CN112899287B

CN112899287B - 一种水稻隐色素定点突变蛋白及其构建方法

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Publication number: CN112899287B
Application number: CN202110243352.XA
Authority: CN
Inventors: 朱国萍; 刘莉; 王鹏; 文斌; 徐蕾; 卞命杰; 陈雪霏; 胡德港; 王孟黎; 赵家鑫; 信晓蕊; 闫子木
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2041-03-04
Also published as: CN112899287A

Abstract

本发明公开了一种水稻隐色素定点突变蛋白及其构建方法,本发明从基因库中获得基因序列，进行人工密码子优化并且进行蛋白质羧基端截短之后，获得目的基因序列与pET22b质粒连接，构建出重组表达质粒。截短后基因序列如SEQ ID NO:1所示。设计突变引物，利用重组质粒进行定点突变，并将该突变重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出工程菌；本发明与现有技术相比：表达的突变体酶S392L表达量更高，聚合形式更紧密，为体外研究提供了便利。本发明S393L突变体酶更有利于水稻性状及开花周期的调控。加ATP后，光还原过程中425nm附近峰值上升，有利于农业生产，为改良水稻性状且提高水稻产量提供方向。

Description

一种水稻隐色素定点突变蛋白及其构建方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及基因、蛋白质工程技术领域，具体涉及一种水稻隐色素基因及其构建方法。

背景技术：

隐色素/光修复酶蛋白家族(cryptochrome/photolyase family,CPF)由隐色素和光修复酶两大类蛋白组成。该家族成员在生物中普遍存在，在DNA损伤修复、生物钟调节及转录调控等功能上存在很大差异。该家族蛋白具有较高的序列同源性，且具有相似的空间结构，但是二者功能有很大差别。

光修复酶及动物隐色素的作用机制已经研究的非常清楚，但是关于植物隐色素的光反应作用机制，目前有两种不同的模型。其中一种模型认为植物隐色素在基态结合的是氧化型FAD辅酶，而受到光激发后氧化型FAD 通过光还原途径获得一个电子和质子生成自由基型(FADH^·)，在此状态下植物隐色素的自磷酸化活性被激发使其自身被磷酸化。在植物隐色素自磷酸化后CCT结构域更容易被其他蛋白激酶磷酸化，进而蛋白构象发生改变，可与一种多功能的E3泛素连接酶COP1相互作用，抑制其对多种转录因子等的泛素化降解，从而促进相应光反应基因的表达。另一种模型认为植物隐色素的作用类似于光修复酶，但其基态可能是阴离子自由基型(FAD^·-)，在受到光激发后FAD^·-提供一个电子给ATP，激发自磷酸化活性，然后电子回传给FAD，后面的步骤和前一种模型相同。

水稻做为中国主要种植品种，水稻的种植面积为3千万公顷，总产量高达2亿吨以上。水稻隐色素能够蓝光抑制下胚轴伸长、蓝光刺激子叶展开、调控开花时间及气孔开放、引导昼夜节律和调节基因表达，因此可以利于水稻隐色素调控开花周期，使水稻的生长趋利避害，提高水稻产量，这将对国内民生产生重大的影响。而目前对水稻隐色素的研究较为稀缺。

发明内容：

本发明所要解决的第1个技术问题是提供定点突变的水稻隐色素基因。

本发明所要解决的第2个技术问题是提供含有该基因的表达载体。

本发明所要解决的第3个技术问题是含有该基因的宿主细胞。

本发明所要解决的第4个技术问题是所述水稻隐色素的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种水稻隐色素定点突变蛋白，该隐色素所编码的基因具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

一种水稻隐色素定点突变蛋白，该编码蛋白具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

一种载体，所述的载体为重组质粒，该重组质粒含有所述的定点突变的水稻隐色素基因的重组质粒。

一种宿主，所述的宿主为定点突变的水稻隐色素重组工程菌，该工程菌为大肠杆菌且含有所述的重组质粒表达载体，以及核苷酸序列。

本发明采用定点突变的方法改造蛋白：通过聚合酶链式反应(PCR)在目的DNA片段(质粒，基因组)中引入所需变化(包括碱基的添加，删除，点突变)。

本发明从基因库中获得基因序列，进行人工密码子优化并且进行蛋白质羧基端截短，获得目的基因序列与pET22b质粒连接，构建出重组表达质粒；设计突变引物，利用重组质粒进行定点突变，并将该突变重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于水稻隐色素蛋白表达的基因工程菌 Rosetta(DE3)/pET22b-S392L；在20℃，180rpm/min和1mMIPTG(异丙基 -β-D-硫代吡喃半乳糖苷)条件下获得了较好的表达。

