RU2518115C1 - Способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений - Google Patents
Способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений Download PDFInfo
- Publication number
- RU2518115C1 RU2518115C1 RU2012153566/04A RU2012153566A RU2518115C1 RU 2518115 C1 RU2518115 C1 RU 2518115C1 RU 2012153566/04 A RU2012153566/04 A RU 2012153566/04A RU 2012153566 A RU2012153566 A RU 2012153566A RU 2518115 C1 RU2518115 C1 RU 2518115C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- histone
- nuclear
- proteins
- guanidine hydrochloride
- proteinases
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии эукариотической клетки. Предложен способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений, в котором первоначально в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводят отделение зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделяют клеточные ядра, проводят экстракцию ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом, выделяют из вышеперечисленных фракций гистоновые и негистоновые белки с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8, пропускают полученные белки с помощью метода аффинной хроматографии через колонку с сефарозой 4В с иммобилизованным ингибитором трипсина с последующей оценкой протеолитической активности. Изобретение может применяться для анализа молекулярно-генетических механизмов формирования структур клеточного ядра, что необходимо для получения дополнительной информации в разработках и построении компьютерных моделей организации генных и эпигенных сетей управления. 4 ил.
Description
Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии эукариотической клетки и может быть применено к анализу молекулярно-генетических механизмов формирования структур клеточного ядра и роли белковых компонентов в их организации, что необходимо для получения дополнительной информации в разработках и построении компьютерных моделей организации генных и эпигенных сетей управления.
Известен способ [1] выделения ядерных фракций из растений, обладающих протеолитической и ингибиторной активностью. Недостатком способа является то, что активность определялась непосредственно в супраструктурах, извлеченных из клеточных ядер, без разделения на негистоновые и гистоновые белки.
Известен способ [2] препаративного выделения основных белков из супраструктур клеточных ядер растений. Недостатком этого способа является то, что полученные из супраструктур клеточных ядер гистоновые и негистоновые белки не оценивались на протеолитическую активность и не было получено методом аффинной хроматографии фракции, обладающей Арг-Х протеолитической активностью.
Известен анализ [3] Арг-Х протеолиза и его ингибирования в негистоновых и гистоновых белках супрамолекулярных структур клеточных ядер растений, в котором Арг-Х протеолитическая и ингибиторная активность определялась непосредственно в негистоновых и гистоновых белках, полученных с помощью ионообменной хроматографии на ИРЦ-50 без последующего выделения ядерных протеиназ методом аффинной хроматографии.
Вышеуказанный анализ Арг-Х протеолиза и его ингибирования в негистоновых и гистоновых белков супрамолекулярных структур клеточных ядер растений [3] был принят за основу, в котором первоначально в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводят отделение зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделяют клеточные ядра, проводят экстракцию ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом и выделяют из вышеперечисленных фракций основные белки с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 6,8, и определяют в них сайты Арг-х протеазо- и ингибитор-трипсиновой активности.
Цель изобретения - предлагается способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений.
Указанная цель достигается тем, что в способе получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков клеточных ядер растений первоначально в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводят отделение зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделяют клеточные ядра, проводят экстракцию ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом, выделяют из вышеперечисленных фракций негистоновые и гистоновые белки с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 6,8, пропускают полученные белки с помощью метода аффинной хроматографии через колонку с сефарозой 4В с иммобилизованным ингибитором трипсина с последующей оценкой протеолитической активности.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Пример
