JP2000004884A - 植物を矮性化させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、植物の矮性に関与する遺伝子の
発現を抑制することによる植物を矮性化させる方法、お
よび植物の矮性化に利用するための分子を提供すること
を課題とする。 【解決手段】 マップベースクローニングの手法を用い
ることにより、イネに矮性の異常をもたらすd1変異の原
因となる単一の遺伝子を広大な染色体領域において同定
し、単離した。単離したd1遺伝子の塩基配列を決定し、
これと構造的に関連した遺伝子のデーターベース検索を
行った結果、d1遺伝子は、植物のGタンパク質αサブユ
ニットとしてこれまで知られてきたイネのRGA1遺伝子と
して特徴づけされていた遺伝子と同一遺伝子であった。
RGA1遺伝子が植物の矮性に関与するという報告はこれま
でになされておらず、本発明者らは、d1(RGA1)遺伝子を
利用することにより、植物を矮性化させることが可能で
あることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物を矮性化させ
る方法および該方法に用いられる分子に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物体を小型化することは、農業や園芸
において様々な意義を有する。例えば、草丈またはかん
長を小型化することで、新たな美的価値を有する観賞用
植物を作出することが可能であり、また、野菜や果実を
小型化することで一口サイズなどの新たな商品価値を有
する作物を作ることもできる。また、このような産業上
の利用以外でも、例えば、実験用植物の小型化は、その
取り扱いやすさのみならず、植物の栽培空間の減少によ
る実験空間の有効利用の観点から重要である。

【０００３】植物の小型化において、特に植物の草丈あ
るいはかん長が野生型（正常型）より短くなる特性は矮
性と呼ばれる。この特性を示すイネ品種や系統はγ-線
や化学物質による突然変異誘起処理において数多く見い
出されており、それらの遺伝解析も古くから進められて
きた。これまでに60種類以上の遺伝子がこの矮性に関与
することが知られている（Rice Genetic Newsletter Vo
l.12：30-32 （1995））。しかしながら、なぜ矮性形質
を表現するのかについての知見は少なく、少数の矮性変
異体が植物成長ホルモンであるジベレリンの生合成に関
与する遺伝子の変異によって生じていることがあきらか
になっているにすぎない。

【０００４】イネ矮性変異体のなかでも大黒型矮性は、
特に第２節間の伸長を抑制し、その結果として草丈を正
常型の半分以下にするばかりでなく、粒が小円型になる
特徴があることで知られている（明峰正夫 日本学術会
報告1巻：108-314（1925）、中山 包 信州大文理学部
紀要 4巻：1-31（1954）、高橋萬右衛門・武田和義北大
農邦文紀要7巻：32-43（1969））。また、この大黒型矮
性は遺伝解析の結果、イネ第５染色体上の単一の劣性遺
伝子d1によって支配されていることが明らかとなってい
る（Nagao and Takahashi J. Fac. Agr., Hokkaido Un
iv. 53：72-130（1963）、Iwata and Omura Jpn.J.Gen
et. 51：135-137（1976））。d1遺伝子の変異体におい
ては、植物ホルモンの一種であるジベレリンの含量は高
く正常型とほぼ同じであり、外生ジベレリンの処理によ
っては草丈は回復しない（Suge, H. and Y. Murakami
Plant and Cell Physiol.,9, 411-414 (1968））。この
特徴から、d1遺伝子は植物体内でのジベレリン生合成に
関与するのではなく、ジベレリンの受容体あるいはそれ
以降のシグナル転移に関与する遺伝子座であることが推
定されている（Mitsunaga, S., T. Tashiro, and J. Ya
maguchi Theor.Appl. Genet.87：705-712（1994））。

【０００５】このため、大黒型矮性遺伝子d1を単離し、
その遺伝子産物の機能を明らかにすることは、植物にお
ける形態形成過程を明らかにする上で重要となるばかり
でなく、その知見を利用して植物の大きさの人工的な制
御をおこなう上で極めて重要であると考えられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物の矮性
に関与するd1遺伝子を単離することを課題とする。さら
に本発明は、d1遺伝子の発現を制御することにより植物
を矮性化する方法およびd1遺伝子の発現を制御するため
の分子を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】イネ矮性遺伝子d1は、イ
ネの矮性に関与するタンパク質をコードする遺伝子とし
て、これまでイネ第5染色体という広大な領域にいずれ
かの場所に存在するものとして知られていた。本発明者
らは、d1遺伝子を広大な染色体の領域から単離するため
に、マップベースクローニングの手法を利用して鋭意研
究を行いd1遺伝子その存在領域を解明し、遂に所期の遺
伝子を単離することに成功した。具体的には、まず、分
子マーカーを用いた連鎖解析を行い、d1遺伝子が存在す
る染色体上の領域を特定の分子マーカーで挟まれる領域
に絞り込んだ。次いで、絞り込んだ遺伝子周辺の領域に
つき、YACクローンの整列化による物理的地図の作成を
行い、これらクローンに対してESTマッピングを行った
結果、１つのcDNAクローン「ST5933」をd1遺伝子の候補
として同定することに成功した。

【０００８】同定されたクローンST5933の塩基配列（36
2 塩基対）はイネゲノム解析研究において解析されてお
り、遺伝子配列をデータベースに対して類似性検索を行
なった結果、同一の塩基配列を有する遺伝子をデータベ
ース上に見出した。この遺伝子は、植物のGタンパク質
のαサブユニットとして特徴づけされていた。しかしな
がら、これまで該遺伝子と植物の矮性との関わりは全く
知られていなかった。

【０００９】Gタンパク質はヒトを含めた生物において
ホルモン等の受容体あるいは受容体からのシグナル伝達
に関与する因子として機能することが知られており、イ
ネ矮性遺伝子d1は植物ホルモンであるジベレリンの受容
体あるいはそれ以降のシグナル転移に関与する可能性が
示唆されている。従って、この種の機能を有するGタン
パク質遺伝子は、イネのみならず幅広く植物界に存在す
ることが予想され、本発明者らは、d1遺伝子若しくは他
の植物の相同遺伝子の発現を抑制することにより、幅広
く植物の矮性化を行うことが可能であることを見出し
た。

【００１０】即ち、本発明は、植物の矮性に関与するd1
遺伝子若しくはその相同遺伝子の発現を抑制することに
よる植物を矮性化する方法、およびこれら遺伝子の発現
を抑制するために用いられる分子に関し、より具体的に
は、（１） 植物を矮性化するために用いる、下記
（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAの転写産物と
相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、 （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするDNA。 （ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNA。 （ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAとハ
イブリダイズするDNAであって、配列番号：１に記載の
アミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタン
パク質をコードするDNA。 （２） 植物を矮性化するために用いる、（１）の
（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAの転写産物を
特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコード
するDNA、（３） 植物細胞における発現時に、共抑制
効果により、（１）の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記
載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードするDNA、
（４） 植物細胞内において（１）の（ａ）から（ｃ）
のいずれかに記載のDNAの発現を抑制することを特徴と
する、植物を矮性化する方法、（５） （１）から
（３）のいずれかに記載のDNAを植物細胞内で発現させ
ることにより、請求項１の（ａ）から（ｃ）のいずれか
に記載のDNAの発現を抑制する、（４）に記載の方法、
（６） （１）から（３）のいずれかに記載のDNAを発
現可能に保持するトランスジェニック植物細胞、（７）
（６）に記載の細胞を含む矮性化したトランスジェニ
ック植物体、（８） （７）に記載の植物体の繁殖媒
体、に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明は、d1遺伝子若しくはその
相同遺伝子の発現を抑制することによる植物を矮性化す
る方法、およびこれら遺伝子の発現を抑制するために用
いられる分子に関する。本発明者らによりイネの矮性と
の関係が明らかにされたd1遺伝子のcDNAの塩基配列を配
列番号：２に、ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：３
に、これら遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配
列を配列番号：１に示す(これら配列は、Seoら Plant.M
ol.Biol.27:1119-1131,1995、Ishikawaら Plant.Cell.P
hysiol.36(2):353-359,1995を参照した）。