相对于野生型(wild type,WT)水稻隐色素蛋白，本发明表达的突变体酶S392L为四聚体，野生型为单体，聚合形式更紧密。野生型水稻隐色素的蛋白最高吸收峰为254mAU，而S392L突变体的蛋白最高吸收峰为624 mAu，S392L突变体的表达量为野生型的2.46倍，为体外研究提供了便利。光还原比野生型慢且产生更多的自由基，隐色素中FAD辅酶的活性形式为自由基型，说明S393L突变体酶更有利于水稻性状及开花周期的调控。加 ATP后，光还原过程中425nm附近峰值上升，与野生型相比发生了明显变化，这为体外研究水稻隐色素作用机制提供了思路，有利于农业生产，为改良水稻性状且提高水稻产量提供方向。

附图说明:

图1为实施例3所制的WT(wild type)及实施例2所制的S392L突变体酶纯化的SDS-PAGE电泳图

M为低分子量标准蛋白，泳道1，2分别为实施例3所制的野生型和实施例2所制的S392L突变体酶纯化蛋白分管收集样品。

图2为实施例3所制的WT水稻隐色素凝胶过滤层析图

图3为实施例2所制的S392L突变体酶凝胶过滤层析图

图4为实施例2所制的S392L突变体酶还原光谱图

41、42、43、44、45、46分别为第0s、30s、10min、20min、40min、 50min的氧化型FAD450nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。

图5为实施例3所制的WT水稻隐色素还原光谱图

51、52、53、54分别为第0s、10s、10min、30min的氧化型FAD 450 nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。

图6为实施例2所制的S392L突变体酶氧化光谱图

61、62、63、64、65、66分别为0min、2min、5min、10min、20min、 30min氧化型FAD450nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。

图7为实施例3所制的WT水稻隐色素氧化光谱图

71、72、73、74、75、76分别为0min、1min、5min、10min、20min、 30min氧化型FAD450nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。

图8为实施例2所制的S392L突变体酶加ATP后还原光谱图

81、82、83、84、85分别为第0s、30s、10min、30min、60min的氧化型FAD 450nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。

图9为实施例3所制的WT水稻隐色素加ATP后还原光谱图

91、92、93、94分别为第0s、10s、15min、30min的氧化型FAD 450 nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。

图10为实施例2所制的S392L突变体酶加ATP后氧化光谱图

101、102、102、104、105、106分别为0min、2min、5min、10min、 30min、80min氧化型FAD 450nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。

图11为实施例3所制的WT水稻隐色素加ATP后氧化光谱图

111、112、113、114、115、116分别为0min、5min、10min、30min、 60min、100min氧化型FAD 450nm吸收峰和自由基型FAD 580nm吸收峰变化曲线。

具体实施方式:

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1：S392L突变体酶基因的获得以及表达载体的构建

1.1水稻隐色素2基因oscry2

查找NCBI(National Center for Biotechnology,AB103094)水稻的隐色素基因序列，基于大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中密码子偏好性进行优化并截短，设计适于大肠杆菌表达的基因，交由南京金斯瑞公司人工合成该基因，并装载到pET22b质粒载体上，经由公司测序成功后，寄回构建成功的重组质粒pET22b-OsCRY2。(郑彬琼.大肠杆菌同义密码子偏好性概述[J]. 硅谷,2009(01):23-24.)(Fumiaki Hirose.Involvement ofrice cryptochromes in de-etiolation responses and flowering[J].Plant CellPhysiol,2006, 47(7):915-25.)。

1.2构建突变体菌株

设计一对突变引物，突变引物分别为：

S392L S:5'GGACGCGGATCTGGAACTGGATATCCTGGGC 3'

