CN103834623B - 具有催化活性的人源尿酸氧化酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一系列具有催化活性的人源尿酸氧化酶,编码它们的DNA序列,含有该DNA序列的表达载体,以及含有该表达载体的宿主细胞。该人源尿酸氧化酶具有以SEQ ID NO:17为基础进行具体位点氨基酸残基替换、或者进行外显子位点氨基酸残基替换得到的重组氨基酸残基序列。本发明成功复活了人类尿酸氧化酶假基因,使之表达出具有催化活性的人源尿酸氧化酶,具有制备低免疫原性甚至无免疫原性降尿酸药物的良好前景。
Description
技术领域
本发明涉及一系列具有催化活性的人源尿酸氧化酶,编码它们的DNA序列,含有该DNA序列的表达载体,以及含有该表达载体的宿主细胞,属于生物技术领域。
背景技术
据申请人了解,尿酸氧化酶(Uricase,Urate oxidase,EC1.7.3.3)参与生物体嘌呤代谢途径,它可结合分子氧和水分子将尿酸催化降解成尿囊素、CO2和H2O2(Ramazzina I,Folli C,Secchi A et al.Nat.Chem Biol.2006.2:144–148)。由于结构域搜索发现尿酸氧化酶含有铜离子结合结构域,研究者一度认为尿酸氧化酶属于铜离子结合酶,然而后来的研究表明,尿酸氧化酶行使催化功能并不需要铜离子参与(Chu RY,Lin YL,Rao MS etal.Annals of the New York Academy of Sciences.1996.804:781-786)。目前研究者普遍认为,尿酸氧化酶为同源四聚体蛋白,它具有四个活性中心,且各活性中心分别位于二聚体界面处(Retailleau P,Vivarès D,BonnetéF et al.Acta Crystallogr.2004.60:453–462)。
在人科动物[指人类(Homo Spiens),黑猩猩(Pan troglodytes),猩猩(Pongopygmaeus abelii),大猩猩(Gorilla gorilla)和长臂猿(Nomascus leucogenys)]漫长的进化过程中,尿酸氧化酶基因突变成为假基因,导致人科动物体内缺少活性尿酸氧化酶。目前,尿酸氧化酶在人类等人科动物体内功能缺失的进化意义仍然未知,较多研究者认为这种功能缺失由于在人类早期进化中具有优势而被保留(KEILIN,Biol.Rev.J.1959.34:265–296),然而现代人类却因此承受着体内尿酸水平过高导致的诸多病症。
人体内的嘌呤经过一系列酶的催化形成尿酸。尿酸是pKa为5.75的二元有机弱酸,在生理条件下,98%的尿酸以单钠尿酸盐的形式存在。由于人体内缺乏活性尿酸氧化酶,导致人的血浆中尿酸含量高于具有活性尿酸氧化酶的动物的血浆中尿酸含量。在正常嘌呤饮食状态下,两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L,女性高于360μmol/L,即称为高尿酸血症。造成高尿酸血症的因素有多种,一般与饮食行为(如过食嘌呤含量高的食物,酗酒)、服用药物(如利尿药物,免疫抑制药物)、肾功能以及性别和年龄等有关。高尿酸血症可分为急性和慢性两种:(1)急性高尿酸血症通常并发于血液恶性肿瘤化疗;由于血液恶性肿瘤化疗造成机体细胞大量凋亡并释放大量嘌呤,短时间内,嘌呤代谢形成大量尿酸,导致血浆尿酸水平急剧升高,造成急性高尿酸血症;由于人体内大部分尿酸经肾脏排出体外,因此若不针对急性高尿酸血症进行及时有效地处理,则很可能造成急性肾衰竭(Stamp LK,O’DonnellJL,Chapman PT.Intern.Med.J.2007.37:258–266)。(2)慢性高尿酸血症通常由人体内嘌呤代谢紊乱导致血浆内尿酸水平长期过高而导致;慢性高尿酸血症常常可以持续数年或者数十年,由于尿酸盐在血液中的溶解度很低,慢性高尿酸血症往往导致尿酸结晶堆积在组织和关节处,进而引起急性炎症反应,并最终演变成严重的痛风;尿酸结晶沉积于肾脏、关节和软组织会导致慢性疾病,其主要临床表现为反复发作的关节炎和/或肾病变;尿酸结晶沉积于结缔组织会形成肉芽肿,并发展成痛风石。此外,现代医学研究发现,高尿酸血症与高血压、高甘油三脂血症、肾脏损害、糖尿病、冠心病、代谢综合征等疾病也密切相关;如Ruggiero等报道,血液中尿酸参与了多种炎症反应(Ruggiero C,Cherubini A,Ble1A etal.European Heart Journal.2006.27:1174–1181)。据统计,高尿酸血症导致亚洲人群高血压发生风险增加57%,总死亡风险增加8%,心血管疾病死亡风险增加21%,冠心病发生风险增加9%,冠心病死亡风险增加16%,肾功能降低风险增加21%,因慢性肾病死亡风险增加68%,卒中发生风险增加47%,卒中死亡风险增加26%。
近年来,随人们生活水平的提高,痛风和高尿酸血症的发病率有增高趋势,且发病年龄有低龄化趋势,其临床治疗手段主要有:改变病人生活方式(如戒酒、少食富含嘌呤的食物),使用利尿药物加快尿酸的排泄,使用黄嘌呤氧化酶抑制剂抑制尿酸的生物合成,辅以抗炎药物提高病人生活质量,等等。目前针对痛风和高尿酸血症并没有很好的治疗方案,直到2008、2009年,欧洲和美国才分别出台了关于痛风诊断和治疗的守则。由于缺乏有效的治疗药物,迄今为止别嘌呤醇依然是治疗高尿酸血症和痛风的首选药物,但是别嘌呤醇具有较强的肾脏毒性,长期服用会降低病人的治疗依从性,且对于肾功能不全者必须降低使用剂量,而在亚治疗剂量条件下却无法满足降低尿酸水平至360μmol/L的治疗目标,导致这些患者会逐渐发展成难治性痛风,患有难治性痛风的患者其痛风发作频率提高,并发症也增加,患者的生活质量受到很大影响。除别嘌呤醇外,苯溴马隆和丙磺舒作为促尿酸排泄药物也已应用数年,但是它们在高尿酸症治疗方案中的真正地位尚未明确;2008年,欧洲药物协会批准了Febuxostat(一种非嘌呤性黄嘌呤氧化酶抑制剂)用于治疗痛风,这才使痛风的治疗多了一种选择。痛风治疗的目的是通过药物来降低血浆内尿酸水平并形成尿酸负平衡,进而阻止尿酸晶体形成,降低痛风发作频率。从理论上来说,使用传统治疗方案溶解痛风石通常需要数年时间,然而目前事实上还没有以传统治疗方案完全溶解痛风石的案例。
尿酸氧化酶可将尿酸降解成溶解度更高的尿囊素,能快速降低人体血浆尿酸水平,并促进痛风石溶解,具有研制成高尿酸血症和痛风治疗药物的良好前景。目前已有由具有高效尿酸分解活性的黄曲霉来源重组尿酸氧化酶研制而成的拉布立酶和ELITEK,它们先后于2001年、2002年用于治疗肿瘤溶解综合征引起的高尿酸血症,然而,黄曲霉来源重组尿酸氧化酶的免疫原性问题限制了它们在痛风治疗中的应用。
非人源的尿酸氧化酶作为外源治疗蛋白,可诱发快速而强烈的过敏反应、溶血反应,并产生抗体影响该药物体内生物活性和药物疗效的发挥,如何降低或消除尿酸氧化酶的免疫原性已成为扩大尿酸氧化酶应用规模必须突破的重要课题。研究者曾考虑修饰尿酸氧化酶以降低其免疫原性,但在修饰后尿酸氧化酶催化活性大大降低,同时其免疫原性却未能完全消除(Chen RH-L,Abuchowski A,Es TV etal.Biochim.Biophys.Acta.1981.660:293–298;Tsuji J,Hirose K,Kasahara E etal.Int.J.Immunopharmacol.1985.7:725-730)。比较成功的修饰是以PEG(即聚乙二醇)对尿酸氧化酶进行共价修饰;2010年,美国FDA批准PEG修饰的猪-狒狒尿酸氧化酶的嵌合体Krystexxa上市,Krystexxa用于治疗传统治疗方法无效或者不耐受的痛风病人,在为期一年的临床Ⅰ期、Ⅱ期试验中,共有212位有痛风症状的病人参加,试验证明Krystexxa能有效地降低血液中尿酸水平,减少尿酸结晶在关节和软组织的沉积;但在临床试验中,有四分之一的病人经历了严重的过敏反应,以及其它的不良反应:如痛风发作、恶心、注射部位瘀伤、便秘、胸痛和呕吐等(Corinne SY,William H,Michelle AB etal.J.Clin.Pharmacol.2008.48:708–718)。长期以来,研究者认为PEG对人体没有免疫原性,将PEG与蛋白质药物共价连接,不但能延长蛋白质药物的半衰期,而且能减少蛋白质药物的免疫原性,但Ganson等在进行皮下注射PEG修饰尿酸氧化酶的Ⅰ期临床实验研究中发现,有的病人血清中产生了抗PEG的抗体,这就限制了某些病人治疗的有效性(Ganson N,Kelly S,Scarlett E et al.Arthritis Research&Therapy2005.8:R12)。因此,PEG对人体的免疫原性尚未定论,还需要做进一步调查研究,确保PEG修饰的蛋白质药物临床使用的安全性和有效性。
根据免疫学理论,抗原来源和人类的亲缘关系远近与抗原的免疫原性相关:抗原来源与人类亲缘关系越远,则抗原的组成成分(如蛋白质或多肽等)与人类的同源程度越低,免疫原性则越强,越易被人类淋巴细胞克隆作为抗原异物识别,产生特异性免疫应答;反之,抗原来源与人类的亲缘关系越近,则免疫原性越弱(吕昌龙,李殿俊,李一.医学免疫学(第六版),高等教育出版社)。有基于此,若能改造人类尿酸氧化酶假基因,使之“复活”,能表达出具有催化活性的人源尿酸氧化酶,则必然能降低其在人体应用中的免疫原性,甚至不产生免疫原性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:克服现有技术存在的问题,提供一系列具有催化活性的人源尿酸氧化酶及其用途。
本发明的其它目的是:提供与上述人源尿酸氧化酶相关的编码基因、表达载体及宿主细胞。
本发明解决其技术问题的技术方案如下:
一种具有催化活性的人源尿酸氧化酶,其特征是,具有将SEQ ID NO:17所示序列进行若干位点氨基酸残基替换所得的重组氨基酸残基序列;所述若干位点氨基酸残基替换至少包括8个主要位点替换;
所述主要位点替换选自:第112位甲硫氨酸替换为缬氨酸或异亮氨酸;第119位组氨酸替换为精氨酸;第208位赖氨酸替换为谷氨酸或天冬氨酸;第219位甲硫氨酸替换为亮氨酸;第222位丝氨酸替换为苯丙氨酸;第232位赖氨酸替换为丝氨酸;第233位苏氨酸替换为丙氨酸;第240位半胱氨酸替换为酪氨酸。
优选地,所述若干位点氨基酸残基替换由8个主要位点替换、0-1个二级位点替换、0-1个三级位点替换、0-4个四级位点替换、0-3个五级位点替换组成;
所述二级位点替换选自:第151位谷氨酰胺替换为脯氨酸或者异亮氨酸;
所述三级位点替换选自:第24位谷氨酸替换为天冬氨酸或者丙氨酸;
所述四级位点替换选自:第115位异亮氨酸替换为组氨酸;第141位半胱氨酸替换为缬氨酸;第145位谷氨酰胺替换为缬氨酸;第214位异亮氨酸替换为丙氨酸;
所述五级位点替换选自:第83位谷氨酸替换为甘氨酸;第121位甘氨酸替换为谷氨酸;第252位丙氨酸替换为谷氨酸;
当所述二级位点替换数量为0时,所述三级、四级、五级位点替换数量均为0;当所述三级位点替换数量为0时,所述四级、五级位点替换数量均为0。
