CN103864914B - 高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高纯度白细胞介素‑24包涵体的制备方法，包括以下步骤：制备含有白细胞介素‑24基因的重组大肠杆菌；重组大肠杆菌进行发酵培养；发酵培养后得到的菌体进行超声破碎得到包涵体；对包涵体进行洗涤；对洗涤后的包涵体进行变性与复性，得到白细胞介素‑24蛋白。与现有技术相比，本发明通过对大肠杆菌生产白细胞介素‑24培养条件进行优化，获得较疏松的白细胞介素‑24包涵体结构，提高了蛋白在高浓度下的复性的效率，同时，本发明方法使白细胞介素‑24的变性效率和复性效率分别提高了50.52％和83.78％，操作简单，节约了生产成本。这种通过优化培养条件来简化其纯化过程的方法可适用于其它有类似包涵体结构特点的蛋白。

Description

高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及生物工程下游蛋白质的纯化过程，尤其是涉及一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法。
背景技术
1995年哥伦比亚大学P.B.Fisher等用差示杂交的方法从人干扰素β和瑞香素(mezerein，MEZ)诱导的人类黑色素瘤细胞cDNA文库中筛选得到一种新型细胞因子，命名为黑色素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation-associated gene7，mda-7)，因其在结构、染色体定位、碱基序列同源性及细胞因子样特性等方面与IL-10家族相近，被归于IL-10家族，正式命名为白细胞介素-24(interleukin-24，IL-24)。MDA-7／IL-24可选择性抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡，包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、中枢神经系统等，但对正常细胞没有影响。另外，IL-24还具有抑制肿瘤血管形成和免疫激活作用，在肿瘤细胞转移和系统性肿瘤免疫过程中发挥作用。鉴于MDA-7／IL-24的广谱抗肿瘤特性和独特的免疫调节作用，其已成为抗肿瘤生物药领域的研究热点。
Introgen公司与德克萨斯大学M.D.Anderson Cancer Center合作开发的基因治疗药物重组复制缺陷的腺病毒-IL-24(recombinant replication defectiveadenovirus-IL-24，Ad.IL-24)，商品名为INGN241，已经进入II期临床试验，其体内外实验和临床试验均证实了MDA-7／IL-24显著的抗肿瘤效果。但是腺病毒载体对一些低表达柯萨奇腺病毒受体(CAR)的肿瘤细胞存在转染效率低的问题，限制了其应用范围。另外，腺病毒的基因治疗存在潜在的风险，其应用也受到社会和医学伦理的限制。Fuson等的研究表明MDA-7／IL-24的翻译后的糖基化仅影响其分泌和在胞外环境中的稳定性，对其抗肿瘤活性没有显著影响。因此，MDA-7／IL-24在原核生物工程菌中的重组表达研究也在进行中。但是IL-24在原核生物中的表达却不那么顺利，因为重组IL-24蛋白容易形成包涵体，并且形成的包涵体十分坚固，不利于后期的复性过程。目前，大肠杆菌生产IL-24的缺陷就在于形成的包涵体过于坚固，包涵体溶解效率低，故而复性收率低。另外低的溶解效率会导致后期的纯化收率低，纯化工艺繁琐。在包涵体的整个处理过程中包涵体的变性和复性是影响最大的两个因素，而包涵体的结构又会影响包涵体的变性过程。
发明内容
本发明的目的就是为了克服IL-24包涵体复性过程收率低、纯化困难的缺点而提供一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法。
本发明分析了IL-24包涵体的结构特点，本发明优化了包涵体的洗涤条件，洗涤方法能有效逐步去除杂蛋白，得到纯度达96％的IL-24蛋白，且步骤得到了简化，节约了生产成本，操作简单。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备含有白细胞介素-24基因的重组大肠杆菌：
表达质粒为pET28a(+)，表达宿主为BL21(DE3)pLysS，白细胞介素-24的基因序列如Genbank号NM-006850所示；具体步骤如下：
1)编码人源IL-24基因的cDNA的序列如Genbank号NM-006850所示，根据基因序列进行引物设计，引物1含有Nde I酶切位点，引物2含有Hind III酶切位点，引物序列如下：
引物1：5′-GGGAATTCCATATGGCCCAGGGCCAAGAATTCCACT-3′，横画线表示Nde I酶切位点；
引物2：5′-CCCAAGCTTGGGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3′，横画线表示Hind III酶切位点；
2)编码人源IL-24基因的cDNA在引物1和引物2的引导下进行PCR反应，得到PCR产物；