【００１２】d1遺伝子は、これまでイネに矮性の表現型
を付与する遺伝子として、イネ第5染色体という広大な
領域にいずれかの場所に存在するものとして知られてい
た。本発明者らは、マップベースクローニングの手法を
利用することにより、イネ第5染色体におけるd1遺伝子
の存在領域の絞り込みを行い、遂に単一の遺伝子として
同定することに成功した。この遺伝子は、細胞内へのシ
グナル伝達に関与する三量体Gタンパク質αサブユニッ
トをコードする遺伝子として、これまでに単離され特徴
づけされていたが(Seoら Plant.Mol.Biol.27:1119-113
1,1995、Ishikawaら Plant.Cell.Physiol.36(2):353-35
9,1995）、本発明者らにより初めて植物の矮性との関係
が証明された。ノーザンハイブリダイゼーション解析の
結果、d1遺伝子は、正常型においては発現していたが、
d1突然変異系統においてはその発現は検出されなかった
（実施例５）。これら事実から、本発明者らは、d1遺伝
子の発現を抑制することにより、植物において矮性化の
表現型を誘導することが可能であることを見出した。

【００１３】本発明において、発現を抑制し植物を矮性
化させるための標的遺伝子としては、イネd1遺伝子に限
定されない。機能的に同等なタンパク質をコードする限
り、イネd1遺伝子以外の他の植物由来の遺伝子も標的遺
伝子として利用することが可能である。ここで「機能的
に同等なタンパク質」とは、d1遺伝子がコードするタン
パク質以外のタンパク質であって、その発現の抑制によ
り、植物の矮性化が誘導されるGタンパク質を指す。イ
ネ矮性遺伝子d1は三量体Gタンパク質αサブユニットを
コードし、植物ホルモンであるジベレリンの受容体ある
いはそれ以降のシグナル転移に関与する可能性が示唆さ
れ、その相同遺伝子がイネのみならず幅広く植物界に存
在することが容易に予想される。本発明においては、こ
のような相同遺伝子を利用してイネ以外の植物を矮性化
することも可能である。本発明において矮性化の標的と
するイネ以外の植物としては、これらに制限されない
が、例えば、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、トマ
ト、エンドウ、ダイズ等が挙げられる。

【００１４】イネd1遺伝子がコードするタンパク質と機
能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を単離する
ための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダ
イゼーション技術（Southern, E.M.: Journal of Molec
ular Biology, Vol. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. Science,vo
l.230, 1350-1354, 1985、Saiki, R. K. et al. Scienc
e, vol.239, 487-491,1988）が挙げられる。即ち、当業
者にとっては、イネd1遺伝子の塩基配列（配列番号：
２）もしくはその一部をプローブとして、またd1遺伝子
（配列番号：２）に特異的にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして、イネ以外の植物から
d1遺伝子の相同遺伝子を単離することは通常行いうるこ
とである。

【００１５】本発明における植物の矮性化は、植物の内
在性のd1遺伝子若しくはその相同遺伝子の発現を抑制す
ることにより行う。本発明における「遺伝子の発現の抑
制」には、遺伝子の転写の抑制、タンパク質への翻訳の
抑制が含まれる。また、遺伝子発現の完全な停止のみな
らず発現の減少も含まれる。

【００１６】植物における特定の内在性遺伝子の発現を
抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方
法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけ
るアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現
法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが
植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて
実証した(J.R.EckerおよびR.W.Davis, Proc.Natl.Acad.
USA.83:5372,1986)。その後、タバコやペチュニアにお
いても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の
発現を低下させる例が報告されており(A.R.van der Kro
lら Nature 333:866,1988)、現在では植物における遺伝
子発現を抑制させる手段として確立している。アンチセ
ンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、
以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖
形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局
部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッ
ド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハ
イブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソン
との接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング
抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成
によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成
による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位や
ポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライ
シング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形
成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結
合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻
訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によ
るペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との
相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑
制などである。これらは、転写、スプライシング、また
は翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する
(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の
複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人,pp.319-34
7,1993)。本発明で用いられるアンチセンス配列は、上
記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよ
い。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非
翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺
伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域
もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得
る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領
域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利
用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアン
チセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結さ
れ、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連
結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方
法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNA
の配列は、形質転換する植物が持つ内在性d1遺伝子（若
しくはその相同遺伝子）またはその一部と相補的な配列
であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害で
きる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRN
Aは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは9
0％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。
アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現
を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくと
も15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、
さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられ
るアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは
2.5kbよりも短い。

【００１７】内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボ
ザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能であ
る。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことを
いう。リボザイムには種々の活性を有するものがある
が、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研
究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザ
イムの設計が可能となった。リボザイムには、グループ
Ｉイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400
ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘ
ッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活
性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子,
蛋白質核酸酵素,35:2191,1990)。

【００１８】例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自
己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断する
が、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重
要とされ、15位の塩基はCの他にＡまたはUでも切断され
ることが示されている(M.Koizumiら,FEBS Lett.228:22
5,1988)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA
配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のU
C、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切
断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumi
ら,FEBS Lett. 239:285,1988, 小泉誠および大塚栄子,
蛋白質核酸酵素,35:2191,1990, M.Koizumiら, Nucleic
Acids Res. 17:7059,1989)。例えば、d1遺伝子のコード
領域（配列番号：２）中には標的となりうる部位が100
カ所以上存在する。

【００１９】また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の
目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例
えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAの
マイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,
1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こ
すように設計できることが示されている(Y.Kikuchiおよ
びN.Sasaki Nucleic Acids Res. 19:6751,1992, 菊池
洋,化学と生物 30:112,1992)。

【００２０】標的を切断できるよう設計されたリボザイ
ムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザ
イクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターお
よび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写
されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されて
いると、リボザイムの活性が失われてしまうことがあ
る。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNA
からリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボ
ザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシ
スに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも
可能である(K.Tairaら, Protein Eng. 3:733,1990, A.
M.DzianottおよびJ.J.Bujarski Proc.Natl.Acad.Sci.US
A. 86:4823,1989, C.A.GrosshansおよびR.T.Cech Nucle
ic Acids Res. 19:3875, 1991, K.Tairaら Nucleic Aci
ds Res. 19:5125, 1991)。また、このような構成単位を
タンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断でき
るようにして、より効果を高めることもできる(N.Yuyam
aら Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,1992)。こ
のようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子
の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制す
ることができる。

【００２１】内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標
的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNA
の形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成
されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と
同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換に
より導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性
遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共
抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においては
しばしば観察される(Curr.Biol.7:R793,1997,Curr.Bio
l.6:810,1996)。例えば、d1遺伝子が共抑制された植物
体を得るためには、d1遺伝子若しくはこれと類似した配
列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNA
を目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からd1変異
体の形質を有する植物、即ち矮性となった植物を選択す
ればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全
に同一である必要はないが、好ましくは90％以上の配列
の同一性を有する。

