JPH05503511A - 生物分子の濃縮もしくは精製のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物分子の濃縮もしくは精製のための方法効果的かつ安価な精製方法は、化学的 がっ生物学的生成物の製造の際に中心的役割を果たす。殊に、最近数年の生物工 学および遺伝子工学の発展に伴って、蛋白質、ペプチドおよびビタミンを精製す る方法の発展は、工業的な規模で、ますます重要なものとなっている。

多くの細胞内容物の単離の際の重要な工程は、出発物質または精製の過程中の中 間物質の分別蒸留である。

このために、通常、（分別蒸留される）沈澱または分配クロマトグラフィが用い られる。沈澱を行うために。

溶剤の性質は、蛋白質の可溶性が著しく減少し、この蛋白質が沈澱するように相 応する試薬の添加によって変えられる。この可溶性は、硫酸アンモニウムのよう な塩またはエタノールのような溶剤の添加によるがもしくはｐＨ値または温度の 変化によって変動することができる（Ｇｒｅｅｎ、Ａ、Ａ、＆　Ｈｕｇｈｅｓ　 Ｗ、Ｌ、ｉｎ″Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、第１＠、６７ 〜９ｏ頁（１９５５）；Ｂｅ１ｔｅｒ他、１９８８年の”Ｂｉｏｓｅｐｅｒａｔ ｉｏｎｓ”、１００ｆｆ頁、編纂者：　Ｂｅ１ｔｅｒ、Ｐ、Ａ、、Ｃｕ５ｓｌｅ ｒ、Ｅ、Ｌ、＆　Ｈｕ、Ｗ、−５，ン。

また、液／液２相分配クロマトグラフィは、久しい以前から、生物分子の精製の ために使用されている。

１９４０年代および１９５０年代では、専ら水と混合不可能な有機溶剤を用いた 有機／水性２相系が使用されていた。これは、抗生物質およびビタミンのような 低分子量の生物分子の濃縮または精製に極めて適しているが（Ｓｃｈｌｕｅｇｅ ｒｌ、に、、　１９８７年の“５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ”　、編纂者：　ＶｅｒｒａｌＪ、Ｓ、＆　Ｈｕｄｓｏｎ。

Ｍ、Ｊ、　２６０〜２６９頁）、シかしながら、殊に蛋白質の単離の際のその使 用は、狭く限定されていた。殊に、有機／水性系の調整器中での蛋白質の変性お よび沈澱は、大きな問題である（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ　Ｇ、、　１９８５年のＰ ａｔｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｉｎ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ　ｓｙｓｔ ｅｍｓ″、　Ａｃａｄ。

Ｐｒｅｓｓ、　１６１〜２２５頁）。

液／液２相抽出のもう１つの方法は、１９５０年代の終わりに、Ａ　Ｉ　ｂ　ｅ 　ｒ　ｔ　Ｓ　Ｏｎによって開発された。

この人は、２つの水相を有する２相系を使用し、これが殊に蛋白質の濃縮に極め て適していることを示すことができた（Ｎａｔｕｒｅ　ｌ　８２．７０７　（１ ９８５年））。

それ以来、２相系を用いて蛋白質を抽出するために、はとんど専ら、水性２相系 が使用され、更に発展してきた。

しかしながら、ポリエチレングリコールまたはデキストランのような相誘導重合 体のための高い使用経費に基づき、水性２相抽出法は、工業的規模では滅多に実 施されない。

本発明の対象は、生物分子を、水および／または緩衝液および水と混合可能な有 機溶剤からなる混合物中に溶解し、引続き塩の添加により惹起される相分離の際 に、分離した相の中で濃縮され、濃縮が行われた際のｐＨ値、生物分子の抽出に 適当な溶剤および塩の種類を一連の試験の中で測定することにより特徴づけられ る生物分子の濃縮もしくは精製のための方法である。

生物分子としては、特にビタミンおよび有利に蛋白質およびペプチドが該当する 。この方法の実施のために、生物分子を、まず水または緩衝液中におよび／また は直接水性有機溶剤系中に入れる。

水相への有機溶剤の添加の際、精製すべき蛋白質が溶液中に残留することに注意 しなければならない。蛋白質が溶液中に残留しない場合には、ｐＨ１１、温度、 有機ａＭの割合および種類、霞衝液の種類およびその濃度、蛋白質濃度並びに塩 の種類および濃度を変動させることが推奨される。有機溶剤の添加の際に、ほか の物質が沈澱する場合、この物質を遠心分離で除去するかまたは濾別する。溶剤 としては、特にｌ−および２−プロパツール、アセトン、ＴＨＦおよびアセトニ トリルが適当である。ヒルジンの精製には、ｎ−ブタノールおよび２−プロパツ ールが、最も適している。