Опыты проводили на элитных семенах пшеницы (Triticum aestivum L.) сортов Артемовка, Мироновская 808 и Мироновская яровая (любезно присланные нам из коллекции ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И.Вавилова). Проращивание зародышей осуществляли в темноте при 22±1°С. В определенные интервалы времени - 0 ч (воздушно-сухое семя) и от начала замачивания семян: 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводили отделение зародышей от эндосперма. Клеточные ядра выделяли по методу [4]. Надмолекулярные структуры: нуклеоплазму (Нп), хроматин непрочно- (Хр-I) и прочно- (Хр-II) связанный с ядерным матриксом (ЯМ), а также ЯМ выделяли из очищенных клеточных ядер соответственно при повышении ионной силы раствора: 0,14М NaCl, 0,35M NaCl, 2M NaCl в 0,01М трис-HCl буфере, рН 6.8. ЯМ извлекали 6М гуанидингидрохлоридом (Gu·HCI) с 0,004%-ным β-меркаптоэтанолом в том же буфере. Полученные супраструктуры клеточных ядер пропускали через колонку с амберлитом ИРЦ-50 (полиментакриловая синтетическая смола со свободными карбоксильными группами). Смола использовалась в виде порошка, получаемого при размалывании в шаровой мельнице. Размельченная смола просеивалась через сито 200 меш, после чего многократно промывалась водой для удаления мельчайших частиц, высушивалась и промывалась ацетоном. Для достижения большей хроматографической эффективности проводили циклизацию. К 100 г смолы добавляли 500 мл 4н. NaOH, перемешивали в течение 3 ч с последующим отмыванием на фильтре водой до нейтральной реакции и переводили в кислую форму, пропуская через нее 500 мл 4 М HCl, избыток HCl удаляли промыванием водой. Этой смолой заполняли колонку размером 0,4×4,5 см. На колонку наносили белок в количестве 20-50 мкг, растворенный в 6% гуанидин гидрохлориде на 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 6,8. Скорость элюции составляла 6 мл/ч. Препаративное отделение основных белков протеома клеточных ядер проводили в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8. Описанным выше методом удалось разделить белки супраструктур клеточных ядер на 5 фракций, которые по концентрации гуанидин гидрохлорида в элюате соответствуют фракциям: 0 - фракция, обогащенная негистоновыми белками и белками HMG; фракция, обогащенная гистоном H1; фракция, обогащенная гистонами Н2А и Н2В; фракция, обогащенная гистонами Н3 и Н4, и, наконец, фракция, содержащая остатки гистонов Н3 и Н4 с примесью белков ядерного матрикса.
Количество белка определяли по связыванию белка с кумасси ярко-синим G (Loba, Австрия) [1, 4]. Метод использовался в случае микро-наноколичественного определения белка.
Пробы, полученные в результате ионообменной хроматографии, диализовали против 0,05 М трис-HCl буфера рН 7,5 для удаления гуанидин гидрохлорида. Полноту удаления контролировали с помощью рефракторметра.
Аффинную хроматографию проводили на колонке (0,3×4 см) с иммобилизованным ингибитором трипсина, ковалентно присоединенного к CNBr-активированной агарозе (Институт химии АН Эстонии) [1]. Гель содержал 0,1 мкмоль присоединенного ингибитора трипсина. Уравновешивание колонки проводили с помощью 0,05 М трис-HCl, рН 8 (из буфера был исключен CaCl2 вследствие того, что при последующих реакциях по определению протеолитической активности он давал осадочную реакцию). Связавшийся белок элюировали 0,1 н. Na-ацетатным буфером, рН 3. Работу колонки с иммобилизованным ингибитором трипсина проверяли пропусканием через нее чистого сывороточного альбумина (Реахим), а также альбумина с добавлением трипсина (0,5-1 мкг). Колонка не связывала чистый сывороточный альбумин, а из смеси альбумин-трипсин идентифицировала трипсин.
В полученных методом аффинной хроматографии фракциях Арг-х протеазоактивность определяли по расщеплению низкомолекулярного белка протамина («Calbiochem», США) [1] (молекула которого состоит из 33 аминокислот: 22-х молекул Arg; 4-х молекул Ser; 3-х молекул Pro; по 2 молекулы Glu и Val). Активность выражали в нмоль аргинина·с-1·мг-1 белка.
Ход анализа: 0,02-0,025% раствор протаминсульфата готовили на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0. К 0,5 мл ферментного раствора (в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0) добавляли 0,2 мл протаминсульфата, инкубировали при 37° в течение 20 мин. Реакцию прекращали добавлением 0,7 мл 20% ТХУ (трихлоруксусная кислота). В контрольные пробы протаминсульфат вносили после добавления ТХУ. Мерой активности фермента служило количество растворимых в ТХУ аргининсодержащих пептидов, образующихся из протаминсульфата при его расщеплении трипсином или трипсиноподобными белками клеточного ядра. После добавления холодной 20% ТХУ опытные и контрольные пробы тщательно перемешивали и центрифугировали при 1500 g в течение 15 мин. Все операции проводили при 0-4°С. К 0,5 мл прозрачного центрифугата добавляли 1,25 мл 0,04% раствора 8-оксихинолина ("Реахим") (приготовленного в день опыта путем пятикратного разведения холодной дистиллированной водой 0,2% раствора 8-оксихинолина, растворенного в 96° этаноле), затем в пробу вносили 0,25 мл 10% NaOH, перемешивали и оставляли стоять в течение 2 мин, после этого добавляли 0,05 мл NaBrO (приготовленного путем растворения 1 г брома в 100 мл 5% NaOH) и через 15 с вносили 0,25 мл 40% мочевины, еще через 40 с - 2,75 мл холодной дистиллированной воды. После 5 мин стояния определяли оптическую плотность растворов при А490 (ФЭК-56 М, СССР).