【００２２】さらに、本発明における内在性遺伝子の発
現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質
を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達
成することができる。ドミナントネガティブの形質を有
する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、
植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失も
しくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。本
発明で利用されるd1遺伝子は、ヘテロ３量体Gタンパク
質のαサブユニットとして知られる。一般的に、αサブ
ユニット中のGTP/GDP結合活性やGTPアーゼ活性に重要な
領域に変異を入れ、ヘテロ３量体の形成やレセプターと
の結合に重要な領域は野生型のままにした変異体タンパ
ク質を発現させれば、該タンパク質は他のサブユニット
やレセプターと複合体を形成するが、GTPによって活性
化されないため、ドミナントネガティブの形質を持つと
考えられる。例えば、Gタンパク質のαサブユニットに
よく保存されているアミノ酸配列(-Asp-Val-Gly-Gly-Gl
n-)は、GTPのγ位のリン酸基と相互作用する部位と考え
られている。例えば、このアミノ酸配列中の一つ目のGl
yをThrへ置換したあるGタンパク質αサブユニットの変
異体タンパク質は、COS-1細胞中で発現させるとドミナ
ントネガティブの形質を示すことが示されている(j.Bio
l.Chem. 266:4673,1991)。こうした変異を入れたドミナ
ントネガティブタンパク質を発現するように形質転換さ
れた植物は、標的遺伝子の機能が阻害されると考えられ
る。

【００２３】本発明で利用される、遺伝子の発現を抑制
する機能を有する上記のようなDNAを利用して矮性化し
た形質転換植物体を作製する場合には、該DNAを適当な
ベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これに
より得られた形質転換植物細胞を再生させる。用いられ
るベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現さ
せることが可能なものであれば特に制限はない。例え
ば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプ
ロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの
35Sプロモーター）を有するベクターを用いることが可
能である。また、植物の組織特異的なプロモーターを用
いれば、組織特異的な矮性化、例えば、葉や花、実など
植物の特定の部分を矮性化することが可能であるかもし
れない。組織特異的プロモーターとしては、種子特異的
プロモーターとしてインゲンマメのβーファセオリン
（Bustosら (1991) EMBO J. 10:1469-1479）やダイズ
のグリシニン（Lelievreら (1992) Plant Physiol. 98:
387-391）、葉特異的プロモーターとしてはエンドウのR
bcS遺伝子（Lam and Chua (1990) Science 248:471-47
4）やコムギのCab1遺伝子（Gotornら (1993) Plant J.
3:509-518）、根特異的なプロモーターとしてはタバコ
のTobRB7遺伝子（Yamamotoら (1991) Plant Cell3:371-
382）やアグロバクテリウム・リゾゲネスのrolD遺伝子
（Elmayan and Tepfer (1995) Transgenic Res 4:388
-396）が挙げられる。また、外的な刺激により誘導的に
活性化されるプロモーターを有するベクターを用いるこ
とも可能である。ベクターを挿入する植物細胞として
は、特に制限はないが、イネ以外に、例えば、トウモロ
コシ、トマト、ダイズ、ナタネ、ポプラ、リンゴ等が挙
げられる。植物は針葉樹、広葉樹、双子葉植物、単子葉
植物などいずれでもよい。なお、ここでいう「植物細
胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細
胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれ
る。植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリ
コール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、
アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法
など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種
類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である
（Tokiら (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507参
照）。

【００２４】作出された植物体またはその繁殖媒体（例
えば、種子、塊茎、切穂など）から得た植物体は、野生
型の植物体と比較して、標的遺伝子の発現が抑制され、
これにより植物体が矮性化する。本発明における植物の
矮性化には、植物体全体の矮性化のみならず、植物体の
部分の矮性化を含む。

【００２５】なお、本発明者らにより単離されたイネd1
遺伝子もしくは他の植物の相同遺伝子を野生型の植物に
導入して発現させることにより、植物の成長を増大させ
ることも可能であるかもしれない。この場合、植物細胞
内に導入する遺伝子としては、具体的には、配列番
号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコー
ドするDNA、配列番号：１に記載のアミノ酸配列にお
いて1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／も
しくは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：１に記
載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な
タンパク質をコードするDNA、配列番号：２に記載の
塩基配列のコード領域を含むDNA、配列番号：２に記
載の塩基配列からなるDNAと相補的にハイブリダイズす
るDNAであって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列か
らなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコード
するDNAが含まれる。 植物細胞内で発現させるために利
用されるベクター、ベクターの導入される植物細胞、植
物体の再生などの方法は、上記矮性化の場合と同様に行
うことが可能である。

【００２６】

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものでは
ない。

【００２７】[実施例１] 矮性遺伝子d1の低精度連鎖解
析 インド型品種IR24にd1遺伝子をもつ日本型標識遺伝子系
統FL2を交配したF2集団100個体を育成し、各個体毎にDN
Aを抽出した。d1は第５染色体に座乗することが明らか
にされていたことから、d1遺伝子と第５染色体に座乗す
るRFLPマーカーとの連鎖解析を行い、連鎖地図を作成し
た。さらにより正確な座乗位置を決定するために、プー
ルドサンプリング法（Churchillら, Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA.90:16-20,1993）による連鎖解析を行なった。す
なわち標識遺伝子系統FL2にIR24を反復親として戻し交
雑を行って得られたBC3F2集団約2600個体を幼苗期に選
抜し、644個の矮性（劣性ホモ）個体を育成した。この
個体群に対してd1遺伝子近傍のマーカーを用いたRFLP分
析を行い、より正確な連鎖地図を作成した。その結果、
d1遺伝子はRFLPマーカーC309,S2351と組換え頻度約0.8%
で連鎖していることが明らかになった（図１）。しかし
ながらd1近傍に存在すると推定されるDNAマーカーの大
部分が利用した分離集団の親系統間で多型を示さなかっ
たことから、解析集団を変更した。

【００２８】[実施例２] 矮性遺伝子d1の高精度連鎖地
図の作成 DNAマーカーの多型を確実に得るために、分離集団の親
系統にSL18を選定した。この系統は水稲品種日本晴の遺
伝的背景（12種類の染色体）のうち、第５染色体のみを
インド型品種カサラーサ(Kasalath)の染色体に置換した
系統である。SL18とFL2を交配して得られたF2種子約130
00個を播種した後、幼苗期に3185個の矮性個体（劣性ホ
モ型）を選抜して圃場に移植した。5個体を１プールと
して葉のサンプリングを行い、637個のプールからDNAを
抽出し、RFLP分析に供した。その結果、第５染色体のd1
座近傍に位置づけられたRFLPマーカーV147では37個のプ
ールが、G5004では71個のプールが組換え個体を含み、d
1座をV147とG5004に挟まれた領域(1.8cM)に位置づけた
（図２）。組換え個体を含むプールから組換え個体を同
定するために、540個体（5個体×108プール）のDNAを抽
出後、RFLP分析によりd1とV147の間で、またd1とG5004
の間で組換えを起こしている個体を選定した。

【００２９】[実施例３] 矮性遺伝子d1を含むYACクロ
ーンの選定とそれらの整列化地図の作成 さらにd1座を含むゲノミッククローンを同定するため
に、V147およびG5004を用いてYACライブラリーをスクリ
ーニングした（Umeharaら,Molecular Breeding.1:79-8
9,1995）。その結果、V147およびG5004の塩基配列を含
むYACクローンをそれぞれ３および２種類選定すること
ができた。またカセット-PCR法を用いて調製した各YAC
クローンの末端DNA断片を用いて、YACクローンの重複の
確認と染色体歩行を行うとともに連鎖地図上へのマッピ
ングを行った。V147で選抜されたYACクローンのうち1つ
のYACクローンY5483の末端DNA断片がd1座に0.03cMで密
接に連鎖し、d1座とG5004との間に位置づけられること
が判明した。以上の結果より、このYACクローンが d1座
を含むことが明らかになった。さらにこのYACクローン
の末端DNA断片を基に再度YACクローンの選択を行なった
ところ、新たに3種類のYACクローン（Y1988、Y3745およ
びY4488）を選抜した。これらのYACクローンの重なりを
ハイブリダイゼーション法あるいはPCR法により確認し
たところ、4種類のYACクローンがd1遺伝子を含むことが
明らかとなった。

