CN102344486B

CN102344486B - 利用cry1g380r创建植物矮化以及提早开花的方法

Info

Publication number: CN102344486B
Application number: CN 201110130339
Authority: CN
Inventors: 杨洪全; 顾南南
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2011-05-19
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2031-05-19
Also published as: CN102344486A

Abstract

一种农业科学技术领域的利用CRY1^G380R创建植物矮化以及提早开花的方法，通过定点诱变植物隐花色素CRY1的保守位点可导致植物的组成型矮化，即植物矮化发育受光质、光照强度的影响微小；此方法同时还可导致植物明显地早开花，并且此早开花表型不依赖于植物生长的光周期条件。

Description

利用CRY1G380R创建植物矮化以及提早开花的方法

技术领域

本发明涉及的是一种农业科学技术领域的方法，具体是一种利用植物隐花色素的突变蛋白CRY1^G380R创建植物矮化以及提早开花的方法。

背景技术

光对植物生长发育以及动物生理都起重要调控作用。太阳光谱中蓝光/A区紫外光、红光、远红光是调控植物生长发育的主要波段。动植物中普遍存在蓝光/A区紫外光光受体CRYPTOCHROME(CRY)，又称为隐花色素。动植物的CRY蛋白都存在一个保守的N端结构域，称为PHR结构域(Photolyase-Related Region)。这些PHR结构域都与古老的DNA光裂解酶(photolyase)家族的同源性很高，属于一个蛋白超家族(photolyase/CRY)，具有非常相似的蛋白序列、三维空间结构、光激活机制。甚至有极少数氨基酸位点存在于原核至真核的各界生物的photolyase/CRY超家族成员中，并且完全保守；其中包括拟南芥CRY1的第380位甘氨酸(G380)，它在水稻OsCRY1b的对应位点为第388位甘氨酸(G388)。

植物CRY(包括拟南芥CRY1、水稻OsCRY1b)主要参与调控植物的光形态建成和开花时间。黑暗条件下，CRY不具有生理活性，植物幼苗下胚轴伸长迅速且子叶闭合呈钩状弯曲，以利于快速破土见光，称为“暗形态建成”(Skotomorphogenesis)。自然光照条件下，植物CRY受蓝光/A区紫外光激活后介导蓝光信号通路，促进幼苗子叶充分打开并扩展，下胚轴伸长受到抑制，以利于植物机体基因表达、合成色素，进行充分的营养生长，称为“光形态建成”(photomorphogenesis)，为下一步进入生殖生长的开花阶段做准备。目前已有研究证明，利用35S强启动子的转基因技术使植物CRY1光受体蛋白(如拟南芥CRY1或OsCRY1b)在植物中过量表达，能导致植物呈现对蓝光特异性的增强光反应的表型；即仅在蓝光下生长时植株呈现矮化的表型，而在红光、远红光以及黑暗条件下，过量表达CRY1或OsCRY1b的植株其形态建成表型与野生型类似；另外，拟南芥中CRY1只在另一隐花色素CRY2缺失的遗传背景下才表现其促进开花的作用，在野生型中过量表达CRY1光受体蛋白对植物的开花时间的影响比较小。

经过对现有与植物隐花色素CRY相关的技术的检索发现，只有一种方法能够导致植物呈现组成型的光形态建成的表型，(COP表型，Constitutive Photomorphogenesis)。这一方法是，将拟南芥CRY1、CRY2或水稻CRY1b的C端(分别表示为CCT1、CCT2、OsCCT1b)或其全长蛋白与GUS融合后产生的重组蛋白在植物中过量表达时，导致植株不仅在蓝光下呈现出增强的光反应的表型，而且在红光、远红光以及黑暗条件下都呈现出相似的超敏感的光反应的表型[Yang，H.Q.，et al.，(2000)The C termini of Arabidopsis cryptochromes mediate aconstitutive light response.Cell 103：815-827.Zhang，Y.C.，et al.，(2006)Functional andsignaling mechanism analysis of rice CRYPTOCHROME 1.Plant Journal 46：971-983.Sang，Y.，and Li，Q.H.，et al.，(2005)N-terminal domain-mediated homodimerization is required forphotoreceptor activity of Arabidopsis CRYPTOCHROME 1.Plant Cell 17：1569-1584.]。

CRY1的G380以及OsCRY1b的G388在进化中的完全保守性意味着该甘氨酸位点(glycine，G)对于相应CRY的生理功能而言是至关重要的，该G位点突变后很可能导致相应CRY蛋白的生理功能发生明显改变(功能缺失，抑或功能获得)。目前关于该保守G位点突变后怎样影响相应的photolyase/CRY蛋白功能，对生物体会产生怎样的生理影响尚无报导。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种利用CRY1^G380R创建植物矮化以及提早开花的方法，通过定点诱变植物隐花色素CRY1的上述保守G位点也能导致植物呈现如上所述的COP表型(包括对光质及光强均不敏感的组成型矮化表型)的方法；本发明的这一方法还导致另外一方面效应，即导致植物提早开花。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种植物隐花色素的突变蛋白CRY1^G380R，包括：

