CN110818789B

CN110818789B - 一种高纯度食蟹猴白细胞介素17a的纯化方法

Info

Publication number: CN110818789B
Application number: CN201810889340.2A
Authority: CN
Inventors: 肖建国; 黄浩旻; 朱祯平
Original assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Current assignee: Sunshine Guojian Pharmaceutical Shanghai Co Ltd
Priority date: 2018-08-07
Filing date: 2018-08-07
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2038-08-07
Also published as: CN110818789A

Abstract

本发明专利涉及到用生物工程方法制备高纯度食蟹猴白细胞介素17A，属于生物工程范畴，具体涉及食蟹猴白细胞介素17A的提取纯化方法。该方法使用金属离子Ni²⁺亲和层析制备高纯度食蟹猴白细胞介素17A，在PH4.5±0.2的条件下上样和洗脱，产品纯度可达到95％以上，并且具有生物活性。

Description

一种高纯度食蟹猴白细胞介素17A的纯化方法

技术领域

本发明专利涉及用生物工程方法制备高纯度食蟹猴白细胞介素17A，属于生物工程范畴，具体涉及食蟹猴白细胞介素17A的提取纯化方法。

背景技术

亲和层析(affinity chromatography graphy,AC)是蛋白纯化的一种重要的方法，具有很高的选择性、分离性能以及较高的载量，它通常只需要一步处理即可将某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，是分离纯化蛋白质的有力工具。亲和层析技术是基于某种蛋白质所具有的生物学特异性，即蛋白质可与另一种称作配体的大分子能发生特异的可逆结合。所谓的配体是指能被蛋白质所识别并与之结合的原子、原子团或分子。亲和层析的基本原理是：把待纯化的某种蛋白质的特异配体，通过化学反应共价连接到载体表面的功能基上构成配基。载体的性能方面允许蛋白质自由通过，当含有目的蛋白的混合样品加到该配基上时，目的蛋白即和其特异性配体结合而吸附在配体载体的表面，而其他杂质则被洗出。被特异地结合在配基上的目的蛋白质可通过改变缓冲液的条件使之解吸附，并进一步收集(沈同，王镜岩.生物化学第二版[M]1990,223)。

食蟹猴白细胞介素17A的氨基酸序列含有六个半胱氨酸，生物体内形成含有链间二硫键均一的二倍体。食蟹猴白细胞介素17A在大肠杆菌中通常以包涵体的形式表达，该包涵体纯化很困难，经溶解、变复性后，目前常规方法采用金属离子Ni²⁺亲和层析在层析柱平衡至PH 7-8上样和洗脱复性液，使用10～15CV平衡液PBS，20-40mM咪唑，pH 7.4平衡，在上样液中加入咪唑，上样，再用平衡液PBS，40mM咪唑，pH 7.4平衡到紫外吸收值280几乎不变，用洗脱液PBS，500mM咪唑，pH 7.4洗脱，收集洗脱峰。食蟹猴白细胞介素17A在该方法中的溶解性和稳定性都较差，目标蛋白损失较大，并且该方法很难纯化出高纯度蛋白。本发明针对现有技术的不足，提供了一种制备高纯度食蟹猴白细胞介素17A的方法。与现有技术相比，该方法纯化的蛋白与层析柱吸附效果好，纯化后的目标蛋白纯度明显提高，并且没有破坏食蟹猴白细胞介素17A的生物活性，可以作为ELISA或生物活性测定的标准品，具有广泛的应用前景。

发明内容

本申请的发明人经过大量研究，发明了一种食蟹猴白细胞介素17A的亲和层析洗脱方法。具体的：

本发明提供了一种高纯度食蟹猴白细胞介素17A的纯化方法，该方法采用金属离子Ni²⁺亲和层析纯化带有His标签的食蟹猴白细胞介素17A，用PH4.5±0.2的平衡液平衡层析柱，加入上样液，洗脱得到纯化的目标蛋白。