С помощью калибровочной кривой значения оптической плотности при А490 переводили в количество нмолей аргинина в пробе. В качестве стандарта для калибровочного графика использовали D,L-аргинин ("Reanal", Венгрия).
Протеолитическую активность рассчитывали по формуле:
Обозначения в формуле:
V - объем (мл) ТХУ фильтрата, взятого для диализа;
ΔС - количество аргинина в нг (в ТХУ фильтрате);
1,4 - общий объем (мл) реакционной смеси;
Т - время инкубации (с);
V1 - объем (мл) ядерного экстракта, взятого для инкубации;
174,2 - молекулярная масса аргинина;
Б - количество белка (мг) в 1 мл ядерного экстракта.
На фиг.1 представлена эффективность экстракции супрамолекулярных комплексов возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом по процентному выходу белка. На оси абсцисс обозначены выделенные супрамолекулярные структуры клеточных ядер: Нп - нуклеоплазма, Xp-I - хроматин непрочносвязанный с ядерным матриксом, Хр-II - хроматин прочносвязанный с ядерным матриксом и ЯМ - ядерный матрикс. На оси ординат показан процент выхода белка.
На фиг.2 эффективность выхода негистоновых и гистоновых белков в результате элюции супрамолекулярных структур клеточных ядер в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида. Использованы следующие обозначения: Нп - нуклеоплазма, Xp-I - хроматин непрочносвязанный с ядерным матриксом, Хр-II - хроматин прочносвязанный с ядерным матриксом и ЯМ - ядерный матрикс. На оси ординат показано содержание белка на 1 ядро, пг. На оси абсцисс - концентрации прерывистого градиента гуанидин гидрохлорида с обозначением соответствующих белков: НГБ - негистоновые белки; Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4 - гистоны.
На фиг.3 эффективность выхода фракций, обладающих Арг-Х протеолитической активностью, с помощью аффинной хроматографии на колонке с сефарозой, иммобилизованной ингибитором трипсина. На оси ординат показано содержание белка на 1 ядро, пг. На оси абсцисс - концентрации прерывистого градиента гуанидин гидрохлорида с обозначением соответствующих белков: НГБ - негистоновые белки; HI, Н2А, Н2В, Н3, Н4 - гистоны.
На фиг.4 показана Арг-Х протеолитическая активность фракций, полученных в результате аффинной хроматографии. На оси ординат показана активность протеиназ, выраженная в нмоль аргинина на 1 мг белка/с. На оси абсцисс - концентрации прерывистого градиента гуанидин гидрохлорида с обозначением соответствующих белков: НГБ - негистоновые белки; HI, H2A, Н2В, Н3, Н4 - гистоны.
Анализ фиг.1-4 показывает, что в период перехода G1 в S фазу клеточного цикла как в негистоновых, так и гистоновых блоках клеточного ядра локализуются комплексы, обладающие Арг-Х протеолитической активностью. Известно, что аргинин в составе белков активно участвует в процессах, структурирующих упаковку ДНК, особенно при модификации гуанидиновой группы. Сжатие или растяжение нуклеопротеидных супраструктур клеточного ядра способно экранировать гидрофобные или гидрофильные поверхности белка для межмолекулярных взаимодействий и тем самым влиять на плотность упаковки ДНК и ее транскрипционную активность.
Данное изобретение рекомендуется для анализа молекулярно-генетических механизмов, происходящих на разных уровнях пространственно-временной реорганизации интерфазного хроматина, которая способна выполнять важную роль в функционировании эпигенетических механизмов, работающих не на уровне триплетного кода ДНК, а на уровне N-концевых аргининовых и лизиновых участков, выступающих из нуклеосомной глобулы.
Источники информации
1. Иванова Э.А., Вафина Г.Х. Способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью. Авторское свидетельство 1733471 //БИ 1992. Т.18, С.96.
2. Иванова Э.А.. Вафина Г.Х. Способ препаративного выделения. основных белков из супраструктур клеточных ядер растений. Патент №2408602//Опубликовано: 10.01.2011. Бюл. №1.
3. Иванова Э.А., Вафина Г.Х. Способ выделения растительных клеточных ядер. Авторское свидетельство 1701747// Б.И. 1991. №48. С.98.
4. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. С.342.