优选地,所述重组氨基酸残基序列为SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:16之一。
本发明还提供:一种具有催化活性的人源尿酸氧化酶,其特征是,具有将SEQ IDNO:17所示序列进行若干位点氨基酸残基替换所得的重组氨基酸残基序列;所述若干位点氨基酸残基替换由1个主外显子位点替换、2至7个次外显子位点替换组成;
所述主外显子位点替换选自:第212至252位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第212至252位氨基酸残基序列;
所述次外显子位点替换选自:第1至10位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第1至10位氨基酸残基序列;第11至83位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第11至83位氨基酸残基序列;第84至122位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第84至122位氨基酸残基序列;第123至148位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第123至148位氨基酸残基序列;第149至211位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第149至211位氨基酸残基序列;第253至280位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第253至280位氨基酸残基序列;第281至305位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第281至305位氨基酸残基序列。
优选地,所述重组氨基酸残基序列为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7之一。
需要指出的是,主外显子位点替换中包括:第222位丝氨酸替换为苯丙氨酸;第232位赖氨酸替换为丝氨酸;第240位半胱氨酸替换为酪氨酸;而这三个位点同样包含于主要位点替换之中。
本发明还涉及:
上述人源尿酸氧化酶用于制备降尿酸药物的用途。
含有上述人源尿酸氧化酶的药物组合物。
编码上述人源尿酸氧化酶的基因序列。
含有上述基因序列的表达载体。
含有上述表达载体的宿主细胞。
与现有技术相比,本发明成功复活了人类尿酸氧化酶假基因,使之表达出具有催化活性的人源尿酸氧化酶,具有制备低免疫原性甚至无免疫原性降尿酸药物的良好前景。
附图说明
图1为人尿酸氧化酶假基因各外显子及应用SOE-PCR技术获得的全长人尿酸氧化酶基因琼脂糖凝胶电泳图。图中,M1为50-500bp标准分子量Marker;1为外显子1-2;2为外显子3;3为外显子4;4为外显子5;5为外显子6;6为外显子7;7为外显子8;8为全长人尿酸氧化酶基因;M2为100-1200bp标准分子质量MarkerII。
图2为消除了第33位和187位终止突变的人尿酸氧化酶SDS-PAGE凝胶蛋白电泳图。图中,1为标准蛋白质分子质量Marker;2为无IPTG诱导;3为IPTG诱导的dHU蛋白;4为空宿主菌。
图3为猪尿酸氧化酶基因琼脂糖凝胶电泳图。图中,M为标准分子量marker;1为猪尿酸氧化酶基因。
图4为猪尿酸氧化酶SDS-PAGE凝胶蛋白电泳图。图中,1为标准蛋白质分子质量Marker;2为无IPTG诱导;3为0.1mM IPTG诱导;4为0.2mM IPTG诱导;5为0.4mM IPTG诱导;6为0.6mM IPTG诱导;7为0.8mM IPTG诱导。
图5为14种不同来源的尿酸氧化酶氨基酸残基序列比对图。图中,蛋白质序列用标准的单字母表示,“-”表示终止密码子,序列上面的数字与消除了33位及187位终止密码子的人尿酸氧化酶(dHU)一致;人类(human)、黑猩猩(chimpanzee)、大猩猩(gorilla)、红毛猩猩(orangutan)和长臂猿(gibbon)的尿酸氧化酶氨基酸残基序列是利用生物信息学软件根据其假基因序列的外显子进行推导得出的,它们的假基因序列分别来自GenBank(GenBankID:AB074326.2,AB074334.2,AB074342.2,AB074350.2,and AB074358.2);狒狒(baboon)、恒河猴(rhesus)、食蟹猴(crabeating)、夜猴(Aotus)、兔子(rabbit)、小鼠(mice)、狗(canine)、牛(bovine)、猪(porcine)的尿酸氧化酶氨基酸残基序列来自于GenBank(GenBank ID:BAB91554.1,BAB91555.1,BAB91556.1,BAB91557.1,NP_001121545.1,NP_033500.1,NP_001069116.1,NP_001011886.1,NP_999435.1)。
具体实施方式
1.本发明的主要技术构思
据发明人所知,人尿酸氧化酶假基因由8个外显子和7个内含子组成,作为复制型假基因,它保留了功能基因完整的外显子和内含子结构。
为研究人尿酸氧化酶假基因失活的机制,发明人将从培养的人肝脏细胞中提取得到的人类基因组作为模板,根据GenBank中公布的人尿酸氧化酶假基因各外显子序列设计引物,应用PCR技术扩增得到人尿酸氧化酶假基因的8个外显子基因序列,接着应用SOE-PCR技术将人尿酸氧化酶假基因的8个外显子基因序列连接起来,并设计引物消除了位于第33和187位的终止突变,最后构建得到重组人尿酸氧化酶基因工程菌,所得人尿酸氧化酶的氨基酸残基序列如SEQ ID NO:17所示。
但是,恢复人尿酸氧化酶假基因的功能绝非仅仅将编码区终止密码子回复突变就能实现,上述工程菌表达的重组人尿酸氧化酶根本没有尿酸分解活性。
发明人据此推断,在人类漫长的进化过程中,尿酸氧化酶基因因发生有害的初级突变而导致体内尿酸氧化酶失活,形成假基因;此后,由于该基因无法像正常基因一样经历进化选择,相当于逃避了选择压力,导致有害的次级突变不断积累,这无疑为人尿酸氧化酶基因失活机制的研究、及复活人尿酸氧化酶假基因增大了难度。
为寻找人尿酸氧化酶基因中引起尿酸分解活性下降以致失活的有害突变在人尿酸氧化酶假基因外显子中的分布区域,发明人采用了以下方法:用有活性的哺乳动物尿酸氧化酶为模板,与没有活性的人尿酸氧化酶基因进行对应外显子替换,构建人尿酸氧化酶嵌合体,从而确定有害突变的分布区域。
本发明中,由于猪尿酸氧化酶具有高尿酸分解活性,且与人尿酸氧化酶假基因有高达90%的同源性,因此发明人选择猪尿酸氧化酶基因作为外显子替换的模板,具体过程为:发明人从猪肝组织中提取得到猪肝脏细胞总RNA,应用RT-PCR方法得到猪尿酸氧化酶基因,构建获得重组猪尿酸氧化酶基因工程菌,重组猪尿酸氧化酶能够表达并且表现出较高的尿酸分解活性。
本发明中,根据猪尿酸氧化酶和人尿酸氧化酶各外显子序列设计引物,应用SOE-PCR技术,发明人成功构建了10个重组人-猪尿酸氧化酶基因工程菌,并获得10个人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白(H1-2P3-8、P1-2H3P4-8、P1-3H4P5-8、P1-4H5P6-8、P1-5H6P7-8、P1-6H7-8、H1-5P6H7-8、H1- 4P5-6H7-8、H1-2P3H4P5-6H7-8、H1P2-3H4P5-6H7-8),这10个人-猪尿酸氧化酶嵌合蛋白表现出了不同的尿酸分解活性。需要说明的是,人尿酸氧化酶与猪尿酸氧化酶基因具有相同的外显子数目,均为八个外显子,共表达304个氨基酸(人尿酸氧化酶的氨基酸残基序列如SEQ ID NO:17所示,猪尿酸氧化酶的氨基酸残基序列如SEQ ID NO:18所示),且每个外显子对应的氨基酸残基数目也一致;H1、H2、......、H8分别表示1至8号人尿酸氧化酶外显子对应的氨基酸残基序列;P1、P2、......、P8分别表示1至8号猪尿酸氧化酶外显子对应的氨基酸残基序列;其中,第1至10位氨基酸残基对应于1号外显子,第11至83位氨基酸残基对应于2号外显子,第84至122位氨基酸残基对应于3号外显子,第123至148位氨基酸残基对应于4号外显子,第149至211位氨基酸残基对应于5号外显子,第212至252位氨基酸残基对应于6号外显子,第253至280位氨基酸残基对应于7号外显子,第281至305位氨基酸残基对应于8号外显子。
根据上述各嵌合蛋白尿酸分解活性的高低,发明人确定了有害的错义突变在人尿酸氧化酶假基因各外显子中的分布区域。
接着,发明人应用生物信息学技术,对14种不同生物来源(人、黑猩猩、猩猩、大猩猩、长臂猿、狒狒、猕猴、食蟹猴、夜猴、家兔、小鼠、狗、牛、猪)的尿酸氧化酶氨基酸残基序列进行了比对(如图5所示),除第33和187位终止突变位点以外,在人尿酸氧化酶假基因上发现了另外13个错义突变位点,分别位于第24、83、112、119、121、151、208、219、222、232、233、240、252位。
发明人认为,复活人尿酸氧化酶假基因的前提条件是必须首先鉴别出13个错义突变中的有害突变,然后对这些有害突变逐一进行修复。
根据蛋白质高级结构与功能的关系,可逐一考察上述13个错义突变位点氨基酸残基在蛋白质高级结构中的位置及其发挥的功能。由于哺乳动物来源的尿酸氧化酶在pH9以下不稳定且溶解度低,获得蛋白质结晶非常困难,因此难以应用X-射线晶体衍射技术测定哺乳动物来源尿酸氧化酶的蛋白质高级结构。
同源模建是预测哺乳动物来源尿酸氧化酶的蛋白质高级结构的有效方法,发明人将已知的黄曲霉来源尿酸氧化酶(AFU)晶体结构作为模板,模建得到了无活性人尿酸氧化酶(dHU)的蛋白质高级结构,通过对比分析13个突变位点氨基酸残基在AFU和dHU高级结构中的位置及功能,发明人发现13个错义突变位点中,某些位点的突变对于尿酸氧化酶尿酸分解活性影响较小,而有些位点的突变对于尿酸氧化酶活性起着至关重要的作用,这些突变将直接导致尿酸氧化酶的尿酸分解活性降低甚至消失。
在确定了人尿酸氧化酶假基因中的有害突变位点后,发明人根据这些有害突变在人尿酸氧化酶假基因外显子中的分布区域、以及外显子替换实验中得到的一系列人-猪嵌合蛋白尿酸氧化酶活性的分析结果,应用定点突变技术,先后构建了一系列重组人尿酸氧化酶突变体基因工程菌,获得了一系列重组人尿酸氧化酶突变体,在这些突变体中,有的尿酸分解活性略低于猪尿酸氧化酶,有的尿酸分解活性与猪尿酸氧化酶相当。至此,本发明即成功复活了人尿酸氧化酶假基因,获得了有活性的人尿酸氧化酶。可以断定的是,本发明复活得到的活性人尿酸氧化酶应为人类的祖先蛋白,与现代人类的亲缘关系最为接近,根据免疫学原理,该蛋白作为痛风及高尿酸血症的治疗药物应在人体中具有较低甚至没有免疫原性。
至此,本发明可提供两种有活性的人源尿酸氧化酶:一种为在无活性人源尿酸氧化酶基础上,于具体位点替换氨基酸后获得的人源尿酸氧化酶;另一种为在无活性人源尿酸氧化酶基础上,将具体外显子替换为猪尿酸氧化酶的相应外显子获得的人源尿酸氧化酶。