こうして得られた溶液に、相分離のために塩を添加する。塩としては、例えば塩 化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化セシウム、塩化カルシウ ム、塩化簗ＩＩマンガン、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸マグネシ ウム、蟻酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、カリウム−ナト リウム−酒石酸塩および炭酸カリウムのようなアルカリ金属塩化物が該当する。

また、塩の代りに、例えばＤ−ソルビットも使用できる。どの塩が最も適当であ るかは、もう一度、予備試験において測定する。これが、塩の量に相当する。通 常、相が塩で飽和している程度に多量の塩を添加する場合に、相分離は最もよヒ ルジンの精製のためには、特に塩化ナトリウムおよび硫酸アンモニウムが適当で ある。また、適切なパラメータの選択の際に、蛋白質が、相分離後に主として水 相中に存在することに注意すべきである。パラメータの選択のために、なんら一 般的規則を立てられない場合、パラメータを若干の予備試験において測定するこ とが推奨される。

相分離の際に、沈澱物が生じた場合、この沈澱物は廃棄される。

本発明方法は、迅速で、安価かつ簡単に実施可能である。従来の有機／水性抽出 法と比べて、精製すべき蛋白質が、有機／水性混合相中に溶解したまま残留し、 次の相分離によって初めて、有利に分離した水相に変えられることにより顕著で ある。新規方法の特別な利点は、蛋白質が、水と混合可能な有機溶剤の使用に基 づき、絶えず水性の環境に存在することである。従つて、適当な条件下で、多く の蛋白質は、活性形でｆｌｌｌａすることができる。

しかしまた、この方法は、不活性もしくは変性された蛋白質の濃縮のためにも使 用できる。

実施例　１ ヒルジン含有の細胞抽出液を用いた有機／水性分配クロマトグラフィ ヒルジンとともに更に多数の異種蛋白質、ペプチド並びに発酵媒体および細胞の 部分的に着色した成分を含有するＥ、ｃｏｌｉからの粗（前精製された細胞抽出 液から出発した。ヒルジンを約１０％（蛋白質に対して）に濃縮した。

１０〜１００ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度を有する前記抽出液の水溶液に、０〜２０ ℃で、イソプロパツール１容量を添加し、混合相のｐＨ値を、２ＮのＨＣＩでｐ Ｈ１〜２に調節した。沈澱した物質を、遠心分離（３０分間、ｌ１００ｏＯ，０ 〜２０℃）または濾過により分離した。この上清もしくは濾液を、引続き、２Ｎ のＮａＯＨでｐＨ４〜４．３に調節し、撹拌しながら、飽和するまで固体のＮａ ＣＩを添加した。撹拌過程の終了後、有機相および水相の自然分離が発生した。

同時に、有機相と水相との間に、主として沈澱した蛋白質からなる揮発性の純粋 な中間相が形成された。

ヒルジンは、はとんど専ら水相中に存在していた。水相中の活性ヒルジンの収率 は、７０〜９０％であった。

更に収率を増大させることは、有機相を、繰返しＨ２０／食塩で抽出する場合に 可能である。

抽出によって、ヒルジンは少なくとも５倍だけ濃縮された。更に、（部分的に着 色された）疎水性の汚染物質を、相分離後に著しい暗色を示すインプロパツール 相に変換した。

実施例　２ 粗く濃縮された蛋白質　Ａ−ヒルジン−融合蛋白質を用いた有機／水性分配クロ マトグラフィ出発物質として、Ｅ、ｃｏｌｉの細胞！！！濁液から沈澱した沈澱 物を使用した。この沈澱物は、不活性のヒルジンを、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ ｕｓ　ａｕｒｅｕｓからの蛋白質　ＡのＮ末端領域との融合蛋白質の形で有して いる。全部の蛋白質についての融合蛋白質の蛋白質含量は、約４０％であった。

異種蛋白質とともに、沈澱物は、大量の細胞成分および発酵成分を有している。

この沈澱物を水に入れて、ＩＪ当り沈澱物５０ｇの濃厚液に変えた。この＃＠液 のｐＨ値を、４０％のＨ２ＳＯ，もしくは２ＮのＮ　ａ　ＯＨで、ｐＨ５に調節 した。

引続き、インプロパツール】容量を添加し、混合相のｐＨ値を、新たにｐＨ５に 調節し、不溶性物質を遠心分離（ｌｏｏｏｏｇ、１５分間、２０℃）によって分 離した。こうして、上清のｐＨｆｌｌを、２ＮのＮ　ａ　ＯＨでｐＨ７に調節し た。次に、上清に、撹拌しながらＮａｃｌｌ、５モルの濃厚液になるまで、固体 のＮ　ａ　Ｃ１を添加した。撹拌過程の終了後、有機相および水相の自然分離が 行われ、この場合、前記の相の間で主として変性された蛋白質からなる中間相が 形成された。