1)拟南芥隐花色素突变蛋白CRY1^G380R的氨基酸序列，如SEQ ID No.1所示；以及

2)水稻隐花色素突变蛋白OsCRY1b^G388R的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示。

本发明涉及上述突变蛋白CRY1^G380R的应用，通过CRY1^G380R创建植物矮化或植物早开花。

所述的创建是指：通过将拟南芥CRY1的G380或水稻OsCRY1b相对应的G388突变为R，再利用35S启动子使该突变蛋白在植物中过量表达。

所述的过量表达是通过包括定点诱变技术在内的分子克隆技术，构建过量表达CRY1^G380R、OsCRY1b^G388R的植物表达载体35S::CRY1^G380R、35S::OsCRY1b^G388R。

本发明适用于培养各种矮化的供观赏和绿化的园林植物、农作物以及经济作物，包括：十字花科芸苔属、茄科番茄属、茄科烟草属、蝶形花科、禾本科稻属、禾本科大麦属的各种植物。

本发明与现有技术相比的优点在于：本发明提供的方法可导致植物的组成型矮化，即植物矮化发育受光质、光照强度的影响微小；此方法同时还可导致植物明显地早开花，并且此早开花表型不依赖于植物生长的光周期条件。

附图说明

图1为植物表达载体示意图；

图中：A为过量表达拟南芥CRY1^G380R cDNA序列的植物表达载体示意图。数字表示氨基酸残基数；B为利用ClusterX对拟南芥和水稻的CRY1进行氨基酸序列比对，显示水稻OsCRY1b的G388与拟南芥CRY1的G380相对应，并拟将其突变为R；C为过量表达水稻OsCRY1b^G388R cDNA序列的植物表达载体示意图。数字表示氨基酸残基数。

图2为35S::CRY1^G380R幼苗光形态建成表型示意图；

图中：A-D分别在黑暗(DK)、蓝光(BL，60μmol·m^-2·s^-1)、红光(RL，20μmol·m^-2·s^-1)、远红光(FR，0.2μmol·m^-2·s^-1)萌发6天的WT(野生型)和35S::CRY1^G380R#4转基因幼苗的光形态建成表型。标尺为5mm。E为上述A-D条件相对应的幼苗下胚轴长度统计分析(mm)。n≥20，误差线表示±SE。

图3为35S::OsCRY1b^G388R幼苗光形态建成表型示意图；

图中：A-D分别在黑暗(DK)、蓝光(BL，60μmol·m^-2·s^-1)、红光(RL，20μmol·m^-2·s^-1)、远红光(FR，0.2μmol·m^-2·s^-1)萌发6天的WT(野生型)和35S::OsCRY1b^G388R#2转基因幼苗的光形态建成表型。标尺为5mm。E为上述A-D条件相对应的幼苗下胚轴长度统计分析(mm)。n≥20，误差线表示±SE。

图4为成苗矮化表型示意图；

图4在长日照(LD，16h白光/8h黑暗)下生长3周的WT、35S::CRY1^G380R#4及35S::OsCRY1b^G388R#2转基因成苗的矮化表型。标尺为5cm。

图5为植株开花表型示意图；

图中：A为在长日照(LD，16h白光/8h黑暗)下生长3周的WT、35S::CRY1^G380R#4、35S::OsCRY1b^G388R#2植株的开花表型。35S::CRY1^G380R#4、35S::OsCRY1b^G388R#2植株在长日照下比WT略早开花，标尺为5cm；B为在短日照(SD，8h白光/16h黑暗)下生长6周的WT、35S::CRY1^G380R#4、35S::OsCRY1b^G388R#2植株的开花表型。35S::CRY1^G380R#4、35S::OsCRY1b^G388R#2植株在短日照下比WT显著早开花，标尺为5cm。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecular cloning：A laboratory manual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring HarborLaboratory，2001)和植物分子生物学实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：在拟南芥中过量表达CRY1^G380R或OsCRY1b^G388R的转基因植株的构建

将PCR扩增的拟南芥CRY1的全长cDNA序列克隆到pBS-Myc载体的EcoRI和SacI位点间，得到pBS-Myc-CRY1。测序后利用定点诱变PCR技术将CRY1的第380位甘氨酸诱变为精氨酸(G380R)，得到克隆pBS-Myc-CRY1^G380R。Myc-CRY1^G380R片段用XhoI和SacI酶切，插入pKYL71载体上35S启动子的后面获得过量表达Myc-CRY1^G380R的植物表达载体(图1A)，用获得的质粒转化农杆菌GV3101菌株。

