CN102559674B - 茄科植物矮牵牛花粉的一种特异表达启动子及其基因序列与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了茄科植物矮牵牛花粉的一种特异表达启动子及其基因序列与应用。本发明提供的启动子名称为PhSLF-S3A启动子，是具有序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的DNA，或者是将SEQ ID No：1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列相同启动子活性的由SEQ ID No：1衍生的启动子。本发明的启动子可以驱动目的基因在矮牵牛花粉中的特异表达，并且对培育茄科植物、尤其是矮牵牛新品种具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域。更具体地，本发明涉及茄科植物矮牵牛花粉的一种特异表达启动子及其基因序列与应用。
背景技术
自交不亲和性是一种广泛存在于显花植物中的种内生殖障碍，该机制可以抑制近亲繁殖而促进异交，从而提高物种的遗传多样性和适应性。其中，存在于茄科、车前科和蔷薇科中的配子体自交不亲和性是最常见的类型。长期的遗传学研究发现，这类自交不亲和性是由单一的多态性S-位点所控制，该位点至少包含两个独立的自交不亲和反应特异性决定因子，分别称为花柱S基因和花粉S基因，它们分别在花柱中表达(控制花柱识别的特异性)和花粉中表达(控制花粉识别的特异性)(deNettancourt，2001)。由于花柱S基因首先被克隆，并且证明其具有核酸酶活性，又称其为S核酸酶，存在于上述三个科中的自交不亲和性又被称为基于S核酸酶的配子体自交不亲和性。在这三个科中，自交不亲和性共享同样的机制。
花柱S基因已经有系统的研究。花粉S基因的研究随着其被克隆也逐渐开展。根据先前的遗传学研究，人们预期花粉S基因应该具有至少三个特征：位于S位点、在花粉中表达且与S核酸酶有直接的相互作用。花粉S基因首先在车前科的金鱼草中被克隆，然后在蔷薇科的杏和茄科植物的矮牵牛中克隆到了花粉S基因，花粉S基因编码一类F-box蛋白，将其命名为SLF/SFB(S locus F-box/S-haplotype-specific F-box)(Lai et al，2002；Ushijima et al，2003；Sijacic et al，2004)。SLF已经被证明与S位点连锁，在花粉中特异表达，且与S核酸酶有相互作用，转基因实验也证明其控制了自交不亲和的特异性(Qiao et al，2004a；Sijacic et al，2004)。生化分析表明，SLF在体内形成一类SCF复合体，作为一种泛素连接酶来起作用，它通过泛素化异己的S核酸酶来行使功能(Qiao etal，2004b)。
在Qiao等的工作中，本实验室克隆了花粉S基因PhSLF-S3A，它具有上述花粉S基因的特征：位于S位点、在花粉中表达且与自己和异己的S核酸酶均有相互作用(Qiao et al，2004b)。
花粉特异表达的启动子研究始于上世纪八九十年代，双子叶植物中有代表性的是西红柿中的LAT52、LAT56和LAT59启动子(Twell et al，1991)，烟草中的G10启动子(Rogers et al，2001)。单子叶植物中有代表性的是水稻中的OSIPA和OSIPK的启动子研究(Gupta et al，2007；Swapna et al，2010)。由于启动子调控表达的时间空间不同，在相同时空表达的启动子又有表达强度的区别，人们在进行生物工程改造时，根据不同的需要就要选择合适的启动子。本发明就为这种需要提供了一种新的选择。
矮牵牛是一种广泛栽培的园艺植物，花色丰富，品种多样，且花期较长，从4月至10月底可陆续开花不断，深受人们喜爱。
发明内容
本发明的目的是提供一种矮牵牛花粉特异表达的启动子及其基因序列。
本发明提供的是矮牵牛花粉S基因PhSLF-S3A的启动子，是具有序列表中SEQ ID No：1的DNA序列，或者是将SEQ ID No：1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列相同作用的由SEQ ID No：1衍生的启动子。是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；
2)与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性。