【００３０】[実施例４] 矮性遺伝子d1の候補遺伝子の
同定 イネゲノム解析研究プログラムにおいて、ESTマッピン
グ（YACクローンに対するcDNAクローンの直接的な位置
付け）が進められている。これまでに蓄積された情報を
基にして、前述のYACクローンの存在するcDNAクローン
の有無を調査したところ、ST5933の存在が明らかとなっ
た。このクローンをプローブに、高精度連鎖解析により
特定できたd1近傍の組換え個体に対してゲノミックサザ
ンハイブリダイゼーションによるRFLP解析を行なった。
その結果、ST5933から生じる9.6kbのバンド（日本晴）
はd1遺伝子と共分離することが判明した（図２）。

【００３１】さらに、分子マーカーST5933をプローブと
したd1突然変異系統のゲノミックサザンハイブリダイゼ
ーションを行った（図３）。その結果、2種の正常型イ
ネ品種日本晴（Japonica）とカサラーサ（Indica）では
約9.6kbのバンドが見られたが，9種のd1突然変異系統の
うち7系統（FL2, HO532, HO533, HO537, HO538, HO541,
HO552)で正常型イネとは違うサイズのバンドが検出さ
れた。一般に日本晴（日本型品種）とカサラーサ（イン
ド型品種）との間ではRFLPが検出されやすく、日本型品
種間では多型が極めて出にくい傾向がある．しかし、こ
の結果では，日本型品種の遺伝背景をもつd1突然変異系
統間で多型が検出された。このことは d1突然変異系統
における候補遺伝子ST5933のゲノムDNA領域に著しい構
造変異が生じていることを示す。このことからST5933が
d1遺伝子の有力な候補遺伝子であることが示唆された。
類似性検索の結果、この遺伝子は三量体Gタンパク質α
サブユニットをコードする遺伝子であり、そのcDNAなら
びにゲノムDNA領域は既に単離され、その構造（塩基配
列）は解析されていた(Seoら Plant.Mol.Biol.27:1119-
1131,1995、Ishikawaら Plant.Cell.Physiol.36(2):353
-359,1995）。

【００３２】[実施例５] ST5933 の発現パターンの解
析 ゲノミックサザンハイブリダイゼーションにより候補遺
伝子ST5933に構造変異が認められた4種のd1突然変異系
統と2つの正常型（日本晴，カサラーサ）よりRNAを抽出
し， ST5933をプローブとしてノーザンハイブリダイゼ
ーションを行った（図４）。その結果、2つの正常型で
は1.8kbのバンドが検出されたが，4種のd1突然変異系統
ではバンドは検出されなかった。この結果から、候補遺
伝子ST5933が矮性形質d1の原因遺伝子であることが支持
される。

【００３３】

【発明の効果】本発明により、植物の矮性化に関与する
イネd1遺伝子若しくは他の植物の相同遺伝子の発現を抑
制することにより植物を矮性化させる方法が提供され
た。これにより、例えば、新たな新たな商品価値を有す
る観賞用植物や農作物を作出することが可能であり、特
に農業や園芸の分野において有益である。

