592M | 2,39 | T592A | 2,02 | T592Y | 1,82 | T592N | 1,8 | |
T592K | 1,78 | T592P | 1,7 | T592S | 1,63 | T592D | 1,57 | T592I | 1,41 | |||||||||||||
T592G | 1,33 | T592F | 1,23 | T592V | 1,21 | T592W | 1,21 | |||||||||||||||
593 | S | Виток | 102 | S | S | S | S | S | S | S | B21 | S593Y | 1,66 | S593G | 1,44 | S593R | 1,24 | S593V | 1,24 | |||
594 | L | Виток | 130 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
595 | D | Клубок | 63 | D | D | D | D | D | D | D | B21 | D595R | 1,83 | D595S | 1,77 | D595G | 1,74 | D595H | 1,72 | D595N | 1,57 | |
D595V | 1,55 | D595F | 1,54 | D595K | 1,52 | D595T | 1,5 | D595Y | 1,4 | |||||||||||||
D595I | 1,36 | D595M | 1,3 | D595A | 1,25 | D595P | 1,21 | |||||||||||||||
596 | N | Клубок | 100 | N | N | N | N | N | N | N | B21 | N596V | 2,7 | N596T | 2,45 | N596I | 2,15 | N596S | 2,14 | N596G | 1,97 | |
N596L | 1,7 | N596W | 1,54 | N596Y | 1,33 | N596H | 1,3 | N596P | 1,3 | |||||||||||||
N596D | 1,29 | |||||||||||||||||||||
597 | L | Клубок | 64 | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||
598 | Q | Клубок | 57 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | B21 | Q598V | 1,5 | Q598G | 1,27 | Q598D | 1,22 | Q598I | 1,21 | |||
599 | S | Клубок | 35 | S | S | S | S | S | S | S | B25 | S599C | 1,72 | S599Q | 1,72 | S599L | 1,6 | S599Y | 1,48 | S599T | 1,47 | |
S599V | 1,44 | S599A | 1,27 | S599P | 1,24 | |||||||||||||||||
600 | R | Клубок | 58 | R | R | R | R | G | G | R | ||||||||||||
601 | D | Лист | b20 | 20 | D | N | N | N | D | D | D | B21 | N601Y | 1,47 | N601F | 1,33 | N601V | 1,33 | N601G | 1,25 | N601M | 1,24 |
N601E | 1,22 | |||||||||||||||||||||
602 | F | Лист | 55 | F | F | F | F | F | F | F | B25 | F602M | 2,53 | |||||||||
603 | G | Лист | 27 | G | G | G | G | G | G | G | B25 | G603M | 2,12 | G603A | 2,04 | G603Y | 2,04 | G603R | 1,88 | G603S | 1,75 | |
G603L | 1,57 | G603W | 1,46 | G603D | 1,3 | G603T | 1,23 | |||||||||||||||
604 | Y | Клубок | 4 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||
605 | F | Клубок | 108 | F | F | F | F | V | V | F | 258 | F605S | 2,2 | F605W | 1,91 | F605R | 1,89 | F605M | 1,85 | F605A | 1,63 | |
F605I | 1,56 | F605C | 1,52 | F605V | 1,49 | F605K | 1,45 | F605I | 1,56 | |||||||||||||
F605D | 1,39 | F605Y | 1,38 | F605N | 1,38 | F605Q | 1,35 | F605G | 1,34 | |||||||||||||
F605E | 1,27 | F605P | 1,25 | |||||||||||||||||||
606 | E | Клубок | 86 | E | E | E | E | E | E | E | B21 | E606R | 3,03 | E606H | 2,38 | E606K | 2,27 | E606F | 2,19 | E606Q | 2,12 | |
E606W | 1,83 | E606G | 1,78 | E606Y | 1,76 | E606M | 1,74 | E606T | 1,64 | |||||||||||||
E606A | 1,51 | E606I | 1,37 | E606L | 1,34 | E606N | 1,28 | |||||||||||||||
607 | S | Клубок | 9 | S | S | S | S | I | I | S | 258 | S607R | 2,59 | S607C | 1,58 | S607T | 1,58 | S607I | 1,55 | S607Q | 1,48 | |
S607G | 1,34 | S607D | 1,31 | S607E | 1,27 | S607V | 1,26 | |||||||||||||||
608 | T | Лист | 14 | T | T | R | R | N | N | T | 258 | T608R | 2,35 | T608S | 2,24 | T608V | 2,2 | T608L | 1,88 | T608F | 1,7 | |
T608G | 1,5 | T608Y | 1,47 | T608A | 1,33 | T608K | 1,32 | T608W | 1,23 | |||||||||||||
T608Q | 1,22 | |||||||||||||||||||||
609 | N | Лист | 40 | N | N | N | N | N | N | N | B25 | N609G | 2,52 | N609P | 2,4 | N609L | 2,23 | N609R | 2,2 | N609S | 1,93 | |
N609V | 1,91 | N609F | 1,46 | N609I | 1,31 | |||||||||||||||||
610 | A | Клубок | 0 | A | A | A | A | A | A | A | B25 | A610G | 2,13 | A610F | 1,45 | A610P | 1,29 | A610L | 1,28 | |||
611 | F | Клубок | 90 | F | F | F | F | F | F | F | B25 | F611L | 2,19 | F611K | 1,58 | F611G | 1,48 | F611W | 1,44 | F611V | 1,38 | |
612 | T | Клубок | 73 | T | T | T | T | T | T | T | B25 | T612F | 2,32 | T612H | 2,07 | T612G | 1,36 | T612E | 1,35 | T612N | 1,31 | |
T612D | 1,23 | T612P | 1,21 | |||||||||||||||||||
613 | S | Клубок | 89 | S | S | S | S | S | S | S | B25 | S613M | 2,85 | S613T | 1,98 | S613W | 1,58 | S613V | 1,54 | S613N | 1,5 | |
S613R | 1,47 | S613Y | 1,33 | S613G | 1,25 | |||||||||||||||||
614 | A | Лист | b22 | 51 | A | A | A | A | A | A | V | B25 | A614M | 2,07 | A614S | 2,01 | A614L | 1,73 | A614H | 1,66 | A614V | 1,66 |
A614R | 1,64 | A614G | 1,55 | A614Y | 1,35 | A614D | 1,2 | A614R | 1,64 | |||||||||||||
615 | T | Лист | 14 | T | T | T | T | T | T | T | ||||||||||||
616 | G | Лист | 50 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
617 | N | Лист | 31 | N | N | N | N | N | N | N | B25 | N617V | 2,25 | N617Q | 1,96 | N617G | 1,96 | N617K | 1,76 | N617M | 1,57 | |
N617R | 1,56 | N617C | 1,25 | N617L | 1,23 | |||||||||||||||||
618 | V | Лист | 17 | V | V | V | V | I | I | V | 258 | V618N | 1,82 | V618H | 1,51 | V618W | 1,44 | V618R | 1,4 | V618G | 1,31 | |
V618L | 1,3 | V618D | 1,29 | V618T | 1,24 | |||||||||||||||||
619 | V | Лист | 10 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
620 | G | Лист | 2 | G | G | G | G | G | G | G | ||||||||||||
621 | V | Лист | 4 | V | V | V | V | A | V | V | ||||||||||||
622 | R | Лист | 61 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
623 | N | Клубок | 89 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
624 | F | Клубок | 0 | F | F | F | F | F | F | F | B25 | F624A | 1,27 | F624M | ||||||||
625 | S | Клубок | 123 | S | S | S | S | S | S | S | ||||||||||||
626 | E | Клубок | 83 | E | E | E | E | A | A | E | 258 | E626K | 3,16 | E626G | 2,62 | E626R | 2,01 | E626T | 1,84 | E626H | 1,81 | |
E626A | 1,71 | E626N | 1,45 | E626I | 1,44 | E626Y | 1,43 | E626Q | 1,37 | |||||||||||||
E626P | 1,31 | E626S | 1,29 | |||||||||||||||||||
627 | N | Клубок | 98 | N | N | N | N | N | N | N | ||||||||||||
628 | A | Клубок | 19 | A | A | A | A | A | A | A | B25 | A628V | 2,38 | A628F | 2,05 | A628K | 1,86 | A628Q | 1,81 | A628W | 1,62 | |
A628S | 1,59 | A628R | 1,49 | A628G | 1,49 | A628L | 1,42 | A628I | 1,21 | |||||||||||||
A628D | 1,21 | |||||||||||||||||||||
629 | G | Клубок | 42 | G | G | G | G | E | E | R | 258 | G629M | 1,57 | G629Q | 1,42 | G629R | 1,4 | G629P | 1,36 | G629A | 1,32 | |
G629S | 1,28 | G629T | 1,28 | G629E | 1,23 | |||||||||||||||||
630 | V | Лист | b23 | 2 | V | V | V | V | V | V | V | B25 | V630A | 1,9 | V630C | 1,62 | ||||||
631 | I | Лист | 12 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
632 | I | Лист | 8 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
633 | D | Клубок | 4 | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||
634 | R | Лист | 7 | R | R | R | R | R | R | R | ||||||||||||
635 | F | Лист | 23 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
636 | E | Лист | 0 | E | E | E | E | E | E | E | ||||||||||||
637 | F | Лист | 15 | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||
638 | I | Лист | 12 | I | I | I | I | I | I | I | ||||||||||||
639 | P | Лист | 6 | P | P | P | P | P | P | P | ||||||||||||
640 | V | Виток | 33 | V | V | V | V | V | V | V | ||||||||||||
641 | T | Виток | 113 | T | T | T | T | T | T | T | B25 | T641P | 3,01 | T641H | 2,65 | T641A | 2,45 | T641L | 2,43 | T641Q | 2,31 | |
T641Y | 2,21 | T641E | 2,1 | T641I | 1,96 | T641S | 1,91 | T641V | 1,82 | |||||||||||||
T641D | 1,57 | T641G | 1,21 | |||||||||||||||||||
642 | A | Клубок | 3 | A | A | A | A | A | A | A | ||||||||||||
643 | T | Клубок | 117 | T | T | T | T | T | T | T | B25 | T643L | 2,72 | T643A | 2,09 | T643Q | 2,04 | T643H | 1,94 | T643S | 1,58 | |
T643D | 1,53 | T643M | 1,51 | T643C | 1,38 | T643R | 1,26 | |||||||||||||||
644 | F | F | F | F | F | F | F | F | ||||||||||||||
645 | E | E | E | E | E | E | E | E | B25 | E645T | 2,28 | E645M | 2,26 | E645L | 1,8 | E645Y | 1,77 | E645A | 1,73 | |||
E645N | 1,71 | E645V | 1,67 | E645P | 1,65 | E645I | 1,61 | E645W | 1,48 | |||||||||||||
E645C | 1,28 | E645S | 1,21 | |||||||||||||||||||
646 | A | A | A | A | A | A | A | A | B25 | A646S | 1,96 | A646Y | 1,95 | A646D | 1,78 | A646E | 1,65 | A646M | 1,57 | |||
A646F | 1,51 | A646H | 1,46 | A646V | 1,41 | A646W | 1,37 | A646I | 1,37 | |||||||||||||
A646C | 1,27 | A646C | 1,27 | |||||||||||||||||||
647 | E | E | E | E | E | E | K | E | ||||||||||||||
648 | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | Y | ||||||||||||||
649 | D | D | D | D | D | D | D | D | ||||||||||||||
650 | L | L | L | L | L | L | L | L | ||||||||||||||
651 | E | E | E | E | E | E | E | E |
Таблица 5
Положение MP 258 |
А.к. MP 258 |
Ос тов |
Вариант | FAE | Вариант | FAE | Вариант | FAE | Вариант | FAE | Вариант | FAE | Вариант | FAE | Вариант | FAE | Вариант | FAE |
50 | L | B45 | L50W | 1,06 | L50M | 1,05 | L50E | 0,98 | L50T | 0,89 | L50G | 0,73 | ||||||
53 | A | B45 | A53N | 1,19 | A53I | 1,15 | A53W | 1,13 | A53L | 1,08 | A53M | 1,06 | A53S | 0,55 | ||||
54 | S | B45 | S54M | 1,16 | S54Y | 1,13 | S54H | 1,11 | S54L | 1,08 | S54V | 1,03 | S54N | 0,99 | S54E | 0,95 | S54T | 0,89 |
S54D | 0,87 | S54W | 0,57 | |||||||||||||||
57 | Q | B45 | Q57C | 1,19 | Q57E | 1,14 | Q57S | 1,13 | Q57W | 1,13 | Q57F | 0,91 | ||||||
65 | R | B45 | R65M | 1,19 | R65T | 1,15 | R65K | 1,04 | R65L | 0,99 | R65V | 0,94 | R65F | 0,87 | R65E | 0,74 | R65P | 0,53 |
R65W | 0,50 | |||||||||||||||||
67 | L | B45 | L67P | 1,12 | L67Q | 1,11 | L67W | 0,54 | L67A | 0,52 | L67E | 0,52 | L67Y | 0,51 | L67T | 0,51 | L67R | 0,50 |
L67S | 0,49 | L67C | 0,48 | L67D | 0,48 | L67V | 0,46 | L67G | 0,44 | |||||||||
68 | G | B45 | G68D | 1,16 | G68K | 1,08 | G68M | 0,75 | G68L | 0,62 | G68V | 0,60 | G68S | 0,54 | G68I | 0,50 | G68N | 0,50 |
G68P | 0,48 | G68W | 0,37 | |||||||||||||||
70 | L | B45 | L70S | 1,16 | L70T | 1,11 | L70Q | 1,10 | L70A | 0,98 | L70F | 0,97 | L70C | 0,97 | L70N | 0,96 | L70G | 0,92 |
L70Y | 0,92 | L70V | 0,92 | L70P | 0,90 | L70R | 0,87 | L70D | 0,85 | |||||||||
71 | G | B45 | G71D | 1,12 | G71E | 1,11 | G71F | 1,10 | G71N | 1,00 | G71R | 1,00 | G71K | 0,96 | G71A | 0,88 | G71I | 0,87 |
G71Q | 0,79 | G71C | 0,75 | G71V | 0,72 | G71L | 0,61 | G71Y | 0,26 | G71W | 0,25 | G71T | 0,22 | |||||
72 | V | B45 | V72S | 0,85 | V72R | 0,84 | V72L | 0,81 | V72F | 0,79 | V72Y | 0,75 | V72I | 0,74 | V72N | 0,72 | V72H | 0,66 |