序列表中SEQ ID No：1的DNA序列由2120个碱基对组成，扩增PhSLF-S3A启动子中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内，其中，上游引物和下游引物之间的距离在50到2100个碱基之间；该引物对中的每一个引物的长度为15到30个碱基。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的启动子导入植物细胞，获得使某目的基因在矮牵牛花粉中表达的转基因细胞系及转基因植株。本发明的启动子在构建到植物表达载体中时，在其转录起始后可加上任何一种基因的编码序列或任何一种增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。携带有本发明启动子的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导等常规生物技术方法导入植物细胞，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的启动子可以驱动目的基因在矮牵牛花粉中特异表达，并对培育矮牵牛新品种具有重要意义。当本发明的启动子被用于目的基因在矮牵牛花粉中特异表达或改变矮牵牛的自交不亲和或自交亲和状态时，以及产生植物雄性不育系时，可采用以下方法：1、将本发明的启动子克隆到植物转化载体中，在其后接上目的基因的编码序列；2、将所构建的植物转化载体转化可再生矮牵牛组织(或器官)并使本发明启动子在转化植物的组织中表达；3、将被转化的组织(或器官)培养成植株。
更具体地，本发明提供以下各项：
1、PhSLF-S3A启动子，具有序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，或者是将SEQ ID No：1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No：1所示的核苷酸序列相同启动子活性的由SEQ ID No：1衍生的启动子序列。
2、根据以上1所述的启动子，其特征在于：它具有序列表中SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列的一段碱基序列。
3、PhSLF-S3A启动子，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；
2)与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列。
4、用于PCR扩增根据以上1-3中任一项所述的启动子或其片段的引物对，其中，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物和所述下游引物在所述启动子或其片段上退火配对的位置之间的距离在50到2100个碱基之间；所述引物对中的所述上游引物和下游引物的长度各自为15到30个碱基。
5、含有根据以上1-3中任一项所述的启动子的表达载体，优选所述表达载体包括在所述启动子的下游的增强子和/或目的基因的编码序列，还优选所述表达载体包含植物可选择性标记(如编码β-葡萄糖苷酸酶的GUS基因)或抗生素抗性基因。
6、含有根据以上1-3中任一项所述的启动子或根据以上5所述的表达载体的细胞系，优选植物细胞系，更优选茄科植物细胞系，最优选矮牵牛细胞系。
7、根据以上1-3中任一项所述的启动子在驱动目的基因在矮牵牛花粉或茄科植物花粉中特异表达的应用。
8、根据以上1-3中任一项所述的启动子、根据以上5所述的表达载体或根据以上6所述的细胞系在培育茄科植物新品种、特别是矮牵牛新品种中的应用。
9、根据以上1-3中任一项所述的启动子在产生植物雄性不育系的应用。
10、根据以上9所述的应用，其中所述植物是茄科植物，优选矮牵牛。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为PhSLF-S3A启动子与GUS基因的融合载体。
图2为PhSLF-S3A启动子与GUS基因的融合载体中的GUS基因在矮牵牛花药和花粉中特异表达的分析结果(A，转基因植物的Southern杂交鉴定；B，PhSLF-S3A启动子与GUS基因的融合载体中的GUS基因在矮牵牛花药中有特异表达(蓝色)，WT表示野生型植物，PhSLF-S3A-pro::GUS表示转基因植物；C，野生型的花粉和转基因植物T0代的花粉的GUS染色(有一半花粉有GUS染色))；和
图3为本发明克隆的PhSLF-S3A启动子的DNA序列(2120bp，矮牵牛属，杂交矮牵牛(Petunia hybrida))。
具体实施方式
实施例中所用的植物材料：
温室中生长的杂交矮牵牛(Petunia hybrida，S3S3基因型)(Robbinset al，2000；Qiao et al，2004a)，在花期收集新鲜植物材料进行实验。
实施例1、矮牵牛花粉特异启动子的克隆
矮牵牛花粉特异启动子的克隆采用反式PCR(Inverse PCR)的方法。