S392L AS:5'CAGTTCCAGATCCGCGTCCAGCAGCACGT 3'

快速定点突变原理：经PCR扩增目的基因，DpnⅠ酶切延伸产物。由于原来模板质粒来源于大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnⅠ敏感而被切碎(DpnⅠ识别序列为甲基化的G^mATC)，而体外合成的带突变的质粒由于没有甲基化而不被切开，即可得到突变质粒的克隆。

PCR反应体系(60μl)

PCR反应条件

消化反应体系(20μl)

Dpn I 2μl

10×FastDigestBuffer 2μl

质粒pET22b-S392L 16μl

消化反应条件

37℃ 90min

80℃ 5min

以pET22b-OsCRY2重组质粒为模板进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性5min；94℃变性50s，60℃退火复性50s，72℃延伸3min，循环 30次；72℃充分延伸10min。如图1，得到PCR产物为突变重组质粒 pET22b-S392L。经过DpnI酶切反应后，将突变质粒pET22b-S392L转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，经过Amp抗性筛选阳性克隆，送通用生物公司测序鉴定。序列比对结果发现392位突变成功。

将突变成功的菌体平板划线，挑菌，摇菌，重提质粒，转化到大肠杆菌E.coliRosetta(DE3)感受态细胞，构建工程菌Rosetta(DE3)/pET22b-S392L。

实施例2：突变体水稻隐色素S392L蛋白的表达与纯化

2.1蛋白表达

(1)接菌：挑取工程菌Rosetta(DE3)/pET22b-S392L接种于5ml LB(Amp⁺,Cam⁺)液体培养基中37℃，225rpm过夜培养；

(2)扩培：取5ml过夜培养的菌液转接到500ml含相应抗生素的液体LB 中，37℃，225rpm培养4-5h，至OD₆₀₀为1左右；

(3)诱导：加入500μl的1MIPTG至终浓度为1mM，20℃，180rpm，诱导表达20h；

(4)收菌：诱导表达结束后，4℃，5500rpm，离心5min，收集菌体，然后置于-80℃冰箱中保存。

2.2蛋白纯化

Start Buffer(500ml)

Elution Buffer(500ml)：

Protein Buffer(500ml)：

(均用HCl调pH7.2，加入ddH₂O定容至500ml)

(1)破碎：加30ml Start Buffer重悬菌体，将菌液置于超声破碎仪中，70 Mpa压力，工作1s，间歇2s，破碎30min；

(2)离心：将破碎液分装在两个离心管中配平，4℃，10000rpm，12min 高速离心；

(3)结合：将破碎离心后的上清分两次加入30ml Ni²⁺离子亲和柱中，混匀；4℃下于水平摇床上晃动样品15min，使上清与镍离子树脂充分结合；

(4)洗脱：结合结束，先用25ml的Start Buffer清洗树脂，然后用25ml 的Elutionbuffer洗脱目的蛋白，用50ml小烧杯收集洗脱蛋白；

(5)浓缩：将收集的洗脱蛋白加入超滤离心管中，4℃，5000rpm，浓缩至600μl；

(6)脱气：将浓缩好的蛋白用移液器转移至1.5ml EP管中，4℃，12000 rpm，离心10min；

(7)凝胶过滤层析：用1ml注射器吸出蛋白样品，注射进上样孔。运行事先设置好的程序，进行层析。收集目的蛋白，进行后续试验。

实施例3：WT(wild type)水稻隐色素蛋白的表达与纯化

除：接菌：挑取工程菌Rosetta(DE3)/pET22b-OsCRY2接种于5ml LB(Amp⁺,Cam⁺)液体培养基中37℃，225rpm过夜培养；外

其余与实施例2相同。

如图1，纯化后的蛋白经12％的SDS-PAGE鉴定，M为低分子量标准蛋白，泳道1，2分别为野生型和S392L突变体酶纯化蛋白分管收集样品。在56kDa处有单一特异性很高的条带，说明纯化后的蛋白的纯度较高(90％以上)。且与通过氨基酸序列计算分子量大小一致。S392L突变体酶条带比 WT粗，表明S392L突变体酶的表达量提高。