作为进一步优选的方案，平衡液PH为4.5。

作为进一步优选的方案，所述平衡液包含柠檬酸。

作为进一步优选的方案，所述平衡液组成为柠檬酸，NaCl和咪唑。

作为进一步优选的方案，所述平衡液组成为20mM柠檬酸，100mM NaCl，20mM咪唑。

作为进一步优选的方案，采用PH4.5±0.2的洗脱液洗脱得到纯化的目标蛋白；优选的，采用PH4.5的洗脱液洗脱得到纯化的目标蛋白。

作为进一步优选的方案，所述洗脱液组成为20mM柠檬酸，100mM NaCl，500mM咪唑。

作为进一步优选的方案，所述上样液中含有咪唑，所述咪唑浓度为20mM～25mM；优选的，咪唑浓度为20mM。

作为进一步优选的方案，采用金属离子Ni²⁺亲和层析纯化带有His标签的食蟹猴白细胞介素17A，用PH4.5±0.2的第一平衡液平衡层析柱，加入上样液，再用第二平衡液平衡层析柱，洗脱得到纯化的目标蛋白。

作为更进一步优选的方案，所述第二平衡液组成为20mM柠檬酸，100mM NaCl，20mM咪唑。

本发明所述的带有His标签的食蟹猴白细胞介素17A通过如下步骤制备：

1)构建表达菌株：在食蟹猴白细胞介素17A的氨基酸序列的C端加入His标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，按照大肠杆菌密码子偏好优化密码子，全基因合成食蟹猴白细胞介素17A基因，其基因序列如SEQ ID NO:2所示，插入pet28a MCS，构建质粒，食蟹猴白细胞介素17A基因如SEQ ID NO:3所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。利用强启动子T7表达蛋白。将质粒mil17apet28a用42度热激转化表达菌株BL21(DE3)，对四个菌落进行诱导表达，超声碎菌，离心。

2)IPTG诱导表达：将甘油菌种接种到含抗性培养基，37度，180rpm培养过夜；将种子液接种到含抗性培养基，37度，180rpm培养到OD600为0.3～0.8；加入IPTG，继续培养，离心，去上清，收集菌体。

3)碎菌：菌体加入碎菌液，超声，离心，收集沉淀。

4)包涵体洗涤及变复性：加入洗涤液重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀。

包涵体沉淀中加入变性液，溶解离心后，滴加到复性液，缓慢搅拌，过夜，再透析，得到复性液，该复性液中含有带有His标签的食蟹猴白细胞介素17A。

然后将该复性液通过金属离子Ni²⁺亲和层析纯化，得到纯化后的目标蛋白，产品纯度可达到95％以上。

本发明的有益效果是：

1、产品纯度显著提高，采用现有技术所得目标蛋白纯度在60％左右，而本发明所得目标蛋白纯度可达95％以上，产品纯度提高了30％以上。

2、本发明没有破坏目标蛋白的生物活性，所得产品可以作为ELISA或生物活性测定的对照品。

3、在本发明操作简便，目标蛋白的溶解性和稳定性都较好，减少操作过程目标蛋白损失。

附图说明

图1：本发明表达产物上清和沉淀的SDS-PAGE图谱

其中，M表示蛋白Marker，U表示未诱导表达的食蟹猴白介素17A在大肠杆菌中的表达结果，S表示表达产物上清，P表示表达产物沉淀。

图2：本发明IPTG诱导表达产物SDS-PAGE图谱

其中，M表示蛋白Marker，U表示未诱导表达的食蟹猴白介素17A在大肠杆菌中的表达结果，P表示表达产物沉淀。

图3：本发明目标蛋白SDS-PAGE

其中，M表示蛋白Marker，F表示含有目标蛋白的洗脱液，F1、F2、F3、F4分别表示自目标蛋白开始流出后收集的体积分别为21mL、21mL、21mL、30mL的含有目标蛋白的洗脱液。

图4：本发明目标蛋白SEC图谱

其中，编号1、2、3、4与图3中F1、F2、F3、F4所表示的相同。

图5：本发明目标蛋白诱导hHS27细胞分泌Gro-alpha图谱

a、人白介素17A诱导hHS27细胞分泌Gro-alpha图谱

b、本发明目标蛋白诱导hHS27细胞分泌Gro-alpha图谱

图6：在PH7.4条件下上样和洗脱的目标蛋白SDS-PAGE图谱

其中，M表示蛋白Marker，F表示含有目标蛋白的洗脱液。

图7：在PH7.4条件下上样和洗脱的目标蛋白SEC图谱

图8：本发明目标蛋白在冻干和-80℃条件下保存2个月后的SDS-PAGE图谱

具体实施方式

以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的任何限制。以下实施例中使用的检测方法说明如下：

1.SEC检测：

液相色谱系统：1260Infinity Agilent

流动相:200mM PB缓冲液pH 6.8

流速：0.5ml/min

柱温：室温

样品温度：2～8度

检测波长：280nm

柱子型号：TosoH TSK G3000S WXL

2.SDS-PAGE检测：

检测系统：Mini protein Tetra system

检测条件：140V恒压45～55min

3.紫外检测：

仪器型号：Nano Vue(通用电气公司GE)