V72A | 0,66 | V72W | 0,64 | V72C | 0,64 | V72K | 0,55 | V72E | 0,35 | V72P | 0,28 | |||||||
73 | P | B45 | P73F | 1,14 | P73R | 1,11 | P73V | 0,80 | P73A | 0,33 | ||||||||
74 | F | B45 | F74N | 1,19 | F74T | 1,15 | F74W | 1,04 | F74L | 1,00 | F74H | 0,91 | F74K | 0,88 | F74A | 0,82 | F74Y | 0,80 |
F74C | 0,78 | F74M | 0,37 | |||||||||||||||
75 | A | B45 | A75D | 1,03 | A75F | 0,94 | A75R | 0,90 | A75V | 0,83 | A75L | 0,59 | A75T | 0,59 | A75G | 0,57 | A75I | 0,29 |
76 | G | B45 | G76K | 1,15 | G76W | 0,94 | G76Q | 0,91 | G76H | 0,54 | G76C | 0,52 | G76N | 0,51 | G76L | 0,50 | G76F | 0,48 |
77 | Q | B45 | Q77V | 1,15 | Q77F | 1,13 | Q77Y | 1,08 | Q77R | 0,96 | ||||||||
79 | A | B45 | A79E | 0,98 | A79G | 0,71 | A79F | 0,57 | ||||||||||
80 | S | B45 | S80I | 1,20 | S80T | 0,54 | ||||||||||||
83 | S | B45 | S83T | 1,19 | S83V | 0,60 | S83I | 0,60 | S83P | 0,58 | S83W | 0,53 | ||||||
87 | G | B45 | G87Y | 1,10 | G87S | 1,05 | G87F | 1,01 | G87L | 0,97 | G87V | 0,92 | G87T | 0,69 | G87Q | 0,50 | G87I | 0,46 |
91 | P | B45 | P91I | 1,17 | P91Q | 1,14 | P91W | 1,13 | P91G | 1,05 | P91F | 1,01 | P91M | 0,67 | P91L | 0,55 | P91V | 0,55 |
P91K | 0,54 | P91C | 0,53 | P91H | 0,53 | P91A | 0,50 | |||||||||||
92 | S | B45 | S92K | 1,03 | S92W | 0,85 | S92R | 0,76 | S92M | 0,70 | S92A | 0,39 | S92P | 0,32 | ||||
93 | G | B45 | G93E | 0,93 | G93N | 0,90 | G93V | 0,86 | G93L | 0,86 | G93A | 0,83 | G93T | 0,82 | G93S | 0,80 | G93K | 0,75 |
G93W | 0,74 | G93C | 0,72 | G93R | 0,69 | G93Y | 0,53 | |||||||||||
94 | R | B45 | R94E | 0,99 | R94K | 0,95 | R94V | 0,95 | R94G | 0,92 | R94A | 0,88 | R94W | 0,88 | R94N | 0,77 | R94I | 0,71 |
R94M | 0,70 | |||||||||||||||||
95 | D | B45 | D95W | 1,10 | D95T | 0,94 | D95L | 0,87 | D95R | 0,83 | D95K | 0,80 | D95S | 0,64 | D95E | 0,50 | D95A | 0,28 |
106 | Q | B45 | Q106P | 1,08 | Q106L | 1,08 | Q106N | 0,98 | Q106Y | 0,96 | Q106T | 0,52 | ||||||
108 | V | B45 | V108G | 1,14 | V108K | 1,14 | V108S | 1,06 | V108C | 1,04 | V108E | 0,95 | V108W | 0,83 | ||||
109 | R | 258 | R109K | 1,07 | R109A | 1,05 | R109Q | 1,02 | R109W | 0,97 | R109H | 0,92 | R109L | 0,91 | R109E | 0,91 | R109G | 0,86 |
R109T | 0,85 | R109I | 0,84 | R109D | 0,83 | R109F | 0,79 | R109M | 0,74 | R109C | 0,73 | R109Y | 0,49 | R109P | 0,07 | |||
110 | Q | 258 | Q110K | 1,19 | Q110D | 1,18 | Q110I | 1,18 | Q110M | 1,14 | Q110N | 1,13 | Q110E | 1,09 | Q110S | 1,09 | Q110L | 0,89 |
Q110C | 0,84 | Q110A | 0,77 | Q110W | 0,73 | Q110G | 0,70 | Q110P | 0,15 | |||||||||
111 | Q | 258 | Q111V | 1,14 | Q111W | 1,08 | Q111N | 1,01 | Q111F | 1,01 | Q111P | 0,85 | Q111T | 0,79 | Q111C | 0,77 | Q111Y | 0,50 |
Q111D | 0,25 | |||||||||||||||||
112 | I | B45 | I112K | 0,93 | I112G | 0,84 | I112M | 0,64 | I112C | 0,57 | I112T | 0,57 | I112E | 0,39 | I112Y | 0,28 | I112N | 0,28 |
I112S | 0,27 | I112F | 0,27 | I112D | 0,26 | I112R | 0,24 | I112W | 0,24 | |||||||||
113 | T | B45 | T113W | 0,98 | T113F | 0,82 | T113C | 0,75 | T113P | 0,73 | T113I | 0,61 | ||||||
114 | E | 258 | E114Q | 1,15 | E114W | 1,13 | E114C | 0,79 | E114R | 0,41 | E114P | 0,09 | ||||||
115 | N | B45 | N115I | 0,96 | N115Y | 0,93 | N115M | 0,91 | N115S | 0,88 | N115V | 0,87 | N115D | 0,82 | N115L | 0,69 | N115C | 0,61 |
N115W | 0,57 | N115K | 0,51 | N115R | 0,35 | N115H | 0,24 | |||||||||||
118 | N | B45 | N118W | 1,05 | N118K | 0,99 | N118Y | 0,92 | N118R | 0,84 | N118M | 0,60 | ||||||
119 | T | B45 | T119Y | 1,00 | T119F | 0,95 | T119P | 0,94 | T119W | 0,84 | T119L | 0,78 | T119C | 0,62 | T119G | 0,50 | T119N | 0,42 |
122 | A | B45 | A122E | 1,11 | A122L | 1,06 | A122S | 1,06 | A122W | 1,04 | A122D | 1,01 | A122V | 1,00 | A122K | 0,96 | A122C | 0,96 |
123 | R | B45 | R123H | 0,73 | R123A | 0,73 | R123Y | 0,72 | R123P | 0,63 | R123T | 0,61 | R123V | 0,61 | R123L | 0,61 | R123F | 0,57 |
R123G | 0,55 | R123N | 0,49 | R123S | 0,49 | R123M | 0,46 | R123C | 0,43 | R123W | 0,42 | R123D | 0,32 | R123E | 0,28 | |||
R123I | 0,24 | |||||||||||||||||
125 | Q | B45 | Q125V | 1,14 | Q125I | 0,96 | Q125K | 0,63 | ||||||||||
129 | A | B45 | A129E | 1,08 | A129Y | 1,08 | A129R | 1,07 | A129Q | 1,06 | A129C | 1,05 | A129M | 0,91 | A129G | 0,90 | A129N | 0,87 |
A129F | 0,83 | A129I | 0,83 | |||||||||||||||
132 | R | B45 | R132Y | 0,98 | R132A | 0,96 | R132V | 0,96 | R132M | 0,89 | R132L | 0,86 | R132Q | 0,80 | R132S | 0,72 | R132E | 0,70 |
R132F | 0,68 | R132D | 0,66 | R132G | 0,65 | R132N | 0,59 | R132C | 0,59 | R132P | 0,36 | |||||||
133 | A | B45 | A133D | 0,87 | A133V | 0,85 | A133S | 0,63 | A133T | 0,54 | A133G | 0,47 | A133P | 0,36 | A133H | 0,33 | A133M | 0,32 |
A133Q | 0,32 | A133F | 0,32 | A133E | 0,29 | A133L | 0,26 | A133R | 0,23 | A133Q | ||||||||
136 | Q | B45 | Q136G | 1,06 | Q136W | 1,03 | Q136D | 0,96 | Q136S | 0,92 | Q136V | 0,59 | ||||||
140 | D | B45 | D140G | 0,92 | D140Y | 0,73 | D140S | 0,46 | D140T | 0,40 | D140Q | 0,40 | D140M | 0,36 | D140C | 0,36 | D140K | 0,30 |
D140R | 0,24 | D140A | 0,22 | D140L | 0,22 | |||||||||||||
142 | L | B45 | L142H | 1,03 | L142Q | 0,86 | L142S | 0,78 | L142R | 0,73 | L142A | 0,67 | L142G | 0,67 | L142Y | 0,66 | L142M | 0,62 |
L142W | 0,58 | L142D | 0,52 | L142C | 0,47 | L142E | 0,43 | |||||||||||
143 | E | B45 | E143K | 0,98 | E143D | 0,98 | E143V | 0,95 | ||||||||||
144 | N | B45 | N144F | 1,13 | N144P | 1,09 | N144S | 1,07 | N144Y | 0,94 | N144E | 0,86 | N144G | 0,84 | N144D | 0,52 | ||
145 | R | B45 | R145F | 1,16 | R145Q | 1,02 | R145V | 0,99 | R145T | 0,94 | R145C | 0,69 | ||||||
146 | D | B45 | D146E | 1,16 | D146A | 1,15 | D146P | 1,14 | D146S | 1,11 | D146R | 1,05 | D146N | 1,05 | D146L | 1,01 | D146Q | 0,95 |
D146F | 0,95 | D146G | 0,83 | D146M | 0,80 | |||||||||||||
147 | D | B45 | N147T | 1,02 | N147L | 1,01 | N147Y | 0,63 | N147K | 0,62 | N147F | 0,61 | N147I | 0,59 | N147P | 0,57 | N147M | 0,55 |
N147Q | 0,49 | N147G | 0,45 | |||||||||||||||
148 | A | B45 | A148G | 1,18 | A148Q | 1,00 | A148M | 0,95 | A148R | 0,90 | A148Y | 0,87 | A148T | 0,85 | A148S | 0,84 | A148D | 0,83 |
A148E | 0,76 | |||||||||||||||||
149 | R | B45 | R149F | 1,00 | R149Q | 0,99 | R149H | 0,94 | R149W | 0,94 | R149Y | 0,87 | R149P | 0,84 | R149G | 0,82 | R149C | 0,24 |
151 | R | B45 | R151S | 1,06 | R151V | 0,90 | R151K | 0,72 | R151M | 0,69 | R151L | 0,68 | R151G | 0,63 | R151T | 0,56 | R151Q | 0,52 |
R151A | 0,50 | R151I | 0,42 | R151N | 0,42 | R151Y | 0,39 | R151W | 0,39 | R151E | 0,38 | R151P | 0,32 | R151D | 0,32 | |||
R151F | 0,27 | |||||||||||||||||
152 | S | B45 | S152K | 1,07 | S152M | 0,98 | S152C | 0,95 | S152Q | 0,89 | S152L | 0,83 | S152I | 0,76 | S152R | 0,61 | S152G | 0,60 |
S152P | 0,47 | S152Y | 0,44 | S152F | 0,41 | S152W | 0,37 | S152D | 0,32 | S152V | 0,25 | |||||||
159 | I | B45 | I159G | 0,92 | I159D | 0,78 | I159S | 0,59 | I159T | 0,32 | I159R | 0,32 | I159Y | 0,29 | I159N | 0,28 | I159M | 0,28 |
I159P | 0,27 | I159F | 0,26 | I159W | 0,26 | I159E | 0,26 | I159Q | 0,25 | I159L | 0,25 | |||||||
160 | A | B45 | A160F | 1,12 | A160E | 0,92 | A160P | 0,89 | A160G | 0,85 | A160K | 0,82 | A160T | 0,81 | A160I | 0,75 | ||
163 | L | B45 | L163F | 0,80 | L163Q | 0,72 | L163V | 0,60 | L163M | 0,56 | L163C | 0,28 | L163A | 0,28 | L163K | 0,27 | L163P | 0,26 |
L163E | 0,24 | L163G | 0,24 | L163S | 0,24 | L163R | 0,24 | L163D | 0,23 | L163N | 0,23 | |||||||
164 | D | B45 | D164A | 0,90 | D164S | 0,88 | D164G | 0,81 | D164M | 0,81 | D164R | 0,72 | D164N | 0,71 | D164L | 0,63 | D164Y | 0,56 |
D164V | 0,54 | D164F | 0,51 | D164T | 0,49 | D164C | 0,49 | D164I | 0,42 | D164E | 0,30 | D164P | 0,25 | |||||
166 | L | B45 | L166Q | 1,07 | L166D | 1,01 | L166M | 0,98 | L166P | 0,98 | L166H | 0,98 | L166G | 0,97 | L166R | 0,96 | L166K | 0,96 |
L166S | 0,95 | L166N | 0,92 | L166Y | 0,73 | L166F | 0,62 | L166S | 0,95 | |||||||||
167 | N | B45 | N167R | 1,15 | N167G | 1,13 | N167S | 1,04 | N167C | 0,98 | N167F | 0,92 | N167E | 0,90 | N167D | 0,87 | N167P | 0,83 |
N167I | 0,67 | |||||||||||||||||
173 | A | B45 | A173N | 1,12 | A173P | 0,97 | A173G | 0,92 | A173V | 0,88 | A173S | 0,77 | A173E | 0,56 | ||||
174 | I | B45 | I174V | 0,91 | I174Q | 0,89 | I174H | 0,77 | I174K | 0,73 | I174G | 0,72 | I174M | 0,72 | I174E | 0,63 | I174N | 0,59 |
I174S | 0,56 | I174R | 0,33 | I174D | 0,32 | |||||||||||||
177 | Q | B45 | Q177F | 1,10 | Q177N | 1,06 | Q177H | 1,05 | Q177Y | 1,01 | Q177I | 1,00 | Q177R | 0,96 | Q177M | 0,95 | Q177V | 0,93 |
Q177L | 0,89 | Q177D | 0,78 | Q177G | 0,74 | Q177K | 0,40 | |||||||||||
178 | Q | B45 | Q178E | 0,98 | Q178H | 0,92 | Q178W | 0,83 | Q178G | 0,78 | Q178S | 0,75 | Q178V | 0,74 | Q178P | 0,67 | Q178I | 0,54 |
Q178F | 0,53 | Q178Y | 0,50 | Q178L | 0,37 | Q178D | 0,31 | |||||||||||
179 | V | B45 | V179C | 1,01 | V179A | 0,86 | V179N | 0,80 | V179M | 0,80 | V179E | 0,77 | V179S | 0,75 | V179P | 0,67 | V179G | 0,61 |
V179R | 0,61 | V179F | 0,44 | V179W | 0,41 | V179D | 0,37 | |||||||||||
180 | P | B45 | P180C | 1,05 | P180K | 1,00 | P180T | 0,94 | P180V | 0,88 | P180G | 0,83 | P180F | 0,62 | P180R | 0,60 | P180N | 0,56 |
P180Y | 0,53 | P180W | 0,38 | P180D | 0,28 | |||||||||||||
201 | L | B45 | L201C | 0,79 | L201N | 0,67 | L201A | 0,64 | L201P | 0,64 | L201Q | 0,62 | L201G | 0,61 | L201W | 0,60 | L201Y | 0,60 |
L201H | 0,55 | L201R | 0,54 | L201D | 0,52 | |||||||||||||
206 | F | B45 | F206V | 1,00 | F206C | 0,86 | F206E | 0,76 | F206A | 0,75 | F206Y | 0,74 | F206Q | 0,69 | F206G | 0,58 | F206R | 0,53 |
F206S | 0,53 | F206D | 0,51 | F206K | 0,49 | F206N | 0,47 | F206P | 0,37 | |||||||||
208 | L | B45 | L208F | 0,91 | L208I | 0,79 | L208Y | 0,71 | L208S | 0,71 | L208E | 0,67 | L208V | 0,66 | L208M | 0,56 | L208H | 0,50 |
L208Q | 0,44 | L208W | 0,44 | L208C | 0,39 | L208G | 0,37 | L208T | 0,35 | L208A | 0,35 | L208P | 0,34 | L208R | 0,30 | |||
L208D | 0,29 | |||||||||||||||||
209 | T | B45 | T209S | 0,94 | T209Q | 0,88 | T209I | 0,75 | T209G | 0,68 | T209W | 0,67 | T209F | 0,64 | T209Y | 0,62 | T209P | 0,28 |