3)PCR产物经Cycle-Pure Kit纯化后，用Nde I和Hind III限制性内切酶进行双酶切，并将酶切产物克隆入经同样双酶切的质粒载体pET-28a(+)，验证正确的阳性克隆即为含有白细胞介素-24基因的重组大肠杆菌。
(2)重组大肠杆菌进行发酵培养：
重组大肠杆菌进行发酵培养时，接种量为2～4wt％。
所述的发酵培养包括诱导前培养与诱导后培养两个过程；
诱导前培养采用LB培养基，控制培养温度为28-37℃，pH值为6.5-7.5，当菌种浓度OD600达到0.4-1.0时，用终浓度为0.05-0.2mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导；
诱导后培养采用优化过的LB培养基，控制诱导温度为25-37℃，pH值为6.5-7.5；所述的优化过的LB培养基组成为：蛋白胨10-15g／L，酵母粉5-10g／L，NaCl5—10g／L，MgSO41-2g／L，CaCl21-2g／L和MnSO4·H2O0.2-1.0g/L。所述的优化培养条件的目的是改善包涵体结构，使包涵体结构变得更疏松，颗粒变得更小，提高包涵体变性效率，进而提高包涵体复性效率。
(3)发酵培养后得到的菌体进行超声破碎得到包涵体：将菌体重悬于TE缓冲液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.5)，置于冰上进行超声破碎，超声功率设为300-400W，超声时间为2×100次(超声3s，暂停6s)，将破碎溶液离心(10,000×g，30min，4℃)收获包涵体；
(4)对包涵体进行洗涤，依次使用三种洗涤缓冲液及去离子水洗涤包涵体，四次洗涤均采用搅拌洗涤2小时，10,000×g离心30min，取沉淀。所述方法能有效逐步去除杂蛋白，得到纯度达96％的IL-24蛋白，本洗涤纯化方法节约了生产成本，且操作简单；所述的三种洗涤缓冲液为：
洗涤缓冲液I：含有20mM Tris-HCl、10mM EDTA、100mM NaCl、体积百分比1.0％Triton X-100及2M Urea，pH为8.5；
洗涤缓冲液II：含有20mM Tris-HCl、10mM EDTA、体积百分比2.0％TritonX-100及4M Urea，pH为8.5；
洗涤缓冲液III：含有20mM Tris-HCl、10mM EDTA、体积百分比1.0％TritonX-100及4M Urea，pH为9.5。
(5)对洗涤后的包涵体进行变性与复性，得到白细胞介素-24蛋白，具体方法如下：
1)洗涤后的包涵体溶解于变性缓冲液中搅拌过夜，10,000×g离心30min后取上清液；变性缓冲液中含有20mM Tris、10mM EDTA及8M urea，pH为9.0；
2)采用透析复性方法对包涵体进行复性，得到溶于PBS中的白细胞介素-24蛋白；在进行复性时，静水压采用0.5-1.0kPa，按重量比10∶1比例添加还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽，尿素浓度梯度依次为6M、3M、1.5M、0.75M、0M、0M，pH梯度依次为9.0、9.0、8.5、8.0、7.5、7.4，甘油体积浓度梯度依次为0％、15％、10％、5％、0％、0％。
本发明从发酵条件入手改善包涵体的结构来进而优化后期的复性和纯化过程。经过条件优化，包涵体的结构变得疏松，包涵体颗粒明显变得均匀，并且直径变小，优化后的IL-24包涵体的变性效率提高了50.52％，这为后期复性效率的提高奠定了基础。本发明进一步地对包涵体的洗涤过程和复性过程进行了优化，复性效率提高了83.78％。这种通过优化培养条件来改善复性和纯化过程的方法可能适用于其它有类似包涵体结构特点的蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)通过培养条件的优化，改善了包涵体结构，使包涵体结构变得更疏松，颗粒变得更小，所述方法使IL-24的变性效率和复性效率分别提高了50.52％和83.78％：
(2)对包涵体洗涤过程进行了优化，洗涤方法能有效逐步去除杂蛋白，得到纯度达96％的IL-24蛋白，本发明提供的洗涤纯化方法节约了生产成本，且操作简单；复性过程的优化提高了蛋白的复性效率。
(3)本发明为实现白细胞介素IL-24的商业化生产提供了一种有效的方法。
附图说明
图1为IL-24在重组大肠杆菌中的诱导表达：
图中，M表示Marker；1为非诱导表达对照组，2为诱导组全细胞，3为诱导组沉淀，4为诱导组上清液；
图2为金属离子添加剂对包涵体变性的影响；
图中1-9添加的金属离子分别为(1)未加金属离子对照组，(2)Mg2+，(3)Ca2+，(4)Na+，(5)NH4 +，(6)Mn2+，(7)Fe3+，(8)K+，(9)Cu2+；
图3为诱导温度、pH、诱导剂浓度对包涵体变性的影响；
图中，1-4分别为四个梯度，温度梯度1-4为37℃、30℃、25℃、18℃；pH梯度1-4为6.0、7.0、8.0、9.0；IPTG梯度1-4为0.1mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM。
图4为包涵体经洗涤优化后的SDS-PAGE电泳图；
