CN109852623B

CN109852623B - 一种peg修饰的重组人源化尿酸氧化酶的制备方法、纯化方法及其用途

Info

Publication number: CN109852623B
Application number: CN201910119347.0A
Authority: CN
Inventors: 张文宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-02-15
Filing date: 2019-02-15
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2039-02-15
Also published as: CN109852623A

Abstract

本发明涉及重组人源化尿酸氧化酶制备方法及纯化方法、编码重组人源化尿酸氧化酶蛋白的核酸序列、表达重组尿酸氧化酶蛋白的质粒载体及工程菌。本发明以人尿酸酶假基因序列为模板对其位点进行突变，获得了与人假基因序列同源性更高(92.6％)且有活性的重组人源化尿酸氧化酶，与此同时对纯化工艺进行了改进，最大限度的降低尿酸酶在纯化过程中出现的活性损失。本发明制备的高剂量的人源化尿酸氧化酶在给药两天后显示出显著的缓解尿酸钠结晶引起的疼痛，给药4天后症状缓解程度与假手术组已无差异，表明症状完全缓解，具有显著的进步。

Description

一种PEG修饰的重组人源化尿酸氧化酶的制备方法、纯化方法及其用途

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及PEG修饰的重组人源化尿酸氧化酶制备方法及纯化方法、编码重组人源化尿酸氧化酶蛋白的核酸序列、表达重组尿酸氧化酶蛋白的质粒载体及工程菌。

背景技术

痛风是一种单钠尿酸盐(MSU)沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱及(或)尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，属于代谢性风湿病。据中华医学会风湿病学分会2016年的不完全统计资料表明，我国痛风的患病率在1％～3％，并呈逐年上升趋势。

尿酸氧化酶(尿酸酶，E.C.1.7.3.3)是生物体内嘌呤代谢的关键酶，其可将不溶性的尿酸降解为可溶性尿囊素，并随之排出体外。在生物体嘌呤代谢途径中，嘌呤降解生成尿酸的过程从原核到真核生物高度保守，大多数的生物体内都存在尿酸氧化酶，尿酸氧化酶催化尿酸生成更易溶于水和更易排泄的尿囊素。在灵长类动物漫长的进化过程中，人、黑猩猩、猩猩、大猩猩和长臂猿5种人科动物尿酸氧化酶基因大约在1 000～2 200万年前失活，成为假基因，因此，人科动物体内没有尿酸氧化酶。由于人体内缺失尿酸氧化酶，尿酸成为人体内嘌呤代谢的最终产物，因此人体内血浆尿酸水平大约是非灵长类动物的10倍。在正常嘌呤饮食状态下，两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即称为高尿酸血症。高尿酸血症是由人体内产生尿酸的速率和肾脏排泄的速率不平衡导致的，目前研究认为尿酸的低溶解度和异常的高血清尿酸浓度是导致痛风、肾结石和血管类疾病的直接原因。研究表明，高尿酸血症能增加心血管疾病、慢性肾病、肾功能受损、高血压和中风等并发症的危险，其严重的并发症引起了人们对其治疗的极大关注。故从上世纪60年代McCarty和Hollander阐明了单钠尿酸盐的结晶是痛风致病机理后，人们对用尿酸酶来治疗痛风的探索就没有停止：1.1968年Laboureur P从黄曲霉中提取尿酸氧化酶治疗肿瘤裂解综合征；2.2002年FDA批准重组黄曲霉的尿酸氧化酶Rasburicase用于治疗肿瘤裂解综合征引起的高尿酸血症，但由于其的强免疫原性及半衰期较短，尝试痛风治疗的探索受阻；3.2010年FDA批准Pegloticase作为治疗顽固性痛风的治疗药物，为了解决尿酸氧化酶Rasburicase在治疗时出现的的高免疫原性和半衰期较短的问题，该药品使用陆生哺乳动物来源的尿酸氧化酶并将其进行PEG化。4.此外，国内一些生物医药公司也对尿酸酶用于痛风治疗进行了一些探索，如重庆富进公司合成的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶以及沈阳三生制药的聚乙二醇化重组假丝酵母尿酸氧化酶，两类尿酸氧化酶均是通过利用陆生哺乳动物来源的尿酸氧化酶或是通过对尿酸酶进行PEG化进行修饰从而降低尿酸氧化酶的免疫原性和延长半衰期。

尿酸氧化酶作为痛风治疗的降酸药物，其在产业化及临床应用过程中主要存在以下四个问题：1.如何降低免疫原性以满足重复给药的要求；2.在生产工艺过程中如何最大限度的保留酶活性；3.如何在生理pH条件下使尿酸氧化酶溶解度较好且保持生物学功能；4.如何延长尿酸酶在体内的半衰期，降低给药频率。

聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶和Pegloticase都是通过利用陆生哺乳动物来源的尿酸氧化酶的片段基因与人或是狒狒的尿酸氧化酶基因的片段进行整合从而获得与人尿酸酶假基因序列高度同源化的尿酸酶基因序列，其同源性分别为91.4％和88％，降低了免疫原性。此外，利用PEG化修饰，使陆生哺乳动物来源的尿酸氧化酶在生理pH条件下可溶，并且延长其在体内的半衰期。但是哺乳类动物来源的尿酸酶在其产业化过程中仍然存在些问题，其中在纯化过程中哺乳动物来源的尿酸氧化酶在生理pH条件下不溶解，故传统的纯化方法只能在较高的pH(8.5-9.2)条件下将其溶解后，用黄嘌呤亲和层析进行纯化，而该过程中尿酸酶要长期暴露在高pH条件下，会损失部分的酶活。