【００３４】

【配列表】 （１）出願人氏名又は名称：農林水産省農業生物資源研究所長 中川原 捷洋 社団法人 農林水産先端技術産業振興センター （２）発明の名称：植物を矮性化させる方法 （３）整理番号：ＭＯＡ−００３ （４）出願番号： （５）出願日： （６）配列の数：３ 配列番号 : 1 配列の長さ : 配列の型 : アミノ酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Gly Ser Ser Cys Ser Arg Ser 1 5 His Ser Leu Ser Glu Ala Glu Thr Thr Lys Asn Ala Lys Ser Ala Asp 10 15 20 Ile Asp Arg Arg Ile Leu Gln Glu Thr Lys Ala Glu Gln His Ile His 25 30 35 40 Lys Leu Leu Leu Leu Gly Ala Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr Ile Phe 45 50 55 Lys Gln Ile Lys Leu Leu Phe Gln Thr Gly Phe Asp Glu Ala Glu Leu 60 65 70 Arg Ser Tyr Thr Ser Val Ile His Ala Asn Val Tyr Gln Thr Ile Lys 75 80 85 Ile Leu Tyr Glu Gly Ala Lys Glu Leu Ser Gln Val Glu Ser Asp Ser 90 95 100 Ser Lys Tyr Val Ile Ser Pro Asp Asn Gln Glu Ile Gly Glu Lys Leu 105 110 115 120 Ser Asp Ile Asp Gly Arg Leu Asp Tyr Pro Leu Leu Asn Lys Glu Leu 125 130 135 Val Leu Asp Val Lys Arg Leu Trp Gln Asp Pro Ala Ile Gln Glu Thr 140 145 150 Tyr Leu Arg Gly Ser Ile Leu Gln Leu Pro Asp Cys Ala Gln Tyr Phe 155 160 165 Met Glu Asn Leu Asp Arg Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Val Pro Thr Lys 170 175 180 Glu Asp Val Leu Tyr Ala Arg Val Arg Thr Asn Gly Val Val Gln Ile 185 190 195 200 Gln Phe Ser Pro Val Gly Glu Asn Lys Arg Gly Gly Glu Val Tyr Arg 205 210 215 Leu Tyr Asp Val Gly Gly Gln Arg Asn Glu Arg Arg Lys Trp Ile His 220 225 230 Leu Phe Glu Gly Val Asn Ala Val Ile Phe Cys Ala Ala Ile Ser Glu 235 240 245 Tyr Asp Gln Met Leu Phe Glu Asp Glu Thr Lys Asn Arg Met Met Glu 250 255 260 Thr Lys Glu Leu Phe Asp Trp Val Leu Lys Gln Arg Cys Phe Glu Lys 265 270 275 280 Thr Ser Phe Ile Leu Phe Leu Asn Lys Phe Asp Ile Phe Glu Lys Lys 285 290 295 Ile Gln Lys Val Pro Leu Ser Val Cys Glu Trp Phe Lys Asp Tyr Gln 300 305 310 Pro Ile Ala Pro Gly Lys Gln Glu Val Glu His Ala Tyr Glu Phe Val 315 320 325 Lys Lys Lys Phe Glu Glu Leu Tyr Phe Gln Ser Ser Lys Pro Asp Arg 330 335 340 Val Asp Arg Val Phe Lys Ile Tyr Arg Thr Thr Ala Leu Asp Gln Lys 345 350 355 360 Leu Val Lys Lys Thr Phe Lys Leu Ile Asp Glu Ser Met Arg Arg Ser 365 370 375 Arg Glu Gly Thr 380 配列番号 : 2 配列の長さ : 1461 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 91 .. 1230 特徴を決定した方法 : S 配 列 GACGTCAACG TGCTTCCTGG AAAGAGAGAG GCTCAGGCAT GAGAGCATAC CTCTAAAATA 60 ATGTCCGTGC TTACCTGTGT GCTTGATAAC ATG GGC TCA TCC TGT AGC AGA TCT 114 Met Gly Ser Ser Cys Ser Arg Ser 1 5 CAT TCT TTA AGT GAG GCT GAA ACA ACC AAA AAT GCA AAA TCT GCA GAC 162 His Ser Leu Ser Glu Ala Glu Thr Thr Lys Asn Ala Lys Ser Ala Asp 10 15 20 ATT GAC AGG CGA ATT TTG CAA GAG ACA AAA GCA GAG CAA CAC ATC CAC 210 Ile Asp Arg Arg Ile Leu Gln Glu Thr Lys Ala Glu Gln His Ile His 25 30 35 40 AAG CTC TTA CTT CTT GGT GCG GGA GAA TCA GGG AAG TCT ACG ATA TTT 258 Lys Leu Leu Leu Leu Gly Ala Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr Ile Phe 45 50 55 AAA CAG ATT AAG CTC CTT TTC CAA ACT GGC TTT GAT GAG GCA GAA CTT 306 Lys Gln Ile Lys Leu Leu Phe Gln Thr Gly Phe Asp Glu Ala Glu Leu 60 65 70 AGG AGC TAC ACA TCA GTT ATC CAT GCA AAC GTC TAT CAG ACA ATT AAA 354 Arg Ser Tyr Thr Ser Val Ile His Ala Asn Val Tyr Gln Thr Ile Lys 75 80 85 ATA CTA TAT GAA GGA GCA AAA GAA CTC TCA CAA GTG GAA TCA GAT TCC 402 Ile Leu Tyr Glu Gly Ala Lys Glu Leu Ser Gln Val Glu Ser Asp Ser 90 95 100 TCA AAG TAT GTT ATA TCC CCA GAT AAC CAG GAA ATT GGA GAA AAA CTA 450 Ser Lys Tyr Val Ile Ser Pro Asp Asn Gln Glu Ile Gly Glu Lys Leu 105 110 115 120 TCA GAT ATT GAT GGC AGG TTG GAT TAT CCA CTG CTG AAC AAA GAA CTT 498 Ser Asp Ile Asp Gly Arg Leu Asp Tyr Pro Leu Leu Asn Lys Glu Leu 125 130 135 GTA CTC GAT GTA AAA AGG TTA TGG CAA GAC CCA GCC ATT CAG GAA ACT 546 Val Leu Asp Val Lys Arg Leu Trp Gln Asp Pro Ala Ile Gln Glu Thr 140 145 150 TAC TTA CGT GGA AGT ATT CTG CAA CTT CCT GAT TGT GCA CAA TAC TTC 594 Tyr Leu Arg Gly Ser Ile Leu Gln Leu Pro Asp Cys Ala Gln Tyr Phe 155 160 165 ATG GAA AAT TTG GAT CGA TTA GCT GAA GCA GGT TAT GTG CCA ACA AAG 642 Met Glu Asn Leu Asp Arg Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Val Pro Thr Lys 170 175 180 GAG GAT GTG CTT TAT GCA AGA GTA CGG ACA AAT GGT GTT GTA CAA ATA 690 Glu Asp Val Leu Tyr Ala Arg Val Arg Thr Asn Gly Val Val Gln Ile 185 190 195 200 CAA TTT AGT CCT GTT GGA GAA AAC AAA AGA GGT GGA GAG GTA TAT AGG 738 Gln Phe Ser Pro Val Gly Glu Asn Lys Arg Gly Gly Glu Val Tyr Arg 205 210 215 TTG TAT GAT GTA GGA GGC CAG AGG AAT GAG AGG AGA AAG TGG ATT CAT 786 Leu Tyr Asp Val Gly Gly Gln Arg Asn Glu Arg Arg Lys Trp Ile His 220 225 230 CTT TTT GAA GGT GTT AAT GCG GTA ATC TTT TGT GCT GCC ATT AGC GAA 834 Leu Phe Glu Gly Val Asn Ala Val Ile Phe Cys Ala Ala Ile Ser Glu 235 240 245 TAT GAT CAG ATG CTA TTT GAA GAT GAG ACA AAA AAC AGA ATG ATG GAG 882 Tyr Asp Gln Met Leu Phe Glu Asp Glu Thr Lys Asn Arg Met Met Glu 250 255 260 ACC AAG GAA CTC TTT GAC TGG GTT TTA AAG CAA AGA TGT TTT GAG AAA 930 Thr Lys Glu Leu Phe Asp Trp Val Leu Lys Gln Arg Cys Phe Glu Lys 265 270 275 280 ACA TCA TTC ATT CTG TTT CTC AAC AAA TTT GAT ATA TTC GAG AAG AAA 978 Thr Ser Phe Ile Leu Phe Leu Asn Lys Phe Asp Ile Phe Glu Lys Lys 285 290 295 ATA CAA AAG GTT CCT TTA AGT GTG TGC GAG TGG TTT AAA GAC TAC CAG 1026 Ile Gln Lys Val Pro Leu Ser Val Cys Glu Trp Phe Lys Asp Tyr Gln 300 305 310 CCT ATT GCA CCT GGG AAA CAG GAG GTT GAA CAT GCA TAT GAG TTT GTC 1074 Pro Ile Ala Pro Gly Lys Gln