CN107365370B

CN107365370B - 与植物果实发育相关的蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN107365370B
Application number: CN201710774019.5A
Authority: CN
Inventors: 刘富中; 张映; 陈钰辉; 李香景; 张伟伟; 齐东霞; 连勇
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-08-31
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2037-08-31
Also published as: CN107365370A

Abstract

本发明公开了一种与植物果实发育相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白为下述任一：1)序列2所示蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同功能的蛋白质；3)与1)或2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；4)在1)‑3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。SmAGPP基因是调控茄子坐果和果实发育的相关基因，本发明对于改进果实品质，降低栽培成本，具有很大的应用价值。

Description

与植物果实发育相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种与植物果实发育相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

单性结实是指子房不经过受精作用而形成无籽果实的现象。单性结实是园艺作物倍受青睐的农业性状，它能够改善果实品质、降低栽培成本和提高作物的环境适应性(刘富中,连勇,陈钰辉,宋燕.2005.温度和蕾期去雄及去柱头处理对茄子单性结实性的影响.园艺学报,32(6):1021-1025.)。因此，克隆单性结实的相关基因并研究其作用机制，对指导单性结实品种的育种工作具有重要意义。

目前，国内外研究者先后对茄子单性结实的特性(刘富中,连勇,陈钰辉,宋燕.2005.温度和蕾期去雄及去柱头处理对茄子单性结实性的影响.园艺学报,32(6):1021-1025.)、内源激素的种类和含量变化(武彦荣,郭秀林,高秀瑞,李冰,潘秀清.茄子单性结实系开花期内源激素含量的变化.河北农业科学,2009,13(9):14-16.)、胚胎及果实发育的解剖特点(张伟春,魏毓棠,王静,何明,唐萍.茄子单性结实与非单性结实品系胚胎发育及果实解剖结构的观察.沈阳农业大学学报,2008，39(5):534-537.)、遗传规律(刘富中,万翔,陈钰辉,连勇,宋明.茄子单性结实基因的遗传分析及AFLP分子标记.园艺学报,2008，35(9):1305-1309.)、AFLP分子标记(刘富中,万翔,陈钰辉,连勇,宋明.茄子单性结实基因的遗传分析及AFLP分子标记.园艺学报,2008，35(9):1305-1309.)进行了研究。

迄今已从3个物种中克隆出单性结实基因，包括苹果中的MdPI基因(Yao J,DongY,Morris B.2001.Parthenocarpic apple fruit production conferred by transposoninsertion mutations in a MADS-box transcription factor.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,98(3):1306-1311.)；番茄中的Tm29基因(Ampomah-Dwamena C,Morris B,Sutherland P,Veit B,YaoJ.2002.Down-regulation of TM29,a tomato SEPALLATA homolog,causesparthenocarpic fruit development and floral reversion.Plant Physiology,130(2):605-617.)；以及从拟南芥生长素反应因子ARF8突变体arf8-4、arf8-1和arf8-6中克隆出的基因(Goetz M,Hooper L,Johnson S,Rodrigues J,Vivian-Smith A,KoltunowA.2007.Expression of aberrant forms of AUXIN RESPONSE FACTOR8 stimulatesparthenocarpy in Arabidopsis and tomato.Plant Physiology,145(2):351-366.)。从单性结实的苹果品种Rae Ime克隆出的MdPI基因，为拟南芥控制花发育基因MADS-box基因家族中的PI基因的同源基因。MdPI MADS-box的转录因子功能丧失突变导致了苹果突变体的单性结实果实的发育(Yao J,Dong Y,Morris B.2001.Parthenocarpic apple fruitproduction conferred by transposon insertion mutations in a MADS-boxtranscription factor.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,98(3):1306-1311.)。从番茄cDNA文库中克隆出单性结实基因Tm29，也属于控制花器官发育的MADS-box基因，在番茄中下调表达导致单性结实(Ampomah-Dwamena C,Morris B,Sutherland P,Veit B,Yao J.2002.Down-regulation of TM29,atomato SEPALLATA homolog,causes parthenocarpic fruit development and floralreversion.Plant Physiology,130(2):605-617.)。拟南芥生长素反应因子ARF8突变体arf8-4、arf8-1和arf8-6能在去雄情况下产生无籽果实，基因克隆表明arf8-4是由于ARF8基因翻译起始位点ATG突变为ATA引起，而arf8-1和arf8-6是由于ARF8基因编码框出现了T-DNA的插入突变，拟南芥ARF8基因的编码区域突变功能缺失导致单性结实的形成(Goetz M,Vivian-Smith A,Johnson S D,Koltunow A M.2006.AUXIN RESPONSE FACTOR8is anegative regulator of fruit initiation in Arabidopsis.Plant Cell,18(8):1873-1886.)。笔者发现和获得温敏型圆茄单性结实材料D-10等，在低温下可自然结果，其坐果率76.9％～100％，且果实无籽，其单性结实率为100％,当温度适宜后，植株上部果实又产生种子(刘富中,连勇,陈钰辉,宋燕.2005.温度和蕾期去雄及去柱头处理对茄子单性结实性的影响.园艺学报,32(6):1021-1025；张映，刘富中，陈钰辉，连勇.低温下茄子单性结实特性的研究.中国蔬菜，2009(2):16～20.)，但目前调控茄子温敏型单性结实和低温下高坐果率基因的分离克隆尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物果实发育相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物果实发育相关的蛋白，名称为SmAGPP，来源于茄科、茄属、茄子(Solanum melongena L.)单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2，是如下任一的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且来源于茄子并具有相同功能的蛋白质；