本发明还涉及编码上述人源尿酸氧化酶的基因序列,包括RNA、DNA等多核苷酸,其中DNA包括cDNA以及人工合成DNA等,DNA可以为双链或单链。具体的基因序列可因冗余或遗传密码的兼并而有所不同。上述基因序列可包括:(1)仅上述人源尿酸氧化酶的编码基因序列;(2)含有上述人源尿酸氧化酶的编码基因序列及额外的编码基因序列(如前导或分泌序列或前蛋白质序列);(3)上述人源尿酸氧化酶的编码基因序列及非编码基因序列(如内含子,或突变蛋白编码序列5’和/或3’端的非编码序列)。因此,术语“编码上述人源尿酸氧化酶的基因序列”所指的多核苷酸可能不仅含有上述人源尿酸氧化酶的编码基因序列,还含有包括额外编码基因序列和/或非编码基因序列的多核苷酸。
本发明将上述基因序列与相应表达载体进行有效连接后,转化或转导入宿主细胞中表达。上述载体能以附加体或整合到宿主染色体的形式在宿主生物中进行复制;在适当的启动子控制下,上述人源尿酸氧化酶可以在哺乳动物细胞、昆虫、酵母、细菌或其它细胞中表达,也可以利用由本发明DNA构建体衍生的RNA、通过无细胞翻译系统产生上述人源尿酸氧化酶。
对于宿主,优选大肠杆菌来克隆本发明上述基因序列;其它适用的微生物宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌菌属(Pseudomonas)和葡萄球菌属(Staphy lococcus)等。此外,也可以在这些原核宿主中制备表达载体,还可具有众多公知启动子中的任一种,如乳糖启动子系统、色氨酸启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ或T7来源的启动子系统;通常这些启动子会控制表达,且具有核糖体结合位点序列等,以便起始和完成转录及翻译。
酵母或真菌等其它微生物也可用于表达本发明上述人源尿酸氧化酶。优选的酵母宿主有毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)以及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia angusta);真菌宿主包括黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)及裂褶菌(Schizophyllumcommune),也可选择使用其它真菌。
哺乳动物细胞培养液可用于表达本发明上述人源尿酸氧化酶。优选的细胞包括:CHO细胞系、多种COS细胞系、NOS细胞、叙利亚地鼠(Syrian Hamster)卵巢细胞系、Hela细胞或人肽细胞系(即HEK293、HEK293EBNA)。
此外,可以通过公知方法将含有上述基因序列的载体转移到宿主细胞内,所采用的具体方法取决于细胞宿主的类型。例如,对原核细胞通常采用氯化钙转化法,而对于其它细胞宿主可以使用磷酸钙处理或电穿孔法。
2.本发明已获得的活性人源尿酸氧化酶氨基酸残基序列
(1)人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白H1-2P3-8,其序列为SEQ ID:1;
(2)人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白P1-2H3P4-8,其序列为SEQ ID:2;
(3)人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白P1-3H4P5-8,其序列为SEQ ID:3;
(4)人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白P1-4H5P6-8,其序列为SEQ ID:4;
(5)人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白P1-6H7-8,其序列为SEQ ID:5;
(6)人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白H1-2P3H4P5-6H7-8,其序列为SEQ ID:6;
(7)人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白H1P2-3H4P5-6H7-8,其序列为SEQ ID:7;
(8)对SEQ ID NO:17的第112、119、208、219、222、232、233、240位进行氨基酸残基替换得到的人源尿酸氧化酶,表示为M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,其序列为SEQ ID:8;
(9)对M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y(SEQ ID:8)的第112、208位进行氨基酸残基替换得到的人源尿酸氧化酶,表示为M112I-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,其序列为SEQ ID:9;
(10)对M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y(SEQ ID:8)的第151位进行氨基酸残基替换得到的人源尿酸氧化酶,表示为M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,其序列为SEQ ID:10;
(11)对M112I-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y(SEQ ID:9)的第151位进行氨基酸残基替换得到的人源尿酸氧化酶,表示为M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,其序列为SEQ ID:11;
(12)对M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y(SEQ ID:10)的第24、83、121、252位进行氨基酸残基替换得到的人源尿酸氧化酶,表示为E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E,其序列为SEQID:12;
(13)对M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y(SEQ ID:11)的第24位进行氨基酸残基替换得到的人源尿酸氧化酶,表示为E24A-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,其序列为SEQ ID:13;
(14)对E24A-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y(SEQID:13)的第141、145位进行氨基酸残基替换得到的人源尿酸氧化酶,表示为E24A-M112I-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,其序列为SEQ ID:14;
(15)对M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y(SEQ ID:10)的第24、121、141、145、233、252位进行氨基酸残基替换得到的人源尿酸氧化酶,表示为E24D-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E,其序列为SEQ ID:15;
(16)对E24A-M112I-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y(SEQ ID:14)的第115、214位进行氨基酸残基替换得到的人源尿酸氧化酶,表示为E24A-M112I-I115H-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-I214A-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,其序列为SEQ ID:16。
上述(8)至(16)的各替换位点采用三联体表示方式:字母-数字-字母,数字表示替换氨基酸残基的具体位点,数字前字母表示替换前的氨基酸残基,数字后字母表示替换后氨基酸残基。其中,E代表谷氨酸,S代表丝氨酸,M代表甲硫氨酸,V代表缬氨酸,H代表组氨酸,R代表精氨酸,G代表甘氨酸,Q代表谷氨酰胺,P代表脯氨酸,K代表赖氨酸,D代表天冬氨酸,L代表亮氨酸,F代表苯丙氨酸,T代表苏氨酸,C代表半胱氨酸,Y代表酪氨酸,A代表丙氨酸,I代表异亮氨酸,N代表天冬酰胺,W代表色氨酸。
3.本发明具体实施例
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
以下各实施例中所提到的材料:
(1)宿主菌和质粒载体
宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工程菌种,基因工程研究相关的实验室一般都有保存。pET-22b(+)载体为市售品。
(2)酶和试剂
分子克隆工具酶为Fermentas公司产品;质粒抽提试剂盒为上海生工生物科技有限公司;PCR胶回收试剂盒为上海生工的产品,DAB显色试剂盒为北京鼎国昌盛生物技术有限公司产品。
(3)培养基
LB培养基,配方见参考文献Sambrook J,FristshE F,Maniatis T.MolecularCloning;A Laboratory Manual2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。
各实施例中涉及的质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌,均为基因工程研究领域的常规操作方法,具体参见Sambrook J,FristshE F,Maniatis T.Molecular Cloning;A Laboratory Manual2nd ed.NY:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989,pp.16-340。
实施例1人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白H1-2P3-8DNA的构建及其在大肠杆菌BL21中重组表达
获得含模板的质粒:接种分别含有人尿酸氧化酶基因和猪尿酸氧化酶基因大肠杆菌工程菌甘油管,接种量为1%,过夜培养,提取质粒。
分别以上述含有人尿酸氧化酶DNA和猪尿酸氧化酶DNA序列的重组pET-22b(+)-HU、pET-22b(+)-PU为模板获得H1-2、P3-8片段,再使用重叠延伸PCR的方法获得H1-2P3-8DNA。