早期的关于尿酸氧化酶主要集中在非人源的尿酸氧化酶，如CN101402688A公开的微生物源尿酸氧化酶(如黄曲霉、假丝酵母、植物等)，但是微生物源尿酸氧化酶存在和人类尿酸氧化酶基因序列同源性较差的问题。后来陆续有专利报道了哺乳动物源尿酸氧化酶，如CN102634492A公开的聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶，但是其在动物试验中降尿酸的能力并不理想，CN103834623A虽然公开了一种低免疫原性的降尿酸的人源尿酸氧化酶，但是其未进行PEG修饰，导致该尿酸氧化酶对pH更加敏感，不能耐受较高的pH，在生产中会存在酶活性降低的问题。

基于上述背景技调研，本发明旨在至少解决以下技术问题：如何降低尿酸氧化酶免疫原性以满足重复给药的要求；2.在生产工艺过程中如何避免pH对尿酸氧化酶活性的影响从而最大限度的保留酶活性；3.如何在生理pH条件下使尿酸氧化酶溶解度较好且保持生物学功能；4.如何延长尿酸酶在体内的半衰期，降低给药频率。

本发明以人源尿酸酶假基因序列为模板对其位点进行突变，获得了与人假基因序列同源性更高(92.6％)且有活性的尿酸酶，与此同时对纯化工艺进行了改进，最大限度的降低尿酸酶在纯化过程中出现的活性损失。

发明内容

本发明针对以上要解决的技术问题，提供重组人源化尿酸氧化酶制备方法及纯化方法、编码重组人源化尿酸氧化酶蛋白的核酸序列、表达重组尿酸氧化酶蛋白的质粒载体及工程菌。

本发明的另一目的于提供一种编码重组人源化尿酸氧化酶蛋白的核酸序列，其特征在于，该核酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的另一目的于提供一种重组人源化尿酸氧化酶蛋白，其特征在于通过上述编码重组人源化尿酸氧化酶蛋白的核酸序列翻译获得。

本发明的另一目的于提供一种表达重组人源化尿酸氧化酶蛋白的质粒载体，其特征在于：所述质粒载体包含上述编码重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列。

本发明的另一目的于提供一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌包含上述质粒载体。

本发明的另一目的于提供一种重组人源化尿酸氧化酶纯化的技术途径，其特征在于通过如下步骤进行：(1)重组人源化尿酸氧化酶基因在工程菌种的表达；(2)对步骤(1)中表达的工程菌进行破碎，收集类包涵体；(3)加入pH10.3碳酸盐缓冲溶液，4℃溶解类包涵体。(4)通过加入既可提高分子内氢键又可以降低电导的试剂调整溶液的pH和电导；(5)进行DEAE层析得到人源化尿酸氧化酶。

上述重组人源化尿酸氧化酶纯化的技术途径，所述步骤(4)的具体操作如下：向缓冲溶液中加入甘油、PEG或蔗糖，后在加入NaHCO₃、CH₃COOH或HCl使缓冲液的pH降低到8.5—9.2。

本发明的另一目的于提供一种纯化PEG修饰后的重组人源化尿酸氧化酶的方法，其特征在于通过如下步骤进行：(1)调整人源化尿酸氧化酶的浓度，进行PEG试剂进行PEG修饰；(2)将PEG修饰反应完全的溶液用50KD超滤离心管超滤替换缓体系，缓冲体系替换成的pH10.5-11.0的氯化铵-氨水缓冲液。(2)降低pH值至7.5-8.0进行洗脱；(3)通过提高氯化钠盐浓度至0.5-1.0M，将表面电荷较多的、结合较强的PEG-尿酸酶洗脱得到纯化的PEG修饰的重组人源化尿酸氧化酶。

本发明的另一目的于提供一种PEG修饰后的重组人源化尿酸氧化酶，其特征在于由上述的重组人源化尿酸氧化酶蛋白的核酸序列在工程菌种表达获得。

本发明的另一目的于提供一种上述PEG修饰的尿酸氧化酶在制备降低尿酸生物试剂上的应用。

本发明的另一目的于提供一种上述PEG修饰的尿酸氧化酶在制备缓解通风急性发作生物试剂上的应用。

1)人源化尿酸氧化酶(MERE)蛋白序列及DNA序列：

天然存在的人尿酸酶假基因编码区在33位和187位存在两个终止密码子，将两个密码子经回复突变后变为精氨酸(Arg)的密码子，并把该序列翻译后形成了人源化尿酸氧化酶蛋白的骨架序列(SEQ ID NO:1)，我们以此序列为骨架，对序列进行突变及截断部分氨基酸序列得到了一类新的与人尿酸酶假基因同源性达到92.6％的人源化尿酸氧化酶(MERE)蛋白序列(SEQ ID NO:2)。

MERE序列与人类尿酸酶假基因序列相比主要突变为：33与187位终止密码子变为R，N端1-7位密码子MAHYHNN变为MD，E83G，G91A，V92M，M112V，I115V，H119R，L120F，G121E，L146M，Q151P，C202G，K208E，I214V，L217I，M219L，S222F，L232S，T232P，C240Y，A252E。