210 | S | B45 | S210G | 1,13 | ||||||||||||||
211 | Q | B45 | Q211V | 1,17 | Q211K | 1,15 | Q211H | 1,10 | Q211E | 1,08 | Q211W | 1,03 | Q211F | 1,01 | Q211Y | 1,01 | Q211C | 1,00 |
Q211S | 0,94 | Q211D | 0,54 | |||||||||||||||
212 | E | B45 | E212F | 1,05 | E212A | 0,86 | E212V | 0,79 | E212N | 0,78 | E212P | 0,77 | E212C | 0,72 | E212T | 0,68 | E212G | 0,64 |
E212L | 0,64 | E212Q | 0,63 | E212K | 0,61 | E212S | 0,59 | E212R | 0,56 | |||||||||
213 | I | B45 | I213C | 1,11 | I213S | 0,98 | I213R | 0,94 | I213E | 0,91 | I213W | 0,74 | I213D | 0,67 | I213Y | 0,63 | I213F | 0,62 |
I213P | 0,59 | I213H | 0,58 | I213A | 0,49 | |||||||||||||
214 | Q | B21 | Q214S | 1,12 | Q214F | 1,05 | Q214Y | 1,01 | Q214D | 0,76 | Q214V | 0,68 | Q214C | 0,67 | Q214E | 0,58 | Q214I | 0,53 |
Q214T | 0,53 | Q214H | 0,52 | Q214L | 0,43 | Q214G | 0,40 | Q214K | 0,28 | Q214R | 0,27 | |||||||
215 | R | B45 | R215V | 0,95 | R215A | 0,94 | R215I | 0,85 | R215N | 0,83 | R215Y | 0,77 | R215F | 0,75 | R215Q | 0,73 | R215K | 0,72 |
R215S | 0,67 | R215G | 0,66 | R215T | 0,66 | R215P | 0,59 | R215D | 0,56 | R215E | 0,54 | |||||||
218 | E | B45 | E218G | 1,18 | E218L | 1,10 | E218C | 1,10 | E218K | 1,08 | E218R | 0,93 | E218F | 0,92 | E218P | 0,55 | ||
219 | R | B21 | R219Y | 1,15 | R219E | 1,13 | R219W | 1,08 | R219Q | 0,71 | R219K | 0,63 | R219D | 0,53 | R219P | 0,23 | R219H | 0,07 |
R219T | 0,05 | R219M | 0,03 | R219L | 0,01 | R219A | 0,01 | R219V | 0,01 | R219I | 0,01 | R219C | 0,00 | |||||
221 | A | B45 | A221S | 1,16 | A221C | 1,03 | A221E | 0,91 | A221M | 0,83 | A221P | 0,62 | A221Q | 0,50 | ||||
222 | E | B45 | E222C | 1,13 | E222S | 1,11 | E222L | 1,10 | E222F | 1,10 | E222A | 0,98 | E222N | 0,98 | E222V | 0,94 | E222W | 0,90 |
E222R | 0,84 | E222P | 0,59 | |||||||||||||||
225 | R | B45 | R225W | 1,19 | R225S | 1,17 | R225E | 1,14 | R225A | 1,02 | R225P | 0,87 | R225K | 0,85 | R225T | 0,77 | ||
226 | E | B45 | E226T | 1,18 | E226F | 1,17 | E226G | 1,15 | E226W | 1,13 | E226N | 1,11 | E226M | 1,05 | E226I | 1,00 | E226L | 0,98 |
E226H | 0,96 | E226Q | 0,96 | |||||||||||||||
230 | Y | B45 | Y230F | 1,19 | Y230M | 1,15 | Y230R | 1,01 | Y230C | 0,93 | Y230T | 0,93 | Y230D | 0,88 | Y230N | 0,85 | Y230G | 0,81 |
Y230I | 0,63 | Y230V | 0,57 | Y230P | 0,53 | |||||||||||||
233 | R | B45 | R233E | 1,19 | R233V | 1,10 | R233F | 1,09 | R233N | 1,05 | R233L | 1,03 | R233M | 1,01 | R233S | 0,87 | R233C | 0,78 |
R233H | 0,50 | |||||||||||||||||
234 | W | B45 | W234G | 1,06 | W234K | 0,93 | W234T | 0,63 | W234E | 0,60 | W234D | 0,59 | W234P | 0,46 | W234Q | 0,45 | ||
236 | N | B45 | N236Q | 1,18 | N236D | 1,16 | N236R | 1,08 | N236A | 1,04 | N236I | 0,93 | N236Y | 0,89 | N236V | 0,89 | N236G | 0,58 |
N236M | 0,54 | N236C | 0,53 | N236W | 0,42 | |||||||||||||
240 | N | B45 | N240I | 1,18 | N240D | 1,17 | N240V | 1,16 | N240E | 0,57 | N240P | 0,44 | ||||||
241 | N | B45 | N241G | 1,17 | N241F | 1,16 | N241Q | 1,15 | N241E | 1,13 | N241T | 1,12 | N241D | 1,07 | N241H | 0,90 | N241P | 0,50 |
N241R | 0,49 | |||||||||||||||||
242 | L | B45 | L242M | 0,95 | L242I | 0,93 | L242C | 0,83 | L242R | 0,75 | L242S | 0,70 | L242Q | 0,68 | L242A | 0,66 | L242N | 0,58 |
L242F | 0,49 | L242H | 0,46 | L242W | 0,40 | L242G | 0,39 | L242Y | 0,33 | L242K | 0,32 | |||||||
243 | R | B45 | R243L | 0,98 | R243A | 0,86 | R243Y | 0,82 | R243F | 0,76 | R243H | 0,73 | R243W | 0,71 | R243G | 0,67 | R243D | 0,57 |
R243P | 0,46 | |||||||||||||||||
244 | G | B45 | G244C | 0,94 | G244L | 0,72 | G244A | 0,71 | G244Q | 0,60 | G244S | 0,58 | G244D | 0,56 | G244K | 0,54 | G244R | 0,54 |
G244Y | 0,53 | G244E | 0,53 | G244H | 0,47 | G244M | 0,47 | G244N | 0,46 | G244T | 0,37 | G244V | 0,28 | G244P | 0,28 | |||
G244I | 0,26 | |||||||||||||||||
245 | T | B45 | T245P | 0,96 | T245L | 0,82 | T245C | 0,71 | ||||||||||
246 | N | B45 | N246A | 0,85 | N246K | 0,84 | N246P | 0,79 | N246E | 0,78 | N246M | 0,77 | N246R | 0,76 | N246F | 0,66 | N246L | 0,61 |
N246Y | 0,60 | N246V | 0,60 | N246I | 0,58 | |||||||||||||
247 | A | B45 | A247C | 0,52 | A247N | 0,52 | A247L | 0,41 | A247D | 0,41 | A247V | 0,39 | A247W | 0,39 | A247R | 0,31 | A247F | 0,30 |
A247Y | 0,30 | A247M | 0,28 | A247K | 0,28 | A247H | 0,25 | |||||||||||
248 | E | B45 | E248I | 1,11 | E248W | 1,06 | E248H | 1,01 | E248C | 0,82 | E248G | 0,76 | E248M | 0,74 | E248K | 0,50 | ||
252 | R | B45 | R252L | 1,09 | R252Y | 1,06 | R252K | 1,06 | R252G | 1,05 | R252M | 1,05 | R252S | 0,99 | R252Q | 0,98 | R252H | 0,96 |
R252V | 0,92 | R252D | 0,90 | R252E | 0,79 | R252L | 0,76 | R252P | 0,66 | R252T | 0,48 | |||||||
277 | R | B45 | R277H | 1,13 | R277N | 1,07 | R277C | 0,95 | R277E | 0,88 | R277W | 0,87 | R277S | 0,87 | R277F | 0,86 | R277T | 0,85 |
R277Y | 0,82 | R277D | 0,70 | R277A | 0,69 | R277I | 0,55 | R277P | 0,47 | |||||||||
280 | P | B45 | P280Q | 1,18 | P280Y | 1,08 | P280V | 0,98 | P280R | 0,90 | P280F | 0,90 | P280W | 0,87 | P280E | 0,86 | P280K | 0,64 |
P280G | 0,62 | P280A | 0,58 | P280S | 0,54 | P280D | 0,50 | P280I | 0,47 | P280L | 0,46 | |||||||
281 | I | B45 | I281T | 1,15 | I281N | 1,14 | I281Y | 1,14 | I281C | 1,07 | I281G | 1,00 | I281F | 0,94 | I281W | 0,82 | I281D | 0,72 |
303 | S | 258 | S303A | 1,09 | S303M | 0,95 | S303L | 0,70 | S303Y | 0,66 | S303G | 0,64 | S303I | 0,61 | S303T | 0,57 | S303H | 0,57 |
S303F | 0,56 | S303C | 0,43 | S303Q | 0,39 | S303V | 0,37 | S303W | 0,29 | S303D | 0,15 | S303K | 0,13 | S303E | 0,07 | |||
S303R | 0,03 | |||||||||||||||||
304 | G | 258 | G304N | 0,22 | G304C | 0,02 | G304S | 0,01 | G304A | 0,01 | G304I | 0,01 | G304L | 0,01 | G304T | 0,01 | G304F | 0,01 |
G304E | 0,01 | G304Q | 0,01 | G304K | 0,01 | G304P | 0,01 | G304R | 0,01 | G304H | 0,01 | G304W | 0,01 | G304V | 0,01 | |||
G304D | 0,01 | G304M | 0,00 | G304Y | 0,00 | |||||||||||||
305 | F | 258 | F305A | 0,07 | F305Q | 0,03 | F305N | 0,03 | F305M | 0,02 | F305I | 0,01 | F305L | 0,01 | F305R | 0,01 | F305G | 0,01 |
F305V | 0,01 | F305K | 0,01 | F305E | 0,00 | F305D | 0,00 | F305C | 0,00 | F305W | 0,00 | F305T | 0,00 | F305S | 0,00 | |||
F305H | 0,00 | F305P | 0,00 | F305Y | 0,00 | |||||||||||||
306 | A | 258 | A306Q | 1,14 | A306K | 0,96 | A306N | 0,93 | A306S | 0,87 | A306M | 0,78 | A306T | 0,52 | A306H | 0,50 | A306R | 0,48 |
A306W | 0,44 | A306L | 0,33 | A306F | 0,30 | A306I | 0,30 | A306V | 0,26 | A306P | 0,22 | A306D | 0,09 | A306C | 0,07 | |||
A306E | 0,02 | A306Y | 0,00 | |||||||||||||||
308 | T | 258 | T308S | 0,63 | T308A | 0,03 | T308G | 0,02 | T308K | 0,02 | T308F | 0,02 | T308Q | 0,01 | T308V | 0,01 | T308C | 0,01 |
T308N | 0,01 | T308E | 0,01 | T308R | 0,01 | T308D | 0,01 | T308L | 0,01 | T308I | 0,01 | T308P | 0,01 | T308M | 0,01 | |||
T308Y | 0,01 | T308W | 0,01 | T308H | 0,00 | |||||||||||||
360 | R | B21 | R360K | 0,97 | R360A | 0,94 | R360G | 0,66 | R360H | 0,63 | R360Q | 0,44 | R360E | 0,41 | R360L | 0,28 | ||
362 | E | B21 | N362Q | 1,20 | N362M | 1,16 | N362C | 0,95 | N362T | 0,88 | ||||||||
364 | R | B21 | R364G | 1,02 | R364S | 0,89 | R364A | 0,39 | R364K | 0,38 | R364M | 0,25 | ||||||
367 | R | B21 | G367S | 1,09 | G367M | 0,97 | G367C | 0,53 | G367F | 0,38 | ||||||||
406 | L | 258 | L406I | 0,76 | L406W | 0,53 | L406A | 0,39 | L406F | 0,31 | L406C | 0,29 | L406V | 0,27 | L406Q | 0,27 | L406H | 0,24 |
L406N | 0,23 | L406K | 0,13 | L406T | 0,05 | L406S | 0,03 | L406Y | 0,03 | L406G | 0,02 | L406D | 0,01 | L406P | 0,01 | |||
L406E | 0,01 | |||||||||||||||||
407 | L | 258 | L407E | 1,13 | L407D | 1,00 | L407V | 0,66 | L407C | 0,56 | L407F | 0,46 | L407A | 0,41 | L407R | 0,34 | L407T | 0,34 |
L407N | 0,20 | L407M | 0,17 | L407H | 0,11 | L407S | 0,10 | L407G | 0,06 | L407K | 0,04 | L407Q | 0,02 | L407P | 0,01 | |||
408 | T | 258 | T408A | 0,96 | T408Y | 0,54 | T408S | 0,48 | T408V | 0,47 | T408L | 0,36 | T408M | 0,32 | T408Q | 0,30 | T408N | 0,27 |
T408R | 0,26 | T408H | 0,25 | T408K | 0,25 | T408F | 0,24 | T408P | 0,22 | T408W | 0,20 | T408I | 0,17 | T408C | 0,11 | |||
T408G | 0,08 | T408E | 0,02 | |||||||||||||||
409 | T | 258 | T409Q | 0,53 | T409M | 0,30 | T409A | 0,26 | T409I | 0,21 | T409V | 0,20 | T409L | 0,17 | T409S | 0,16 | T409K | 0,13 |
T409H | 0,11 | T409W | 0,11 | T409E | 0,10 | T409R | 0,10 | T409Y | 0,08 | T409N | 0,08 | T409F | 0,05 | T409C | 0,02 | |||
T409D | 0,01 | T409P | 0,01 | T409G | 0,01 | |||||||||||||
411 | V | 258 | V411I | 0,82 | V411M | 0,52 | V411L | 0,51 | V411C | 0,32 | V411R | 0,27 | V411N | 0,21 | V411Q | 0,19 | V411T | 0,14 |
V411H | 0,12 | V411W | 0,11 | V411A | 0,10 | V411F | 0,09 | V411S | 0,08 | V411G | 0,06 | V411K | 0,03 | V411E | 0,02 | |||
V411Y | 0,02 | V411D | 0,01 | V411P | 0,01 | |||||||||||||
418 | R | B21 | R418S | 1,13 | R418A | 1,11 | R418L | 1,09 | R418H | 0,91 | R418D | 0,89 | R418I | 0,83 | R418V | 0,78 | R418N | 0,76 |
R418Y | 0,76 | R418M | 0,69 | R418E | 0,63 | R418G | 0,58 | R418Q | 0,58 | R418W | 0,54 | R418F | 0,43 | R418C | 0,36 | |||
R418P | 0,14 | |||||||||||||||||
420 | N | B21 | N420D | 1,11 | N420Y | 1,10 | N420E | 1,04 | N420P | 1,00 | N420G | 0,98 | N420L | 0,91 | N420F | 0,90 | N420W | 0,89 |
N420V | 0,81 | N420M | 0,74 | N420K | 0,71 | N420T | 0,68 | N420H | 0,68 | N420R | 0,68 | N420Q | 0,65 | N420S | 0,63 | |||
N420I | 0,60 | N420C | 0,50 | N420A | 0,47 | |||||||||||||
422 | R | B21 | R422Q | 1,13 | R422S | 1,13 | R422Y | 1,06 | R422A | 1,01 | R422T | 0,92 | R422K | 0,91 | R422L | 0,87 | R422V | 0,84 |
R422N | 0,79 | R422D | 0,77 | R422W | 0,74 | R422M | 0,72 | R422G | 0,67 | R422H | 0,66 | R422C | 0,63 | R422E | 0,60 | |||
R422F | 0,59 | R422I | 0,51 | R422P | 0,03 | |||||||||||||
425 | L | B21 | L425V | 1,19 | L425A | 1,16 | L425Y | 1,15 | L425M | 1,15 | L425F | 1,08 | L425R | 1,04 | L425S | 1,00 | L425K | 0,96 |
L425Q | 0,93 | L425I | 0,93 | L425W | 0,93 | L425N | 0,92 | L425H | 0,89 | L425T | 0,84 | L425E | 0,83 | L425C | 0,67 | |||
L425D | 0,54 | |||||||||||||||||
426 | N | B21 | N426M | 1,17 | N426S | 1,09 | N426D | 1,05 | N426Y | 1,01 | N426A | 0,99 | N426V | 0,91 | N426E | 0,83 | N426L | 0,83 |