获得H1-2P3-8DNA:第一阶段PCR:模板序列为含有人尿酸氧化酶基因的上述质粒,引物为引物1和引物6,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃35s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物H1-2片段;第二阶段PCR:模板序列为含有猪尿酸氧化酶基因的上述质粒,引物为引物5和引物4,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min40s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物P3-8片段;第三阶段PCR:模板为上述两个阶段获得的片段的1:1混合液,引物为引物1和引物4,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃2min,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物H1-2P3-8片段。各引物序列见表1。
将H1-2P3-8片段和pET-22b(+)同时使用Nde I和Hind III进行双酶切,回收酶切片段,使用T4DNA连接酶连接两个酶切片段,使用《分子克隆》(卢圣栋编)中所述的标准方法将连接混合物转入大肠杆菌表达宿主菌BL21。
在含有AMP抗性的LB平板上,经过16h小时的生长,挑取单克隆转化菌落,在AMP+的LB液体培养基过夜培养,进行菌落PCR初步筛选出阳性克隆,经测序确定含有H1-2P3-8DNA的阳性重组质粒中的尿酸氧化酶序列与理论完全一致。
将上述经过测序正确的BL21表达重组菌,按照1%的甘油管接种量接入LB培养基装液量为30ml的250ml的三角瓶中,且培养基中含有100μg/ml的AMP。37℃,220rpm摇床中培养至OD600约为1.7时,加入终浓度为0.2μM的IPTG进行尿酸氧化酶的诱导表达,诱导6h后收集菌体,离心得到湿菌体,并以SDS-PAGE监测。
使用pH8.4的硼酸-硼酸钠缓冲液洗涤收集的湿菌体,洗涤两次,最终用缓冲液/湿菌体质量=10/1(V/m)重悬洗涤后的菌体。超声破细胞,将超声处理后的菌体悬浮液离心后,上清即为含有人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白H1-2P3-8的粗酶液。
尿酸氧化酶的活性测定:酶活性单位定义:在pH8.4和37℃时,每分钟催化1μmol尿酸氧化所需的酶量为一个酶活单位。尿酸氧化酶催化尿酸降解,尿酸在293nm处具有特征吸收峰,但是尿酸降解后的产物在此波长无吸收峰,因此可以根据293nm处吸光值的减少量来确定尿酸被尿酸氧化酶降解的量,然后使用尿酸的摩尔消光系数算出尿酸浓度,根据尿酸浓度的变化可以计算出尿酸氧化酶的活性。
实施例2人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白P1-2H3P4-8DNA的构建及其在大肠杆菌BL21中重组表达
采用与实施例1相同的方法获得含有人、猪尿酸氧化酶基因序列模板的质粒。
获得P1-2H3P4-8DNA:第一阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-PU,引物为引物8和引物3,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃35s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物P1-2片段;第二阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-HU,引物为引物7和引物9,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃20s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得H3片段;第三阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-PU,引物为引物10和引物4,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min10s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物P4-8片段;第四阶段PCR:模板为P1-2片段、H3片段、P4-8片段1:1:1的混合液,引物为引物3和引物4,PCR条件同实施例1第三阶段PCR条件,最终获得P1-2H3P4-8片段。各引物序列见表1。
采用与实施例1相同的方法,将P1-2H3P4-8片段进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、获得粗酶液并测定酶活。
实施例3人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白P1-3H4P5-8DNA的构建及其在大肠杆菌BL21中重组表达
采用与实施例1相同的方法获得含有人、猪尿酸氧化酶基因序列模板的质粒。
获得P1-3H4P5-8DNA:第一阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-PU,引物为引物11和引物3,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃45s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物P1-3片段;第二阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-HU,引物为引物12和引物13,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃15s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得H4片段;第三阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-PU,引物为引物14和引物4,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物P5-8片段;第四阶段PCR:模板为P1-3片段、H4片段、P5-8片段1:1:1的混合液,引物为引物3和引物4,PCR条件同实施例1第三阶段PCR条件,最终获得P1-3H4P5-8片段。各引物序列见表1。
采用与实施例1相同的方法,将P1-3H4P5-8片段进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、获得粗酶液并测定酶活。
实施例4人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白P1-4H5P6-8DNA的构建及其在大肠杆菌BL21中重组表达
采用与实施例1相同的方法获得含有人、猪尿酸氧化酶基因序列模板的质粒。
获得P1-4H5P6-8DNA:第一阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-PU,引物为引物15和引物3,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃59s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物P1-4片段;第二阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-HU,引物为引物16和引物17,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃25s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得H5片段;第三阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-PU,引物为引物18和引物14,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃35s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物P6-8片段;第四阶段PCR:模板为P1-4片段、H5片段、P6-8片段1:1:1的混合液,引物为引物3和引物4,PCR条件同实施例1第三阶段PCR条件,最终获得P1-4H5P6-8片段。各引物序列见表1。
采用与实施例1相同的方法,将P1-4H5P6-8片段进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、获得粗酶液并测定酶活。
实施例5人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白P1-6H7-8DNA的构建及其在大肠杆菌BL21中重组表达
采用与实施例1相同的方法获得含有人、猪尿酸氧化酶基因序列模板的质粒。
获得P1-6H7-8DNA:第一阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-PU,引物为引物3和引物19,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min30s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得产物P1-6片段;第二阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-HU,引物为引物20和引物2,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃30s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得H7-8片段;第三阶段PCR:模板为P1-6片段、H7-8片段1:1的混合液,引物为引物2和引物3,PCR条件同实施例1第三阶段PCR条件,最终获得P1-6H7-8片段。各引物序列见表1。
采用与实施例1相同的方法,将P1-6H7-8片段进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、获得粗酶液并测定酶活。
实施例6人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白H1-2P3H4P5-6H7-8DNA的构建及其在大肠杆菌BL21中重组表达
采用与实施例1相同的方法获得含有人、猪尿酸氧化酶基因序列的含模板的质粒。