SEQ ID NO:1

MAHYHNNYKKNDEVEFVRTGYGKEMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKEIKSIEAFGVNICEHFLSSFNHVIRAQVYMEEIPWKHLGKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQLRSGPQVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQCRDVDFKATWDTIRDLVMEKSAGPYDKGEYLTSVQKTLCDIQVLSLSRVPAIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL

SEQ ID NO:2

MDYKKNDEVEFVRTGYGKEMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQMRSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLEKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL

将突变后形成的新的尿酸氧化酶MERE的氨基酸序列转换为核酸序列，利用软件进一步优化(选择Ecoli系统常用的密码子，同时平衡GC碱基的分布，使其分布均匀，降低二级结构形成的概率等)使其利于在大肠杆菌(Ecoli)中进行高效表达，优化后的核酸序列(SEQID NO:3)如下所示：

SEQ ID NO:3

GATTATAAGAAAAATGATGAAGTGGAGTTTGTGCGCACCGGCTATGGCAAGGAAATGGTGAAGGTGCTGCACATCCAGCGTGATGGCAAATATCATAGCATTAAAGAAGTGGCCACCAGCGTGCAGCTGACCCTGAGCAGCAAAAAGGATTACCTGCACGGCGACAACAGCGATATCATTCCGACCGACACCATCAAGAATACCGTGCATGTGCTGGCCAAATTCAAGGGCATCAAGAGCATCGAGGCCTTCGCCATGAATATCTGCGAGCATTTTCTGAGCAGCTTCAACCACGTGATTCGTGCCCAGGTGTATGTGGAAGAAGTGCCGTGGAAGCGCTTCGAGAAAAATGGCGTGAAGCACGTGCATGCCTTTATCCATACCCCGACCGGCACCCACTTTTGCGAAGTGGAGCAGATGCGTAGCGGCCCGCCGGTGATTCATAGCGGCATCAAAGATCTGAAGGTGCTGAAAACCACCCAGAGTGGCTTTGAGGGCTTTATCAAGGACCAGTTCACCACCCTGCCGGAGGTGAAAGACCGTTGCTTTGCCACCCAGGTGTACTGCAAATGGCGTTACCACCAGGGCCGCGATGTGGATTTTGAAGCCACCTGGGATACCGTTCGCGATATCGTGCTGGAAAAGTTTGCCGGCCCGTATGATAAGGGCGAATACAGTCCGAGCGTGCAGAAGACCCTGTATGATATCCAGGTGCTGAGCCTGAGCCGTGTGCCGGAGATCGAGGACATGGAAATCAGCCTGCCGAACATTCATTATTTTAATATCGATATGAGCAAGATGGGCCTGATCAACAAAGAAGAAGTTCTGCTGCCGCTGGATAACCCGTATGGTAAGATCACCGGTACCGTGAAGCGTAAGCTGAGCAGCCGTCTGTAA

人源化尿酸氧化酶高效表达菌株构建

将MERE的蛋白序列转化为DNA序列并经优化后的序列(SEQ ID NO:3)，在SEQ IDNO:3前后两端分别加入NcoI(CCATGG)和XhoI(CTCGAG)双酶切位点后人工合成SEQ ID NO:4(苏州金唯智生物科技有限公司)，合成后的序列SEQ ID NO:4双酶切(NcoI和XhoI)后连接到同样双酶切的pET-28a载体上，转入DH5α菌体扩增并提质粒，获得表达载体。

SEQ ID NO:4

CCATGGATTATAAGAAAAATGATGAAGTGGAGTTTGTGCGCACCGGCTATGGCAAGGAAATGGTGAAGGTGCTGCACATCCAGCGTGATGGCAAATATCATAGCATTAAAGAAGTGGCCACCAGCGTGCAGCTGACCCTGAGCAGCAAAAAGGATTACCTGCACGGCGACAACAGCGATATCATTCCGACCGACACCATCAAGAATACCGTGCATGTGCTGGCCAAATTCAAGGGCATCAAGAGCATCGAGGCCTTCGCCATGAATATCTGCGAGCATTTTCTGAGCAGCTTCAACCACGTGATTCGTGCCCAGGTGTATGTGGAAGAAGTGCCGTGGAAGCGCTTCGAGAAAAATGGCGTGAAGCACGTGCATGCCTTTATCCATACCCCGACCGGCACCCACTTTTGCGAAGTGGAGCAGATGCGTAGCGGCCCGCCGGTGATTCATAGCGGCATCAAAGATCTGAAGGTGCTGAAAACCACCCAGAGTGGCTTTGAGGGCTTTATCAAGGACCAGTTCACCACCCTGCCGGAGGTGAAAGACCGTTGCTTTGCCACCCAGGTGTACTGCAAATGGCGTTACCACCAGGGCCGCGATGTGGATTTTGAAGCCACCTGGGATACCGTTCGCGATATCGTGCTGGAAAAGTTTGCCGGCCCGTATGATAAGGGCGAATACAGTCCGAGCGTGCAGAAGACCCTGTATGATATCCAGGTGCTGAGCCTGAGCCGTGTGCCGGAGATCGAGGACATGGAAATCAGCCTGCCGAACATTCATTATTTTAATATCGATATGAGCAAGATGGGCCTGATCAACAAAGAAGAAGTTCTGCTGCCGCTGGATAACCCGTATGGTAAGATCACCGGTACCGTGAAGCGTAAGCTGAGCAGCCGTCTGTAACTCGAG