3)与1)或2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且来源于茄子并具有相同功能的蛋白质；

4)在1)-3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

序列表中的序列2由506个氨基酸残基组成，预测其编码的SmAGPP蛋白分子量为56.7609KD，理论等电点PI为8.67。

为了便于所述蛋白质的纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因，所述基因具体可为如下任一：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1的第225-1745位的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

4)与1)-3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列1由2064个核苷酸组成，包括224bp的5'端非编码区(序列1的第1-224位)，一个完整的开放阅读框(序列1的第225-1745位)，和包含ployA尾巴的319bp的3'端非编码区(序列1的第1746-2064位)。

含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1300、pCUbi1390、pCHF3、pGreen0029、pCAMBIA3301、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。

所述的蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒或所述转基因细胞系或所述重组微生物在调控植物果实发育中的应用也属于本发明的保护范围。

所述调控植物果实发育体现为调控植物座果率。所述植物中所述蛋白质的表达量和/或活性越高，所述植物的座果率越高；所述植物中所述蛋白质的表达量和/或活性越低，所述植物的座果率越低。

本发明还保护如下几种方法。

(I)一种培育座果率提高的植物品种的方法，具体可包括如下步骤：使受体植物中所述蛋白质的表达量提高和/或活性提高，从而获得座果率提高的植物品种；

(II)一种培育座果率降低的植物品种的方法，具体可包括如下步骤：使受体植物中所述蛋白质的表达量降低和/或活性降低，从而获得座果率降低的植物品种。

(III)一种培育座果率提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比座果率提高；

(IV)一种培育座果率降低的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：对受体植物中所述蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比座果率降低。

在方法(III)中，所述蛋白质在所述转基因植物中的表达量高于所述受体植物。在方法(IV)中，所述蛋白质在所述转基因植物中的表达量低于所述受体植物。

所述基因具体可为如下任一：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1的第225-1745位的DNA分子；

在方法(IV)中，对所述受体植物中所述蛋白质的编码基因进行抑制表达具体可通过如下实现：向所述受体植物中导入pTRV2-SmAGPP载体和pTRV1载体；所述pTRV2-SmAGPP载体为将序列1的第664-1013位所示DNA片段添加TOPO克隆所必须的4个碱基CACC后，插入到pTRV2载体的attB1和attB2之间后得到的重组载体。

在方法(III)中，所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述受体植物中，得到所述转基因植物。所述重组表达载体为将所述基因插入到植物表达载体的多克隆位点后得到的能够表达所述基因的重组载体。

在上述两种方法中，均可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将相应载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

上述的各应用和方法中，所述植物可为茄科植物，具体可为茄子。更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述植物为茄子单性结实品系，具体为茄子(Solanum MelongenaL.)单性结实品系D-10。

本发明利用Gateway同源重组技术，构建了SmAGPP基因的烟草脆裂病毒(Tobaccorattle virus，TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体pTRV2-SmAGPP。表达载体转入农杆菌GV3101后，用注射压迫法侵染茄子叶片。采用表型观察、TRV病毒分子检测和qRT-PCR技术，评价SmAGPP基因的沉默效果。结果表明，报告基因PDS沉默后叶片呈现明显的光漂白现象，SmAGPP基因沉默后叶片呈花叶状，叶片中SmAGPP基因的表达量明显降低，座果率显著小于空白对照和阴性对照，证明SmAGPP基因是调控茄子坐果和果实发育的相关基因，本发明对于提高坐果率，降低栽培成本，具有很大的应用价值。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性结果。其中，A泳道为单性结实品系D-10门茄花后7天的总RNA；泳道B为非单性结实品系03-2门茄花后7天的总RNA。