获得H1-2P3H4P5-6H7-8DNA:第一阶段PCR同实施例1,最终获得产物H1-2片段;第二阶段PCR:模板为pET-22b(+)-PU,引物为引物5和引物11,PCR条件同实施例2,最终获得P3片段;第三阶段PCR:模板为pET-22b(+)-HU,引物为引物12和引物13,PCR条件同实施例3,最终获得H4片段;第四阶段PCR:模板为pET-22b(+)-PU,引物为引物14和引物19,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃40s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得P5-6片段;第五阶段PCR:模板为pET-22b(+)-HU,引物为引物19和引物20,PCR条件同实施例5,最终获得H7-8片段;第六阶段PCR:模板序列为H1-2、P3、H4、P5-6、H7-8按照1:1:1:1:1的混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1,最终获得H1-2P3H4P5-6H7-8片段。各引物序列见表1。
采用与实施例1相同的方法,将H1-2P3H4P5-6H7-8片段进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、获得粗酶液并测定酶活。
实施例7人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白H1P2-3H4P5-6H7-8DNA的构建及其在大肠杆菌BL21中重组表达
采用与实施例1相同的方法获得含有人、猪尿酸氧化酶基因序列模板的质粒。
获得H1P2-3H4P5-6H7-8DNA:第一阶段PCR:模板为pET-22b(+)-PU,引物为引物49和引物50,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃30s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得H1P2片段;第二阶段PCR:模板为pET-22b(+)-H1-2P3H4P5- 6H7-8引物为引物12和引物2,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min30s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得P3H4P5-6H7-8片段;第三阶段PCR:模板为以上两个阶段获得的片段1:1的混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1,最终获得H1P2-3H4P5-6H7-8片段。各引物序列见表1。
采用与实施例1相同的方法,将H1P2-3H4P5-6H7-8片段进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、获得粗酶液并测定酶活。
实施例8人尿酸氧化酶HU突变体DNA的构建及其在大肠杆菌BL21中重组表达
人尿酸氧化酶HU突变体DNA是在HU(即SEQ ID NO:17的原始编码基因序列)基础上做的一系列点突变获得的,包括:
No.1:HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
No.2:HU-M112I-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
No.3:HU-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
No.4:HU-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
No.5:HU-E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E
No.6:HU-E24A-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
No.7:HU-E24A-M112I-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y
No.8:HU-E24D-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E
No.9:HU-E24A-M112I-I115H-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-I214A-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y。
本实施例将逐一陈述这些突变体DNA分子的获得及其在大肠杆菌BL21中重组表达。
采用与实施例1相同的方法获得含有人、猪尿酸氧化酶基因序列模板的质粒。
获得No.1:HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA:第一阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-HU,引物为引物1和引物21,PCR条件:95℃30s,55℃30s,72℃1min20s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-M219L-S222F的上半段片段;第二阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-HU,引物为引物2和引物22,PCR条件:95℃30s,55℃30s,72℃1min,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-M219L-S222F的下半段片段;第三阶段PCR:模板序列为以上两个阶段获得的两个片段的1:1混合液,引物为引物2和引物1,PCR条件:95℃30s,50℃30s,72℃2min,共10个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,以上PCR结束以后在体系中加入引物32,PCR条件为:95℃30s,50℃30s,72℃1min30s,共20个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得含有HU-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段;第四阶段PCR:引物添加之前步骤同本实施例第三阶段,添加引物31,PCR条件:95℃30s,50℃30s,72℃25s,共20个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得含有HU-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y下半段片段;第五阶段PCR:模板序列为第三和第四阶段PCR最终获得的片段的1:1溶液,PCR体系及循环条件设置同第三阶段前10个循环,以上PCR结束以后在体系中加入引物25,PCR条件为:95℃30s,50℃30s,72℃45s,共20个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-M112V-H119R-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段;第六阶段PCR:引物添加之前步骤同本实施例第三阶段,添加引物26,PCR条件:95℃30s,50℃30s,72℃1min10s,共20个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-M112V-H119R-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y点突变的下半段片段;第七阶段PCR:模板序列为第五和第六阶段PCR最终获得的片段的1:1溶液,PCR体系及循环条件设置同第三阶段前10个循环,以上PCR结束以后在体系中加入引物27,PCR条件为:95℃30s,50℃30s,72℃1min30s,共20个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段;第八阶段PCR:引物添加之前步骤同本实施例第三阶段引物添加之前步骤,添加引物28,PCR条件:95℃30s,50℃30s,72℃40s,共20个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段;将第七、第八阶段PCR得到的片段按照实施例1的第三阶段PCR设置,最终获得含有设计点突变的No.1:HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA。
获得No.2:HU-M112I-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA:第一阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA,引物为引物1和引物29,PCR条件:95℃30s,55℃30s,72℃1min20s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-M112V-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段;第二阶段PCR:模板同第一阶段PCR,引物为引物2和引物30,PCR条件:95℃30s,55℃30s,72℃40s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-M112V-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段;第三阶段PCR:模板为第一第二阶段最终获得的两个片段1:1混合液,引物为引物1和引物2,PCR反应条件同实施例1的第三阶段PCR条件,最终获得HU-M112V-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA;第四阶段PCR:模板为第三阶段获得的片段,引物为引物1和引物34,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃40s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-M112I-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段;第五阶段PCR:模板为第三阶段获得的片段,引物为引物1和引物33,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min20s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-M112I-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段;第六阶段PCR:模板为第四第五阶段PCR获得的片段,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1最后一阶段PCR,最终获得No.2:HU-M112I-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA。