图中，M：Marker；1：诱导组上清液；2、4、5：包涵体经洗涤缓冲液I、II、III洗涤后的沉淀；3、6、7：包涵体经洗涤缓冲液I、II、III洗涤后的上清液；8：最后去离子水洗后的沉淀。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
重组IL-24在大肠杆菌的表达
编码人源IL-24基因的cDNA来自于本实验室，其序列与GenBank(NM-006850)公布的人IL-24的全序列一致。首先根据基因序列并应用PrimerPrimer5.0软件进行引物设计，此引物扩增的片段中不含前48个氨基酸的信号肽。
引物1：5′-GGGAATTCCATATGGCCCAGGGCCAAGAATTCCACT-3′(含NdeI酶切位点)
引物2：5′-CCCAAGCTTGGGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3′(含Hind III酶切位点)
PCR产物经Cycle-PureKit纯化后，用Nde I和Hind III限制性内切酶进行双酶切，并将酶切产物克隆入经同样双酶切的质粒载体pET-28a(+)。验证正确的阳性克隆即为制备IL-24的基因工程菌。接种阳性单克隆菌落于LB培养基(100μg/mL卡那霉素)，置于37℃摇床200rmp培养。当OD600至0.6-0.8时，加入0.SmM诱导剂IPTG，37℃诱导4h。收获发酵液，经离心(10000rpm，10min)收集诱导表达的重组菌菌体，并用Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.5)洗涤一次菌体。将菌体重悬于TE缓冲液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.5)，置于冰上进行超声破碎，超声功率设为300-400W，超声时间为2×100次(超声3s，暂停6s)。将破碎溶液离心(10,000×g，30min，4℃)收获包涵体，并对基因工程菌不同表达部分取样进行SDS-PAGE。电泳结果显示，所构建的基因工程菌有目的蛋白MDA-7／IL-24的表达，而对照却未见相应表达条带，结果见图1。
实施例2
重组IL-24包涵体的获得
以对包涵体变性的影响也就是溶解后的浊度为参数优化培养条件，诱导温度选取18℃，25℃，30℃和37℃；pH6.0，7.0，8.0和9.0；IPTG浓度0.1mM，0.5mM，1.0mM和1.5mM。离子添加剂的优化选取的是Mg2+，Fe3+，Ca2+，Na+，NH4+，Mn2+，Cu2+，K+，每个离子采用四个梯度0.50g／L，1.00g／L，2.00g/L和3.00g／L.每个离子对应的化合物为MgSO4，Fe2(SO4)3，CaCl2，NaCl，NH4Cl，MnSO4·H2O，CuSO4·5H2O和KCl。优化后的结果见图2和图3。选取了诱导温度30℃，pH7.0，诱导剂IPTG0.05-0.2mM作为培养条件。另外，Mg2+，Ca2+和Mn2+对包涵体增溶有正作用，通过Box-Behnken设计找到了三种离子交互作用后的最适浓度。
重组菌的培养过程如下：重组大肠杆菌在LB种子培养基中培养后，按接种量3wt％将种子培养液接种到发酵培养基中，重组菌在优化过的培养条件下生长，获得的菌体经超声破碎得到改善后的包涵体。发酵培养分为诱导前培养与诱导后培养。诱导前培养采用LB培养基，控制培养温度为28-30℃，pH值为7.0，当菌种浓度OD600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.05-0.2mM诱导剂IPTG进行诱导。诱导后培养采用优化过的LB培养基，控制诱导温度为25-28℃，pH值为7.0。优化过的LB培养基组成为以下组分及含量：蛋白胨10-15g／L，酵母粉5-10g/L，NaCl5-10g/L，MgSO41-2g／L，CaCl21-2g／L和MnSO4·H2O0.2-1.0g／L。优化培养条件的目的是改善包涵体结构，使包涵体结构变得更疏松，包涵体颗粒变得更小，提高包涵体变性效率，进而提高包涵体复性效率。
实施例3
IL-24包涵体的洗涤
将菌体重悬于TE缓冲液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.5)，置于冰上进行超声破碎，超声功率设为300-400W，超声时间为2×100次(超声3s，暂停6s)。将破碎溶液离心(10,000×g，30min，4℃)收获包涵体。对收获后的包涵体用三种洗涤缓冲液及去离子水分别洗涤包涵体，每次搅拌洗涤2小时，10,000×g离心30min，取沉淀。方法能有效逐步去除杂蛋白，得到纯度达96％的IL-24蛋白，减少了纯化步骤，节约了生产成本，操作简单结果见图4。
三种洗涤缓冲液为：
buffer I：20Mm Tris-HCl，10mM EDTA，100mM NaCl，1.0％TritonX-100，2M Urea，pH8.5；
bufferII：20mM Tris-HCI，10mM EDTA，2.0％TritonX-100，4M Urea，pH8.5；
bufferIII：20mM Tris-HCl，10mM EDTA，1.0％TritonX-100，4M Urea，pH9.5。
实施例4
IL-24包涵体的变复性