消光系数：1.0

4.金属离子Ni²⁺亲和层析

层析柱：XK16/20(通用电气公司GE)

填料：Ni sepharose excel(通用电气公司GE)

层析系统：AKTA Purifier(通用电气公司GE)

操作系统：unicorn 7.0(通用电气公司GE)

流速；3.0ml/min

实施例1：带有His标签的食蟹猴白细胞介素17A的制备

1.1食蟹猴白细胞介素17A表达菌株构建

在食蟹猴白细胞介素17A的氨基酸序列的C端加入His标签，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示，按照大肠杆菌密码子偏好优化密码子，全基因合成食蟹猴白细胞介素17A基因，其基因序列如SEQ ID NO:2所示，插入pet28a MCS，构建质粒，食蟹猴白细胞介素17A基因如SEQ ID NO:3所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。利用强启动子T7表达蛋白。将质粒mil17apet28a用42度热激转化表达菌株BL21(DE3)，对四个菌落进行诱导表达，超声碎菌，离心12000rpm×5min，表达产物上清和沉淀的还原SDS-PAGE图谱见图1。

1.2IPTG诱导表达

将甘油菌种按体积比为1：1000比例接种含抗性培养基，37度，180rpm培养过夜；将种子液按照体积比为1：100比例接种含抗性培养基，37度，180rpm培养到OD600为0.3～0.8；加入IPTG使终浓度为1mM，25度，170rpm，继续培养18小时；离心8500rpm×6min，去除上清，收集菌体；取样，超声碎菌，沉淀进行SDS-PAGE检测，诱导表达产物的还原SDS-PAGE图谱见图2。

1.3包涵体的分离纯化

溶液：

碎菌液：50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5；

洗涤液A：50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X100，pH 8.5；

洗涤液B：50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5；

变性液：6M盐酸胍，100mM NaCl，5mM EDTA，20mM Tris，10mM DTT，pH 8.5；

复性液：50mM Tris，100mM NaCl，400mM精氨酸，pH 9.5；

透析液A：50mM Tris，300mM Nacl，pH 9.0；

透析液B：50mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0；

透析液C：20mM柠檬酸，100mM NaCl，pH 4.5。

菌体与碎菌液按照湿重：体积为1：5～1：10比例加入碎菌液，超声2s间隔3s，power80％，5min，重复超声步骤四次，4℃离心12000rpm×15min，收集沉淀。

使用包涵体洗涤液A重悬沉淀，超声2s间隔3s，power 80％，5min，重复超声步骤一次，4℃离心12000rpm×15min，收集沉淀。重复该洗涤步骤一次。

再使用包涵体洗涤液B重悬沉淀，超声2s间隔3s，power 80％，5min，重复超声步骤一次，4℃离心12000rpm×15min，收集沉淀。

上述沉淀与变性液按照湿重：体积为1：20比例加入变性液，溶解后离心，滴加到复性液中，终浓度为0.25mg/ml，在4℃下缓慢搅拌，过夜。

使用3.5K透析膜，在4℃下将所得溶液与透析液A以体积比为1：10透析过夜；在4℃下将所得溶液与透析液B以体积比为1：10透析过夜；在4℃下将所得溶液与透析液C以体积比为1：10透析过夜。将所得包涵体复性液进行分离纯化。

实施例2：pH 4.5条件下上样分离纯化包涵体复性液

溶液：

平衡液：20mM柠檬酸，100mM NaCl，20mM咪唑，pH 4.5；

洗脱液：20mM柠檬酸，100mM NaCl，500mM咪唑，pH 4.5。

15cv平衡液平衡层析柱，包涵体复性液作为上样液，在上样液中加入咪唑，使咪唑浓度为20mM，上样，再用平衡液平衡到紫外吸收值为280不变，洗脱液洗脱，收集洗脱峰。用SDS-PAGE和SEC检测，本发明上样及纯化的食蟹猴白细胞介素17A的还原SDS-PAGE图谱如图3，SEC图谱如图4，SEC检测结果如表1。