获得No.3:HU-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240YDNA:第一阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-HU-M112V-H119R-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,平行的设置两个相同的体系,命名为体系1和体系2,体系1的引物为引物1和引物36,体系2的引物为引物2和引物35,两个PCR条件相同:95℃30s,55℃30s,72℃1min,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终,体系1和体系2分别获得获得HU-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段和HU-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段;第二阶段PCR:模板为第一阶段获得的两个片段的1:1混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1最后一阶段PCR条件,最终获得No.3:HU-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA。
获得No.4:HU-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240YDNA:第一阶段PCR:模板序列为pET-22b(+)-HU-M112I-H119R-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,平行的设置两个相同的体系,命名为体系1和体系2,体系1的引物为引物1和引物38,体系2的引物为引物2和引物37,两个PCR条件相同:95℃30s,55℃30s,72℃1min,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终,体系1和体系2分别获得获得HU-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段和HU-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段;第二阶段PCR:模板为第一阶段获得的两个片段的1:1混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1中的最后一阶段PCR条件,最终获得No.4:HU-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA。
获得No.5:HU-E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E DNA:第一阶段PCR:模板为pET-22b(+)-HU-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,引物为引物1和引物40,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃15s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min。最终获得HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y上半段片段;第二阶段PCR:模板同第一阶段PCR,引物为引物2和引物39,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min40s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y下半段片段;第三阶段PCR:模板为以上两个阶段获得片段的1:1混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1中的第三阶段PCR条件,最终获得HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y;第四阶段PCR:模板为第三阶段PCR获得的片段,引物为引物1和引物48,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min35s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E上半段片段;第五阶段PCR:模板为第三阶段PCR获得的片段,引物为引物2和引物47,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃25s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E下半段片段;第六阶段PCR:模板为第四第五阶段获得片段的1:1混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1中的第三阶段PCR条件,最终获得HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E;第七阶段PCR:模板为第六阶段PCR获得的片段,引物为引物1和引物45,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-E24D-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E上半段片段;第八阶段PCR:模板为第六阶段PCR获得的片段,引物为引物1和引物46,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min。最终获得HU-E24D-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E下半段片段;第九阶段PCR:模板为第七第八阶段获得片段的1:1混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1中的第三阶段PCR条件,最终获得HU-E24D-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E;第十阶段PCR:模板为第九阶段PCR获得的片段,引物为引物1和引物52,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃35s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E上半段片段;第十一阶段PCR:模板为第九阶段PCR获得的片段,引物为引物1和引物51,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min30s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终获得HU-E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E下半段片段;第十二阶段PCR:模板为第十、第十一阶段获得片段的1:1混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1中的第三阶段PCR条件,最终获得No.5:HU-E24D-E83G-M112V-H119R-G121E-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E DNA。
获得No.6:HU-E24A-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA:第一阶段PCR:模板为pET-22b(+)-HU-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,引物为引物1和引物42,PCR条件同HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y获得的第一阶段PCR,最终获得HU-E24A-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y上半段片段;第二阶段PCR:模板同第一阶段PCR,引物为引物2和引物41,PCR条件同HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y获得的第二阶段PCR,最终获得HU-E24D-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y下半段片段;第三阶段PCR:模板为以上两个阶段获得片段的1:1混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1中的第三阶段PCR条件,最终获得No.6:HU-E24A-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA。
获得No.7:HU-E24A-M112I-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA:第一阶段PCR:模板为pET-22b(+)-HU-E24A-M112I-H119R-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,PCR条件为:平行的设置两个相同的体系,命名为体系1和体系2,体系1的引物为引物1和引物44,体系2的引物为引物2和引物43,两个PCR条件相同:95℃30s,55℃30s,72℃1min,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终,体系1和体系2分别获得获得HU-E24A-M112I-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段和HU-E24A-M112I-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段;第二阶段PCR:模板为第一阶段获得的两个片段的1:1混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1中的最后一阶段PCR条件,最终获得No.7:HU-E24A-M112I-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240YDNA。