图2为5’RACE PCR产物和3’RACE PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。其中，泳道M为markerⅦ；泳道A为单性结实品系D-10门茄花后7天子房的5’RACE PCR产物；泳道B为非单性结实品系03-2门茄花后7天子房的5’RACE PCR产物；泳道C为单性结实品系D-10门茄花后7天子房的3’RACE PCR产物；泳道D为非单性结实品系03-2门茄花后7天子房的3’RACE PCR产物。

图3为不同果实中SmAGPP基因的相对表达量。其中，-2表示开花前2天；0表示开花当天；2、4、6、10、15和20依次表示开花后2天、4天、6天、10天、15天和20天。

图4为PCR检测表达载体pTRV2-SmAGPP。M:Marker；1：空载体pTRV2；2：3:pTRV2-SmAGPP。

图5为侵染4周后植株叶片沉默表型。A：pTRV2-PDS；B：pTRV2阴性对照；C：pTRV2-SmAGPP；D：空白对照CK。

图6为处理株TRV病毒RNA1和RNA2的检测。M：MarkerⅢ；1、7：沉默pTRV2-PDS植株；2、8：沉默pTRV2植株；3、4、9、10：沉默pTRV2-SmAGPP植株；5、6：空白对照。

图7为处理株SmAGPP基因叶片中相对表达量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与植物果实发育相关编码基因的获得

一、RNA的提取

以茄子单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2的子房为试验材料，利用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit分别提取上述两个品系茄子的子房总RNA。其中每份材料包含3个重复，在液氮中迅速研磨。从所得的两个品系茄子的RNA中均取出少量用于1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性(图1)，微型分光光度计检测浓度，其余放于-20℃或-80℃冰箱中贮存备用。

二、SmAGPP基因的获得

1、SmAGPP基因5’端序列和3’端序列的获得

分别以单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2的门茄开花后7天子房的总RNA为模板，利用SMARTER^TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)分别合成5’RACE ReadycDNA第一链和3’RACE Ready cDNA第一链。

根据单性结实抑制差减文库中的EST片段lpi-fl-3(周亚君，陈钰辉，刘富中，张映，连勇.2010.利用抑制差减杂交技术分离茄子单性结实相关ESTs园艺学报，37(12)：1944-1952)，利用primer premier5软件并结合oligo6软件设计合成5’RACE PCR引物antisense：5’-GATTGCTTTGGTTTGCGGAGACG-3’，3’RACE PCR引物sense：5’-TGAGGAGTCAAGGACGGTGCCCATT-3’。分别以上述步骤合成的5’RACE Ready cDNA第一链和3’RACE Ready cDNA第一链为模板，利用设计合成的5’RACE和3’RACE引物，使用2PCR Kit(Clontech)分别对SmAGPP基因的5’端序列和3’端序列进行扩增。PCR反应程序为：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，30个循环。

经琼脂糖凝胶电泳检测，可以看到茄子单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2的5’RACE PCR和3’RACE PCR的产物都有一条清楚的条带(图2)。且两个品系的5’RACE PCR产物(5’端片段)大小均约为1.8kb，3’RACE PCR产物(3’端片段)大小均约为800bp。利用omega公司的胶回收试剂盒回收上述两个品系各自的5’端片段和3’端片段。

将上述回收的两个品系各自的5’端片段和3’端片段与pMD18-T载体(TaKaRa)在16℃连接2小时，然后转化到DH5α(天根)感受态细胞中，经蓝白斑筛选后，挑取阳性克隆进行菌液PCR，将出现目的条带大小的菌液送金唯智公司测序，测序结果表明，上述茄子单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2的5’RACE PCR产物(5’端片段)的序列一致，大小均为1700bp，两个品系的3’RACE PCR产物(3’端片段)的序列也一致，大小均为771bp。