如图2，WT水稻隐色素洗脱体积为14.75ml，计算出分子量为57kDa，表明WT水稻隐色素为单体。蛋白最高吸收峰为254mAU。

如图3，S392L突变体酶洗脱体积为12.15ml，计算出分子量为197kDa，表明S392L突变体酶为四聚体。蛋白最高吸收峰为624mAU，进一步说明 S392L突变体酶具有更高的表达量。

实施例4：S392L突变体酶与WT水稻隐色素蛋白的光谱性质

体外纯化出的植物隐色素FAD以氧化型存在，经蓝光照射会发生还原反应，形成自由基型。氧化型在450nm附近有吸收峰，而自由基型吸收峰在580nm附近，因此可以通过检测450nm和580nm处峰值的下降与上升来计算还原、氧化速率。

3.1未加ATP光谱

吸取足够浓度的蛋白样品600μl，加600μl Protein Buffer对半稀释备用。

吸取600μl稀释后的蛋白样品置于半微量比色皿里，加入6μl 1MDTT (二硫苏糖醇，电子供体)至终浓度为10mM。将比色皿放入50ml小烧杯中，再将小烧杯置于0℃冰水中(及时换冰，保证冰水浴条件)。使用波长446nm LED蓝灯照射样品，每隔一定时间检测光谱变化，直至蛋白还原完全。光还原之后，样品放置于UV-1800紫外-可见光分光光度计中。在有氧条件下，温度控制在17℃±0.5℃范围内，蛋白持续缓慢的氧化。每隔一段时间，机器自动记录光谱变化，直至氧化过程结束。

3.2加ATP光谱

吸取剩余600μl蛋白样品置于半微量比色皿里，加入6μl 1MDTT至终浓度为10mM，加12μl 0.1MATP(腺嘌呤腺苷三磷酸)至终浓度为2mM。将比色皿放入50ml小烧杯中，再将小烧杯置于0℃冰水中(及时换冰，保证冰水浴条件)。使用波长446nm LED蓝灯照射样品，每隔一定时间检测光谱变化，直至蛋白还原完全。光还原之后，样品放置于UV-1800紫外-可见光分光光度计中。在有氧条件下，温度控制在17℃±0.5℃范围内，蛋白持续缓慢的氧化。每隔一段时间，机器自动记录光谱变化，直至氧化过程结束。

使用实施例2和实施例3中纯化的突变体酶S392L和WT水稻隐色素进行光谱性质测定。

如图4，S392L突变体酶光还原不同于WT水稻隐色素，其还原速率变慢，直至50min才还原完全，且产生更多的自由基型FAD。

如图5，测定了为WT水稻隐色素光还原图谱，野生型水稻隐色素在 10s内还原完全，30min内无明显变化，FAD由氧化型还原至自由基型。

如图6，S392L突变体酶氧化与WT水稻隐色素类似，均在30min内氧化完全。

如图7，测定了WT水稻隐色素在30min内的氧化光谱，WT水稻隐色素在30min内氧化完全。

如图8，S392L突变体酶加ATP后，其还原光谱与未加ATP时发生了明显变化，450nm处氧化型FAD峰值在30s后基本无变化，580nm处自由基型FAD峰值在下降，而在425nm处出现了新的峰值，表明S392L突变体酶在加ATP之后，出现了新的物质。

如图9，WT水稻隐色素加ATP后，还原光谱图未发生改变，依然是 10s内还原完全，在30min内无明显变化，FAD由氧化型还原至自由基型。

如图10，S392L突变体酶加ATP后与野生型一样，氧化速率变慢，在 80min氧化完全。不同的是，其425nm和450nm处峰值皆上升，两处的氧化速率相等。与野生型相比，S392L突变体酶光还原及氧化性质发生了明显变化，这为体外研究水稻隐色素作用机制提供了思路，有利于农业生产，为改良水稻性状且提高水稻产量提供方向。

如图11，WT水稻隐色素结合底物ATP后，其氧化变慢，因为ATP结合在辅酶口袋外侧，使FAD不易脱落，因而其氧化速率变慢，直至100min 才氧化完全。

序列表

<110> 安徽师范大学

<120> 一种水稻隐色素定点突变蛋白及其构建方法

<130> 2021.1.8

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> 水稻隐色素(Oryza sativacryptochrome人工合成)