获得No.8:HU-E24D-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E DNA:第一阶段PCR:模板为pET-22b(+)-HU-M112V-H119R-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,PCR条件为:平行的设置两个相同的体系,命名为体系1和体系2,体系1的引物为引物1和引物44,体系2的引物为引物2和引物43,两个PCR条件相同:95℃30s,55℃30s,72℃1min,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终,体系1和体系2分别获得获得HU-M112V-H119R-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段和HU-M112V-H119R-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段;第二阶段PCR:模板为第一阶段PCR获得的两个片段1:1混合液,引物为引物1和引物2,平行设置两个体系命名为体系1和体系2,两个体系PCR条件相同,为:95℃30s,55℃30s,72℃2min,共10个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,循环结束以后分别在体系1和体系2中添加引物引物45、引物46,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min10s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终体系1和体系2分别获得HU-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段和HU-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段;第三阶段PCR:模板为第二阶段PCR获得的两个片段1:1混合液,平行设置两个体系,命名为体系3和体系4,引物为引物1和引物2,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃2min,共10个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,10个循环结束以后分别在体系3和体系4添加引物48和47,体系3的PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min30s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,体系4的PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃20s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终体系3和体系4分别获得HU-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E的上半段片段和HU-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y-A252E的下半段片段;第四阶段PCR:模板为第三阶段PCR获得的两个片段1:1混合液,平行设置两个体系,命名为体系5和体系6,引物为引物1和引物2,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃2min,共10个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,10个循环结束以后分别在体系5和体系6添加引物23和24,体系5的PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min30s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,体系6的PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃40s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终体系5和体系6分别获得HU-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E的上半段片段和HU-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E的下半段片段;第五阶段PCR:模板为第四阶段PCR获得的两个片段1:1混合液,平行设置两个体系,命名为体系7和体系8,引物为引物1和引物2,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃2min,共10个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,10个循环结束以后分别在体系7和体系8添加引物40和39,体系7的PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃15s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,体系8的PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min45s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min,最终体系7和体系8分别获得HU-E24D-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E的上半段片段和HU-E24D-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E的下半段片段;第六阶段PCR:模板为第五阶段获得的两个片段的1:1混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1的最后一阶段PCR条件,最终获得No.8:HU-E24A-M112V-H119R-G121E-C141V-Q145V-Q151P-K208E-M219L-S222F-L232S-T233P-C240Y-A252E DNA。
获得No.9:HU-E24A-M112I-I115H-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-I214A-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y DNA:第一阶段PCR:模板为:pET-22b(+)-HU-E24A-M112I-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y,平行设置两个体系,命名为体系1和体系2,体系1引物为引物1和引物54,体系2引物为引物2和引物53;体系1的PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃45s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min;体系2的PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min25s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min;最终体系1和体系2分别获得HU-E24A-M112I-I115H-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y上半段片段和HU-E24A-M112I-I115H-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y下半段片段;第二阶段PCR:模板为第一阶段PCR获得的两个片段1:1混合液,平行设置两个体系,命名为体系3和体系4,引物为引物1和引物2,PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃2min,共10个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min;10个循环结束以后分别在体系3和体系4添加引物56和55,体系3的PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃1min20s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min;体系4的PCR条件为:95℃30s,55℃30s,72℃45s,共30个循环,第一个循环95℃变性5min,最后一个循环72℃延伸10min;最终体系3和体系4分别获得E24A-M112I-I115H-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-I214A-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的上半段片段和E24A-M112I-I115H-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-I214A-M219L-S222F-L232S-T233A-C240Y的下半段片段;第三阶段PCR:模板为第五阶段获得的两个片段的1:1混合液,引物为引物1和引物2,PCR条件同实施例1的最后一阶段PCR条件,最终获得No.9:HU-E24A-M112I-I115H-H119R-C141V-Q145V-Q151I-K208D-I214A-M219L-S222F-L232S-T233A-C240YDNA。
各引物序列见表1。
采用与实施例1相同的方法,将以上9个人尿酸氧化酶HU突变体DNA分别进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、获得粗酶液并测定酶活。
以上各实施例所得粗酶液的酶活数据如表2所示。
表1各实施例所用引物序列
引物名称 | 引物DNA序列 |
1 | CGCAcatatgGCCCACTACCATAACAACT |
2 | CGATaagcttTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCTCTTGACT |
3 | CGCAcatatgGCTCATTACCGTAATGAC |