反式PCR原理：这是一种染色体步移(genomic walking)的方法，用来克隆已知序列紧密相邻的未知序列。基因组DNA或者基因组文库的质粒DNA经单酶切，然后自连接进行DNA环化。单酶切的DNA产物，由于两端均是同一个酶切位点，在稀释的(DNA浓度较低)连接体系中，片段自我连接的可能性很大，这样就形成了一个环化的DNA分子。通过选择不同的限制酶，我们就可以找到合适的环化DNA分子，其中包含了已知序列和目标未知序列。根据已知序列设计相反方向引物(而非传统PCR的相向引物)，以合适的环化的DNA分子为模板，用这一对引物进行PCR扩增。由于PCR的模板是环化的分子，相反方向的引物就变成了相向方向，就成为了传统PCR反应，扩增的序列就包含了未知序列。
首先，从本申请人之前构建的矮牵牛基因组可转化人工染色体(transformation-competent artificial chromosome，TAC)文库(Liu et al，2000)中筛选到了目的基因PhSLF-S3A(GenBank Accession No.AY639403.1)的三个TAC克隆：77H11、182D11和204P5。分别提取三个TAC克隆的质粒DNA，提取方法按照《分子克隆实验指南》(第三版)中的减法提取。三个克隆的质粒DNA各取500ng各自分别经EcoRI、HindIII、BamHI、XhoI或PstI(Takara产品)消化。酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。纯化质粒DNA酶切产物，并溶于80μlTE(Tris-EDTA，pH 7.5)缓冲液中。
接着进行酶切产物的自连接。取上面纯化的酶切产物40μl，分别加入10μl 10×连接缓冲液(Takara产品)，1.0μl T4DNA连接酶(6units/μl，Takara产品)，补水至100μl，16℃连接过夜；70℃5分钟终止反应。稀释5倍作为反式PCR的模板。
将上面15份自连接的质粒DNA各取1μl为模板，再各加入38μl去离子水，5μl 10×PCR缓冲液(Takara产品)，1μl dNTP(10μM)，2μl正向引物(5μM)，2μl反向引物(20μM)，1μl Ex Taq(5U/μl，Takara产品)，进行PCR反应。根据PhSLF-S3A的序列设计反式PCR的引物，如下：
正向引物：5’-CCGAAGATTTGGTGTTTCTTATAC-3’
反向引物：5’-CTTTAAAATACCATTCGCCAT-3’
在MJ PCR仪(MJ Research PTC-225Tetrad Thermal Cycler)上扩增：94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸3min，共计35个循环，最后72℃延伸10min。将获得的PCR产物，作1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。以三个TAC质粒的HindIII酶切产物作模板时有特异扩增，出现约2kb的条带。
切取上面特异扩增的约2kb的目的片段，用Wizard PCR PrepsDNA Purification System (Promega公司产品)纯化。然后克隆到pGEM-T Easy载体(Promega公司产品)上，转化到E.coli DH5α感受态细胞(Invitrogen公司产品)中。经蓝白筛选，用载体上的引物VT7和Sp6扩增片段挑选阳性克隆，提取质粒，送华大基因公司进行测序。所得2120bp序列(SEQ ID No：1)即为PhSLF-S3A的启动子的序列(该序列作为启动子的功能由以下实施例2证明)。
在以上实施例中，由于矮牵牛的基因组尚未测序，我们就只能通过染色体步移(genomic walking)的方法克隆序列。在获得PhSLF-S3A的启动子的序列(SEQ ID No：1)后，可以将该启动子利用引物直接从S3S3基因型的杂交矮牵牛的基因组中克隆出来。
实施例2、转化分析
在PhSLF-S3A的启动子的5’和3’端分别设计含HindIII和XbaI酶切位点的引物，以77H11质粒为模板(也可以以S3S3基因型的杂交矮牵牛的基因组DNA作为模板)，进行PCR扩增。引物为：
FP+HindIII：5’-AAGCTTATTGGTAAGATTCAG-3′
RP+XbaI：5’-TCTAGACCTTTATCCTCGAGAATGC-3′