N426Q | 0,83 | N426R | 0,80 | N426T | 0,77 | N426G | 0,68 | N426F | 0,59 | N426K | 0,59 | N426I | 0,53 | N426H | 0,51 | |||
N426C | 0,34 | N426W | 0,31 | N426P | 0,29 | |||||||||||||
427 | S | B21 | S427H | 1,20 | S427P | 1,14 | S427Q | 1,13 | S427N | 1,12 | S427W | 1,10 | S427T | 1,10 | S427G | 1,03 | S427L | 0,97 |
S427F | 0,87 | S427I | 0,84 | S427E | 0,83 | S427M | 0,78 | S427K | 0,74 | S427A | 0,73 | S427C | 0,68 | S427D | 0,55 | |||
S427V | 0,53 | S427R | 0,48 | |||||||||||||||
428 | L | B21 | L428N | 1,15 | L428Q | 1,08 | L428G | 1,07 | L428P | 0,96 | L428T | 0,92 | L428M | 0,85 | L428H | 0,83 | L428R | 0,82 |
L428S | 0,82 | L428W | 0,76 | L428A | 0,74 | L428V | 0,73 | L428E | 0,72 | L428D | 0,65 | L428Y | 0,63 | L428I | 0,60 | |||
L428K | 0,52 | L428F | 0,42 | L428C | 0,28 | |||||||||||||
429 | R | B21 | R429L | 1,13 | R429H | 1,09 | R429W | 1,09 | R429N | 1,08 | R429K | 1,00 | R429M | 0,99 | R429F | 0,91 | R429A | 0,89 |
R429Y | 0,88 | R429Q | 0,86 | R429T | 0,83 | R429G | 0,79 | R429V | 0,73 | R429P | 0,72 | R429E | 0,65 | R429D | 0,63 | |||
R429S | 0,54 | R429C | 0,36 | |||||||||||||||
431 | S | B21 | S431K | 1,15 | S431M | 1,00 | S431V | 0,90 | S431T | 0,87 | S431E | 0,87 | S431Y | 0,86 | S431Q | 0,86 | S431F | 0,82 |
S431R | 0,81 | S431N | 0,81 | S431I | 0,73 | S431W | 0,71 | S431P | 0,61 | S431D | 0,60 | S431C | 0,32 | |||||
435 | T | B21 | T435M | 1,13 | T435W | 1,01 | T435F | 1,00 | T435I | 0,90 | T435K | 0,88 | T435Q | 0,82 | T435V | 0,79 | T435S | 0,58 |
T435N | 0,57 | T435D | 0,55 | T435E | 0,52 | T435A | 0,52 | T435R | 0,47 | T435C | 0,24 | T435G | 0,20 | T435P | 0,04 | |||
437 | G | B21 | G437M | 1,15 | G437T | 1,13 | G437Y | 1,00 | G437F | 0,95 | G437H | 0,94 | G437V | 0,88 | G437W | 0,88 | G437L | 0,84 |
G437I | 0,75 | G437E | 0,67 | G437D | 0,62 | G437P | 0,36 | G437C | 0,26 | |||||||||
439 | T | B21 | T439S | 1,20 | T439F | 1,16 | T439V | 1,16 | T439A | 1,15 | T439H | 1,08 | T439N | 0,99 | T439Y | 0,92 | T439I | 0,89 |
T439K | 0,83 | T439R | 0,80 | T439L | 0,79 | T439G | 0,67 | T439D | 0,64 | T439E | 0,58 | T439W | 0,54 | T439C | 0,17 | |||
T439P | 0,02 | |||||||||||||||||
444 | Q | B21 | Q444E | 0,91 | Q444M | 0,89 | Q444A | 0,62 | Q444H | 0,58 | Q444T | 0,53 | Q444L | 0,48 | Q444S | 0,48 | Q444V | 0,47 |
Q444F | 0,34 | Q444D | 0,31 | Q444N | 0,28 | Q444K | 0,28 | Q444Y | 0,26 | Q444W | 0,24 | Q444I | 0,18 | Q444G | 0,12 | |||
Q444C | 0,10 | Q444R | 0,05 | Q444P | 0,01 | |||||||||||||
447 | D | B21 | D447Q | 1,17 | D447Y | 1,16 | D447K | 1,01 | D447G | 0,94 | D447F | 0,94 | D447H | 0,94 | D447T | 0,88 | D447W | 0,78 |
D447R | 0,63 | D447P | 0,52 | D447C | 0,52 | |||||||||||||
473 | R | B21 | R473H | 1,07 | R473C | 1,07 | R473L | 1,02 | R473Q | 1,02 | ||||||||
476 | S | B21 | I476K | 1,13 | I476T | 1,12 | I476N | 1,07 | I476C | 0,84 | I476R | 0,59 | I476D | 0,40 | I476A | 0,29 | ||
477 | G | B21 | G477R | 1,04 | G477T | 1,01 | G477Q | 0,90 | G477K | 0,53 | G477H | 0,42 | G477M | 0,41 | G477E | 0,33 | G477F | 0,25 |
G477Y | 0,24 | G477C | 0,13 | G477W | 0,04 | |||||||||||||
478 | N | B21 | N478Q | 1,14 | N478R | 1,12 | N478H | 1,06 | N478T | 1,04 | N478L | 0,88 | N478V | 0,82 | N478M | 0,68 | N478I | 0,59 |
N478D | 0,31 | N478F | 0,26 | N478C | 0,13 | |||||||||||||
479 | T | B21 | T479G | 1,00 | T479I | 0,93 | T479L | 0,81 | T479S | 0,75 | T479A | 0,66 | T479N | 0,50 | T479Q | 0,44 | T479Y | 0,40 |
T479P | 0,40 | T479R | 0,30 | T479M | 0,23 | T479F | 0,19 | T479W | 0,18 | |||||||||
481 | R | B21 | R481K | 0,65 | R481L | 0,48 | R481W | 0,30 | R481Y | 0,23 | R481N | 0,18 | R481T | 0,18 | R481D | 0,15 | R481F | 0,14 |
R481A | 0,13 | R481S | 0,13 | R481G | 0,07 | R481E | 0,04 | |||||||||||
492 | A | B25 | A492S | 0,93 | A492C | 0,70 | A492V | 0,69 | A492G | 0,38 | ||||||||
498 | I | B25 | I498V | 1,02 | I498E | 0,93 | I498L | 0,90 | I498C | 0,65 | I498W | 0,47 | I498M | 0,43 | I498Y | 0,37 | I498A | 0,28 |
I498R | 0,27 | |||||||||||||||||
499 | A | B25 | A499D | 1,09 | ||||||||||||||
503 | I | B25 | I503C | 0,63 | I503L | 0,59 | I503V | 0,44 | ||||||||||
504 | T | B25 | T504S | 0,78 | T504G | 0,66 | T504A | 0,63 | T504C | 0,60 | T504Q | 0,52 | ||||||
505 | Q | B25 | Q505C | 0,34 | Q505L | 0,28 | Q505E | 0,26 | Q505S | 0,20 | ||||||||
506 | I | B25 | I506L | 0,96 | I506V | 0,94 | I506W | 0,19 | I506A | 0,11 | ||||||||
507 | P | B25 | P507A | 0,44 | P507G | 0,34 | P507S | 0,29 | ||||||||||
508 | A | B25 | A508V | 0,91 | A508M | 0,64 | A508S | 0,48 | A508I | 0,23 | ||||||||
509 | V | B25 | V509I | 0,95 | V509C | 0,86 | V509N | 0,86 | V509G | 0,83 | V509S | 0,72 | V509A | 0,67 | V509W | 0,57 | V509M | 0,55 |
V509D | 0,31 | V509E | 0,24 | |||||||||||||||
511 | G | B25 | G511A | 0,88 | G511S | 0,62 | ||||||||||||
512 | N | 258 | N512S | 1,13 | N512C | 1,10 | N512H | 1,08 | N512L | 1,05 | N512T | 1,04 | N512F | 0,96 | N512A | 0,82 | ||
513 | F | B25 | F513R | 1,18 | F513A | 1,02 | F513Y | 0,91 | F513M | 0,75 | ||||||||
514 | L | |||||||||||||||||
515 | F | B25 | F515W | 1,04 | F515G | 0,60 | F515R | 0,56 | F515V | 0,53 | F515Q | 0,51 | F515K | 0,50 | F515T | 0,45 | F515A | 0,44 |
F515S | 0,43 | F515E | 0,22 | F515D | 0,19 | |||||||||||||
517 | G | B25 | G517V | 0,39 | ||||||||||||||
520 | I | B25 | I520G | 1,02 | I520N | 0,93 | ||||||||||||
525 | F | B25 | F525T | 0,82 | F525S | 0,79 | F525V | 0,77 | F525W | 0,72 | F525C | 0,60 | F525A | 0,40 | F525G | 0,39 | ||
526 | T | B25 | T526A | 0,79 | T526S | 0,70 | T526V | 0,69 | T526G | 0,24 | ||||||||
527 | G | B25 | G527T | 0,45 | G527S | 0,23 | ||||||||||||
530 | L | B25 | L530I | 0,86 | L530V | 0,80 | L530C | 0,56 | L530Y | 0,52 | S536N | 0,41 | L530G | 0,31 | L530S | 0,27 | L530E | 0,22 |
L530K | 0,22 | |||||||||||||||||
531 | V | B25 | V531I | 0,96 | V531C | 0,75 | V531A | 0,21 | ||||||||||
533 | L | B25 | L533I | 0,86 | L533N | 0,62 | L533V | 0,54 | V531A | 0,21 | ||||||||
534 | N | B25 | N534R | 1,17 | N534V | 1,12 | N534M | 1,04 | N534A | 0,86 | N534T | 0,81 | ||||||
535 | N | B25 | N535G | 1,10 | N535C | 0,92 | N535V | 0,91 | ||||||||||
536 | S | 258 | S536Y | 1,03 | S536T | 1,02 | S536A | 0,85 | S536N | 0,83 | S536Q | 0,66 | S536C | 0,62 | S536M | 0,60 | S536H | 0,56 |
S536F | 0,55 | S536G | 0,49 | S536W | 0,47 | S536D | 0,35 | S536E | 0,30 | S536P | 0,27 | S536K | 0,21 | S536V | 0,20 | |||
S536R | 0,18 | S536L | 0,11 | S536I | 0,09 | |||||||||||||
537 | G | 258 | G537L | 1,18 | G537M | 1,17 | G537I | 1,06 | G537C | 0,95 | G537P | 0,57 | ||||||
538 | N | 258 | N538K | 1,17 | N538Y | 0,98 | N538R | 0,80 | ||||||||||
539 | N | B25 | N539D | 0,95 | N539A | 0,92 | N539S | 0,88 | N539H | 0,79 | N539E | 0,77 | N539L | 0,72 | N539A | 0,60 | N539F | 0,57 |
N539T | 0,57 | N539V | 0,56 | N539G | 0,51 | N539C | 0,49 | N539W | 0,43 | N539Y | 0,39 | N539R | 0,18 | N539K | 0,17 | |||
540 | I | B25 | I540V | 0,90 | I540H | 0,86 | I540S | 0,84 | I540P | 0,84 | I540L | 0,82 | I540G | 0,51 | I540C | 0,50 | I540R | 0,17 |
541 | Q | 258 | Q541H | 0,92 | Q541G | 0,71 | Q541A | 0,62 | Q541S | 0,54 | Q541E | 0,39 | Q541C | 0,37 | Q541T | 0,30 | Q541L | 0,30 |
Q541K | 0,20 | Q541R | 0,12 | |||||||||||||||
542 | N | B25 | N542R | 0,87 | N542M | 0,86 | N542A | 0,65 | N542L | 0,64 | N542Y | 0,63 | N542H | 0,61 | N542T | 0,53 | N542C | 0,52 |
N542S | 0,50 | N542G | 0,41 | N542V | 0,31 | N542I | 0,24 | N542P | 0,05 | |||||||||
543 | R | 258 | R543Y | 0,1104 | R543H | 0,0972 | R543G | 0,068 | R543W | 0,06 | R543M | 0,0587 | R543L | 0,0419 | R543K | 0,0394 | R543S | 0,033 |
R543A | 0,0329 | R543V | 0,0262 | R543C | 0,0171 | R543Q | 0,0079 | R543P | 0,0079 | R543D | 0,002 | R543T | 0,0011 | R543E | 0,0002 | |||
545 | Y | 258 | Y545A | 0,39 | Y545L | 0,34 | Y545C | 0,28 | Y545V | 0,26 | Y545H | 0,26 | Y545N | 0,25 | Y545W | 0,24 | Y545T | 0,21 |
Y545K | 0,19 | Y545R | 0,11 | Y545D | 0,10 | Y545G | 0,08 | Y545I | 0,07 | Y545Q | 0,07 | Y545E | 0,06 | Y545P | 0,04 | |||
546 | L | B25 | I546V | 1,04 | I546L | 1,02 | I546M | 1,01 | I546F | 0,80 | I546S | 0,32 | I546G | 0,23 | ||||
547 | E | 258 | E547K | 1,11 | E547V | 1,04 | E547R | 1,01 | E547Y | 0,94 | E547T | 0,85 | E547H | 0,78 | E547P | 0,75 | E547L | 0,58 |
E547C | 0,53 | E547W | 0,28 | E547D | 0,28 | E547F | 0,27 | |||||||||||
548 | V | B25 | V548L | 1,02 | V548S | 0,58 | V548A | 0,57 | V548G | 0,45 | V548W | 0,26 | ||||||
549 | P | B25 | P549Y | 0,52 | P549V | 0,38 | P549T | 0,50 | P549S | 0,75 | P549R | 1,03 | P549M | 0,55 | P549L | 0,86 | P549G | 1,73 |
P549D | 0,78 | P549C | 0,89 | |||||||||||||||
550 | I | B25 | I550V | 0,96 | I550L | 0,95 | I550A | 0,61 | I550F | 0,45 | ||||||||
551 | Q | B25 | Q551V | 1,12 | Q551F | 1,09 | Q551M | 1,05 | Q551G | 1,01 | Q551E | 0,93 | Q551N | 0,87 | Q551L | 0,85 | ||
552 | F | B25 | F552C | 1,10 | F552D | 1,06 | F552G | 1,00 | F552A | 0,98 | F552Q | 0,80 | F552R | 0,51 | ||||
553 | I | B25 | I553N | 1,12 | ||||||||||||||
554 | S | B25 | S554M | 0,93 | ||||||||||||||
555 | T | B25 | T555R | 1,13 | T555C | 1,13 | T555S | 0,85 | T555G | 0,78 | T555L | 0,27 | ||||||
557 | T | B25 | T557L | 1,16 | T557W | 1,05 | ||||||||||||
558 | R | B25 | R558A | 1,11 | ||||||||||||||
559 | Y | B25 | Y559L | 0,67 | Y559M | 0,63 | Y559V | 0,61 | Y559A | 0,47 | Y559E | 0,43 | Y559T | 0,27 | Y559S | 0,17 | Y559D | 0,10 |
Y559R | 0,10 | Y559P | 0,07 | Y559G | 0,05 | |||||||||||||
563 | V | B25 | V563G | 1,05 | V563S | 0,69 | V563C | 0,68 | V563T | 0,54 | V563E | 0,05 | ||||||
564 | R | B25 | R564M | 1,04 | R564G | 0,78 | R564L | 0,24 | R564P | 0,20 | ||||||||
568 | V | B25 | V568P | 1,17 | ||||||||||||||
569 | T | B25 | T569V | 1,19 | T569E | 1,15 | T569L | 1,12 | T569R | 1,10 | T569W | 1,02 | T569K | 0,82 | T569A | 0,58 | T569Y | 0,35 |
570 | P | 258 | P570A | 1,15 | P570K | 1,07 | P570G | 1,07 | P570Y | 1,07 | P570V | 1,06 | P570H | 1,05 | P570R | 1,03 | P570I | 1,03 |
P570S | 0,89 | P570Q | 0,79 | P570N | 0,79 | P570C | 0,70 | P570D | 0,52 | P570L | 0,47 | |||||||