4 | CGATaagcttTCACAGCCTTGAAGTCAGC |
5 | TCTTGGCAAAATTTAAAGAAA TCAAAAGCAT TGAAACT |
6 | AGTTTCAATGCTTTTGATTTCTTTAAATTTTGCCAAG |
7 | GTCCTGGCAAAGTTTAAAGAAATCAAAAGCATAGAAGCTTTTG |
8 | CAAAAGCTTCTATGCTTTTGATTTCTTTAAACTTTGCCAGGAC |
9 | GCATGGACGTGCTTAACTCCATTCTTTCCAAGATGCTTCCAAGGGAT |
10 | ATCCCTTGGAAGCATCTTGGAAAGAATGGAGTTAAGCACGTCCATGC |
11 | GCATGGACGTGCTTAACTCCATTCTTTTCAAAACGCTTCC |
12 | GTTCCTTGGAAGCGTTTTGAAAAGAATGGAGTTAAGCACGTCCATGC |
13 | CAGAATGAATGACCGGCGGTCCACTACGCAGCTGTTCAACTTC |
14 | TCTGTGAAGTTGAACAGCTGCGTAGTGGACCGCCGGTCATTCATTCTG |
15 | CCAGAATGAATGACTTGGGGTCCATTCCTTATCTGTTCAACCTCAC |
16 | GTGAGGTTGAACAGATAAGGAATGGACCCCAAGTCATTCATTCTGG |
17 | ATGCTCCTAACAGTGTCCCAGGTAGCCTTGAAGTCCAC |
18 | GTGGACTTCAAGGCTACCTGGGACACTGTTAGGAGCAT |
19 | ATTTCCATATCTTCTATCTCAGGAACCTGGC |
20 | GCCAGGTTCCTGAGATAGAAGATATGGAAAT |
21 | CATAGGGCCCAGCAAATTTCTCCAGGACAAGGTCCCGAATGGTGT |
22 | ACACCATTCGGGACCTTGTCCTGGAGAAATTTGCTGGGCCCTATG |
23 | CACCTGGATATCATAGAGGGTCTTCTGCACAGATGGCGAGTATTCACC |
24 | GGTGAATACTCGCCATCTGTGCAGAAGACCCTCTATGATATCCAGGTG |
25 | GCTTAACTCCATTCTTTCCAAGACGCTTCCAAGGGATTTCTTCCACGT |
26 | TACGTGGAAGAAATCCCTTGGAAGCGTCTTGGAAAGAATGGAGTTAAGC |
27 | GAATGGTGTCCCAGGTAGCCTCGAAGTC |
28 | GACTTCGAGGCTACCTGGGACACCATTC |
29 | GAATGGTGTCCCAGGTAGCATCGAAGTC |
30 | GACTTCGATGCTACCTGGGACACCATTC |
31 | GGTGAATACTCGGCCTCTGTGCAGAAGACCCTCTATGATATCCAGGTG |
32 | CACCTGGATATCATAGAGGGTCTTCTGCACAGAGGCCGAGTATTCACC |
33 | TACATCGAAGAAATCCCTTGGAAGCGTCTTGGAAAGAATGGAGTTAAGC |
34 | GCTTAACTCCATTCTTTCCAAGACGCTTCCAAGGGATTTCTTCGATGT |
35 | TTCTGTGAAGTTGAACAGCTGAGAAGTGGACCCCCAGTCATTCAT |
36 | ATGAATGACTGGGGGTCCACTTCTCAGCTGTTCAACTTCACAGA |
37 | TTCTGTGAAGTTGAACAGCTGAGAAGTGGACCCATAGTCATTCAT |
38 | ATGAATGACTATGGGTCCACTTCTCAGCTGTTCAACTTCACAGA |
39 | GAAGGATATGGTAAAAGTTTTGCATATTCAGCGAGATGGAAAGT |
40 | ACTTTCCATCTCGCTGAATATGCAAAACTTTTACCATATCCTTC |
41 | GAAGGCAATGGTAAAAGTTTTGCATATTCAGCGAGATGGAAAGT |
42 | ACTTTCCATCTCGCTGAATATGCAAAACTTTTACCATTGCCTTC |
43 | CACTGGAACACACTTCGTTGAAGTTGAAGTGCTGAG |
44 | CTCAGCACTTCAACTTCAACGAAGTGTGTTCCAGTG |
45 | CATTCTTTTCAAGACGCTTCCAAGGGATTTCTTCCACGTAGACT |
46 | TACGTGGAAGAAATCCCTTGGAAGCGTCTTGAAAAGAATG |
47 | CTCTCCCTGAGCCGAGTTCCTGAAATAGAAGATATGG |
48 | CCATATCTTCTATTTCAGGAACTCGGCTCAGGGAGAG |
49 | CTTCCCATAGCCAGTTCGGACAAACTCTACCTCATC |
50 | CGCAcatatgGCTCATTACCGTAATGACTACAAAAAGAATGATGAGGTAGAGTTTGT |
51 | CAAGAACACAGTTCATGTCTTGGCAAAGTTTAAAGGAAT |
52 | ATTCCTTTAAACTTTGCCAAGACATGAACTGTGTTCTTGAT |
53 | GAAGAAGTCCCTTGGAAGCGTCTTGGAAAG |
54 | CTTTCCAAGACGCTTCCAAGGGACTTCTTC |
55 | GCTACCTGGGACACCGTTCGGGACCTTGTCCGT |
56 | ACGGACAAGGTCCCGAACGGTGTCCCAGGTAGC |
注:引物1、2、3、4、50中带下划线的小写字母为添加的酶切位点,其中引物1、3、50的为NdeI酶切位点,引物2、4的为HindIII酶切位点。
表2各实施例所得粗酶液的酶活数据
注:wPU的酶活数据是通过采用与实施例1相同的方法获得猪尿酸氧化酶基因的DNA,并进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、获得粗酶液后测得的。
此外,发明人还构建了人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白P1-5H6P7-8、H1-5P6H7-8、H1-4P5- 6H7-8,但是这三种蛋白没有酶活。
结合以上各实施例的酶活数据,发明人认为可以得出以下结论:
一方面,对于具体位点氨基酸残基替换,在SEQ ID NO:17基础上,
(1)必须包含以下8个主要位点替换,才能使人源尿酸氧化酶具备活性:第112位甲硫氨酸替换为缬氨酸或异亮氨酸;第119位组氨酸替换为精氨酸;第208位赖氨酸替换为谷氨酸或天冬氨酸;第219位甲硫氨酸替换为亮氨酸;第222位丝氨酸替换为苯丙氨酸;第232位赖氨酸替换为丝氨酸;第233位苏氨酸替换为丙氨酸;第240位半胱氨酸替换为酪氨酸。
(2)若要在(1)的基础上增强酶活,则需要包含以下二级位点替换:第151位谷氨酰胺替换为脯氨酸或者异亮氨酸。
(3)若要在(2)的基础上进一步增强酶活,则需要包含以下三级位点替换:第24位谷氨酸替换为天冬氨酸或者丙氨酸。
(4)若要在(3)的基础上进一步增强酶活,则可选择包含至少一个以下四级位点替换:第115位异亮氨酸替换为组氨酸;第141位半胱氨酸替换为缬氨酸;第145位谷氨酰胺替换为缬氨酸;第214位异亮氨酸替换为丙氨酸。
(5)若要在(3)的基础上进一步增强酶活,则可选择包含至少一个以下五级位点替换:第83位谷氨酸替换为甘氨酸;第121位甘氨酸替换为谷氨酸;第252位丙氨酸替换为谷氨酸。
而且,对于(4)和(5)而言,四级位点替换和五级位点替换可以同时存在。
另一方面,对于人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白,在SEQ ID NO:17基础上,
(Ⅰ)必须有主外显子位点替换:第212至252位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第212至252位氨基酸残基序列(即6号外显子对应氨基酸残基序列的替换)。
(Ⅱ)仅有(Ⅰ)仍无法保证具有酶活,需要在其余7个次外显子位点替换中选择至少2个,才能使人-猪尿酸氧化酶嵌合体蛋白具有酶活;
7个次外显子位点替换为:第1至10位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第1至10位氨基酸残基序列(即1号外显子对应氨基酸残基序列的替换);第11至83位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第11至83位氨基酸残基序列(即2号外显子对应氨基酸残基序列的替换);第84至122位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第84至122位氨基酸残基序列(即3号外显子对应氨基酸残基序列的替换);第123至148位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第123至148位氨基酸残基序列(即4号外显子对应氨基酸残基序列的替换);第149至211位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第149至211位氨基酸残基序列(即5号外显子对应氨基酸残基序列的替换);第253至280位氨基酸残基序列替换为SEQIDNO:18的第253至280位氨基酸残基序列(即7号外显子对应氨基酸残基序列的替换);第281至305位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO:18的第281至305位氨基酸残基序列(即8号外显子对应氨基酸残基序列的替换)。
Claims (6)
1.一种具有催化活性的人源尿酸氧化酶,其特征是,该人源尿酸氧化酶是由SEQ IDNO:17所示序列进行若干位点氨基酸残基替换所得的重组氨基酸残基序列;所述重组氨基酸残基序列为SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:16之一。
2.权利要求1所述人源尿酸氧化酶用于制备降尿酸药物的用途。
3.含有权利要求1所述人源尿酸氧化酶的药物组合物。
4.编码权利要求1所述人源尿酸氧化酶的基因序列。
5.含有权利要求4所述基因序列的表达载体。
6.含有权利要求5所述表达载体的宿主细胞。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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