表1

样品序号	体积(ml)	蛋白浓度(mg/ml)	蛋白量(mg)	SEC纯度(％)
					F1	21	0.61	12.81	95.8
F2	21	0.58	12.18	94.47
					F3	21	0.40	8.4	92.85
F4	30	0.63	18.9	95.2

实施例3：纯化的食蟹猴白细胞介素17A生物活性测定

用人白细胞介素17A作为对照，本专利方法制备食蟹猴白细胞介素17A刺激HS27cell产生Gro-alpha，结果人白细胞介素17A Ec50＝8.46ng/ml，食蟹猴白细胞介素17AEc50＝1.8ng/ml，说明本专利方法制备食蟹猴白细胞介素17A具有生物活性，可以作为生物活性测定的对照品使用。本发明目标蛋白诱导hHS27细胞分泌Gro-alpha图谱见图5。

实施例4：pH 7.4条件下上样分离纯化包涵体复性液

溶液：

平衡液：PBS，20mM咪唑，pH 7.4；

洗脱液：PBS，500mM咪唑，pH 7.4。

15cv平衡液1000ml平衡层析柱，包涵体复性液作为上样液，在上样液中加入咪唑，使咪唑浓度为20mM，上样，用平衡液平衡到紫外吸收值为280不变，用200ml洗脱液洗脱，收集洗脱峰。用SDS-PAGE和SEC检测，pH 7.4上样及纯化的食蟹猴白细胞介素17A的非还原SDS-PAGE图谱如图6，SEC图谱如图7，SEC检测结果见表2。

表2

样品序号	体积(ml)	蛋白浓度(mg/ml)	蛋白量(mg)	SEC纯度(％)
					F1	6.3	0.73	4.6	62.00

从上表可以看出：本发明纯化的目标蛋白纯度可达到95％以上，相比现有技术目标蛋白的纯度上提高了30％以上，并且没有破坏目标蛋白的生物活性。

实施例5：纯化的食蟹猴白细胞介素17A稳定性试验

将纯化后的食蟹猴白细胞介素17A样品在冻干和-80℃条件下保存2个月，其还原SDS-PAGE图谱与非还原SDS-PAGE图谱见图8，由图可见，本发明纯化方法纯化后的食蟹猴白细胞介素17A在保存2个月后，未见杂质谱带，本发明纯化后的产品有较好的稳定性。

序列表

<110> 沈阳三生制药有限责任公司

<120> 一种高纯度食蟹猴白细胞介素17A的纯化方法

<130> 2018

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 143

<212> PRT

<213> Cynomolgus monkey

<400> 1

Gly Ile Ala Ile Pro Arg Asn Ser Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys

1 5 10 15

Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn

20 25 30

Thr Ser Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr

35 40 45

Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser

50 55 60

Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Val Lys Ala Asp

65 70 75 80

Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile

85 90 95

Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Arg His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu

100 105 110

Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val

115 120 125

His His Val Ala Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His

130 135 140

<210> 2

<211> 432

<212> DNA

<213> Cynomolgus monkey

<400> 2

ggtattgcca ttccgcgcaa tagcggttgc ccgaacagcg aagacaaaaa cttccctcgc 60

accgtgatgg tgaatttaaa catccacaac cgcaacacca gcaccaaccc gaaacgcagc 120

agcgattatt acaaccgcag caccagcccg tggaatttac atcgcaacga agatccggaa 180

cgctatccga gcgtgatttg ggaagccaaa tgccgtcatc tgggctgcgt gaaagcagac 240

ggcaatgtgg actaccacat gaatagcgtg ccgattcagc aagaaattct ggttctgcgc 300

cgtgaaccgc gccattgccc gaatagcttc cgtttagaga agattttagt tagcgttggt 360

tgcacttgtg tgaccccgat tgtgcatcat gtggctggtg gtggcggtag ccaccatcat 420

caccatcatt ga 432

<210> 3

<211> 435

<212> DNA

<213> Cynomolgus monkey

<400> 3

atgggtattg ccattccgcg caatagcggt tgcccgaaca gcgaagacaa aaacttccct 60

cgcaccgtga tggtgaattt aaacatccac aaccgcaaca ccagcaccaa cccgaaacgc 120

agcagcgatt attacaaccg cagcaccagc ccgtggaatt tacatcgcaa cgaagatccg 180

gaacgctatc cgagcgtgat ttgggaagcc aaatgccgtc atctgggctg cgtgaaagca 240

gacggcaatg tggactacca catgaatagc gtgccgattc agcaagaaat tctggttctg 300

cgccgtgaac cgcgccattg cccgaatagc ttccgtttag agaagatttt agttagcgtt 360

ggttgcactt gtgtgacccc gattgtgcat catgtggctg gtggtggcgg tagccaccat 420

catcaccatc attga 435

<210> 4

<211> 144

<212> PRT

<213> Cynomolgus monkey

<400> 4

Met Gly Ile Ala Ile Pro Arg Asn Ser Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp

1 5 10 15

Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg

20 25 30

Asn Thr Ser Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser

35 40 45

Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro

50 55 60

Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Val Lys Ala

65 70 75 80

Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu

85 90 95

Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Arg His Cys Pro Asn Ser Phe Arg

100 105 110

Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile

115 120 125

Val His His Val Ala Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His

130 135 140

Claims

1.一种高纯度食蟹猴白细胞介素17A的纯化方法，其特征在于，采用金属离子Ni²⁺亲和层析纯化带有His标签的食蟹猴白细胞介素17A，用PH4.5的平衡液平衡层析柱，加入上样液，再用平衡液平衡层析柱，洗脱得到纯化的目标蛋白；

具体包括以下步骤：

1)构建表达菌株：在食蟹猴白细胞介素17A的氨基酸序列的C端加入His标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，按照大肠杆菌密码子偏好优化密码子，全基因合成食蟹猴白细胞介素17A基因，其基因序列如SEQ ID NO:2所示，插入pet28a多克隆位点，构建质粒，食蟹猴白细胞介素17A基因如SEQ ID NO:3所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；利用强启动子T7表达蛋白，将构建的质粒用42度热激转化表达菌株BL21(DE3)，对四个菌落进行诱导表达，超声碎菌，离心；

2)IPTG诱导表达：将甘油菌种接种到含抗性培养基，37度，180rpm培养过夜；将种子液接种到含抗性培养基，37度，180rpm培养到OD600为0.3～0.8；加入IPTG，继续培养，离心，去上清，收集菌体；

3)碎菌：菌体加入碎菌液，超声，离心，收集沉淀，所述碎菌液的组成为：50mM Tris，100mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5；

4)包涵体洗涤及变复性：加入洗涤液重悬沉淀，超声，离心，收集沉淀，具体包括：使用包涵体洗涤液A重悬沉淀，超声2s间隔3s，power 80％，5min，重复超声步骤一次，4℃离心12000rpm×15min，收集沉淀，重复该洗涤步骤一次；再使用包涵体洗涤液B重悬沉淀，超声2s间隔3s，power 80％，5min，重复超声步骤一次，4℃离心12000rpm×15min，收集沉淀；

所述包涵体洗涤液A的组成为：50mM Tris、100mM NaCl、5mM EDTA、1％Triton X100、pH8.5，所述包涵体洗涤液B的组成为：50mM Tris、100mM NaCl、5mM EDTA、pH 8.5；

5)包涵体沉淀中加入变性液，变性液的组成为6M盐酸胍、100mM NaCl、5mM EDTA、20mMTris、10mM DTT、pH 8.5，溶解离心后，滴加到复性液，复性液的组成为50mM Tris、100mMNaCl、400mM精氨酸、pH 9.5，缓慢搅拌，过夜，再透析，得到包涵体复性液，该包涵体复性液中含有带有His标签的食蟹猴白细胞介素17A；

所述透析包括：使用3.5K透析膜，在4℃下将所得溶液与透析液A以体积比为1：10透析过夜；在4℃下将所得溶液与透析液B以体积比为1：10透析过夜；在4℃下将所得溶液与透析液C以体积比为1：10透析过夜；

所述透析液A的组成为50mM Tris、300mM NaCl、pH 9.0，透析液B的组成为50mM Tris、300mM NaCl、pH 8.0，透析液C的组成为20mM柠檬酸、100mM NaCl、pH 4.5；

6)采用15cv的平衡液平衡层析柱，包涵体复性液作为上样液，在上样液中加入咪唑，咪唑浓度为20mM，上样，再用平衡液平衡到紫外吸收值为280不变，洗脱液洗脱，收集洗脱峰；用SDS-PAGE和SEC检测；

所述平衡液的组成为20mM柠檬酸，100mM NaCl，20mM咪唑；

洗脱时所用洗脱液的组成为：20mM柠檬酸，100mM NaCl，500mM咪唑，pH为4.5。