2、SmAGPP基因全长cDNA的克隆

使用DNAStar的seqMen软件，将步骤1测序后得到的5’RACE PCR产物(5’端片段)和3’RACE PCR产物(3’端片段)的序列拼接起来，获得全长基因序列，将其命名为SmAGPP基因。(核苷酸序列如序列表中序列1所示)。根据全长基因序列设计引物，进行长距离PCR(LD-PCR)，然后进行胶回收、连接、转化、蓝白斑筛选克隆全长基因，测序正确后放-80℃保存供以后使用。

LD-PCR引物为：

antisense1924：5’-TACAACATATTCCTTCCACCC-3’；

sense32：5’-CCCTCTTTACTCTACCTCTTCC-3’

PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，68℃30s，72℃3min，30个循环。

对PCR产物测序，结果证实此PCR产物的序列与序列1的第32-1924位完全一致。

实施例2、SmAGPP基因全长cDNA序列分析及功能分析

将实施例1获得的SmAGPP基因全长序列(序列1)利用ORF Finder寻找开放读码框，并用expasy中的protparam工具对该蛋白序列组分进行计算，用InterPro对该基因编码的蛋白进行结构域和功能位点的预测，利用其它一些生物信息学工具对该基因进行预测。

SmAGPP基因经ORF finder寻找开放读码框后发现，该基因含有完整的读码框，大小为1521bp(序列1的第225-1745位)，编码506个氨基酸(序列2)，5’端有224bp的非编码区(序列1的第1-224位)，3’端有319bp的非编码区(序列1的第1746-2064位)，包括Ploy(A)尾巴。该基因所编码的蛋白质序列经expasy中的protparam工具计算得分子量为56.7609KD，理论等电点PI为8.67。

用InterPro对SmAGPP基因编码的蛋白进行结构域预测，发现一个GDP岩藻糖蛋白O-岩藻糖基转移酶的保守区域(第98-445位氨基酸)。

用predictprotein软件对该蛋白进行二级结构预测发现该蛋白螺旋43.28％，折叠为8.10％，无规则卷曲部分为48.62％。溶剂可及性预测显示残基暴露表面大于16％的占53.95％，剩余46.05％为其他残基总和。TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)预测蛋白质信号肽，发现该基因编码的蛋白属于分泌途径，具有28个氨基酸长度的信号肽。利用TMpred(http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)进行氨基酸跨膜预测，结果显示在8到25位共18个氨基酸属于跨膜区，N端在胞内，这一结果同信号肽预测相一致。PSORT亚细胞定位预测该蛋白属于质膜蛋白。以AF275345为参照基因组DNA(65426-70636)，用Spidey预测SmAGPP基因的外显子，结果显示该基因有10个外显子。

实施例3、采用实时定量PCR分析SmAGPP基因的表达

本实施例所采用的16份实验材料为：茄子单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2开花前两天、开花当天、开后2天、开后4天、开后6天、开后10天、开后15天和开后20天的子房或果实各一份，共16份，每份材料中有三个重复。

提取上述16份材料的总RNA，利用invitrogen公司的III First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒合成cDNA第一链，以此第一链为模板进行相对荧光定量分析。选用LeActin基因为内参基因，LeActin基因的引物序列为：

LeActin R：5’-CTTCGACCAAGGGATGGTGTAGC-3’

LeActin F：5’-GGGATGGAGAAGTTTGGTGGTGG-3’

待测SmAGPP基因的引物为：

Antisense1699：5’-TTGCTTTGGTTTGCGGAGACG-3’

Sense1522：5’-GCACAATGCAATGGTGGGACA-3’

使用Roche公司的Light480 SYBR Green I Master试剂盒和480II Instrument，并按两者的要求设定PCR反应程序为95℃预变性10min；95℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸30s，45个循环；溶解曲线95℃5s，65℃1min，97℃连续采集信号；冷却：40℃10s。

荧光定量分析结果表明(图3)，低温下，SmAGPP基因在茄子单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2果实各时期都有表达，其表达趋势基本相同，但各时期的表达量有差异，在单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2果实发育的各个时期，单性结实品系D-10子房和果实中的含量大于非单性结实品系03-2。在开花前2天，单性结实品系D-10子房中该基因的含量是非单性结实品系03-2的2.3倍，开花当天至开花后6天，单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2果实中该基因的表达量差异不大。开花6天至开花后20天，SmAGPP基因在单性结实品系D-10果实中的表达量显著高于在非单性结实品系03-2果实中的表达量。开花后10天单性结实品系D-10果实中该基因的表达量达到了最大值，是该时期非单性结实品系03-2果实的1.9倍，之后非单性结实品系03-2果实中该基因的含量逐渐降低，而单性结实品系D-10中则在15天后又开始上升。