Glu Val Glu His Ala Tyr Glu Phe Val 315 320 325 AAG AAG AAG TTT GAA GAG CTC TAC TTC CAG AGC AGC AAG CCT GAC CGT 1122 Lys Lys Lys Phe Glu Glu Leu Tyr Phe Gln Ser Ser Lys Pro Asp Arg 330 335 340 GTG GAC CGC GTC TTC AAA ATC TAC AGA ACT ACG GCC CTA GAC CAG AAA 1170 Val Asp Arg Val Phe Lys Ile Tyr Arg Thr Thr Ala Leu Asp Gln Lys 345 350 355 360 CTT GTA AAG AAG ACA TTC AAG TTG ATT GAT GAG AGC ATG AGA CGC TCC 1218 Leu Val Lys Lys Thr Phe Lys Leu Ile Asp Glu Ser Met Arg Arg Ser 365 370 375 AGG GAA GGA ACT TGATTCAGAG CTAAGACTAG GTTGTAAGTC ACACAGGGAA 1270 Arg Glu Gly Thr 380 GGTAATTAGG ACGGCGAGAG GAACAAAGTT TCACACTGTC ACAGCTTTAT CTGTTGTAAT 1330 TCTTTTACAC GTGGACCATT GATTGATCTT TTGGTTCTTA CTGTGGGCTG TTCAGGTCTG 1390 TACCCTATTT TTTGTTCTCT AGTTAGCCAT TGTGCAAATT TTCCTTGAAT CAGATTCTCT 1450 ACCTGTTGTC T 1461 配列番号 : 3 配列の長さ : 8107 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : Genomic DNA 配 列 GAATTCTCAT GTCTGTAACT TCATTTTTAA GCCATAGAAA TCTAGTTCCA TCCAAAACAC 60 CAAAACGGAT GGTGTTTTAC AGTAGCTTGT CATATGCTTT TAGGCGAGCT TACTAGTCTA 120 TTTTTCATAA TACTTTTTCA CAATTTTGAA AGGCCTAGGG AGTAATATTT AATGGTGCAA 180 AAGGGACGAG TTTTGAAACA TTTGTTTGTC GCAGAAGCAC CAGACCATTC TGATTGTTAT 240 TGTAAGCTGT AACATCAAAG TTTTGGCAGC AGGTTTTCAT GTGCTCTTAA GCGTTGGGGG 300 TTTGTTCCGT TTGGTTTTCA ACTGTATGCT AGCTTTCTCT ATTAGCCAAT GTAATGGCAG 360 TTGCAAAATC TGTTGTAGTG CAGGCGTGCA GCTAAATGCA GTATAGCTGA CTGTTAACTT 420 TAAGCTGATT GTCCCATGCA TGTCCCAGTA AAAGGACAGT CAGGAATGAG TCTCATGGGT 480 CAATATATGG TGCAGACATG TCAGTAGGAT ATAGGAGTAT TACATTATAG TTTTTTCAGC 540 TTCAATAACG TTCATGTTAG CTTGTACATT GTATGGCAAC CCTTCCATAC TTGCGTTAGC 600 ACAAAAGTTC ACCATGTTAG CTTGGCTTTA GATCAGTTTA AACTGTCCTT TAATAGCAAA 660 TTAATAATCC ATAAAATGAA ATTTTACTTC CACTGTTTAC CAGTGCTACT ACTGTTCTAC 720 CTCCAGCGTT CAACAGCTGA GAAACGTGAG GAGTCCAGCA CCAGCAGTAT CATTTACTGC 780 AATGCGAGAG AGATGTTCTC CGTTTCCTCC TTCACTGAGG CTTAGGAGTA GGAGGAGTAG 840 TAGTGATTTT TTCGTGTCGA CTTGTTTAAC ATTATCATTA ACACCATCAA GTGTCAATGC 900 CAGTAGGCTG CTGCTTCTAA TCATTTCTTC CTTCCCTCTT CTAACGCCAT TATCGTTTTA 960 TCTCACCTTG CATTTATGTT CAAGTGACCA TGGTTCTTGA CAGAAGCAGC CCTTGTTCTT 1020 TCCTGTCCCT TTGTTTGTTC AGTACGCTAT TATTCTCTTG GGTACTAGAC CTTGTATAAA 1080 CCGGTTGTGA AATCCTCAAT CAAATAAAAG TTAACTCGAA ATTTGTGGCC TGTTCCAAGT 1140 GTTTGGCAAA CCAATATGTA TATTATCCAC CCGATTATCT AATGGCAATA CAGTGCCTAA 1200 AATTCCTGCT TCCGGAGTCT TAAACTTTAC CCGAATCCAA TCTGGAAACC GAAAAGACAG 1260 CTGCTTAGCT GATGGCAAGT CACTGGGTAC ATTGATTTGT GTTAATTTTC AGTCCAATAA 1320 AACAGCGCAA AAATTGTAAG GGTGATCCCT CTTTAGTAAA GCCATGCATT CTGCAAACTC 1380 TGTTGCAATG CAAGCTGTAT CCTATATCCA GTGCCGATGA ACCAATTCTG TTTGCAGACT 1440 GTACCCTATC TCTACTCTAC AAGCCAACCA AAGGAAAGTG TTTGATCTGC AGTGGAATAC 1500 TAGCAGGTAT TCCACCATTT CAGGGTTGGG AGTGTGATTG ATATGCAGGA GATTGACATT 1560 GTGCAGAACA TTGGCCGTCA GCTGCCGCTG CCGTCGCCGG TGGTGTCGGT GAGAAAGCCC 1620 GGTGGTGGTG GTTGTGCCGG CGGCGAGGAG TGGCTGCAAC AGGATGGGCT GTTGTGCATG 1680 GGCGGATCAG CGGGTGGCTT ATGGCGGTGG CCACGCTGTT AGCCGGCGAC GGACCCGGCG 1740 GCGGCGTCCT TCACGAGGGA CGGCGCATGA TGATCCTGGA TAATTTCGAG ACTTCGGGCC 1800 GGCGTTCGTG CAAAGCCCAT ACATATTCTA CGCGCAACTG TCACGCACAA AAACGAAGTT 1860 TTTAGTACCA CATGGAAAAT CTATGACGAC TAACACCGGC ATAAAAGACG ACGCGCTCGC 1920 ATAGCGGGAG TTGGCAGTTT TCGGCTGCTG GAGAAAACGA GGTTTCTCCC TCGATCGAAT 1980 GGATGCAAAC ATCCTCCCGA CTTTGGCCCA CTAGGGAGGG AAGGTGTGAG TCACCCTGGG 2040 CTCCAGACGG CTGCGTCATG GAGCGAAGAG GACCAACCGA CACCCTTCTC CCCACCCATT 2100 GGCGAATGCC CTAGAGGTTT GGGCAACCGA CACCCTTCTC CCCACCTATT GACGAATGCC 2160 CTTGGGTTGA GATAGGAGTA GAGGGGAGTG AGGTCTTCTC CCCACCCATT GGCGAATGCC 2220 TTTGGGTTGA GATAGGAGTA GAGGGGAGTG AGGTCTTCTC CCCACCCATT GGCGAATGCC 2280 CTAGAGGTTT GGGCAACCGA CACCCTTCTC CCCACCCATT GGCGAATGCC CTAGAGGTTT 2340 GGGTTGAGAT AGGAGTAGAG GGGAGTGAGG TGGAAGAAGA TTGCTAGTTG GCTTGTGGGG 2400 TTCCACGTGG GCCCTGCACT GACTCAGCCA CCACGTTAAC AAAACCGGAA AGCAATACTA 2460 CCTTGGGATT AAAAGTGGTC CGTTTGCAAG ATTAGGGGTT CAGGGCCGTG TAAAACTCAA 2520 CGACAAGATA AGGGACCTTA GATGAACTTT TTTGGGAGAT GAGGCGCCTG TGCATATGAC 2580 CCATAGGCAG GCGACACCGC GGCAGAGCGG CGCTGCACGA CCTCCGCCTC CCCAATCCGT 2640 CCCGTCTCCT CGCCCGCCGC CCTCGACTCC CGTCTCCTCG CCTGCCGCTG GCGCCGATCT 2700 CCATCCTGCT AGCAGAGGTG GCGCCGGCGT CCTCCTGCTC CCGCCGCATT CGCATCCTAA 2760 TCCATCCCAT CCGGCCTCGG CCTCGAATTT CGTCTCCTCG CCCGCCGCTT GCGCCGATCC 2820 CATCCTGCGA GCAGAGGTGG CGCCCGGCGT CCTCCTTCCA CCGTATCGTA GCTCGCCGGT 2880 GAGCATCCCT CCCTACCCAC ACCTCATCAG GTATTCTGCG TTATCCCTCA AAAAGTTTGG 2940 GGGTTCAACC GAAACAGGGT TAGATCTGCC TCTGCCCAGC TCCACCTACT TTCAAGTTGT 3000 TAATTTTGAT TTCCGTTTTT AGCAGATGTA ATTTGGTTAT TGAATCTCAT CCAAACACCC 3060 TCAGAACGAA AAATGTAAGC TTACATAATT TGTACTCATC CAAACTTACA TAAATTTCTT 3120 AAGGAGAATC TAGACCACAA ACTACCCATA GTCACACAAA ATATCTTTTT ATCAAGGTAT 3180 TCTTATAAGT AATTTTAATT CCACAAAATT TTCTAAAGGA CATACTGTGA CACTTGGCAT 3240 GAATCTAATT TAACATTCTT TCTTTATCAG GTTATAAATT GAAACCATTG AACGTATTTT 3300 GTCTTCCCGT CCCTACAACA TTGTGATATA TCTGTAATAT TTTAATATTT TTAATTTTAA 3360 AAATATTTAG ACTAATAATA TAGATATTTA ATTAGGTAAT TAATAAATTC AAATCAAATG 3420 TAGTTTGAAA TAAATAAACA AAATGATATA TGCCAAGTAC AATCTAATAT CGGGCATGAT 3480 TTTAGATGTA GTAGGTATTA TTCTGGAATA CTCCTCGTTG AAACATATGG AACGCATTTC 3540 CCTGAAAAAG GAAAATTTTT TGCCCCGACC CCTCGACACC AACCCCGTCG GATGTGAAGC 3600 CGACGCGCCA GATGGAGGCC AGCGGTGCCA ATGCGTAGGC CAATCGTGCC TCTGGGGAAA 3660 TCTTATCTCC CGGGGCCGGA CGGCTCCGCT