再将表达载体转化BL21，通过Kanamycin筛选阳性菌株，获得表达菌株。获得的菌体小量表达结果如图2所示。其中泳道1为MERE菌体诱导表达的类包涵体，泳道2为标准蛋白，泳道3为MERE菌体表达的细胞上清。从图1的SDS-PAGE电泳图可知，在MERE菌体表达的类包涵体中在30-40KD分子量内有目的蛋白表达，目的蛋白分子量与理论值一致(34.6KD)。构建好的表达菌株冻存到-80℃冰箱备用。

2)人源化尿酸氧化酶(MERE)合成的技术途径

将优化后的MERE的DNA序列进行全基因合成并将其连接到pET-28a载体上，构建好的表达载体转入到DH5α中进行扩增，提取表达载体转入BL21构建表达菌株，通过抗性筛选选择阳性克隆，进行菌株扩增，将获得的菌株在37℃培养扩增，当OD₆₀₀值达到0.6-0.9时，加入IPTG诱导，25℃低温表达16h，收集菌体进行菌体破碎。

3)人源化尿酸氧化酶(MERE)纯化的技术途径(图1所示)

a)菌体收集破碎：在5000rpm条件下离心15min收集菌体，50mM pH8.0的磷酸盐缓冲液重悬菌体，用均质机破碎菌体重悬液中的细菌，破碎过程中保证低温避免蛋白变性(4℃冰浴)，流速设置5000ml/min，用500bar压力破碎一遍后再用1000bar循环破碎，循环20min后压力调为1300bar循环破碎0.5h，收集细胞破碎液；将收集的细胞破碎液12500g离心20min后弃上清，用400ml的50mM pH8.0磷酸盐缓冲液+0.2％triton洗涤1h，然后12500g离心20min收集类包涵体。

b)类包涵体溶解：由于MERE在生理pH条件下溶解度极低，因此通过Ecoli表达而来的MERE以类包涵体形式存在，故必须将其溶解后才能进行下一步纯化。具体方式如下：将离心分离并清洗完的类包涵体，加入pH10.3碳酸盐缓冲溶液，4℃溶解过夜。

c)调整缓冲液条件：MERE在pH10.3溶解的缓冲溶液中，而在此条件下进行下一步层析分离将受到很大的限制；通过对MERE结构分析可知，MERE形成类包涵体的主要是因为分子间的疏水作用形成聚体产生的，因此，通过增加分子内氢键稳定构象，防止疏水作用形成多聚体。通过实验发现，影响MERE形成多聚体沉淀主要与缓冲液中的电导和pH有关。故为了提高MERE在低pH条件下的溶解性，在调pH之前向缓冲液中加入即可提高分子内氢键又可以降低电导的试剂。具体操作如下：通过实验筛选后发现向缓冲溶液中加入甘油、PEG或是蔗糖，后在加入NaHCO₃、CH₃COOH或是HCl使缓冲液的pH降低到8.5-9.2，可以不出现多聚体沉淀，以该处理后的料液进行DEAE层析分离。

d)进行DEAE层析分离：在pH 8.5-9.2之间上样，利用NaCl梯度洗脱目的蛋白。用50mM碳酸钠缓冲液(pH8.5-9.2)平衡层析柱；将处理后的料液上样至DEAE层析柱；待上样完成后，用50mM碳酸钠缓冲液(pH8.5-9.2)冲洗层析柱，待A280吸收值走平后，用A液为50mM碳酸钠缓冲液(pH8.5-9.2)，B液为含0.5M NaCl的50mM碳酸钠缓冲液(pH8.5-9.2)进行梯度洗脱。

4)人源化尿酸氧化酶(MERE)PEG化修饰及修饰后纯化的技术途径

PEG修饰后，PEG长链包裹于尿酸酶分子外形成了一个柔性PEG外层，这一外层约束了尿酸酶分子亚基的解离，使PEG-尿酸酶更稳定，可以耐受更高的pH。PEG长链屏蔽了蛋白表面的部分电荷，修饰位点越多，表面电荷越少。另一方面，经氨基修饰结合PEG的蛋白，等电点一般会较原蛋白下降一个单位。同时，PEG的两亲性质使得尿酸酶分子的水溶性更好。

为了最大程度改善修饰后的尿酸酶免疫原性、溶解度、稳定性等问题，本发明采用了较为饱和的修饰策略。在其中一个实施中，我们发现，几乎所有的酶分子都与PEG结合，但并不是每个天然状态尿酸酶分子的4个亚基都结合了PEG。因此，需对修饰后的尿酸酶进行分离纯化，从多位点修饰、单点修饰和未修饰蛋白混合物种，分离出4个亚基都结合了PEG，修饰位点较多的、更均一的PEG-尿酸酶。

在本发明中，将MERE浓度调为4.0-5.0mg/ml，按照物质量比为1:20--1:160加入对应的10KD PEG-NPC或是PEG-SPA粉末，避光2-8℃反应2h以上。将反应完全的溶液用50KD超滤离心管超滤替换缓体系，缓冲体系替换成的pH10.5-11.0的氯化铵-氨水缓冲液。