通过氨基酸序列比对发现，水稻OsCRY1b的G388与拟南芥CRY1(AtCRY1)的G380相对应(图1B)。将PCR扩增的水稻OsCRY1b的全长cDNA序列克隆到pBS载体的HindIII和SacI位点间，得到pBS-OsCRY1b。测序后利用定点诱变PCR技术将OsCRY1b的第388位甘氨酸诱变为精氨酸(G388R)，得到克隆pBS-OsCRY1b^G388R。测序后将OsCRY1b^G388R片段用HindIII和SacI酶切，插入pHB载体35S启动子的后面获得过量表达OsCRY1b^G388R的植物表达载体(图1C)，用获得的质粒转化农杆菌GV3101菌株。

由获得的GV3101菌株介导，通过浸花法将上述植物表达载体转化植物，分别获得转基因植株。经Immunoblot实验分别检测蛋白Myc-CRY1^G380R或OsCRY1b^G388R的表达量，获得的转基因植株分别为过量表达CRY1^G380R或OsCRY1b^G388R的转基因植株，分别表示为35S::CRY1^G380R和35S::OsCRY1b^G388R植株。

实施例2：在拟南芥中35S::CRY1^G380R和35S::OsCRY1b^G388R转基因植株的光形态建成表型分析通过观察35S::CRY1^G380R和35S::OsCRY1b^G388R转基因植株的形态建成表型发现，35S::CRY1^G380R和35S::OsCRY1b^G388R这两种转基因植株在蓝光(BL)、红光(RL)、远红光(FR)各主要光质条件下以及在黑暗(DK)下生长时，其幼苗的形态建成表型受光条件影响小，表现为：在各种条件下，幼苗下胚轴伸长均受到明显抑制、子叶充分打开并且扩展、幼苗的子叶甚至部分下胚轴明显发红(分别为图2A-2D、图3A-3D)。对下胚轴长度的统计分析显示，35S::CRY1^G380R和35S::OsCRY1b^G388R转基因植株明显比WT矮化(分别为图2E、3E)。这表明转基因植株35S::CRY1^G380R和35S::OsCRY1b^G388R在幼苗阶段的形态建成基本都不需要依赖于光质和光强就几乎能完成正常的形态建成(除叶绿素合成外)。并且35S::CRY1^G380R和35S::OsCRY1b^G388R转基因植株成苗阶段的形态建成表型也明显比WT矮化(图4)。这些结果表明，35S::CRY1^G380R和35S::OsCRY1b^G388R转基因植株在其整个发育阶段都表现组成型的光形态建成的表型，其中最明显的特征即组成型的矮化。

实施例3：在拟南芥中转基因植株35S::CRY1^G380R、35S::OsCRY1b^G388R的开花表型分析

对开花表型的观察发现，在长日照(16h白光/8h黑暗)下，35S::CRY1^G380R、35S::OsCRY1b^G388R转基因植株比WT略早开花(图5A)。另外，拟南芥是长日照植物，WT在短日照(8h白光/16h黑暗)下其开花时间会大大延迟，而35S::CRY1^G380R、35S::OsCRY1b^G388R植株在短日照下的开花时间比WT也明显提前，与WT在长日照的开花时间接近(图SB)。这些结果表明，过量表达CRY1^G380R、OsCRY1b^G388R的植株其开花时间对光周期的变化不敏感，具有提早开花的能力。CRY1^G380R及OsCRY1b^G388R导致植物早开花这一结果也支持了植物CRY1蛋白在参与正调控植物开花方面的作用[Mockler，T.C.，et al.，(1999)Antagonisticactions of the Arabidopsis cryptochromes and phytochrome B in the regulation of floralinduction.Development 126：2073-2082.Imaizumi，T.，and Kay，S.A.(2006)Photoperiodiccontrol of flowering：not only by coincidence.Trends in Plant Sci.11：550-558]。

植物生长条件

拟南芥生长环境的空气相对湿度60％，恒温22℃，光照周期为24h，长日照条件为16h白光/8h黑暗，短日照条件为8h白光/16h黑暗。白光光照强度为160μm0l·m^-2·s^-1。光强测定用的仪器是美国Li-Cor公司的Li250光量子测定仪。

Claims

1.一种植物隐花色素的突变蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为

1）拟南芥隐花色素突变蛋白CRY1^G380R的氨基酸序列，如SEQ ID No.1所示；或

2）水稻隐花色素突变蛋白OsCRY1b^G388R的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示。

2.一种根据权利要求1所述植物隐花色素的突变蛋白的应用，其特征在于，利用35S启动子使该突变蛋白在十字花科芸苔属、茄科番茄属、茄科烟草属、蝶形花科、禾本科稻属或禾本科大麦属的植物中过量表达。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述的过量表达是通过包括定点诱变技术在内的分子克隆技术，构建过量表达CRY1^G380R、OsCRY1b^G388R的植物表达载体35S::CRY1^G380R、35S::OsCRY1b^G388R。