571 | I | B25 | I571E | 1,09 | I571A | 0,90 | ||||||||||||
572 | Q | 258 | Q572G | 1,16 | Q572T | 1,07 | Q572Y | 1,07 | Q572N | 0,87 | Q572E | 0,75 | Q572D | 0,75 | Q572C | 0,57 | ||
574 | S | 258 | S574V | 0,82 | S574I | 0,76 | S574M | 0,69 | S574W | 0,64 | S574Q | 0,64 | S574F | 0,56 | S574Y | 0,56 | S574A | 0,53 |
S574N | 0,48 | S574L | 0,38 | S574E | 0,32 | S574P | 0,29 | S574C | 0,29 | S574D | 0,26 | |||||||
577 | W | 258 | W577L | 1,18 | W577N | 1,16 | W577C | 1,08 | W577S | 1,04 | W577P | 0,97 | W577D | 0,92 | W577E | 0,81 | ||
581 | N | 258 | N581I | 1,02 | N581G | 1,02 | N581F | 1,00 | N581T | 0,90 | N581V | 0,86 | N581H | 0,70 | N581Y | 0,64 | N581M | 0,63 |
N581P | 0,63 | N581W | 0,58 | N581E | 0,57 | N581Q | 0,46 | N581A | 0,42 | N581L | 0,32 | N581D | 0,29 | N581C | 0,13 | |||
N581R | 0,00 | |||||||||||||||||
584 | S | B21 | S584K | 1,14 | S584G | 1,11 | S584A | 1,00 | S584Q | 0,90 | S584V | 0,81 | S584C | 0,78 | S584N | 0,67 | S584Y | 0,66 |
S584L | 0,66 | S584H | 0,65 | S584T | 0,64 | S584F | 0,59 | S584I | 0,54 | S584M | 0,41 | S584W | 0,38 | S584D | 0,31 | |||
S584E | 0,21 | S584P | 0,12 | |||||||||||||||
585 | S | 258 | S585E | 1,11 | S585Y | 1,09 | S585G | 0,93 | S585P | 0,79 | S585A | 0,74 | S585D | 0,67 | S585C | 0,60 | S585V | 0,47 |
590 | T | B25 | T590K | 1,00 | T590V | 0,98 | T590M | 0,73 | T590W | 0,72 | T590L | 0,54 | T590R | 0,53 | T590E | 0,52 | T590P | 0,15 |
591 | A | 258 | A591I | 1,17 | A591G | 1,17 | A591M | 0,94 | ||||||||||
592 | T | 258 | T592E | 1,04 | T592C | 0,66 | ||||||||||||
593 | S | B21 | S593A | 1,10 | S593F | 1,07 | S593L | 1,06 | S593Q | 1,06 | S593T | 1,00 | S593M | 0,96 | S593H | 0,92 | S593D | 0,89 |
S593I | 0,87 | S593W | 0,84 | S593E | 0,80 | S593K | 0,79 | S593N | 0,75 | S593P | 0,75 | S593C | 0,59 | |||||
595 | D | B21 | D595L | 1,19 | D595W | 1,18 | D595Q | 1,13 | D595C | 0,91 | D595E | 0,09 | ||||||
596 | N | B21 | N596F | 1,14 | N596C | 1,10 | N596Q | 1,06 | N596M | 0,98 | N596E | 0,93 | N596R | 0,92 | N596K | 0,92 | ||
598 | Q | B21 | Q598H | 1,03 | Q598F | 1,03 | Q598Y | 1,02 | Q598R | 0,95 | Q598L | 0,92 | Q598E | 0,89 | Q598W | 0,88 | Q598N | 0,83 |
Q598P | 0,82 | Q598M | 0,80 | Q598A | 0,76 | Q598T | 0,60 | Q598K | 0,58 | Q598S | 0,58 | Q598C | 0,55 | |||||
599 | S | B25 | S599G | 1,09 | S599D | 1,07 | S599I | 0,85 | S599W | 0,81 | S599E | 0,61 | ||||||
600 | R | B21 | R600G | 0,88 | R600S | 0,85 | R600M | 0,77 | R600A | 0,74 | R600E | 0,70 | R600T | 0,69 | R600K | 0,69 | R600F | 0,66 |
R600V | 0,65 | R600Q | 0,60 | R600I | 0,57 | R600H | 0,56 | R600C | 0,54 | R600L | 0,54 | R600P | 0,47 | R600N | 0,45 | |||
R600Y | 0,36 | R600D | 0,34 | R600W | 0,31 | |||||||||||||
601 | D | B21 | N601Q | 1,14 | N601W | 1,07 | N601T | 1,00 | N601A | 0,96 | N601S | 0,81 | N601H | 0,79 | N601L | 0,78 | N601K | 0,76 |
N601R | 0,73 | N601C | 0,73 | N601I | 0,64 | N601D | 0,58 | |||||||||||
602 | F | B25 | F602L | 1,15 | F602V | 0,75 | F602Y | 0,70 | F602K | 0,59 | ||||||||
605 | F | 258 | F605H | 1,12 | F605T | 0,96 | F605L | 0,83 | ||||||||||
606 | E | B21 | E606C | 1,15 | E606V | 1,03 | E606S | 0,97 | E606D | 0,85 | E606P | 0,39 | ||||||
607 | S | 258 | S607N | 1,14 | S607H | 1,08 | S607K | 1,01 | S607M | 1,01 | S607W | 1,01 | S607Y | 0,90 | S607P | 0,86 | S607F | 0,83 |
S607L | 0,75 | |||||||||||||||||
608 | T | 258 | T608M | 1,19 | T608H | 1,16 | T608E | 1,05 | T608D | 0,98 | T608P | 0,68 | T608I | 0,53 | T608C | 0,53 | T608N | 0,50 |
609 | N | B25 | N609D | 0,74 | ||||||||||||||
612 | T | B25 | T612A | 1,17 | T612L | 1,09 | T612K | 0,97 | T612Y | 0,86 | T612W | 0,84 | T612I | 0,53 | ||||
613 | S | B25 | S613E | 1,01 | S613L | 0,98 | S613A | 0,97 | ||||||||||
614 | A | B25 | A614W | 1,15 | A614P | 1,14 | A614Q | 0,98 | ||||||||||
617 | N | B25 | N617E | 1,19 | N617S | 1,14 | N617F | 0,96 | ||||||||||
618 | V | 258 | V618F | 1,17 | V618Y | 1,11 | V618M | 1,10 | V618A | 1,10 | V618P | 1,07 | V618E | 1,05 | V618K | 1,03 | V618I | 0,94 |
V618S | 0,70 | V618C | 0,69 | V618Q | 0,67 | |||||||||||||
620 | G | B25 | G620S | 0,38 | G620A | 0,35 | G620E | 0,27 | G620L | 0,25 | G620F | 0,23 | G620K | 0,23 | G620V | 0,23 | G620Q | 0,22 |
G620W | 0,21 | G620R | 0,20 | G620M | 0,15 | |||||||||||||
622 | R | B25 | R622H | 0,28 | R622W | 0,20 | R622C | 0,19 | R622E | 0,09 | ||||||||
623 | N | B25 | N623S | 1,19 | N623A | 1,14 | N623D | 0,88 | N623H | 0,85 | N623C | 0,70 | N623V | 0,68 | N623T | 0,65 | N623Q | 0,61 |
N623I | 0,57 | |||||||||||||||||
624 | F | B25 | F624M | 1,14 | F624E | 0,86 | F624V | 0,76 | F624S | 0,73 | F624D | 0,68 | F624C | 0,59 | F624H | 0,56 | F624R | 0,44 |
F624T | 0,33 | |||||||||||||||||
626 | E | 258 | E626D | 1,18 | E626L | 1,10 | E626F | 1,09 | E626C | 0,66 | E626M | 0,08 | ||||||
628 | A | B25 | A628E | 1,15 | A628T | 1,14 | ||||||||||||
629 | G | 258 | G629C | 1,18 | G629L | 1,15 | G629H | 1,08 | G629I | 1,07 | G629V | 1,05 | G629K | 1,03 | G629D | 0,87 | G629W | 0,86 |
G629F | 0,85 | G629Y | 0,81 | |||||||||||||||
630 | V | B25 | V630I | 1,12 | V630T | 1,08 | V630L | 0,82 | V630G | 0,76 | V630R | 0,66 | V630D | 0,64 | V630S | 0,55 | ||
641 | T | B25 | T641M | 1,18 | T641C | 0,98 | T641K | 0,97 | ||||||||||
643 | T | B25 | T643V | 1,14 | T643P | 0,98 | T643E | 0,93 | T643F | 0,70 | ||||||||
645 | E | B25 | E645R | 1,16 | E645F | 1,13 | E645D | 0,75 | ||||||||||
646 | A | B25 | A646N | 1,08 | A646Q | 1,06 |
Пример 5 - временная экспрессия в листьях маиса и биологический анализ с насекомыми
Полинуклеотиды, кодирующие вариантные полипептиды Cry1B, клонировали в векторы для временной экспрессии под управлением убиквитинового промотора маиса (Christensen и Quail, (1996) Transgenic Research 5:213-218) и дуплицированного варианта промотора из вируса мозаики мирабилис (DMMV PRO; Dey и Maiti, (1999) Plant Mol. Biol., 40:771-82). Из уровня техники хорошо известен способ инфильтрации агробактериями путем введения клеточной суспензии Agrobacterium в растительные клетки интактных тканей с тем, чтобы можно было измерить или изучить воспроизводимые инфицирование и дальнейшую экспрессию трансгена, полученного из растения (Kapila, et. al., (1997) Plant Science 122:101-108). Вкратце, проводили инфильтрацию агробактериями молодых проростков маиса с использованием нормализованных культур бактериальных клеток тестовых и контрольных штаммов. Листовые диски получали из каждого проростка и заражали WCRW (Diabrotica virgifera) вместе с соответствующими контролями. Степень поедания зеленых тканей листа оценивали через 2 дня после заражения.
Пример 6 - временная экспрессия в листьях кустовой фасоли и биологический анализ с насекомыми
Для экспрессии в сое можно сконструировать оптимизированные кодирующие последовательности. Из уровня техники хорошо известен способ инфильтрации агробактериями путем введения клеточной суспензии Agrobacterium в растительные клетки интактных тканей с тем, чтобы можно было измерить или изучить воспроизводимые инфицирование и дальнейшую экспрессию трансгена, полученного из растения (Kapila, et. al., (1997) Plant Science 122:101-108). Вкратце, проводили инфильтрацию агробактериями вырезанных листовых дисков кустовой фасоли с использованием нормализованных культур бактериальных клеток тестовых и контрольных штаммов. Через 4 дня листовые диски заражали по отдельности 2 новорожденными особями соевой совки (SBL) (Chrysodeixis includens), кукурузной совки, (CEW) (Helicoverpa zea), гусеницы бархатных бобов (VBC) (Anticarsia gemmatalis) или травяной совки (Spodoptera frugiperda). Контрольные листовые диски получали с Agrobacterium, содержащими только вектор экспрессии флуоресцентного маркера DsRed2 (Clontech™, 1290 Terra Bella Ave. Маунтин-Вью, Калифорния 94043). Листовые диски от не подвергнутых инфильтрации растений включали в качестве второго контроля. Поедание зеленых тканей листа оценивали через три дня после заражения и присваивали баллы от 0 до 9.
Пример 7 - опосредованная Agrobacterium трансформация маиса и регенерация трансгенных растений
Для трансформации маиса, опосредованной Agrobacterium, с использованием полинуклеотидной последовательности согласно настоящему раскрытию, использовали способ согласно Zhao (патент США № 5981840 и PCT публикация патентной заявки WO98/32326; содержание которых включено в данный документ посредством ссылки). Вкратце, незрелые зародыши выделяли из маиса и зародышей и эмбрионы приводили в контакт с суспензией Agrobacterium в условиях, при которых бактерии были способны переносить нуклеотидную последовательность токсина по меньшей мере в одну клетку по меньшей мере одного из незрелых зародышей (стадия 1: стадия инфицирования). На этой стадии незрелые зародыши можно погружать в суспензию Agrobacterium для инициации инокуляции. Зародыши в течение определенного времени культивировали совместно с Agrobacterium (стадия 2: стадия совместного культивирования). Незрелые зародыши можно культивировать на твердой среде после стадии инфицирования. После периода совместного культивирования предполагалась необязательная стадия "покоя". На этой стадии покоя зародыши инкубировали в присутствии по меньшей мере одного антибиотика, который, как известно, ингибирует рост Agrobacterium, без добавления средства для отбора к растительным трансформантам (стадия 3: стадия покоя). Незрелые зародыши можно культивировать на твердой среде с антибиотиком, но без средства для отбора, для исключения Agrobacterium и в течение фазы покоя для инфицированных клеток. Затем инокулированные зародыши культивировали на среде, содержащей средство для отбора, и выделяли растущий трансформированный каллюс (стадия 4: стадия отбора). Незрелые зародыши культивировали на твердой среде со средством для отбора, что приводило к выборочному росту трансформированных клеток. Затем каллюс регенерировали c получением растений (стадия 5: стадия регенерации), и каллюсы, выращенные на селективной среде, культивировали на твердой среде для регенерации растений.