<400> 1

atggcgggta gcgagcgtac cgtggtttgg tttcgtcgtg acctgcgtat cgacgataac 60

ccggcgctgg cgagcgcggc gcgtgacggc gcggtgctgc cggtttttat ttggtgcccg 120

gcggatgagg gccagttcta cccgggccgt tgcagccgtt ggtggctgaa gcagagcctg 180

ccgcacctga gccaaagcct ggaaagcctg ggttgcccgc tggtgctgat ccgtgcggag 240

agcaccctgg aagcgctgct gcgttgcatt gacagcgtgg gcgcgacccg tctggtttac 300

aaccacctgt atgatccggt tagcctggtt cgtgacgata aaatcaagaa agagctgagc 360

gcgctgggta tcagcattca aagcttcaac ggcgacctgc tgtacgagcc gtgggaaatc 420

tatgacgata gcggtctggc gtttaccacc ttcaacatgt actgggagaa gtgcatggaa 480

ctgccgattg atgcgagccc gagcctggcg ccgtggaaac tggtgccggt tccgggtctg 540

gagagcgtgc gtagctgcag cgttgacgat ctgggcctgg aaagcagcaa ggacgaggaa 600

agcagcaacg cgctgctgat gcgtgcgtgg agcccgggtt ggcgtaacgc ggaaaaaatg 660

ctggaggaat ttgtgagcca cggcctgctg gagtatagca agcacggtat gaaagttgag 720

ggtgcgacca ccagcctgct gagcccgtac ctgcacttcg gtgaggtgag cgttcgtaag 780

gtgtatcagc tggttcgtat gcagcaaatc aaatgggaga acgaaggtac cagcgaagcg 840

gaggaaagca tccacttctt tatgcgtagc attggcctgc gtgagtacag ccgttatctg 900

tgcttcaact ttccgttcac ccacgaaaag agcctgctgg gcaacctgaa gcactacccg 960

tggaaagtgg acgaggaacg ttttaaaagc tggcgtcagg gtatgaccgg ctatccgctg 1020

gttgatgcgg gtatgcgtga actgtgggcg accggttgga cccacaaccg tatccgtgtg 1080

atcattagca gctttgcggt taagttcctg ctgattccgt ggacctgggg tatgaaatac 1140

ttctgggacg tgctgctgga cgcggatctg gaactggata tcctgggctg gcaatatatt 1200

agcggtagcc tgccggatgg tcatgagctg agccgtctgg ataacccgga agttcagggt 1260

caaaagtacg acccggatgg cgtgtatgtt cgtacctgga ttccggagct ggcgcgtatg 1320

ccgaccgaat ggattcacca cccgtgggat gcgccgagct gcattctgga agtggcgggt 1380

gttgaactgg gctttaacta cccgaagccg atcgtggacc tgcacattgc gcgtgagtgc 1440

ctggacgata gcatcagcac catgtggcag ctggat 1476

<210> 2

<211> 492

<212> PRT

<213> 水稻隐色素(Oryza sativacryptochrome人工合成)

<400> 2

Met Ala Gly Ser Glu Arg Thr Val Val Trp Phe Arg Arg Asp Leu Arg

1 5 10 15

Ile Asp Asp Asn Pro Ala Leu Ala Ser Ala Ala Arg Asp Gly Ala Val

20 25 30

Leu Pro Val Phe Ile Trp Cys Pro Ala Asp Glu Gly Gln Phe Tyr Pro

35 40 45

Gly Arg Cys Ser Arg Trp Trp Leu Lys Gln Ser Leu Pro His Leu Ser

50 55 60

Gln Ser Leu Glu Ser Leu Gly Cys Pro Leu Val Leu Ile Arg Ala Glu

65 70 75 80

Ser Thr Leu Glu Ala Leu Leu Arg Cys Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr

85 90 95

Arg Leu Val Tyr Asn His Leu Tyr Asp Pro Val Ser Leu Val Arg Asp

100 105 110

Asp Lys Ile Lys Lys Glu Leu Ser Ala Leu Gly Ile Ser Ile Gln Ser

115 120 125

Phe Asn Gly Asp Leu Leu Tyr Glu Pro Trp Glu Ile Tyr Asp Asp Ser

130 135 140

Gly Leu Ala Phe Thr Thr Phe Asn Met Tyr Trp Glu Lys Cys Met Glu

145 150 155 160

Leu Pro Ile Asp Ala Ser Pro Ser Leu Ala Pro Trp Lys Leu Val Pro

165 170 175

Val Pro Gly Leu Glu Ser Val Arg Ser Cys Ser Val Asp Asp Leu Gly

180 185 190

Leu Glu Ser Ser Lys Asp Glu Glu Ser Ser Asn Ala Leu Leu Met Arg

195 200 205

Ala Trp Ser Pro Gly Trp Arg Asn Ala Glu Lys Met Leu Glu Glu Phe

210 215 220

Val Ser His Gly Leu Leu Glu Tyr Ser Lys His Gly Met Lys Val Glu

225 230 235 240

Gly Ala Thr Thr Ser Leu Leu Ser Pro Tyr Leu His Phe Gly Glu Val

245 250 255

Ser Val Arg Lys Val Tyr Gln Leu Val Arg Met Gln Gln Ile Lys Trp

260 265 270

Glu Asn Glu Gly Thr Ser Glu Ala Glu Glu Ser Ile His Phe Phe Met

275 280 285

Arg Ser Ile Gly Leu Arg Glu Tyr Ser Arg Tyr Leu Cys Phe Asn Phe

290 295 300

Pro Phe Thr His Glu Lys Ser Leu Leu Gly Asn Leu Lys His Tyr Pro

305 310 315 320

Trp Lys Val Asp Glu Glu Arg Phe Lys Ser Trp Arg Gln Gly Met Thr

325 330 335

Gly Tyr Pro Leu Val Asp Ala Gly Met Arg Glu Leu Trp Ala Thr Gly

340 345 350

Trp Thr His Asn Arg Ile Arg Val Ile Ile Ser Ser Phe Ala Val Lys

355 360 365

Phe Leu Leu Ile Pro Trp Thr Trp Gly Met Lys Tyr Phe Trp Asp Val

370 375 380

Leu Leu Asp Ala Asp Leu Glu Leu Asp Ile Leu Gly Trp Gln Tyr Ile

385 390 395 400

Ser Gly Ser Leu Pro Asp Gly His Glu Leu Ser Arg Leu Asp Asn Pro

405 410 415

Glu Val Gln Gly Gln Lys Tyr Asp Pro Asp Gly Val Tyr Val Arg Thr

420 425 430

Trp Ile Pro Glu Leu Ala Arg Met Pro Thr Glu Trp Ile His His Pro

435 440 445

Trp Asp Ala Pro Ser Cys Ile Leu Glu Val Ala Gly Val Glu Leu Gly

450 455 460

Phe Asn Tyr Pro Lys Pro Ile Val Asp Leu His Ile Ala Arg Glu Cys

465 470 475 480

Leu Asp Asp Ser Ile Ser Thr Met Trp Gln Leu Asp

485 490

Claims

1.一种水稻隐色素定点突变蛋白的编码基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

2.一种水稻隐色素定点突变蛋白，其特征在于：该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种载体，其特征在于：其含有权利要求1所述的核苷酸序列。

4.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求2所述的氨基酸序列。

5.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求3所述的载体。

6.权利要求2所述的一种水稻隐色素定点突变蛋白的构建方法，包括以下步骤：从基因库中获得基因序列，进行人工密码子优化并且进行蛋白质羧基端截短，获得目的基因序列与pET22b质粒连接，构建出重组表达质粒；设计突变引物，利用重组质粒进行定点突变，并将突变后的重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，构建出用于水稻隐色素蛋白表达的基因工程菌Rosetta(DE3)/pET22b-S392L；在20 ℃ 180 rpm 和1 mM IPTG条件下进行表达；

突变引物分别为：

S392L S:5' GGACGCGGATCTGGAACTGGATATCCTGGGC 3'，

S392L AS:5' CAGTTCCAGATCCGCGTCCAGCAGCACGT 3' 。