蛋白質　Ａ−ヒルジン−融合蛋白質は、水相中にほぼ定量的に存在していた。融 合蛋白質は、水相中の全部の蛋白質の含量約８０％を有している。異種蛋白質と ともに、抽出によって、就中ＤＮＡ並びに疎水性かつ抽出条件下で劣った可溶性 の細胞内容物および発酵媒体の成分を著しく濃厚にした。これによって、融合蛋 白質の後加工を、著しく単純にした。

また、蛋白質　Ａ−ヒルジン−融合蛋白質の濃縮は、有機相の中でも可能である 。これは、相分離を、上記のようにｐＨ７で実施するのでなく、ｐＨ１，５で実 施した場合に達成される。このｐＨ値を、塩添加の前に、２ＮのＭＣＩで調節し た。

粗（濃縮された蛋白質　Ａ−ヒルジン−融合蛋白質を、以下のようにして得た： 発見プラスミドの製造 ａ）ベクターの構造 蛋白質　Ａ−ベクター　ｐＲＴＴ　２Ｔ（第１図）は、市販のものが入手でき、 詳細に記載されているこのベクターを、以下のようにして変性した：このベクタ ーを、制限エンドヌクレアーゼ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＴで切断した。より大きなフラ グメント（ベクター）を、電気溶出によって寒天ゲルから単離した。前記ベクタ ー中に、相補性オリゴヌクレオチド　Ｋｏｅ　１／２（配列　ｌ）をリゲートし た。生じたキメラプラスミドを、λ−溶溶菌菌株Ｎ　４８３０−１　（Ｐｉｌａ ｒｓａ（ｉａ商品番号２７−４８０８−０１）に形質転換した。

オリゴヌクレオチドの正確な配向を有するクローンを、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ／Ｅｃ ｏＲＩ制限地図を用いて、可能な組換え体から選び出し、Ｄ　Ｎ　Ａ配列により 検査した。前記発現プラスミドを、ｐＲＩＴ　２Ｔと呼称した。

ｂ）アダプタを有する合成ヒルジン遺伝子の使用ｐＲＩＴ　２Ｔ−ＤＮＡを、Ｅ ｃｏＲＩおよび５ａＩＩで切断し、より大きなりＮＡフラグメント（ａ）を、電 気溶出によって寒天ゲルから単離した。

合成ヒルジン遺伝子（配列　６）を、ＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ社、３８０Ａ型）を用ｂ）で製造した。更に、オリゴヌクレオチド （Ｋｏｅ　３−Ｋ。

ｅ　６）４個を調整した（配列　２〜５）。オリゴヌクレオチドを、キナーゼ化 し、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｓ　ａ　ｌ　Ｉで直線化されたプラスミド　ｐＵｃ 　１８をリゲートした。この構造を、ＤＮＡ配列を用いて検査した。前記キメラ プラスミド（ｐＵｃ　ｌ　８−Ｈｉ　ｒ）から、ヒルジン遺伝子（ｂ）を含んだ アダプタを、ＥｃｏＲＪで切断し、寒天ゲル電気泳動および電気溶出を介して単 離した０合成ヒルジン遺伝子は、２つの停止コドンとともに３′末端および５ａ ｉｌ認識部位で、ヒルジン遺伝子が、読み取りラスタを保持しながら、ＥｃｏＲ Ｉ−切断部位を介して蛋白質　八−融合成分と結合するアダプタ配列を内容とし ている。

単離されたｏ　Ｎ　Ａフラグメントａおよびｂを互いに結合させ、溶菌菌株　Ｎ ４８３０−１に形質変換した。こうして、蛋白質　Ａ−ヒルジン発現ベクターｐ ＲＩＴ２ＴＡ−Ｈｉｒを生じた（第２図）。