实施例4、茄子TRV-VIGS体系的建立及SmAGPP基因功能的研究

一、试验材料

茄子(Solanum Melongena L.)单性结实品系D-10以及非单性结实品系03-2。材料种植在控温温室中：昼夜温度分别为25±3℃和20±2℃，温室的相对湿度保持在60％～75％。

pTRV1、pTRV2和pTRV2-PDS载体，农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101由中国农业科学院蔬菜花卉研究所加工番茄课题组提供。RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒及Seamless Cloning and Assembly Kit和FASTPfu高保真DNA聚合酶购自北京全式金有限公司，琼脂糖凝胶回收和质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。pENTR^TM DirectionalCloning Kits和LR Clonase Enzyme Mix购自美国invitrogen公司。

二、试验方法

1、载体构建

以单性结实品系D-10为材料，提取开花0d的子房RNA，反转录成cDNA，利用Gateway技术(同源重组技术)构建插入片段长度为354bp的SmAGPP基因的VIGS表达载体。依据SmAGPP基因的cDNA序列(序列1)设计引物(表1)，以序列1为模板，SmAGPP-F和SmAGPP-R为引物进行PCR扩增，扩增产物进行胶回收，与载体连接并转入到大肠杆菌中，构建入门载体。通过LR反应将连接在入门载体上的插入片段转接到pTRV2载体上，并转入到大肠杆菌中，构建表达载体。将经测序检测正确的表达载体(命名为pTRV2-SmAGPP)转化到农杆菌GV3101中备用。pTRV2-SmAGPP载体结构描述：将序列1的第664-1013位所示DNA片段前添加TOPO克隆所必须的4个碱基CACC后，插入到pTRV2载体的attB1和attB2之间后得到的重组载体。

表1引物序列

2、农杆菌侵染

将含有目标载体pTRV1、pTRV2、pTRV2-PDS、pTRV2-SmAGPP的农杆菌GV3101涂布在LB固体培养基(含50mg.L^-1Kan和50mg.L^-1Rif)中，28℃，倒置暗培养，挑取单克隆于LB液体培养基(含有相同浓度的Kan和Rif)中，28℃，200r/min过夜培养。培养至OD₆₀₀约为0.8时，转接到细菌培养基(YEB)中，28℃，200r/min过夜培养。培养至OD₆₀₀约为0.8时，记录OD₆₀₀的值为X，离心收集菌液(4000r/min，8min)，用22倍X体积的侵染液悬浮菌液。将pTRV1分别与其他菌液1：1(体积比)混合，室温静置1h后用于侵染。采用5mL无菌注射器通过注射压迫法进行接种。从子叶背部进行注射，使菌液充满整片子叶。处理植株为空白对照(不处理)、pTRV2空载的阴性对照、含pTRV2-PDS载体的阳性对照及沉默SmAGPP基因的VIGS表达载体，各处理10株，设3次重复。

3、植株表型性状鉴定

侵染后21d，通过比较白化或TRV病毒导致的花叶表型的植株数与接种TRV的总植株数的百分比评估基因沉默频率。测量果实性状，评估基因沉默对果实发育的影响。数据利用Excel 2010和SPSS进行分析。

4、荧光定量PCR分析

取接种后28d不同处理植株嫩叶，提取总RNA，并用随机引物合成cDNA。用特异引物RNA1和RNA2(表1)检测TRV病毒。对处理植株中内源基因的表达量进行qRT-PCR检测，取接种后不同处理植株嫩叶，提取RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，根据基因插入片段设计荧光定量引物(表1)，以番茄肌动蛋白基因(Actin)为内参基因(表1)，使用仪器Roche LightCycler480进行荧光定量PCR分析。反应体系为10μL：模板2μL，上、下游引物各0.5μL，SYBRGreen Master Mix 5μL，ddH₂O 2uL。反应程序为：95℃，10min；95℃，10s，57℃，20s，72℃，30s，50个循环后作熔解曲线(95～65℃，0.1℃/s^-)。具体参考张映(张映，刘富中，李香景，陈钰辉，张振贤，方智远，连勇.2011.茄子单性结实候选基因的表达分析.中国蔬菜，(16)：20-26)的方法。使用Excel 2010软件和SPSS软件处理数据。