构建该启动子与GUS融合的载体(图1)，具体过程如下：将上面扩增得到的目标片段用Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega公司产品)纯化，然后克隆到pGEM-T Easy载体(Promega公司产品)上，转化到E.coli DH5α感受态细胞(Invitrogen公司产品)中。经蓝白筛选，用载体上的引物VT7和Sp6扩增片段挑选阳性克隆，提取质粒，送华大基因公司进行测序确认，插入序列经确认无误。用HindIII和XbaI双酶切该阳性质粒和pBI101.2载体(Clontech产品，携带GUS基因)，目标片段和pBI101.2载体均用Wizard PCR Preps DNAPurification System(Promega公司产品)纯化。将纯化的片段连接入pBI101.2载体并转化到E.coli DH5α感受态细胞中(Invitrogen公司产品)，通过Kan抗性筛选阳性克隆。在大肠杆菌内鉴定连接正确后，再将构建的质粒转入农杆菌LBA4404(Invitrogen公司产品)中，然后通过根癌农杆菌浸染的方法(Lee et al，1994)转化矮牵牛，得到转基因植物，转基因植物经Southern杂交鉴定为阳性植物(图2A)。
Southern鉴定转基因植物的方法如下：CTAB法提取转基因植物的基因组DNA(Qiao et al，2004a)。取10μg基因组DNA，分别用EcoRI和HindIII(Takara产品)酶切，酶切产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳(20V，20小时)分离。然后在摇床上处理电泳胶：经0.25N HCl浸洗15min，变性液(1.5M NaCl，0.5N NaOH)浸洗30min，中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH 7.2)浸洗30min(共两次，每次15min)。最后用20×SSC将DNA印迹到HybondN+尼龙膜(Amersham公司产品)上。
预杂交、杂交均按常规方法进行：预杂交液(5×SSC，5×Denhardt’s，0.1％SDS，100μg/ml变性鲑鱼精DNA(Sigma产品))65℃处理2小时。杂交液和预杂交液成分相同，加入标记好并变性的探针(NPTII基因(编码新霉素磷酸转移酶)用作探针)(NPTII是抗性筛选基因，我们的转化载体pBI101.2上带有这个基因，用它作为探针就可以检测携带有目的片段的载体是否转入植物体内。NPTII基因的GenBankAccession No.：ABN59488.1)，65℃杂交16个小时。
探针标记：用Promega公司的Primer-a-Gene试剂盒进行，标记3个小时。杂交前用Qiagen公司的PCR Purification试剂盒进行探针纯化。
洗膜用高严谨方法进行(Hybond N+mannual，Amersham)：2×SSC，0.1％SDS，65℃，15min；1×SSC，0.1％SDS，65℃，15min；0.1×SSC，0.1％SDS，65℃，15min。
保鲜膜包裹杂交膜，-70℃下对X光片曝光。Southern结果显示，得到3个独立的转基因株系(图2A)。
转基因植物材料的GUS染色：取转基因植物开花前1天的花蕾和散粉当天的花粉，进行GUS活性检测，方法参照Weigel&Galzebrook(2002)。染色结果显示，GUS只在矮牵牛花粉中表达(图2B和图2C)。这表明，PhSLF-S3A的启动子是花粉特异的启动子，它只在矮牵牛花粉中特异表达。
参考文献
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Claims (8)
1.PhSLF-S3A启动子，其核苷酸序列由序列表中SEQ ID No:1所示的序列组成。
2.用于PCR扩增根据权利要求1所述的启动子的引物对，其中，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物和所述下游引物分别为：5’-AAGCTTATTGGTAAGATTCAG-3'和5’-TCTAGACCTTTATCCTCGAGAATGC-3'。
3.含有根据权利要求1所述的启动子的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其中所述表达载体包括在所述启动子的下游的增强子和/或目的基因的编码序列。
5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其中所述表达载体包含植物可选择性标记或抗生素抗性基因。
6.根据权利要求1所述的启动子在驱动目的基因在矮牵牛花粉中特异表达的应用。
7.根据权利要求1所述的启动子或根据权利要求3-5中任一项所述的表达载体在培育矮牵牛新品种中的应用。
8.根据权利要求1所述的启动子在产生矮牵牛雄性不育系的应用。
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| 基于S-核酸酶的自交不亲和性的分子机制;张一婧等;《植物学通报》;20071231;第24卷(第3期);全文 * |
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