融合蛋白質の発現 発現プラスミドｐＲＩＴ　２ＴＡ−Ｈｉｒを、Ｅ。

ｃｏｌｉ菌株（Ｐｈａｒｍａｃｉａ商品番号２７−４８０８−０１）に形質変換 した。前記菌株は、染色体に熱感応性λ−−制因子　ＣＩ　８５７を有している 。

じゃま板を有する１１のエルシンマイヤーフラスコ中に、ＭＩＭ媒体１００１０ ０ｍ１（は、１１当りトリプトン３２ｇ、＠母エキス２０ｇ、ＮａｔＨＰ○４６ ｇ　、Ｋ　Ｈｒ　Ｐ　Ｏｔ　３　ｇ　、　Ｎ　ａ　ＣＩ　０　、５　ｇ　、Ｎ　 Ｈ４ＣＩ　１ｇおよびＭｇＳＯ４０，１ミリモル並びにＦｅＣ１，０，００１ミ リモルである）を滅菌し、アンピシリン（１ｍｌ当り１００μｇまで）を添加し た。この媒体に、菌株　ｐＲＩＴ　２ＴＡ−Ｈｉｒ／Ｎ　４８３０−１の１晩放 置した新しい培地１ｍｌを接種し、振動させながら、５５０ｎｍでの吸収量が０ ．６になるまでの間、２８℃で温めた０次に、６５℃の熱さの新しいＭ　Ｉ　Ｍ 　／　ａ　ｍ　ｐ−媒体１００ｍ１を添加し、更に４時間、４２℃で温めた。前 記の時間で、望ましい融合蛋白質を合成した。リゾチームを７５ｍｇ／ｌになる まで添加しかつ恒温保持（３時間、３７℃）することにより、細胞壁を酵素的に 除去した。次に、細胞を機械的に（マントン・ガラリン圧縮機（Ｍａｎｔ。

ｎ−Ｇａｕｌ　１ｎ　Ｐｒｅｓｓｅ）、凍結サイクル、強力な撹拌）、８０℃ま での熱衝撃または低張性溶解によって開放することかでき、可溶性の融合蛋白質 を媒体中に遊離することができた。

実施例　３ ヒルジンおよび種々の相系を用いた有機／水性分配クロマトグラフィ ヒルジン並びに種々の溶液系および塩を用いた分配クロマトグラフィの実施のた めに、濃度１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１のヒルジン水溶液から、酢酸ナトリウム２０ ミリモル中、ｐＨ４，０で出発した。

種々の溶剤および塩の多くの組合せ物で、ヒルジンを著しく、主として水相中で 濃縮することができた。

（第１表を参照のこと）。

実施例　４ キモトリプシン　Ａ４および種々の相系を用いた有機−水性分配クロマトグラフ ィ 分配クロマトグラフィの実施のために、濃度１ｍｇ／ｍｌのキモトリプシン水溶 液から出発した。

キモトリプシン溶液を、それぞれ５ｍｌのアリコートに分割し、パンチ量に種々 の有機溶剤（第２表を参照のこと）の１容量を添加しかつ混合した。混合層に、 室温（２０℃）で、Ｎ　ａ　ＣｌまたはＤ−ソルビット（第３表を参照のこと） を撹拌しながら飽和するまで添加した。撹拌過程の終了後、相分離が自然に生じ た。

第３表には、主として下の水相の容量、主として上の有機相の容量並びに前記の 相中に存在する活量を記載した。

キモトリプシン活量を、基質ペプチド　Ｎ−スクシニル−Ａｌ　ａ−Ａｌ　ａ− Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリンの変換に基づき測定した（Ａｎａｌ、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　９９．３１６　（１９７９年））。

実施例　５ 種々の相系中での葉酸を用いた有機−水性分配クロマトグラフィ 分配クロマトグラフィの実施のために、濃度０．　１ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌの葉酸 水溶液から、燐酸ナトリウム２０ミリモル中、ｐＨ７，０で出発した。葉酸溶液 それぞれ５ｍｌに、水と混合可能な有機溶剤（第４表を参照のこと）それぞれ５ 　ｍ　ｌを、室温（２０℃）で添加した。

水相および有機相への溶剤の引続く分離のために、撹拌しながら、種々の塩（第 ４表を参照のこと）を飽和するまで添加した。相分離は、撹拌過程の終了後に自 然に行われた。

相分離後の水相および有機相の容量並びに該相中に含まれた葉酸の含量を、第４ 表に記載した０種々の相中に含まれた葉酸の量を、分光器により測定した。更に 、相の吸着量を、３４６ｎｍの場合に測定した。相の葉酸の含量を、種々の容量 を顧慮しながら、公知の濃度（燐酸ナトリウム２０ミリモル中でＯ，１ｍｇ／ｍ ＋、ｐＨ７，０）の葉酸溶液の吸着量を用いて、３４６ｎｍで計測した。

使用した溶剤系の多数を用いて、葉酸をほぼ定量的に水相中で濃縮することがで きる。しかしながら、若干の系（例えば、インプロパツール／ＨｚＯ／塩化リチ ウム）は、有機相中の濃縮もできるようにするものである。

要　約　書 生物分子を、水性／有機溶剤系に入れ、塩の添加によって相分離を惹起し、この 場合、濃縮した際のｐＨ値、水性／有機溶剤系に適する溶剤および塩の種顕を一 連の試験の中で測定することからなる生物分子の濃縮もしくは精製のための方法 が記載されている。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 生物分子の濃縮もしくは精製のための方法において、生物分子を、水および／ま たは緩衝液および水と混合可能な有機溶剤からなる混合物中に溶解し、引続き塩 の添加によって惹起される相分離の際に分離した相の１つの中で濃縮し、この場 合、濃縮した際のｐＨ値、生物分子の抽出に適する溶剤および塩の種類を一連の 試験の中で測定することを特徴とする、生物分子の濃縮もしくは精製のための方 法。