CCACTTCCCT CCCCGAGTCA CTCAAACCAT 3720 CCAATCCCCC ACACTCCCTT CCCTTGCCCC CATTCCCCAC CGCCGCAAGG AAAAATATTG 3780 TTAATAAACA ATGATGTTGA TGTATTATTA ATAAACAATG ATATTGATGT ATTTCTAAAT 3840 ATTTTCACGT ATTATTTATT AAGTGTCAGT GATTGAAATG GATCCTGGTC GGAAATGAAT 3900 CCTGGTCGGA AAATGGTTAC TAATGTTTTT CCTTCATATA ATATTTCTGG ATATGTATAA 3960 CAATGTGGGT CAGCAATATT GAACTATGCA AACCATTACT CTGTACAATC TTTTCTTTTC 4020 AAATGCTGGC CACATTTCGC TCGAGCTTAC TGCTCATGTA TGCAGCTCAT GGATCCTGAG 4080 ATCTAGACGT CAACGTGCTT CCTGGAAAGA GAGAGGCTCA GGCATGAGAG CATACCTCTA 4140 AAATAATGTC CGTGCTTACC TGAGTGCTTG ATAACATGGG CTCATCCTGT AGCAGATCTC 4200 ATTCTTTAAG TGAGGCTGAA ACAACAAAAA ATGCAAAAGT AAGTTAGCAC TCGGACTTAC 4260 TGAACAAGTA AATGCTAACT CAATTCTTGA TTTGAGAGTT GCCACATTTG GTTTCTTCTA 4320 ATTCAGCTGG TAACAGTCTG CAGACATTGA CAGGCGAATT TTGCAAGAGA CAAAAGCAGA 4380 GCAACACATC CACAAGCTCT TACTTCTTGG TATTGCTAAC TTTCCCAAAT TTAAGTGGTC 4440 ATTTTCCTTG TCACAATTAT CTGCGCTACC TTTAGTATCT ATTGGTGGAG AAAATTAATT 4500 GTTTCTGTTG TTCCTATTTA CCTCTATAAA AAAACCTTTC TCATGTTATT TCCAAAAAAA 4560 AAGAAGATAA ATAAATGTAT CCTAGAAAAT TTTAGTTTGA ACTTGTTCTC AATGTGGATC 4620 CATCCTTCTT TCTCTCTCTC AATTGCTTCT GTTTTAAGGT GCGGCAGAAT CAGGGAAGTC 4680 TACGATATTT AAACAGGTGA TGAATGTTAT ATTCCATGGA GAATCATAAC CCGTACGCCG 4740 CTAGTTAGTC TGATGTATTC TTACTGTTCA CCTGCAGATT AAGCTCCTTT TCCAAACTGG 4800 CTTTGATGAG GCAGAACTTA GGAGCTACAC ATCAGTTATC CATGCAAACG TCTATCAGAC 4860 AATTAAAGTA TGCAATACTG GAAAGGGTGT GTCTTTTTTT TCTTATTGCA AAGTGGGGAT 4920 TATGTAGGAG AGTCGACTAG GGATTTGTAT TCTGTTCATA AGGAAATGCG TTCATACTTT 4980 TCCTTTTTGT CGAGTAATGT GTTAAATGTT AACAGATACT ATATGAAGGA GCAAAAGAAC 5040 TCTCACAAGT GGAATCAGAT TCCTCAAAGT ATGTTATATC CCCAGATAAC CAGGTTTGTC 5100 CTTACTCTTT ACTCAACAGT TAAAGCTAAA TCTGTGCATA TGAACATGTC TTGTTAAATC 5160 TGGGAATACA AACATTTTGA TTTGCAACAT TTCTGTTGTA GTCAAGCTGC TCGGCTCTAT 5220 GTTTTAACCT GTTAAGACCT TGTAGACTGT GCTCGGCTCT ATTGTAGTCT TATATTTTAC 5280 ACGGTCATTC TATAATGAAA ACTTGAAAAA GATATCTATT GAACCGTTCA ATGTACTGAA 5340 CAAAGTAGAA AAGAACAATG AGATTTTGTA ACATTTATTC TTCCTTGTTT ATTTGATTGC 5400 TTCAGACAAT TGTTGATATG CTAAAAATAA CTTGGTATCA AATGTGGGTG TTATAAGATT 5460 CAATTTTTTC CTCAACCAGG TTAAAAAAAG TATACCTTTG TGCATTTCCC TGGTTCCGTT 5520 GCTTTGGAAC TTTAAAGGAA AACTGACTTT CCTTAGGCAT TGAAAGACAA ATATCACCAG 5580 TTTCACACTG TACACCTTAC CAACCAATTT GGTTTCTTAG ATGTCATTTA CTTTGTCATA 5640 TCATCAGGAA ATTGGAGAAA AACTATCAGA TATTGATGGC AGGTTGGATT ATCCACTGCT 5700 GAACAAAGAA CTTGTACTCG ATGTAAAAAG GTTATGGCAA GACCCAGTCA TTCAGGTGAA 5760 AACAAATAGC CATTCAAATC TTTTGAAGTT ATATAGTTTT CCTGGCCAGG TGTGCTGAAG 5820 CAATGCTCTA TACTGTAGGA AACTTACTTA CGTGGAAGTA TTCTGCAACT TCCTGATTGT 5880 GCACAATACT TCATGGAAAA TTTGGTTCGA TTAGCCGAAG CAGGTTATGT GCCAACAAAG 5940 GTGTGCTGTC CATGTTCATA GACAATTATT TACATATTCT CAGATATTTG TCCTGACACC 6000 ATTTCATGTT GATTTTAAGT CTACTTAGTC AGAGGTTGTC AAATGGTTAA CTATGTGTAC 6060 TGAGTCAGAG GTTGCCAAAT AGTTTTAAAA GATGGGCATA TGTTTATCCT TATCTTTTAA 6120 ATAATATTGG AGGCTATCCT TTAAAATTCA ATATTAGGGA GGAGAAACTA TTATTCTACC 6180 GTTATTACGC AGTCTACATA ACGAAGGTAA AAAATGTCCC TGTGAAACAT AGGGTGCAAA 6240 ACTACTGTGA ATAAAACTCT ACTTATCTAA GCACCTTGAG CTTTTGAGTT CCCACATATT 6300 AATCTTATGA CACTAGCATA TATTTTTTTT GTTCAGTTCC TTCAATAAGT TGCAAACCAC 6360 AAATATGATC ACTGTACCAT CCACTTTTGC AACCATTTCC CGTCATTTCT TAAGCATAGA 6420 AAATTGTTTG TCACTTGTTT AAGTCCACAC TGCATGAAAA TTCCAATTAA CTTTGTGTGC 6480 TAAGTGAAGA TATGACTCCA TATTTCTGCA TTTAGCAGTC TGGATGGGAT AATTTGTGAT 6540 TGTACCTTGT CTAATGGTTC GTTTGAAAGG CTGGTAGTTG ATCTTCCATA CTTAAGAATG 6600 CTTGCAGTAT TATAGTTGTC AATATTATGA GTCATTTTCC AGGAGGATGT GCTTTATGCA 6660 AGAGTACGGA CAAATGGTGT TGTACAAATA CAATTTAGGT AATCTGCTGA CACTATTTTT 6720 TGCACATTTT TTTGCTGGTT GCTCTACTAT GTACAGAACG ACAAGTTGAA GTCCTTTTTT 6780 CCTCCCTTTT CACTTCTAAG ATATGACCTG AGAGGTTCTG AATGTAGCTG TTATAAGATG 6840 AGTTGAATCA TCTAGTTAAC TGGGTTTCTT TCTGCAGTCC TGTTGGAGAA AACAAAAGAG 6900 GTGGAGAGGT ATATAGGTTG TATGATGTAG GAGGCCAGAG GAATGAGAGG AGAAAGTGGA 6960 TTCATCTTTT TGAAGGTGTT AATGCGGTAA TCTTTTGTGC TGCCATTAGC GAGTAAGTAC 7020 AATTTTTTTG ATTGTTGAAC TTATCCTAAT CTGCTAAGTT CTTCTCATAG GCTTCTTGTT 7080 CATTTCAGAT ATGATCAGAT GCTATTTGAA GATGAGACAA AAAACAGAAT GATGGAGACC 7140 AAGGAACTCT TTGACTGGGT TTTAAAGCAA AGATGTTTTG AGGTCTGCAT GCATCCATTT 7200 CTGCAACCTT TGTGCTCATG CTTTTTTTTC TCATTTTGAA ACTAATTACG GTGCTATATT 7260 GACCATCAGA AAACATCATT CATTCTGTTT CTCAACAAAT TTGATATATG CGAGAAGAAA 7320 ATACAAAAGG TAAGGCCTGC TCTTTGTACC AATGCATAGT TTAGTACTAA ATGTTACCAA 7380 CATTTATGTT TTCGCTGGTT ACGTAGGTTC CTTTAAGTGT GTGCGAGTGG TTTAAAGACT 7440 ACCAGCCTAT TGCACCTGGG AAACAGGAGG TTGAACATGC ATATGAGTGA GTCCACTACT 7500 CGCCCTCTCA GATGAACATG GGCATTTGGC CATTTGTAAT GTTGCTGCAT GGTGCACTTA 7560 TATGCCTTGA TAAGTTTTTC CATTCTAATG TTATATAGTA TCAAACGTTC ATCATTACTG 7620 TGGCTTATGG TCTGGAGTGA CGTTTTACAG GTTTGTCAAG AAGAAGTTTG AAGAGCTCTA 7680 CTTCCAGAGC AGCAAGCCTG ACCGTGTGGA CCGCGTCTTC AAAATCTACA GAACTACGGC 7740 CCTAGACCAG AAACTTGTAA AGAAGACATT CAAGTTGATT GATGAGAGCA TGAGACGCTC 7800 CAGGGAAGGA ACTTGATTCA GAGCTAAGAC TAGGTTGTAA GTCACACAGG GAAGGTAATT 7860 AGGACGGCGA GAGGAACAAA GTTTCACACT GTCACAGCTT TATCTGTTGT AATTCTTTTA 7920 CACGTGGACC ATTGATTGAC CTTTTGGTTC TTACTGTGGG CTGTTCAGGT CTGTACCCTA 7980 TTTTTTGTTC TCTAGTTAGC CATTGTGCAA ATTTTCCTTG AATCAGATTC TCTACCTGTT 8040 GTCTATGTGT GTTATCTTGG TCTGTTAATT TGCATAGCCC ACTTGTTACA AAAGGAGAGC 8100 CGAATTC 8107