三、结果与分析

1、载体构建

通过Gateway技术构建SmAGPP基因的VIGS表达载体pTRV2-SmAGPP，并将其转化农杆菌GV3101。用特异引物(5’-GTTACTCAAGGAAGCACGAT-3’和5’-AACTTCAGACACGGATCTAC-3’)进行PCR鉴定，在目标位置出现了404bp(354bp+2个attB位点50bp)大小的条带(图4)，说明SmAGPP基因的VIGS表达载体构建成功。

2、表型性状

(1)叶片表型性状调查

在控温温室条件下，采用注射压迫法侵染茄子幼苗子叶，侵染15d后，单性结实品系和非单性结实品系pTRV2-PDS处理株均出现表型，20d后沉默pTRV2和pTRV2-SmAGPP的植株叶片出现病毒斑，4周后，表型明显(图5)。侵染后4周，统计基因沉默频率。和空白对照相比，单性结实品系的pTRV2、pTRV2-PDS和pTRV2-SmAGPP的沉默频率分别为98.8％、95.31％和83.51％，非单性结实品系的pTRV2p、TRV2-PDS和pTRV2-SmAGPP的沉默频率分别为82.11％、92.19％和84.38％，沉默频率较高。

侵染4周后，单性结实品系空白对照CK长出第4片真叶，而接种株则只有3片，与空白对照CK相比，沉默pTRV2、pTRV2-PDS和pTRV2-SmAGPP的处理株长势较弱。

(2)果实表型性状调查

开花后20d，对单性结实品系处理植株果实性状进行调查(表2)。结果表明，与CK和pTRV2相比，pTRV2-SmAGPP处理株的座果率均显著性降低，说明沉默SmAGPP基因会导致单性结实品系座果率的降低。与CK相比，pTRV2处理株的座果率也显著降低，可能是病毒侵染导致植株生长势变弱，导致座果率有所降低。

pTRV2和pTRV2-SmAGPP处理株的果实纵径均显著小于空白对照。果实横径在各个处理株间无明显差异，表明沉默SmAGPP基因对果实大小有一定影响，病毒侵染可能会影响果实的伸长生长。

表2侵染单性结实品系植株的果实性状

注：不同小写字母表示差异显著(α＝0.05)，不同大写字母表示差异极显著(α＝0.01)。

3、病毒分子检测

以特异引物RNA1和RNA2对单性结实处理植株的叶片进行TRV病毒检测。结果表明(图6)，pTRV2-PDS、pTRV2和pTRV2-SmAGPP的植株中均出现病毒的两条特异性条带，对非单性结实品系检测结果相同。说明TRV病毒成功侵入到了茄子植株中。

4、qRT-PCR分析SmAGPP基因表达量

以番茄LeActin基因为内参基因，对单性结实品系和非单性结实品系处理株的叶片进行基因表达量分析。结果表明(图7)，非单性结实品系叶片中基因的表达量高于单性结实品系。与空白对照CK和阴性对照pTRV2相比，沉默pTRV2-SmAGPP单性结实品系和非单性结实品系叶片中基因的表达量均降低。在单性结实品系中，沉默pTRV2-SmAGPP植株基因表达量是pTRV2的0.9倍，是CK的0.68倍，非单性结实品系中，沉默pTRV2-SmAGPP植株基因的表达量是pTRV2的0.59倍，CK的0.45倍。说明沉默SmAGPP基因的mRNA在沉默该基因的茄子叶片中被降解，空白对照CK比阴性对照pTRV2的SmAGPP基因表达量高，说明病毒对基因的表达量有一定影响。

综合以上各实施例，可见：本发明以茄子单性结实品系D-10为实验品系，克隆获得了茄子生长素增长启动子蛋白基因SmAGPP的cDNA序列，初步分析其在茄子单性结实品系果实发育中上调表达。进一步，利用TRV-VIGS技术降低了SmAGPP基因在D-10叶片中的表达量，果实性状鉴定结果表明，SmAGPP基因表达沉默的D-10的座果率显著小于空白对照和阴性对照，证明SmAGPP基因与茄子果实发育相关。