Пример 8. Трансформация зародышей сои
Зародыши сои подвергали бомбардировке плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность токсина, функционально связанную с подходящим промотором, что указано ниже. Для индукции соматических зародышей семядоли длиной 3-5 мм, вырезанные из поверхностно-стерилизованных, незрелых семян соответствующего сорта сои, культивировали на свету или в темноте при 26°C на соответствующей агаровой среде в течение шести-десяти недель. Соматические зародыши, дающие вторичные зародыши, затем вырезали и помещали в подходящую жидкую среду. После повторного отбора в отношении кластеров соматических зародышей, деление клеток в которых уже привело к зародышам на стадии глобулы, суспензии поддерживали, как описано ниже.
Соевые зародышевые суспензионные культуры можно поддерживать в 35 мл жидкой среды на ротационном шейкере при 150 об./мин. при 26°C с флюоресцентными источниками света согласно схеме день/ночь 16:8 часов. Культуры пересевали каждые две недели путем инокуляции примерно 35 мг ткани в 35 мл жидкой среды.
Соевые зародышевые суспензионные культуры затем можно трансформировать при помощи способа бомбардировки генной пушкой (Klein, et al., (1987) Nature (London) 327:70-73, патент США № 4,945,050). Для этих трансформаций можно использовать устройство Biolistic PDS1000/HE от Du Pont (гелиевая модификация).
Селектируемый маркерный ген, который можно использовать для облегчения трансформации сои, без ограничения предусматривал следующее: промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812), ген гигромицин-фосфотрансферазы из плазмиды pJR225 (из E. coli; Gritz, et al., (1983) Gene 25:179-188) и 3'-участок из гена нопалин-синтазы из T-ДНК Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность токсина (например, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 или оптимизированную последовательность маиса), функционально связанную с подходящим промотором, можно выделять в виде рестрикционного фрагмента. Этот фрагмент затем можно вставить в уникальный рестрикционный сайт вектора, несущего маркерный ген.
К 50 мкл суспензии 1 мкм золотых частиц при концентрации 60 мг/мл добавляли (по порядку): 5 мкл ДНК (1 мкг/мкл), 20 мкл спермидина (0,1 М) и 50 мкл CaCl2 (2,5 М). Препарат частиц затем перемешивали в течение трех минут, центрифугировали с использованием микроцентрифуги в течение 10 секунд и удаляли супернатант. Покрытые ДНК частицы затем однократно промывали в 400 мкл 70% этанола и ресуспендировали в 40 мкл безводного этанола. Суспензию ДНК/частицы можно обрабатывать ультразвуком три раза в течение одной секунды. Пять микролитров золотых частиц, покрытых ДНК, затем загружали на каждый диск-макроноситель.
Примерно 300-400 мг двухнедельной суспензионной культуры помещали в пустую 60×15 мм чашку Петри, и остаточную жидкость удаляли из ткани при помощи пипетки. Для каждого трансформационного эксперимента обычно подвергали бомбардировке приблизительно 5-10 плашек с тканью. Устанавливали давление разрыва мембраны 1100 фунтов на кв. дюйм, и в камере создавали вакуум с понижением давления до 28 дюймов ртутного столба. Ткань располагали на расстоянии приблизительно 3,5 дюйма от задерживающего экрана и бомбардировали три раза. После бомбардировки ткань можно разделить пополам, и поместить обратно в жидкость, и культивировать, как описано выше.
Через пять-семь дней после бомбардировки жидкую среду можно заменить свежей средой, а через одиннадцать-двенадцать дней после бомбардировки заменить свежей средой, содержащей 50 мг/мл гигромицина. Эту селективную среду можно обновлять еженедельно. Через семь-восемь недель после бомбардировки можно наблюдать зеленую трансформированную ткань, растущую из нетрансформированных, некрозных зародышевых кластеров. Выделенную зеленую ткань отбирали и инокулировали в отдельные колбы для получения новых, клонально размноженных, трансформированных зародышевых суспензионных культур. Каждую новую линию можно рассматривать как независимый объект трансформации. Эти суспензии затем можно пересевать и поддерживать в виде кластеров незрелых зародышей или регенерировать в целые растения путем созревания и проращивания отдельных соматических зародышей.
Все публикации, патенты и заявки на патент, упомянутые в данном описании, ориентированы на уровень специалиста в области техники, к которой относится настоящее раскрытие. Все публикации, патенты и заявки на патент включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент специально и отдельно была включена посредством ссылки.
Хотя в целях ясности понимания вышеприведенное раскрытие было довольно подробно описано посредством иллюстрации и примеров, очевидно, что на практике можно осуществлять определенные изменения и модификации в пределах объема вариантов осуществления.
Claims (211)
1. Вариантный полипептид Cry1B, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую 1-26 аминокислотных замен по сравнению с полипептидом Cry1B, выбранным из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 52 или SEQ ID NO: 54,
где вариантный полипептид Cry1B обладает повышенной инсектицидной активностью против кукурузной совки и/или травяной совки по сравнению с соответствующим эталонным полипептидом Cry1B и
где указанные замены находятся в положении, соответствующем аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 47, выбранном из:
положение 50, где указанная аминокислотная замена выбрана из R, I, D, A, H, V, S, F, V, K и N;
положение 57, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, R, L, N, G и D;
положение 65, где указанная аминокислотная замена выбрана из Q, A, S и G;
положение 67, где указанная аминокислотная замена выбрана из M, F и I;
положение 68, где указанная аминокислотная замена выбрана из A, R и F;
положение 70, где указанная аминокислотная замена выбрана из E, W и H;
положение 71, где указанная аминокислотная замена представляет собой S;
положение 73, где указанная аминокислотная замена выбрана из S и G;
положение 74, где указанная аминокислотная замена выбрана из I, E, S, R, V и D;
положение 76, где указанная аминокислотная замена выбрана из T, S, Y, V, D и R;
положение 77, где указанная аминокислотная замена выбрана из N, D, G, L, I, H, P, A, T, M, C и S;
положение 79, где указанная аминокислотная замена выбрана из S, V, T, L, R, I, P, N, Q и K;
положение 80, где указанная аминокислотная замена выбрана из Q, K, G, E, R, M, N, C, W, Y и D;
положение 82, где указанная аминокислотная замена представляет собой F;
положение 83, где указанная аминокислотная замена выбрана из E, D, G, A, K, H, R, Y и L;
положение 87, где указанная аминокислотная замена выбрана из D, K, N, C, W и H;
положение 91, где указанная аминокислотная замена выбрана из S, Y, T и D;
положение 92, где указанная аминокислотная замена выбрана из E, G, F, V, L и T;
положение 93, где указанная аминокислотная замена выбрана из H, D и I;
положение 94, где указанная аминокислотная замена выбрана из L, H, T и S;
положение 95, где указанная аминокислотная замена выбрана из G, Q, V и F;
положение 106, где указанная аминокислотная замена выбрана из I, A, F, G, H, C, K, V, R и S;
положение 108, где указанная аминокислотная замена выбрана из L, M и T;
положение 109, где указанная аминокислотная замена выбрана из S, V и N;
положение 110, где указанная аминокислотная замена выбрана из T, R, V, F и H;
положение 111, где указанная аминокислотная замена выбрана из H, L, S, M, R, A, K, Y и E;
положение 112, где указанная аминокислотная замена представляет собой L;
положение 113, где указанная аминокислотная замена выбрана из L, V, S, N и K;
положение 114, где указанная аминокислотная замена выбрана из L, T, M, H, F, Y, A, S и V;
положение 115, где указанная аминокислотная замена представляет собой P;
положение 118, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, T, E, D, F, V и G;
положение 119, где указанная аминокислотная замена выбрана из A, M, S, K, H, E, R и V;
положение 122, где указанная аминокислотная замена выбрана из R, I, F, N, G и T;
положение 123, где указанная аминокислотная замена представляет собой K;
положение 125, где указанная аминокислотная замена выбрана из N, R и E;
положение 129, где указанная аминокислотная замена выбрана из K, W, L, P и V;
положение 136, где указанная аминокислотная замена выбрана из I, F и I;
положение 140, где указанная аминокислотная замена представляет собой E;
положение 143, где указанная аминокислотная замена выбрана из S, R, G, Y, M, Q, L, W, T, A, N и P;
положение 144, где указанная аминокислотная замена выбрана из M, A и T;
положение 145, где указанная аминокислотная замена выбрана из N, P, A, L и S;
положение 146, где указанная аминокислотная замена выбрана из W, T, H и V;
положение 147, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, R, D и S;
положение 148, где указанная аминокислотная замена выбрана из F, W, P, N и L;
положение 149, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, A, S и L;
положение 158, где указанная аминокислотная замена представляет собой F;
положение 159, где указанная аминокислотная замена представляет собой V;
положение 160, где указанная аминокислотная замена представляет собой V;
положение 166, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, E, C, I и T;
положение 167, где указанная аминокислотная замена выбрана из T, M, Q, L и A;
положение 173, где указанная аминокислотная замена выбрана из F и T;
положение 177, где указанная аминокислотная замена выбрана из C, S, T и P;
положение 178, где указанная аминокислотная замена представляет собой K;
положение 179, где указанная аминокислотная замена выбрана из I и L;
положение 180, где указанная аминокислотная замена выбрана из A, S и L, M;
положение 201, где указанная аминокислотная замена представляет собой V;
положение 206, где указанная аминокислотная замена выбрана из L, I, T и W;
положение 209, где указанная аминокислотная замена выбрана из E, R, D, L, V и C;
положение 210, где указанная аминокислотная замена выбрана из P, T, I и R;
положение 211, где указанная аминокислотная замена выбрана из I, R, G, T, P и L;
положение 213, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, T, L, M, Q, N и G;
положение 214, где указанная аминокислотная замена представляет собой W;
положение 218, где указанная аминокислотная замена выбрана из T, A, H, S, I, V, Y, W и D;
положение 219, где указанная аминокислотная замена представляет собой N;
положение 221, где указанная аминокислотная замена выбрана из L, Y, V, K, I, D, G, H, W, R и T;
положение 222, где указанная аминокислотная замена выбрана из G, M, K, T, D и I;
положение 225, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, Q, M, F, L, G, I, Y, C и N;
положение 226, где указанная аминокислотная замена выбрана из D, S, V, C, Y, R и A;
положение 230, где указанная аминокислотная замена выбрана из A, L и S;
положение 233, где указанная аминокислотная замена выбрана из K, D, Q, G, I, A и Y;
положение 234, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, M, L, I, A, R, F, Y и S;
положение 236, где указанная аминокислотная замена выбрана из E, K, S, T и L;
положение 240, где указанная аминокислотная замена выбрана из Y, A, M, S, T, G, K, F, L, R, W и C;
положение 241, где указанная аминокислотная замена выбрана из S, I, W, M, K, Y, V, L и C;
положение 242, где указанная аминокислотная замена выбрана из P и V;
положение 243, где указанная аминокислотная замена выбрана из M, V, T, C, K, I, S и Q;
положение 245, где указанная аминокислотная замена выбрана из Q, Y, K, G, A, I, W, H, S, M, D, N, V, R и F;
положение 246, где указанная аминокислотная замена выбрана из T, S, G и Q;
положение 247, где указанная аминокислотная замена выбрана из E, S, G и P;
положение 248, где указанная аминокислотная замена выбрана из S, N, T, L, Y, V, R и F;
положение 252, где указанная аминокислотная замена выбрана из N, A и F;
положение 277, где указанная аминокислотная замена выбрана из Q, G и V;
положение 280, где указанная аминокислотная замена выбрана из H, C и T;
положение 281, где указанная аминокислотная замена выбрана из Q, M, R, K, S, H и A;
положение 303, где указанная аминокислотная замена выбрана из N и P;
положение 306, где указанная аминокислотная замена представляет собой G;
положение 360, где указанная аминокислотная замена выбрана из S, N, T, Y и M;
положение 362, где указанная аминокислотная замена выбрана из Y, H, W, K, I, D, V, A, L, G и E;
положение 367, где указанная аминокислотная замена выбрана из H, Q, N, W, T, L, Y, I и A;
положение 406, где указанная аминокислотная замена представляет собой M;
положение 407, где указанная аминокислотная замена представляет собой W;
положение 418, где указанная аминокислотная замена выбрана из K и T;
положение 425, где указанная аминокислотная замена выбрана из P и G;
положение 427, где указанная аминокислотная замена представляет собой Y;
положение 429, где указанная аминокислотная замена представляет собой I;
положение 431, где указанная аминокислотная замена выбрана из L, H, G и A;
положение 435, где указанная аминокислотная замена выбрана из Y, H и L;
положение 439, где указанная аминокислотная замена выбрана из M и Q;
положение 447, где указанная аминокислотная замена выбрана из N, V, I, S, L, A, E и M;
положение 473, где указанная аминокислотная замена выбрана из T, G, A, S, M, N, K, D и Y;
положение 476, где указанная аминокислотная замена выбрана из Y, H, G, L, S, F и M;
положение 477, где указанная аминокислотная замена выбрана из S и A;
положение 478, где указанная аминокислотная замена выбрана из G и K;
положение 479, где указанная аминокислотная замена представляет собой V;
положение 490, где указанная аминокислотная замена представляет собой Q;
положение 495, где указанная аминокислотная замена представляет собой N;
положение 499, где указанная аминокислотная замена выбрана из R, S, G, M, C, V, P и W;
положение 502, где указанная аминокислотная замена выбрана из K, V, A, T, N, E, L, Q, P, H, R, F, S и Y;
положение 509, где указанная аминокислотная замена представляет собой T;
положение 512, где указанная аминокислотная замена выбрана из Y, P, M, R, K, G, S, Q, I и W;
положение 513, где указанная аминокислотная замена выбрана из G, V, P, L и H;
положение 515, где указанная аминокислотная замена представляет собой H;
положение 517, где указанная аминокислотная замена выбрана из A, H и S;
положение 518, где указанная аминокислотная замена выбрана из D, A, Y, K, V, L, G, H, E, R, T и C;
положение 520, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, R, Y, C, K, M, E, L, F, S и A;
положение 521, где указанная аминокислотная замена выбрана из G, L, V, A, D, I, Q, F, P, N и M;
положение 526, где указанная аминокислотная замена представляет собой L;
положение 532, где указанная аминокислотная замена выбрана из K, C, W, S, L, V, H и G;
положение 534, где указанная аминокислотная замена выбрана из S, Y, Q, W, E, H, D и L;
положение 535, где указанная аминокислотная замена выбрана из M, Q, E, K, F, D, R, L, A, S и I;
положение 537, где указанная аминокислотная замена выбрана из W, E, F, A, K, S, Q, Y, R, D, V, N, H и T;
положение 538, где указанная аминокислотная замена выбрана из M, G, I, H, T, S, A, V, W, L, Q, I, D и E;