在该条件下，单点修饰及未修饰蛋白表面带有更多电荷，显示出更强的结合能力，可结合至阴离子交换层析介质中。而多位点修饰蛋白几乎不带电荷，无法结合到阴离子交换介质上而穿透。

1)为了将不同修饰程度的尿酸酶蛋白分离，在本发明中，三步分离法：首先通过调节pH至10.5-11.0，将修饰较为饱和、几乎不带表面电荷、与离子交换剂几乎不结合的PEG-尿酸酶穿透分离。然后通过降低pH值至7.5-8.0进行洗脱。该条件下洗脱较为温和，将表面电荷较少的、结合较弱的PEG-尿酸酶洗脱。而后通过提高氯化钠盐浓度至0.5-1.0M，将表面电荷较多的、结合较强的PEG-尿酸酶洗脱。以此分离不同修饰程度的PEG-尿酸酶，获得修饰程度高、均一性高的PEG-尿酸酶。

采用了两步洗脱法。首先通过降低pH值至7.5-8.0进行洗脱。该条件下洗脱较为温和，将表面电荷较少的、结合较弱的PEG-尿酸酶洗脱。而后通过提高氯化钠盐浓度至0.5-1.0M，将表面电荷较多的、结合较强的PEG-尿酸酶洗脱。

5)MERE-PEG缓解痛风急性发作期疼痛的生物活性试验技术途径

尿酸氧化酶作为痛风治疗中的降酸治疗和高尿酸血症的治疗已被大家所熟知，但是其是否可以在痛风急性发作期缓解痛风石诱导的关节疼痛，鲜有公开报道，本发明公开了一种模拟痛风急性发作期疼痛的病理模型，并用MERE-PEG进行治疗，发现MERE-PEG可以很好的缓解痛风急性发作期的疼痛。

在大鼠关节腔中植入尿酸钠晶体，模拟急性痛风时，关节腔内产生的尿酸钠晶体沉积，并由此诱发的疼痛状态；通过Weight-Bearing身体侧倾感应装置直观反映受试动物四肢的承重状态，通过承重比例的差异来反应关节疼痛程度。在关节腔植入尿酸钠结晶4h后通过尾静脉注射MERE-PEG，PBS通过比较两组动物Weight-Bearing试验的差异来判断MERE-PEG缓解痛风急性发作时疼痛的能力差异。

2.技术特征:

2)人源化尿酸氧化酶(MERE)蛋白序列及DNA序列：我们筛选获得一类具有与人尿酸酶假基因高度同源的尿酸酶蛋白及DNA序列，该序列的特征是以人尿酸酶假基因为模板进行突变其中33与187位终止密码子变为R，N端1-7位密码子MAHYHNN变为MD，E83G，G91A，V92M，M112V，I115V，H119R，L120F，G121E，L146M，Q151P，C202G，K208E，I214V，L217I，M219L，S222F，L232S，T232P，C240Y，A252E。

3)人源化尿酸氧化酶(MERE)合成的技术途径：采用pET-28a构建载体并且对DNA序列进行了优化，采用BL21为表达菌株，利用低温诱导方式进行表达从而获得高效表达技术手段。

4)人源化尿酸氧化酶(MERE)纯化的技术途径：由于陆生哺乳动物来源的尿酸氧化酶在生理pH条件下溶解度极低，对纯化带来一定的难度，因此本发明在MERE纯化过程中对类包涵体的溶解和处理以及DEAE层析来获得高纯度的MERE具体特征如下：

a)类包涵体溶解：将离心收集后的大肠杆菌菌体重悬于pH 8.5的碳酸盐缓冲溶液，高压均质机破碎菌体离心分离类包涵体，用含0.2％TritonX-100的缓冲液洗涤类包涵体，清除表面的菌膜和膜蛋白，最后加入pH 10.3的碳酸盐缓冲溶液溶解。

b)调整缓冲液条件：通过实验筛选后发现向缓冲溶液中加入甘油、PEG或是蔗糖，后在加入NaHCO₃、CH₃COOH或是HCl使缓冲液的pH降低到8.5-9.2，可以不出现多聚体沉淀。

c)进行DEAE层析分离：在pH 8.5-9.2之间上样，利用NaCl梯度洗脱目的蛋白。

5)人源化尿酸氧化酶(MERE)PEG化修饰及修饰后纯化的技术途径：本发明采用HiScreen Q HP进行纯化并采用了三步分离法：首先通过调节pH至10.5-11.0，将修饰较为饱和、几乎不带表面电荷、与离子交换剂几乎不结合的PEG-尿酸酶穿透分离。然后通过降低pH值至7.5-8.0进行洗脱。该条件下洗脱较为温和，将表面电荷较少的、结合较弱的PEG-尿酸酶洗脱。而后通过提高氯化钠盐浓度至0.5-1.0M，将表面电荷较多的、结合较强的PEG-尿酸酶洗脱。以此分离不同修饰程度的PEG-尿酸酶，获得修饰程度高、均一性高的PEG-尿酸酶。

6)MERE-PEG缓解痛风急性发作期疼痛的生物活性试验技术途径：通过尿酸钠晶体植入大鼠关节腔来模拟痛风急性发作的病理模型，利用Weight-bearing试验来评价MERE-PEG缓解痛风急性发作时疼痛的药效。

本发明获得了下述有益效果:

1)本发明获得了一条与人尿酸氧化酶假基因同源性达92.6％以上的蛋白和DNA序列。并且该序列可在Ecoli中高效表达。

2)本发明尿酸氧化酶的纯化方法，克服了传统方法(黄嘌呤亲和层析方法)带来的缺陷：1.亲和层析过程中需用黄嘌呤进行洗脱，从而引入了新的杂质；2.亲和层析中，纯化出来的蛋白结构的聚体形式较丰富，且无法去除同分异构体；3.尿酸氧化酶最适pH在8.0-9.0之间，长期在高pH条件下(8.5-9.2)，会影响尿酸氧化酶内的分子间氢键，从而影响构象和活力。

3)本发明采用的MERE-PEG的纯化方法，获得了更均一性的MERE-PEG。

4)本发明公开了痛风急性发作的病理模型，并且利用该模型阐述了MERE-PEG在缓解痛风急性发作时的疼痛有很好的作用。

附图说明

图1为人源化尿酸氧化酶(MERE)纯化的技术路线图

图2为MERE蛋白诱导表达结果。

图3为Capto DEAE阴离子交换层析液相图。

图4为MERE经DEAE层析后SDS-PAGE图。

图5为MERE经DEAE层析后HPLC图。

图6为MERE经PEG化修饰后结果。

图7为MERE-PEG层析图谱。

图8为MERE-PEG HPLC检测图谱。

图9为MERE-PEG对急性痛风在关节处产生的疼痛的作用。

具体实施方式

实施例1

人源化尿酸氧化酶高效表达菌株构建

将MERE的蛋白序列转化为DNA序列并经优化(选择Ecoli系统常用的密码子，同时平衡GC碱基的分布，使其分布均匀，降低二级结构形成的概率等)后的序列(SEQ ID NO:3)，在SEQ ID NO:3前后两端分别加入NcoI(CCATGG)和XhoI(CTCGAG)双酶切位点后人工合成SEQ ID NO:4(给苏州金唯智生物科技有限公司)，合成后的序列SEQ ID NO:4双酶切(NcoI和XhoI)后连接到同样双酶切的pET-28a载体上，转入DH5α菌体扩增并提质粒，获得表达载体。

SEQ ID NO:4

实施例2

人源化尿酸氧化酶表达和纯化

步骤(1).蛋白表达：

a)目的菌株复苏：从-80℃取出甘油冻存的目的菌，在超净工作台中用LB稀释10万倍涂布于50μg Kanamycin的LB平板上，倒扣于37℃培养箱，过夜培养后存于4℃冰箱，2个月后重新复苏。

b)种子培养：配制50μg Kanamycin LB无菌培养基70ml于200ml三角药瓶，挑取平板上单菌落置于培养基中，置于37℃180rpm摇床中过夜培养。

c)批量培养及诱导表达：配制50μg Kanamycin LB无菌培养基400ml于1L三角摇瓶中，在超净工作台中向400ml培养基中加入4ml种子液(吸取前务必摇匀)，封口后放置于37℃250rpm摇床中培养。待OD₆₀₀为0.6-0.8(约3h)时，加入200μl 1MIPTG诱导表达。25℃180rpm培养16h后10℃保存菌液。

步骤(2).菌体破碎：

在5000rpm条件下离心15min收集菌体，50mM pH8.0的磷酸盐缓冲液重悬菌体，用均质机破碎菌体重悬液中的细菌，破碎过程中保证低温避免蛋白变性(4℃冰浴)，流速设置5000ml/min，用500bar压力破碎一遍后再用1000bar循环破碎，循环20min后压力调为1300bar循环破碎0.5h，收集细胞破碎液；将收集的细胞破碎液12500g离心20min后弃上清，用400ml的50mM pH8.0磷酸盐缓冲液+0.2％triton洗涤1h，然后12500g离心20min收集类包涵体。

步骤(3).类包涵体溶解：

用含0.2％TritonX-100的缓冲液洗涤类包涵体，清除表面的菌膜和膜蛋白，最后加入pH 10.3的碳酸盐缓冲溶液溶解。

步骤(4).调整缓冲液条件：

向缓冲溶液中加入10％甘油，后在加入NaHCO₃、使缓冲液的pH降低到9.2。

步骤(5).DEAE柱分离纯化：

层析柱：Capto DEAE60ml:ф＝16mm,L＝400mm

仪器：AKTA purifier

纯化步骤：

平衡：50mM碳酸氢钠缓冲液，pH9.2，流速：5ml/min，250ml

上样：处理后样品50mL，5ml/min。

冲平：50mM碳酸氢钠缓冲液，pH9.2，流速：5ml/min,150ml。

洗脱：A:50mM碳酸氢钠缓冲液，pH9.2

B:50mM碳酸氢钠缓冲液+0.5M NaCl，pH9.2，梯度洗脱：100min，流速：3ml/min，收集洗脱峰，洗脱结果如图2所示。

(6).纯度鉴定：通过SDS-PAGE电泳和HPLC鉴定纯度。

SDS-PAGE电泳：采用12％浓度分离胶进行电泳。DEAE柱分离纯化后电泳图仅见单一主条带，结果如图3所示。

HPLC法：色谱柱为四烷基键合硅胶反相C4柱(Sepax Bio-C4 4.6mm×250mm，粒度5μm，孔径

)；检测器为蒸发光散射检测器(Waters2424，漂移管温度为80℃，气体压力20psi，模式加热，功率75％)；柱温为30℃；进样体积为20μL；流动相：A为0.1体积％三氟乙酸水溶液，B为0.1体积％三氟乙酸乙腈溶液，0.22μm滤膜过滤，超声脱气10min后使用，变梯度洗脱，极性有机溶剂的浓度为连续性递增：0-10min由10体积％B升到35体积％B，10-30min由35体积％B升到80体积％B，30-31min由80体积％B降到10体积％B，31-45min维持10体积％B。DEAE柱分离纯化后HPLC图见图4所示，结果显示MERE纯度为98.52％。