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 与植物果实发育相关的蛋白及其编码基因与应用

<130> GNCLN171572

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2064

<212> DNA

<213> 茄子（Solanum melongena L.）

<400> 1

ggcttttact gaggctcata atgatattgg cccctcttta ctctacctct tccctcaact 60

gattcttggt ttctttcttt atttctctct ttcttccttg attaaagatt gcttttttcc 120

tccttgtatt cctttcttga gagggtttag gcagaccctt ttctttattt cctatatatt 180

ttcattttaa ggggttgtgc caaatatcag aaatctactg cagcatgagt ggaaatcata 240

taagaggtgc catggctggt ctttttgtgg ttcttttggc tttttacttt cctattctta 300

gccatgcctc tcccacaacc attctctctg atttgaatgc tccaaaattc aggcactcac 360

gtcttgcgaa gagtgctgtt catcgccaaa cttccaacga agaacagtca gagctttgga 420

cacctttggc acaccaagga tggagacctt gtgctgaatc tgatgctgcc tccacggtac 480

ctgaaaaatc tgagggatac attcaagtgt tccttgatgg aggactaaat caacagagaa 540

tggggatctg tgatgcagtt gttgttgcca aaattctgaa tgccacactt gtgatccctc 600

agttagaagt aaatcctgtt tggcaagatt caagctcatt cgaggatatc tttgatgtgg 660

atcacttcat caatgtattg aaagacgacg tagctatagt caaggaattg cctgatgaat 720

tttcttggag cacacgagaa tattatggca tagctattcg acctacaaga atcaagactg 780

ctccagttca tgcttcagca aattggtatt tagagaatgt gtcacctgta ctgcagagtt 840

atggaattgc tgccatagcg ccattttctc atcggctgac gtttgacaac atgcctaagt 900

acctccaaca cctacgatgt aaagtcaact ttcaagcatt ggcttttgtt cctcacatca 960

gacaacttgg ggatgccctt atccatcgcc tgagatatcc tcctagtgaa gacaacatgg 1020

ttagtaacaa ttaccttaga gaggttactg atcttaagcc ccaaccagta gctggcaagt 1080

ttgctgttct tcaccttcgc tttgacaagg atatggctgc tcattcagcc tgcgattttg 1140

gtggtggcaa ggctgaaaat ctggctctag ctaaatacag acaagtaatt tggggaggaa 1200

gggtcgtcaa ctctcaattt actgatgaag aattgaggag tcaaggacgg tgcccattga 1260

cccctgaaga agttggattg ctgctggcag ctttgggatt tgacaacagc actcgcctat 1320

atcttgcctc ccataaggtt tatggcgggg aacgccgggt ttcagcctta agaagtttgt 1380

ttcccctgat ggaagataaa aagagtcttg catcttctga ggaaagggct cgtatcaaag 1440

gaaaggcttc cttattggct gcagttgatt attatgttgg catgcacagt gatattttca 1500

tttccgcctc gcccggaaat atgcacaatg caatggtggg acacagaaca tacaacaatt 1560

tgaagacaat aaggccaaac atgccactat taggccagct tttcttgaac aagacactaa 1620

cttggcctga gtttcgagaa tcagtagttg aagggcacca aaacagacaa ggccaaatcc 1680

gtctccgcaa accaaagcaa tccctctaca catatcctgc tcctgattgt atgtgccaag 1740

cttgagagag gggctacata gatcttcatt actatttgtt tggacatcag attattgttt 1800

attatgcctc atataatagt agttataaat aaaatgccac cccttttgtt gacttgtagg 1860

ggataatata tgtttctgtg tcaccacatg aggtttacag taggggtgga aggaatatgt 1920

tgtacaatat atgtgtatta ctcctatgaa gagtgcatat acagatagta gtattctagt 1980

cttaacagat atgttttact atgttgcaac agttcttgta gtttgtttac cagggtggct 2040

acacactcgg gggaaaaaaa aaaa 2064

<210> 2

<211> 506

<212> PRT

<213> 茄子（Solanum melongena L.）

<400> 2

Met Ser Gly Asn His Ile Arg Gly Ala Met Ala Gly Leu Phe Val Val

1 5 10 15

Leu Leu Ala Phe Tyr Phe Pro Ile Leu Ser His Ala Ser Pro Thr Thr

20 25 30

Ile Leu Ser Asp Leu Asn Ala Pro Lys Phe Arg His Ser Arg Leu Ala

35 40 45

Lys Ser Ala Val His Arg Gln Thr Ser Asn Glu Glu Gln Ser Glu Leu

50 55 60

Trp Thr Pro Leu Ala His Gln Gly Trp Arg Pro Cys Ala Glu Ser Asp

65 70 75 80

Ala Ala Ser Thr Val Pro Glu Lys Ser Glu Gly Tyr Ile Gln Val Phe