положение 541, где указанная аминокислотная замена выбрана из Y, W и F;
положение 545, где указанная аминокислотная замена представляет собой F;
положение 547, где указанная аминокислотная замена выбрана из A, S, G, I, M и Q;
положение 551, где указанная аминокислотная замена выбрана из C, R, A, S, D и Y;
положение 552, где указанная аминокислотная замена выбрана из T, V и W;
положение 553, где указанная аминокислотная замена выбрана из Q, D, R, E, A, F, L, P, G, W, S и T;
положение 554, где указанная аминокислотная замена выбрана из R, D, H, N и G;
положение 555, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, M, I и W;
положение 556, где указанная аминокислотная замена выбрана из A, W, G, D, C и P;
положение 557, где указанная аминокислотная замена выбрана из I, R, G, S, Q, M, V, A и C;
положение 558, где указанная аминокислотная замена выбрана из Y, K, T, L, N, G, S, E, I, D, F, P, V, M и H;
положение 559, где указанная аминокислотная замена представляет собой W;
положение 563, где указанная аминокислотная замена выбрана из N, L, I и A;
положение 564, где указанная аминокислотная замена выбрана из H, V, W, I, K, C, S и A;
положение 565, где указанная аминокислотная замена представляет собой F;
положение 568, где указанная аминокислотная замена выбрана из C, A, E, F, R, G, L, S, W и N;
положение 569, где указанная аминокислотная замена выбрана из I, M, G и S;
положение 570, где указанная аминокислотная замена выбрана из M, F, W и T;
положение 571, где указанная аминокислотная замена выбрана из G, V, T, C и L;
положение 572, где указанная аминокислотная замена выбрана из H, P, R, I, K, F, S, A, V, W и M;
положение 573, где указанная аминокислотная замена выбрана из A, T и G;
положение 574, где указанная аминокислотная замена представляет собой R;
положение 577, где указанная аминокислотная замена выбрана из R, F, K, M, V, A, T, H, G и I;
положение 581, где указанная аминокислотная замена выбрана из S и K;
положение 582, где указанная аминокислотная замена представляет собой V;
положение 583, где указанная аминокислотная замена представляет собой S;
положение 584, где указанная аминокислотная замена представляет собой R;
положение 585, где указанная аминокислотная замена выбрана из R, T, K, H, Q, L, W, N, M, F и I;
положение 586, где указанная аминокислотная замена выбрана из M, Y, P, A, S, K, R, F, G, V, Q, N, L, W и T;
положение 587, где указанная аминокислотная замена выбрана из H, C, N, S, D, R, A, T, K, E, W, L, Y и F;
положение 590, где указанная аминокислотная замена выбрана из A, D, F, S и G;
положение 591, где указанная аминокислотная замена выбрана из H, V, N, T, D, R, S, K, C, E, W, L, Y, F, P и Q;
положение 592, где указанная аминокислотная замена выбрана из Q, M, A, Y, N, K, P, S, D, I, G, F, V и W;
положение 593, где указанная аминокислотная замена выбрана из Y, G, R и V;
положение 595, где указанная аминокислотная замена выбрана из R, G, H, N, V, F, K, T, Y, I, M, A и P;
положение 596, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, T, I, S, G, L, W, Y, H, P и D;
положение 598, где указанная аминокислотная замена выбрана из V, G, D и I;
положение 599, где указанная аминокислотная замена выбрана из C, Q, L, Y, T, V, A и P;
положение 601, где указанная аминокислотная замена выбрана из Y, F, V, G, M и E;
положение 602, где указанная аминокислотная замена представляет собой M;
положение 603, где указанная аминокислотная замена выбрана из M, A, Y, R, S, L, W, D и T;
положение 605, где указанная аминокислотная замена выбрана из S, W, R, M, A, I, C, V, K, D, Y, N, Q, G, E и P;
положение 606, где указанная аминокислотная замена выбрана из R, H, K, F, Q, W, G, Y, M, T, A, I, L и N;
положение 607, где указанная аминокислотная замена выбрана из R, C, T, I, Q, G, D, E и V;
положение 608, где указанная аминокислотная замена выбрана из R, S, V, L, F, G, Y, A, K, W и Q;
положение 609, где указанная аминокислотная замена выбрана из G, P, L, R, S, V, F и I;
положение 610, где указанная аминокислотная замена выбрана из G, F, P и L;
положение 611, где указанная аминокислотная замена выбрана из L, K, G, W и V;
положение 612, где указанная аминокислотная замена выбрана из F, H, G, E, N, D и P;
положение 613, где указанная аминокислотная замена выбрана из M, T, W, V, N, R и Y;
положение 614, где указанная аминокислотная замена выбрана из M, S, L, H, V, R, G, Y и D;
положение 618, где указанная аминокислотная замена выбрана из N, H, W, R, G, L, D и T;
положение 624, где указанная аминокислотная замена выбрана из A и M;
положение 626, где указанная аминокислотная замена выбрана из K, G, R, T, H, A, N, I, Y, Q, P и S;
положение 628, где указанная аминокислотная замена выбрана из F, K, Q, S, R, G, L, I и D;
положение 629, где указанная аминокислотная замена выбрана из H, M, S, R, Q, E, T, P и A;
положение 641, где указанная аминокислотная замена выбрана из P, H, A, L, Q, Y, E, I, S, V, D и G;
положение 643, где указанная аминокислотная замена выбрана из L, A, Q, H, S, D, M, C и R;
положение 645, где указанная аминокислотная замена выбрана из T, M, L, Y, A, N, V, P, I, W, C, S и
положение 646, где указанная аминокислотная замена выбрана из S, Y, D, E, M, F, H, V, W и I.
2. Вариантный полипептид Cry1B, обладающий инсектицидной активностью против кукурузной совки и/или травяной совки, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45.
3. Вариантный полипептид Cry1B по п. 2, где вариантный полипептид Cry1B содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45.
4. Вариантный полипептид Cry1B по п. 2, где вариантный полипептид Cry1B содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45.
5. Вариантный полипептид Cry1B по п. 2, где вариантный полипептид Cry1B содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 29.
6. Рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий вариантный полипептид Cry1B по любому из пп. 1-5.
7. Рекомбинантный полинуклеотид по п. 6, где последовательность нуклеиновой кислоты была оптимизирована для экспрессии в растении.
8. Рекомбинантный полинуклеотид по п. 7, где последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность, имеющую предпочтительные для растений кодоны, которые были сконструированы для экспрессии в растении.
9. Рекомбинантный полинуклеотид по п. 8, где последовательность нуклеиновой кислоты была оптимизирована для экспрессии в маисе или сое.
10. Рекомбинантный полинуклеотид по п. 6, где полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты с SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 46.
11. ДНК-конструкция для получения трансгенных растений, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 6-10, функционально связанный с гетерологичным регуляторным элементом.
12. Клетка-хозяин для экспрессирования полинуклеотида, содержащая ДНК-конструкцию по п. 11.
13. Клетка-хозяин по п. 12, где клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку.
14. Клетка-хозяин по п. 13, где клетка-хозяин представляет собой растительную клетку.
15. Клетка-хозяин по п. 14, где клетка-хозяин представляет собой клетку сои или маиса.
16. Трансгенное растение, обладающее инсектицидной активностью против кукурузной совки и/или травяной совки, для экспрессирования ДНК-конструкции, содержащее ДНК-конструкцию по п. 11.
17. Трансгенное растение по п. 16, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из маиса, сорго, пшеницы, капусты, подсолнечника, томата, разновидностей крестоцветных, разновидностей перца, картофеля, хлопчатника, риса, сои, сахарной свеклы, сахарного тростника, табака, ячменя и масличного рапса.
18. Семя для получения трансгенного растения, содержащее ДНК-конструкцию по п. 11.
19. Сельскохозяйственная композиция, содержащая вариантный полипептид Cry1B по любому из пп. 1-5 и носитель или вспомогательное средство.
20. Композиция по п. 19, где композиция содержит от 1 до 99% по весу вариантного полипептида Cry1B.
21. Способ контроля популяции чешуекрылого вредителя, предусматривающий приведение указанной популяции в контакт с пестицидно эффективным количеством вариантного полипептида Cry1B по любому из пп. 1-5, где указанный чешуекрылый вредитель выбран из кукурузного мотылька, кукурузной совки и травяной совки.
22. Способ уничтожения чешуекрылого вредителя, предусматривающий приведение указанного вредителя в контакт с пестицидно эффективным количеством вариантного полипептида Cry1B по любому из пп. 1-5 или питание им указанного вредителя, где указанный чешуекрылый вредитель выбран из кукурузного мотылька, кукурузной совки и травяной совки.
23. Способ получения полипептида с инсектицидной активностью, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п. 12 в условиях, при которых экспрессируется полинуклеотид, кодирующий полипептид.
24. Растение, обладающее инсектицидной активностью против кукурузной совки и/или травяной совки, для экспрессирования ДНК-конструкции, имеющее стабильно встроенную в его геном ДНК-конструкцию по п. 11.
25. Способ защиты растения от насекомого-вредителя, предусматривающий введение в указанное растение ДНК-конструкции по п. 11, где указанный чешуекрылый вредитель выбран из кукурузного мотылька, кукурузной совки и травяной совки.
26. Способ по п. 25, где вариантный полипептид Cry1B обладает повышенной инсектицидной активностью против кукурузной совки и/или травяной совки по сравнению с полипептидом с SEQ ID NO: 47.
27. Способ по п. 25 или 26, где насекомое-вредитель является устойчивым к инсектицидному полипептиду, отличному от Cry1B.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462064877P | 2014-10-16 | 2014-10-16 | |
US62/064,877 | 2014-10-16 | ||
PCT/US2015/055491 WO2016061197A1 (en) | 2014-10-16 | 2015-10-14 | Insecticidal polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017116796A RU2017116796A (ru) | 2018-11-19 |
RU2017116796A3 RU2017116796A3 (ru) | 2019-05-14 |
RU2737538C2 true RU2737538C2 (ru) | 2020-12-01 |
Family
ID=55747257
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017116796A RU2737538C2 (ru) | 2014-10-16 | 2015-10-14 | Инсектицидные полипептиды, обладающие улучшенным спектром активности, и их применения |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20170226164A1 (ru) |
EP (1) | EP3207050A4 (ru) |
CN (2) | CN107074917B (ru) |
AR (1) | AR102284A1 (ru) |
BR (1) | BR112017007927A2 (ru) |
CA (1) | CA2963555A1 (ru) |
MX (1) | MX2017004814A (ru) |
PH (1) | PH12017500679A1 (ru) |
RU (1) | RU2737538C2 (ru) |
UA (1) | UA125168C2 (ru) |
WO (1) | WO2016061197A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201702162B (ru) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2986265A1 (en) | 2015-06-16 | 2016-12-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
US11028407B2 (en) | 2016-04-19 | 2021-06-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof |
US11008585B2 (en) | 2016-05-04 | 2021-05-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
CN109312359A (zh) | 2016-06-16 | 2019-02-05 | 先锋国际良种公司 | 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法 |
WO2018013333A1 (en) | 2016-07-12 | 2018-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods to control insect pests |
BR112019011706A2 (pt) | 2016-12-12 | 2019-10-15 | Syngenta Participations Ag | proteínas pesticidas manipuladas e métodos de controle de pragas de plantas |
BR112019024827A2 (pt) * | 2017-05-26 | 2020-06-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Construto de dna, planta transgênica ou progênie da mesma, composição e método para controlar uma população de pragas de insetos |
US20200165626A1 (en) | 2017-10-13 | 2020-05-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Virus-induced gene silencing technology for insect control in maize |
CN108330132B (zh) * | 2018-02-07 | 2021-06-18 | 南京林业大学 | 一种人工合成cry1Ah1基因及其应用 |
JP2022523564A (ja) | 2019-03-04 | 2022-04-25 | アイオーカレンツ, インコーポレイテッド | 機械学習を使用するデータ圧縮および通信 |
WO2022015619A2 (en) | 2020-07-14 | 2022-01-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
WO2024092330A1 (pt) * | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária - Embrapa | Proteínas inseticidas quiméricas truncadas |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060112447A1 (en) * | 2002-08-29 | 2006-05-25 | Bogdanova Natalia N | Nucleotide sequences encoding cry1bb proteins for enhanced expression in plants |
WO2008145406A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-04 | Bayer Bioscience N.V. | Novel genes encoding insecticidal proteins |
RU2382822C2 (ru) * | 2003-07-07 | 2010-02-27 | Монсанто Текнолоджи, Ллс | ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВИДОВ БАКТЕРИЙ Bacillus, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
Family Cites Families (101)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ201918A (en) | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
US5380831A (en) | 1986-04-04 | 1995-01-10 | Mycogen Plant Science, Inc. | Synthetic insecticidal crystal protein gene |
US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
EP0192319B1 (en) | 1985-01-22 | 1992-07-15 | Mycogen Corporation | Cellular encapsulation of biological pesticides |
US5569597A (en) | 1985-05-13 | 1996-10-29 | Ciba Geigy Corp. | Methods of inserting viral DNA into plant material |
US4853331A (en) | 1985-08-16 | 1989-08-01 | Mycogen Corporation | Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene toxic to beetles of the order Coleoptera |
US5268463A (en) | 1986-11-11 | 1993-12-07 | Jefferson Richard A | Plant promoter α-glucuronidase gene construct |
US5608142A (en) | 1986-12-03 | 1997-03-04 | Agracetus, Inc. | Insecticidal cotton plants |
US4873192A (en) | 1987-02-17 | 1989-10-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection |
US5316931A (en) | 1988-02-26 | 1994-05-31 | Biosource Genetics Corp. | Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes |
US5990387A (en) | 1988-06-10 | 1999-11-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Stable transformation of plant cells |
US5039523A (en) | 1988-10-27 | 1991-08-13 | Mycogen Corporation | Novel Bacillus thuringiensis isolate denoted B.t. PS81F, active against lepidopteran pests, and a gene encoding a lepidopteran-active toxin |
US5023179A (en) | 1988-11-14 | 1991-06-11 | Eric Lam | Promoter enhancer element for gene expression in plant roots |
US5110732A (en) | 1989-03-14 | 1992-05-05 | The Rockefeller University | Selective gene expression in plants |
US5240855A (en) | 1989-05-12 | 1993-08-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Particle gun |
US5879918A (en) | 1989-05-12 | 1999-03-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun |
US5322783A (en) | 1989-10-17 | 1994-06-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Soybean transformation by microparticle bombardment |
ES2187497T3 (es) | 1990-04-12 | 2003-06-16 | Syngenta Participations Ag | Promotores preferentemente en tejidos. |
AU639788B2 (en) | 1990-04-26 | 1993-08-05 | Plant Genetic Systems N.V. | New bacillus thuringiensis strains and their genes encoding insecticidal toxins |
US5498830A (en) | 1990-06-18 | 1996-03-12 | Monsanto Company | Decreased oil content in plant seeds |
CA2051562C (en) | 1990-10-12 | 2003-12-02 | Jewel M. Payne | Bacillus thuringiensis isolates active against dipteran pests |