【図面の簡単な説明】

【図１】低精度の連鎖解析によるd1座の推定領域を示
す。

【図２】高精度の連鎖解析によるd1座の推定領域を示
す。

【図３】ST5933をプローブにした２種のd1野生型品種
(日本晴、カサラーサ)ならびに９種のd1変異体品種(FL
2、HO532、HO533、HO537、HO538、HO541、HO552、CM38
2、CM1792)のゲノミックサザンハイブリダイゼーション
の結果を示す電気泳動像である。0.8%アガロースゲルに
よる電気泳動後ニトロセルロース膜へブロットした。シ
グナルの検出にはECL系を用いた。

【図４】ST5933をプローブにした２種のd1野生型品種
(日本晴、カサラーサ)ならびに４種のd1変異体品種(FL
2、HO532、HO541、HO552)のノザンハイブリダイゼーシ
ョンの結果を示す電気泳動像である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年８月２日（１９９９．８．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１０】即ち、本発明は、植物の矮性に関与するd1
遺伝子若しくはその相同遺伝子の発現を抑制することに
よる植物を矮性化する方法、およびこれら遺伝子の発現
を抑制するために用いられる分子に関し、より具体的に
は、 （１） 植物を矮性化するために用いる、下記（ａ）か
ら（ｃ）のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的な
アンチセンスRNAをコードするDNA。 （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするDNA、 （ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNA。 （ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであ
って、その発現が抑制されることによって植物の矮性化
が誘導されるDNA。 （２） 植物を矮性化するために用いる、請求項１の
（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAの転写産物を
特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコード
するDNA、 （３） 植物を矮性化するために用いるDNAであって、
植物細胞における発現時に、共抑制効果により、下記
（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAの発現を抑制
させるRNAをコードし、下記（ａ）から（ｃ）のいずれ
かに記載のDNAと90％以上の相同性を有するDNA、 （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタン
パク質をコードするDNA。 （ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNA。 （ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであ
って、その発現が抑制されることによって植物の矮性化
が誘導されるDNA。（４） （１）から（３）のいずれかに記載のDNAを発
現可能に保持するトランスジェニック植物細胞、 に関する。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１４】イネd1遺伝子がコードするタンパク質と機
能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を単離する
ための当業者によく知られた方法としては、ストリンジ
ェントな条件下におけるハイブリダイゼーション技術
（Southern, E.M.: Journal ofMolecular Biology, Vo
l. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技
術（Saiki, R. K. et al. Science, vol.230, 1350-135
4, 1985、Saiki, R. K.et al. Science, vol.239, 487-
491, 1988）が挙げられる。即ち、当業者にとっては、
イネd1遺伝子の塩基配列（配 列番号：２）もしくはそ
の一部をプローブとして、またd1遺伝子（配列番号：
２）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
をプライマーとして、イネ以外の植物からd1遺伝子の相
同遺伝子を単離することは通常行いうることである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 吉村 淳 福岡県福岡市中央区港１−10−３−32 (72)発明者 矢野 昌裕 茨城県つくば市観音台２丁目１−２ 農林 水産省農業生物資源研究所内 (72)発明者 松本 隆 茨城県つくば市観音台２丁目１−２ 農林 水産省農業生物資源研究所内 (72)発明者 佐々木 卓治 茨城県つくば市観音台２丁目１−２ 農林 水産省農業生物資源研究所内 (72)発明者 呉 健忠 茨城県つくば市上横場一杯塚446−１ 社 団法人農林水産先端技術産業振興センター 農林水産先端技術研究所内 (72)発明者 山本 公子 茨城県つくば市上横場一杯塚446−１ 社 団法人農林水産先端技術産業振興センター 農林水産先端技術研究所内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA01 CA17 CA19 CB03 4B024 AA05 AA08 BA63 CA03 DA01 GA06 4B065 AA89X AA89Y AB03 AC20 CA24 CA53

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物を矮性化するために用いる、下記
   （ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAの転写産物と
   相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA。 （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタン
   パク質をコードするDNA。 （ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNA。 （ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAとハ
   イブリダイズするDNAであって、配列番号：１に記載の
   アミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタン
   パク質をコードするDNA。
2. 【請求項２】 植物を矮性化するために用いる、請求項
   １の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAの転写産
   物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコ
   ードするDNA。
3. 【請求項３】 植物細胞における発現時に、共抑制効果
   により、請求項１の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載
   のDNAの発現を抑制させるRNAをコードするDNA。
4. 【請求項４】 植物細胞内において請求項１の（ａ）か
   ら（ｃ）のいずれかに記載のDNAの発現を抑制すること
   を特徴とする、植物を矮性化する方法。
5. 【請求項５】 請求項１から３のいずれかに記載のDNA
   を植物細胞内で発現させることにより、請求項１の
   （ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAの発現を抑制
   する、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 請求項１から３のいずれかに記載のDNA
   を発現可能に保持するトランスジェニック植物細胞。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の細胞を含む矮性化した
   トランスジェニック植物体。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の植物体の繁殖媒体。