85 90 95

Leu Asp Gly Gly Leu Asn Gln Gln Arg Met Gly Ile Cys Asp Ala Val

100 105 110

Val Val Ala Lys Ile Leu Asn Ala Thr Leu Val Ile Pro Gln Leu Glu

115 120 125

Val Asn Pro Val Trp Gln Asp Ser Ser Ser Phe Glu Asp Ile Phe Asp

130 135 140

Val Asp His Phe Ile Asn Val Leu Lys Asp Asp Val Ala Ile Val Lys

145 150 155 160

Glu Leu Pro Asp Glu Phe Ser Trp Ser Thr Arg Glu Tyr Tyr Gly Ile

165 170 175

Ala Ile Arg Pro Thr Arg Ile Lys Thr Ala Pro Val His Ala Ser Ala

180 185 190

Asn Trp Tyr Leu Glu Asn Val Ser Pro Val Leu Gln Ser Tyr Gly Ile

195 200 205

Ala Ala Ile Ala Pro Phe Ser His Arg Leu Thr Phe Asp Asn Met Pro

210 215 220

Lys Tyr Leu Gln His Leu Arg Cys Lys Val Asn Phe Gln Ala Leu Ala

225 230 235 240

Phe Val Pro His Ile Arg Gln Leu Gly Asp Ala Leu Ile His Arg Leu

245 250 255

Arg Tyr Pro Pro Ser Glu Asp Asn Met Val Ser Asn Asn Tyr Leu Arg

260 265 270

Glu Val Thr Asp Leu Lys Pro Gln Pro Val Ala Gly Lys Phe Ala Val

275 280 285

Leu His Leu Arg Phe Asp Lys Asp Met Ala Ala His Ser Ala Cys Asp

290 295 300

Phe Gly Gly Gly Lys Ala Glu Asn Leu Ala Leu Ala Lys Tyr Arg Gln

305 310 315 320

Val Ile Trp Gly Gly Arg Val Val Asn Ser Gln Phe Thr Asp Glu Glu

325 330 335

Leu Arg Ser Gln Gly Arg Cys Pro Leu Thr Pro Glu Glu Val Gly Leu

340 345 350

Leu Leu Ala Ala Leu Gly Phe Asp Asn Ser Thr Arg Leu Tyr Leu Ala

355 360 365

Ser His Lys Val Tyr Gly Gly Glu Arg Arg Val Ser Ala Leu Arg Ser

370 375 380

Leu Phe Pro Leu Met Glu Asp Lys Lys Ser Leu Ala Ser Ser Glu Glu

385 390 395 400

Arg Ala Arg Ile Lys Gly Lys Ala Ser Leu Leu Ala Ala Val Asp Tyr

405 410 415

Tyr Val Gly Met His Ser Asp Ile Phe Ile Ser Ala Ser Pro Gly Asn

420 425 430

Met His Asn Ala Met Val Gly His Arg Thr Tyr Asn Asn Leu Lys Thr

435 440 445

Ile Arg Pro Asn Met Pro Leu Leu Gly Gln Leu Phe Leu Asn Lys Thr

450 455 460

Leu Thr Trp Pro Glu Phe Arg Glu Ser Val Val Glu Gly His Gln Asn

465 470 475 480

Arg Gln Gly Gln Ile Arg Leu Arg Lys Pro Lys Gln Ser Leu Tyr Thr

485 490 495

Tyr Pro Ala Pro Asp Cys Met Cys Gln Ala

500 505

Claims

1.蛋白质，为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下任一：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1的第225-1745位的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物。

7.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的重组微生物在调控植物果实发育中的应用；

所述植物为茄科植物；

所述茄科植物为茄子。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述茄子为茄子单性结实品系。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述调控植物果实发育体现为调控所述植物的座果率。

10.方法，为如下(I)或(II)：

(I)一种培育座果率提高的植物品种的方法，包括如下步骤：使受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量提高和/或活性提高，从而获得座果率提高的植物品种；

(II)一种培育座果率降低的植物品种的方法，包括如下步骤：使受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量降低和/或活性降低，从而获得座果率降低的植物品种；

在(I)和(II)中，所述植物为茄科植物；所述茄科植物为茄子。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述茄子为茄子单性结实品系。

12.方法，为如下(III)或(IV)：

(III)一种培育座果率提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比座果率提高；

(IV)一种培育座果率降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比座果率降低。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：在(III)和(IV)中，所述植物为茄科植物；所述茄科植物为茄子。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述茄子为茄子单性结实品系。