US5932782A (en) | 1990-11-14 | 1999-08-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles |
US5277905A (en) | 1991-01-16 | 1994-01-11 | Mycogen Corporation | Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate |
US5459252A (en) | 1991-01-31 | 1995-10-17 | North Carolina State University | Root specific gene promoter |
US5399680A (en) | 1991-05-22 | 1995-03-21 | The Salk Institute For Biological Studies | Rice chitinase promoter |
ATE174626T1 (de) | 1991-08-02 | 1999-01-15 | Mycogen Corp | Neuer mikroorganismus und insektizid |
JPH06510187A (ja) | 1991-08-27 | 1994-11-17 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 同翅類昆虫に対する殺虫性質を有したタンパク質及び植物保護におけるそれらの用法 |
US5723758A (en) | 1991-09-13 | 1998-03-03 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis genes encoding lepidopteran-active toxins |
UA48104C2 (ru) * | 1991-10-04 | 2002-08-15 | Новартіс Аг | Фрагмент днк, содержащий последовательность, которая кодирует инсектицидный протеин, оптимизированную для кукурузы, фрагмент днк, обеспечивающий направленную желательную для сердцевины стебля экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, фрагмент днк, обеспечивающий специфическую для пыльцы экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, рекомбинантная молекула днк, способ получения оптимизированной для кукурузы кодирующей последовательности инсектицидного протеина, способ защиты растений кукурузы по меньшей мере от одного насекомого-вредителя |
ZA927576B (en) | 1991-10-04 | 1993-04-16 | Univ North Carolina State | Pathogen-resistant transgenic plants. |
TW261517B (ru) | 1991-11-29 | 1995-11-01 | Mitsubishi Shozi Kk | |
DE69233118T2 (de) | 1991-12-04 | 2004-04-15 | E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington | Fettsäure-desaturase gene aus pflanzen |
US5324646A (en) | 1992-01-06 | 1994-06-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same |
US5428148A (en) | 1992-04-24 | 1995-06-27 | Beckman Instruments, Inc. | N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis |
US5401836A (en) | 1992-07-16 | 1995-03-28 | Pioneer Hi-Bre International, Inc. | Brassica regulatory sequence for root-specific or root-abundant gene expression |
WO1994002620A2 (en) | 1992-07-27 | 1994-02-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | An improved method of agrobacterium-mediated transformation of cultured soybean cells |
DE69333025T2 (de) | 1992-11-17 | 2004-04-29 | E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington | Für mikrosom delta 12 fettsäuredesaturase kodierende gene und verwandte enzyme von pflanzen |
AU5676394A (en) | 1992-11-20 | 1994-06-22 | Agracetus, Inc. | Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic |
IL108241A (en) | 1992-12-30 | 2000-08-13 | Biosource Genetics Corp | Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus |
DE69428290T2 (de) | 1993-01-13 | 2002-04-18 | Pioneer Hi Bred Int | Derivate von alpha-hordothionin mit höherem behalt an lysin |
US5583210A (en) | 1993-03-18 | 1996-12-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for controlling plant development |
US5849870A (en) | 1993-03-25 | 1998-12-15 | Novartis Finance Corporation | Pesticidal proteins and strains |
US5789156A (en) | 1993-06-14 | 1998-08-04 | Basf Ag | Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors |
US5814618A (en) | 1993-06-14 | 1998-09-29 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
US5322687A (en) | 1993-07-29 | 1994-06-21 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects |
US5837458A (en) | 1994-02-17 | 1998-11-17 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
US5593881A (en) | 1994-05-06 | 1997-01-14 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis delta-endotoxin |
US5633363A (en) | 1994-06-03 | 1997-05-27 | Iowa State University, Research Foundation In | Root preferential promoter |
US5736369A (en) | 1994-07-29 | 1998-04-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Method for producing transgenic cereal plants |
US5792931A (en) | 1994-08-12 | 1998-08-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Fumonisin detoxification compositions and methods |
US5608144A (en) | 1994-08-12 | 1997-03-04 | Dna Plant Technology Corp. | Plant group 2 promoters and uses thereof |
CA2160529A1 (en) | 1994-10-14 | 1996-04-15 | Toshihiko Iizuka | Bacillus strain and harmful organism controlling agents |
US5659026A (en) | 1995-03-24 | 1997-08-19 | Pioneer Hi-Bred International | ALS3 promoter |
EP0832235A1 (en) | 1995-06-02 | 1998-04-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | HIGH METHIONINE DERIVATIVES OF alfa-HORDOTHIONIN |
EP0828835A1 (en) | 1995-06-02 | 1998-03-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | HIGH THREONINE DERIVATIVES OF $g(a)-HORDOTHIONIN |
US5837876A (en) | 1995-07-28 | 1998-11-17 | North Carolina State University | Root cortex specific gene promoter |
US5981722A (en) | 1995-11-20 | 1999-11-09 | Board Of Regents For The University Of Oklahoma | Trypsin inhibitors with insecticidal properties obtained from PENTACLETHRA MACROLOBA |
US5703049A (en) | 1996-02-29 | 1997-12-30 | Pioneer Hi-Bred Int'l, Inc. | High methionine derivatives of α-hordothionin for pathogen-control |
US6072050A (en) | 1996-06-11 | 2000-06-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Synthetic promoters |
JP3441899B2 (ja) | 1996-11-01 | 2003-09-02 | 理化学研究所 | 完全長cDNAライブラリーの作成方法 |
US6232529B1 (en) | 1996-11-20 | 2001-05-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods of producing high-oil seed by modification of starch levels |
US5981840A (en) | 1997-01-24 | 1999-11-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for agrobacterium-mediated transformation |
US6218188B1 (en) | 1997-11-12 | 2001-04-17 | Mycogen Corporation | Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins |
AU760113C (en) | 1997-11-18 | 2004-04-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for genetic modification of plants |
AU745960C (en) | 1997-11-18 | 2003-09-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | A novel method for the integration of foreign DNA into eukaryoticgenomes |
AU1526199A (en) | 1997-11-18 | 1999-06-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Targeted manipulation of herbicide-resistance genes in plants |
ATE454459T1 (de) | 1997-11-18 | 2010-01-15 | Pioneer Hi Bred Int | Mobilisierung eines viralen genoms aus t-dna durch ortsspezifische rekombinationssysteme |
ES2273127T3 (es) | 1998-02-26 | 2007-05-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Promotor alfa-tubulin 3-18 del maiz. |
CA2315549A1 (en) | 1998-02-26 | 1999-09-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Family of maize pr-1 genes and promoters |
CA2329056A1 (en) | 1998-05-22 | 1999-12-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Cell cycle genes, proteins and uses thereof |
ATE309362T1 (de) | 1998-08-20 | 2005-11-15 | Pioneer Hi Bred Int | Samen-bevorzugende promotoren |
WO2000012733A1 (en) | 1998-08-28 | 2000-03-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Seed-preferred promoters from end genes |
US6518487B1 (en) | 1998-09-23 | 2003-02-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Cyclin D polynucleotides, polypeptides and uses thereof |
AU768243B2 (en) | 1998-11-09 | 2003-12-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Transcriptional activator LEC1 nucleic acids, polypeptides and their uses |
AU6702300A (en) * | 1999-08-19 | 2001-03-19 | Syngenta Participations Ag | Hybrid insecticidal toxins and nucleic acid sequences coding therefor |
BR0014516A (pt) | 1999-09-15 | 2002-07-02 | Monsanto Technology Llc | Composições e métodos de uso de delta-endotoxina do bacilo thuringiensis ativo de lepidopteran |
US7462481B2 (en) | 2000-10-30 | 2008-12-09 | Verdia, Inc. | Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes |
US6858778B1 (en) | 2000-11-07 | 2005-02-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Plants transformed with a DNA construct comprising a nucleic acid molecule encoding an 18 kD α-globulin |
US7009087B1 (en) | 2000-12-01 | 2006-03-07 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for altering the disulfide status of proteins |
US7462760B2 (en) | 2002-06-26 | 2008-12-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genes encoding plant protease-resistant pesticidal proteins and method of their use |
WO2004003148A2 (en) | 2002-06-26 | 2004-01-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Genes encoding proteins with pesticidal activity |
WO2005066202A2 (en) | 2003-12-22 | 2005-07-21 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Bacillus cry9 family members |
PL1999141T3 (pl) | 2006-03-21 | 2011-10-31 | Bayer Cropscience Nv | Nowe geny kodujące białka owadobójcze |
US8129594B2 (en) * | 2008-06-11 | 2012-03-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
US8445749B2 (en) * | 2008-09-19 | 2013-05-21 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
US20100077507A1 (en) * | 2008-09-22 | 2010-03-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity |
EA201170961A1 (ru) | 2009-01-23 | 2012-02-28 | Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. | Новый ген bacillus thuringiensis с активностью против lepidoptera |
BRPI1015333A2 (pt) | 2009-04-17 | 2016-05-24 | Dow Agrosciences Llc | "toxinas cry inseticidas dig-3" |
RU2613778C2 (ru) | 2009-10-02 | 2017-03-21 | Зингента Партисипейшнс Аг | Инсектицидные белки |
NZ601097A (en) * | 2009-12-16 | 2014-10-31 | Dow Agrosciences Llc | Insect resistance management with combinations of cry1be and cry1f proteins |
US8735560B1 (en) * | 2010-03-02 | 2014-05-27 | Monsanto Technology Llc | Multiple domain lepidopteran active toxin proteins |
US8933299B2 (en) * | 2010-08-20 | 2015-01-13 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with coleopteran activity |
CN103763916B (zh) * | 2011-02-11 | 2017-07-28 | 孟山都技术公司 | 杀虫核酸和蛋白质及其用途 |
NZ629649A (en) * | 2012-03-09 | 2017-03-31 | Vestaron Corp | Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides |
RU2015116907A (ru) | 2012-10-05 | 2016-11-27 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | ПРИМЕНЕНИЕ Cry1Ea В КОМБИНАЦИЯХ ДЛЯ БОРЬБЫ С РЕЗИСТЕНТНОЙ СОВКОЙ ТРАВЯНОЙ |
US20140242048A1 (en) * | 2013-02-25 | 2014-08-28 | Beijing Dabeinong Technology Group Co., Ltd. | Methods For Controlling Pests |
WO2014138339A2 (en) | 2013-03-07 | 2014-09-12 | Athenix Corp. | Toxin genes and methods for their use |
MX358780B (es) | 2013-08-08 | 2018-09-04 | Pioneer Hi Bred Int | Polipeptidos insecticidas con actividad de espectro amplio y usos de estos. |
CU24541B1 (es) | 2014-10-16 | 2021-08-06 | Monsanto Technology Llc | Proteínas de bacillus thuringiensis quiméricas insecticidas tóxicas o inhibidoras de plagas de lepidópteros |
US11028407B2 (en) | 2016-04-19 | 2021-06-08 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof |
-
2015
- 2015-10-14 MX MX2017004814A patent/MX2017004814A/es unknown
- 2015-10-14 RU RU2017116796A patent/RU2737538C2/ru active
- 2015-10-14 CN CN201580056225.1A patent/CN107074917B/zh active Active
- 2015-10-14 WO PCT/US2015/055491 patent/WO2016061197A1/en active Application Filing
- 2015-10-14 EP EP15850317.7A patent/EP3207050A4/en active Pending
- 2015-10-14 UA UAA201704202A patent/UA125168C2/uk unknown
- 2015-10-14 CN CN202210584952.7A patent/CN114736275A/zh active Pending
- 2015-10-14 CA CA2963555A patent/CA2963555A1/en active Pending
- 2015-10-14 BR BR112017007927A patent/BR112017007927A2/pt unknown
- 2015-10-14 US US15/518,677 patent/US20170226164A1/en not_active Abandoned
- 2015-10-15 AR ARP150103339A patent/AR102284A1/es unknown
-
2017
- 2017-03-28 ZA ZA2017/02162A patent/ZA201702162B/en unknown
- 2017-04-10 PH PH12017500679A patent/PH12017500679A1/en unknown
-
2020
- 2020-12-03 US US17/111,115 patent/US11649266B2/en active Active
-
2023
- 2023-03-30 US US18/193,151 patent/US20230331787A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060112447A1 (en) * | 2002-08-29 | 2006-05-25 | Bogdanova Natalia N | Nucleotide sequences encoding cry1bb proteins for enhanced expression in plants |
RU2382822C2 (ru) * | 2003-07-07 | 2010-02-27 | Монсанто Текнолоджи, Ллс | ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВИДОВ БАКТЕРИЙ Bacillus, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
WO2008145406A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-04 | Bayer Bioscience N.V. | Novel genes encoding insecticidal proteins |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US11649266B2 (en) | 2023-05-16 |
RU2017116796A (ru) | 2018-11-19 |
BR112017007927A2 (pt) | 2018-03-20 |
PH12017500679A1 (en) | 2017-10-09 |
WO2016061197A1 (en) | 2016-04-21 |
US20210147492A1 (en) | 2021-05-20 |
CA2963555A1 (en) | 2016-04-21 |
EP3207050A4 (en) | 2018-09-12 |
CN107074917B (zh) | 2022-05-24 |
US20230331787A1 (en) | 2023-10-19 |
CN114736275A (zh) | 2022-07-12 |
CN107074917A (zh) | 2017-08-18 |
RU2017116796A3 (ru) | 2019-05-14 |
EP3207050A1 (en) | 2017-08-23 |
AR102284A1 (es) | 2017-02-15 |
WO2016061197A9 (en) | 2017-05-18 |
MX2017004814A (es) | 2017-08-02 |
ZA201702162B (en) | 2018-05-30 |
UA125168C2 (uk) | 2022-01-26 |
US20170226164A1 (en) | 2017-08-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11649266B2 (en) | Insecticidal polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof | |
US8802934B2 (en) | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity | |
US8586832B2 (en) | Bacillus thuringiensis gene with Lepidopteran activity | |
US8319019B2 (en) | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity | |
US9404121B2 (en) | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity | |
CN102361982B (zh) | 具有鳞翅目活性的新苏云金芽孢杆菌基因 | |
US10519200B2 (en) | Insecticidal polypeptides having broad spectrum activity and uses thereof | |
MX2013007532A (es) | Nuevo gen de bacillus thuringiensis con actividad contra el orden lepidoptera. | |
US20140352000A1 (en) | Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity | |
US11920146B2 (en) | Insecticidal polypeptides and uses thereof | |
BR112016002596B1 (pt) | Molécula de ácido nucleico isolada, construto de dna, célula hospedeira bacteriana, polipeptídeo isolado, composição, método para controlar uma população, método para matar uma praga, método para produzir um polipeptídeo, método para produzir uma planta ou célula vegetal, método para proteger uma planta, método para exterminar ou controlar uma população | |
US8609937B2 (en) | Bacillus thuringiensis gene with coleopteran activity | |
RU2750459C2 (ru) | Инсектицидные полипептиды с широким спектром активности и их применения | |
US8933299B2 (en) | Bacillus thuringiensis gene with coleopteran activity | |
US8252972B2 (en) | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity | |
US20200131528A1 (en) | Insecticidal polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof | |
US10793611B2 (en) | Bacillus thuringiensis CYT1A mutants | |
US20200308598A1 (en) | Insecticidal polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof | |
US8692066B2 (en) | Bacillus thuringiensis gene with coleopteran activity | |
US20190136259A1 (en) | Methods of using cyt1a mutants against coleopteran pests | |
EA042975B1 (ru) | Инсектицидные полипептиды, обладающие улучшенным спектром активности, и пути их применения |