Claims (1)
- Способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений, включающий отделение в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделение клеточных ядер, экстракцию ядерных супраструктур возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом, выделение из вышеперечисленных фракций негистоновых и гистоновых белков с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8, выделение ядерных протеиназ с помощью метода аффинной хроматографии через колонку с сефарозой 4В с иммобилизованным ингибитором трипсина с последующей оценкой протеолитической активности.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012153566/04A RU2518115C1 (ru) | 2012-12-11 | 2012-12-11 | Способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012153566/04A RU2518115C1 (ru) | 2012-12-11 | 2012-12-11 | Способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2518115C1 true RU2518115C1 (ru) | 2014-06-10 |
RU2012153566A RU2012153566A (ru) | 2014-06-20 |
Family
ID=51213602
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012153566/04A RU2518115C1 (ru) | 2012-12-11 | 2012-12-11 | Способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2518115C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1733471A1 (ru) * | 1990-02-07 | 1992-05-15 | Институт биологии Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР | Способ получени дерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью |
RU2408602C1 (ru) * | 2009-04-22 | 2011-01-10 | Учреждение Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН (ИБ УНЦ РАН) | Способ препаративного выделения основных белков из супраструктур клеточных ядер растений |
-
2012
- 2012-12-11 RU RU2012153566/04A patent/RU2518115C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1733471A1 (ru) * | 1990-02-07 | 1992-05-15 | Институт биологии Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР | Способ получени дерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью |
RU2408602C1 (ru) * | 2009-04-22 | 2011-01-10 | Учреждение Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН (ИБ УНЦ РАН) | Способ препаративного выделения основных белков из супраструктур клеточных ядер растений |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2012153566A (ru) | 2014-06-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Krause | Detection and analysis of protein–protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis:(membrane) protein complexes and supercomplexes | |
ES2388219T3 (es) | Purificación mejorada de colagenasas a partir de un cultivo líquido de Clostridium histolyticum | |
Cℏaga et al. | Natural poly-histidine affinity tag for purification of recombinant proteins on cobalt (II)-carboxymethylaspartate crosslinked agarose | |
KR0169994B1 (ko) | 리포펩티드 탈아실효소 | |
Hanada et al. | Structure-function relationship of Atg12, a ubiquitin-like modifier essential for autophagy | |
Shahali et al. | Allergomic study of cypress pollen via combinatorial peptide ligand libraries | |
Baglia et al. | Localization of the high molecular weight kininogen binding site in the heavy chain of human factor XI to amino acids phenylalanine 56 through serine 86. | |
Heintz et al. | An efficient protocol for the identification of protein phosphorylation in a seedless plant, sensitive enough to detect members of signalling cascades | |
Johns et al. | Chromosomal proteins related to histones | |
Haque et al. | Contacts between mammalian mitochondrial translational initiation factor 3 and ribosomal proteins in the small subunit | |
Lu et al. | Separation and identification of ACE inhibitory peptides from lizard fish proteins hydrolysates by metal affinity-immobilized magnetic liposome | |
JPH05503511A (ja) | 生物分子の濃縮もしくは精製のための方法 | |
Nabeshima et al. | Segmental isotope-labeling of the intrinsically disordered protein PQBP1 | |
Barkla et al. | Quantitative proteomics of heavy metal exposure in Arabidopsis thaliana reveals alterations in one-carbon metabolism enzymes upon exposure to zinc | |
Staes et al. | Protease substrate profiling by N-terminal COFRADIC | |
US8349770B2 (en) | Method for the preparation of a composition based on 4-hydroxyproline and the uses thereof in the agronomical field | |
Wallner et al. | Lab scale and medium scale production of recombinant allergens in Escherichia coli | |
Fröhlich et al. | Deep insights into the plant proteome by pretreatment with combinatorial hexapeptide ligand libraries | |
RU2518115C1 (ru) | Способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений | |
RU2451024C1 (ru) | Анализ арг-х протеолиза и его ингибирования в негистоновых и гистоновых белках супрамолекулярных структур клеточных ядер растений | |
TWI400128B (zh) | 蛋白質純化方法 | |
Kwon et al. | Isolation of the Arabidopsis phosphoproteome using a biotin-tagging approach | |
Fisichella et al. | Purification of wheat flour high-Mr glutenin subunits by Reactive Red 120-Agarose and Reactive Yellow 86-Agarose resins | |
CN104854131A (zh) | 脂蛋白的柱上重折叠和纯化 | |
Kota et al. | Competitive metal‐binding stoichiometry between calcium and strontium by cell wall proteins of Neurospora crassa |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171212 |