洗涤后的包涵体溶解于变性缓冲液中(20mM Tris，10mM EDTA，8M urea，pH为9.0)，搅拌过夜，10,000×g离心30min，取上清。采用透析复性方法，尿素浓度递减(6M-3M-1.5M-0.75M-0M-0M)，pH梯度逐渐减少(9.0-9.0-8.5—8.0-7.5-7.4)，静水压采用0.5-1.0kP，添加还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽质量比10∶1，甘油浓度递减(20％-15％-10％-5％-0％-0％)最终得到溶于PBS中的IL-24蛋白。方法使IL-24的变性效率和复性效率分别提高了50.52％和83.78％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)制备含有白细胞介素-24基因的重组大肠杆菌；
(2)重组大肠杆菌进行发酵培养，发酵培养包括诱导前培养与诱导后培养两个过程：
诱导前培养采用LB培养基，控制培养温度为28-37℃，pH值为6.5-7.5，当菌种浓度OD600达到0.4-1.0时，用终浓度为0.05-0.2mM的诱导剂IPTG进行诱导；
诱导后培养采用优化过的LB培养基，控制诱导温度为25-37℃，pH值为6.5-7.5；所述的优化过的LB培养基组成为：蛋白胨10-15g/L，酵母粉5-10g/L，NaCl 5-10g/L，MgSO4 1-2g/L，CaCl2 1-2g/L和MnSO4·H2O 0.2-1.0g/L；
(3)发酵培养后得到的菌体进行超声破碎得到包涵体；
(4)对包涵体进行洗涤：
依次使用三种洗涤缓冲液及去离子水洗涤包涵体，所述的三种洗涤缓冲液为：
洗涤缓冲液I：含有20mM Tris-HCl、10mM EDTA、100mM NaCl、体积百分比1.0％Triton X-100及2M尿素，pH为8.5；
洗涤缓冲液II：含有20mM Tris-HCl、10mM EDTA、体积百分比2.0％TritonX-100及4M尿素，pH为8.5；
洗涤缓冲液III：含有20mM Tris-HCl、10mM EDTA、体积百分比1.0％TritonX-100及4M尿素，pH为9.5；
(5)对洗涤后的包涵体进行变性与复性，得到白细胞介素-24蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的制备含有白细胞介素-24基因的重组大肠杆菌时，表达质粒为pET28a(+)，表达宿主为BL21(DE3)pLysS，白细胞介素-24的基因序列如Genbank号NM-006850所示。
3.根据权利要求2所述的一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的制备含有白细胞介素-24基因的重组大肠杆菌的步骤如下：
1)编码人源IL-24基因的cDNA的序列如Genbank号NM-006850所示，根据基因序列进行引物设计，引物1含有Nde I酶切位点，引物2含有Hind III酶切位点，引物序列如下：
引物1：5′-GGGAATTCCATATGGCCCAGGGCCAAGAATTCCACT-3′，横画线表示NdeⅠ酶切位点；
引物2：5′-CCCAAGCTTGGGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTG-3′，横画线表示HindⅢ酶切位点；
2)编码人源白细胞介素-24基因的cDNA在引物1和引物2的引导下进行PCR反应，得到PCR产物；
3)PCR产物经Cycle-Pure Kit纯化后，用Nde I和Hind III限制性内切酶进行双酶切，并将酶切产物克隆入经同样双酶切的质粒载体pET-28a(+)，验证正确的阳性克隆即为含有白细胞介素-24基因的重组大肠杆菌。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法，其特征在于，重组大肠杆菌进行发酵培养时，接种量为2～4wt％。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的超声破碎方法为：将菌体重悬于TE缓冲液，置于冰上进行超声破碎，将破碎溶液离心收获包涵体。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度白细胞介素-24包涵体的制备方法，其特征在于，对洗涤后的包涵体进行变性与复性的方法如下：
1)洗涤后的包涵体溶解于变性缓冲液中搅拌过夜，离心后取上清液；
所述的变性缓冲液中含有20mM Tris、10mM EDTA及8M尿素，pH为9.0；
2)采用透析复性方法对包涵体进行复性，得到溶于PBS中的白细胞介素-24蛋白；
在进行复性时，静水压采用0.5-1.0kPa，按重量比10:1比例添加还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽，尿素浓度梯度依次为6M、3M、1.5M、0.75M、0M、0M，pH梯度依次为9.0、9.0、8.5、8.0、7.5、7.4，甘油体积浓度梯度依次为0％、15％、10％、5％、0％、0％。
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