实施例3

步骤(4)向缓冲溶液中加入10％蔗糖，后在加入CH₃COOH使缓冲液的pH降低到8.5，其余步骤和实施例2完全相同。

实施例4

人源化尿酸氧化酶PEG化修饰

将蛋白浓度调为4.0mg/ml，并分装到1.5ml离心管，在黑暗环境中根据反应比例1:20、1:40、1:80、1:160对应量称取10KD PEG-NPC粉末于装有1ml蛋白溶液的1.5离心管中，并用锡箔纸包住放置到4℃冰箱中，反应2小时以上。反应结果如图6所示，从图中可知在1:160的摩尔比下反应PEG修饰最完全。

将反应完全的溶液用50KD超滤离心管超滤替换缓体系，缓冲体系替换成50mMpH8.0的磷酸盐缓冲液。除去未反应的PEG-NPC，经缓冲液置换后可得到纯度88.45％左右的PEG尿酸酶。

实施例5：PEG化尿酸氧化酶纯化

层析柱：HiScreen Q HP(GE Healthcare)

样品：调节PEG修饰后的尿酸酶pH为11.0、电导至5mS/cm。

平衡缓冲液：pH 11.0，50mM氯化铵-氨水缓冲液。

洗脱缓冲液1：pH 7.5，50mM氯化铵-氨水缓冲液。

洗脱缓冲液2：pH7.5，含1.0M氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液。

流速：100cm/h(0.96mL/min)。

层析系统：AKTA Purifier 100(GE Healthcare)。

平衡缓冲液平衡柱体积5CV后，加样至层析柱中，收集穿透液，即图中7Peak1。上样完毕后使用平衡缓冲液洗涤5CV。洗涤完毕后，先使用洗脱缓冲液1进行洗脱，收集洗脱组分,即图7中Peak2。然后使用洗脱缓冲液2进行洗脱，收集洗脱组分,即图中Peak3。该步骤分别收集穿透液、pH梯度洗脱液、盐梯度洗脱液是为了分离不同修饰程度的尿酸酶。

PEG化尿酸氧化酶纯度鉴定：取穿透液部分，HPLC方法如实施例2，经分离纯化后样品HPLC图8显示MERE-PEG纯度为98.81％。

实施例6：

通过降解体内尿酸水平，缓解痛风急性发作时疼痛的能力。具体药效学试验结果如图9所示，从图中可以看出高剂量的MERE在给药两天后显示出显著的缓解尿酸钠结晶引起的疼痛，给药4天后症状缓解程度与假手术组已无差异，表明症状完全缓解。低剂量MERE未能在整个实验过程中体现出症状缓解的作用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 张文宇

<120> 一种PEG修饰的重组人源化尿酸氧化酶的制备方法、纯化方法及其用途

<130> 2019.3.14

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ala His Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe

1 5 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Glu Met Val Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln

35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys

65 70 75 80

Phe Lys Glu Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Met

100 105 110

Glu Glu Ile Pro Trp Lys His Leu Gly Lys Asn Gly Val Lys His Val

115 120 125

His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Leu Arg Ser Gly Pro Gln Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Lys

195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Ile Arg Asp Leu Val Met Glu Lys Ser Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Leu Thr Ser Val Gln Lys Thr Leu Cys

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Ala Ile Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

290 295 300

<210> 2

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr

1 5 10 15

Gly Lys Glu Met Val Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr

20 25 30

His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser

35 40 45

Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Ile Ile Pro Thr Asp

50 55 60

Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys

65 70 75 80

Ser Ile Glu Ala Phe Ala Met Asn Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser

85 90 95

Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp

100 105 110

Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile His

115 120 125

Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Met Arg Ser Gly

130 135 140

Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr

145 150 155 160

Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu

165 170 175

Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp

180 185 190

Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr

195 200 205

Val Arg Asp Ile Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly

210 215 220

Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu

225 230 235 240

Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro

245 250 255

Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn

260 265 270

Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr

275 280 285

Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu

290 295

<210> 3

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gattataaga aaaatgatga agtggagttt gtgcgcaccg gctatggcaa ggaaatggtg 60

aaggtgctgc acatccagcg tgatggcaaa tatcatagca ttaaagaagt ggccaccagc 120

gtgcagctga ccctgagcag caaaaaggat tacctgcacg gcgacaacag cgatatcatt 180

ccgaccgaca ccatcaagaa taccgtgcat gtgctggcca aattcaaggg catcaagagc 240

atcgaggcct tcgccatgaa tatctgcgag cattttctga gcagcttcaa ccacgtgatt 300

cgtgcccagg tgtatgtgga agaagtgccg tggaagcgct tcgagaaaaa tggcgtgaag 360

cacgtgcatg cctttatcca taccccgacc ggcacccact tttgcgaagt ggagcagatg 420

cgtagcggcc cgccggtgat tcatagcggc atcaaagatc tgaaggtgct gaaaaccacc 480

cagagtggct ttgagggctt tatcaaggac cagttcacca ccctgccgga ggtgaaagac 540

cgttgctttg ccacccaggt gtactgcaaa tggcgttacc accagggccg cgatgtggat 600

tttgaagcca cctgggatac cgttcgcgat atcgtgctgg aaaagtttgc cggcccgtat 660

gataagggcg aatacagtcc gagcgtgcag aagaccctgt atgatatcca ggtgctgagc 720

ctgagccgtg tgccggagat cgaggacatg gaaatcagcc tgccgaacat tcattatttt 780

aatatcgata tgagcaagat gggcctgatc aacaaagaag aagttctgct gccgctggat 840

aacccgtatg gtaagatcac cggtaccgtg aagcgtaagc tgagcagccg tctgtaa 897

<210> 4

<211> 908

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccatggatta taagaaaaat gatgaagtgg agtttgtgcg caccggctat ggcaaggaaa 60

tggtgaaggt gctgcacatc cagcgtgatg gcaaatatca tagcattaaa gaagtggcca 120

ccagcgtgca gctgaccctg agcagcaaaa aggattacct gcacggcgac aacagcgata 180

tcattccgac cgacaccatc aagaataccg tgcatgtgct ggccaaattc aagggcatca 240

agagcatcga ggccttcgcc atgaatatct gcgagcattt tctgagcagc ttcaaccacg 300

tgattcgtgc ccaggtgtat gtggaagaag tgccgtggaa gcgcttcgag aaaaatggcg 360

tgaagcacgt gcatgccttt atccataccc cgaccggcac ccacttttgc gaagtggagc 420

agatgcgtag cggcccgccg gtgattcata gcggcatcaa agatctgaag gtgctgaaaa 480

ccacccagag tggctttgag ggctttatca aggaccagtt caccaccctg ccggaggtga 540

aagaccgttg ctttgccacc caggtgtact gcaaatggcg ttaccaccag ggccgcgatg 600

tggattttga agccacctgg gataccgttc gcgatatcgt gctggaaaag tttgccggcc 660

cgtatgataa gggcgaatac agtccgagcg tgcagaagac cctgtatgat atccaggtgc 720

tgagcctgag ccgtgtgccg gagatcgagg acatggaaat cagcctgccg aacattcatt 780

attttaatat cgatatgagc aagatgggcc tgatcaacaa agaagaagtt ctgctgccgc 840

tggataaccc gtatggtaag atcaccggta ccgtgaagcg taagctgagc agccgtctgt 900

aactcgag 908

Claims

1.一种编码重组人源化尿酸氧化酶蛋白的核酸分子，其特征在于:该核酸分子的序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO：4所示。

2.一种表达重组人源化尿酸氧化酶蛋白的质粒载体，其特征在于：所述质粒载体包含权利要求1所述的编码重组人源化尿酸氧化酶蛋白的核酸分子。

3.一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌包含如权利要求2所述的质粒载体。

4.一种重组人源化尿酸氧化酶蛋白，其特征在于:所述重组人源化尿酸氧化酶蛋白通过权利要求1中的核酸分子在工程菌中翻译获得。

5.一种纯化如权利要求4所述的重组人源化尿酸氧化酶蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)如权利要求1所述的编码重组人源化尿酸氧化酶蛋白的核酸分子在工程菌的表达；(2)对步骤(1)中表达的工程菌进行破碎，收集类包涵体；(3)加入pH 10.3碳酸盐缓冲溶液，在4℃溶解类包涵体；(4)通过加入既可提高分子内氢键又可以降低电导的试剂调整溶液的pH和电导；(5)进行DEAE层析得到重组人源化尿酸氧化酶。

6.如权利要求5所述的纯化重组人源化尿酸氧化酶蛋白的方法，所述步骤(4)的具体操作如下：向缓冲溶液中加入甘油、PEG或蔗糖，然后加入NaHCO₃、CH₃COOH或HCl使缓冲液的pH降低到8.5-9.2。

7.一种纯化PEG修饰后的如权利要求4所述的重组人源化尿酸氧化酶蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)调整重组人源化尿酸氧化酶的浓度，加入PEG试剂进行PEG修饰；(2)将PEG修饰反应完全的溶液用50KD超滤离心管超滤替换缓体系，缓冲体系替换成的pH10.5-11.0的氯化铵-氨水缓冲液；(3)降低pH值至7.5-8.0进行洗脱；(4)提高氯化钠盐浓度至0.5-1.0M，将表面电荷较多的、结合较强的PEG-尿酸酶洗脱得到纯化的PEG修饰的重组人源化尿酸氧化酶蛋白。

8.一种PEG修饰后的重组人源化尿酸氧化酶，其特征在于：由权利要求1所述的编码重组人源化尿酸氧化酶蛋白的核酸分子在工程菌中表达，进而通过PEG修饰获得。

9.一种如权利要求8所述的PEG修饰后的重组人源化尿酸氧化酶在制备降低尿酸生物试剂上的应用。

10.一种如权利要求8所述的PEG修饰后的重组人源化尿酸氧化酶在制备缓解通风急性发作生物试剂上的应用。