CN111172132B - 一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶工程技术领域，具体公开了一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法及应用。所述重组聚氨酯塑料降解酶为重组PueA酶，所述制备方法包括：溶解包涵体：以含有SDS的Tris‑HCl缓冲液作为变性剂溶解所述重组PueA酶的包涵体得到包涵体蛋白溶解液；包涵体复性：向包涵体蛋白溶解液中加入KCl对所述包涵体蛋白溶解液进行复性，得到复性后的重组PueA酶。本发明还包括重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法在聚氨酯塑料降解处理中的应用。本发明步骤操作简单，避免了大体积缓冲液连续稀释复性，快速高效，大大降低实验成本；复性条件温和，有利于保持聚氨酯塑料降解酶活性；可应用于实验室研究以及工业化生产。

Description

一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域。具体地说，涉及一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法及应用。
背景技术
聚氨酯(Polyurethane,PUR)，全称为聚氨基甲酸酯。1937年，Otto Bayer首次以石油化学品为原料合成了PUR，并于20世纪50年代开始工业化生产。由于具备良好的机械性能、热稳定性和耐久性，PUR塑料被广泛应用于保温建材、包装材料、汽车材料、合成革、鞋类材料、涂料、医用材料等。据统计，2016年全球PUR塑料年产量占合成塑料总产量的7.5％，达24.2Mt。伴随PUR塑料的广泛应用，不可避免会产生大量的废弃物。当前，PUR废塑料量已占到所有废塑料总体积的30％。传统的废塑料处理方法主要包括填埋、焚烧和回收。填埋在地下的废塑料数十年仍不能降解，不仅占用土地资源，还会产生有毒有害物质污染土壤和地下水；焚烧法虽能解决占用土地资源问题，还能通过回收热量用于发电或供暖，但存在不完全燃烧产生二噁英、一氧化碳和氮氧化物等有毒气体和烟尘等二次污染问题的风险；此外，由于PUR塑料种类繁多，使PUR废塑料的分类回收异常困难。若PUR废塑料未被合理处理，一旦被丢弃到自然环境中，就会对自然景观和生态系统造成严重的破坏和威胁。
通过生物处理方法处理废弃塑料，如利用塑料降解酶分解聚合物，同时生成聚合物单体，进一步回收利用，是一种资源节约、环境友好的处理方法。2000年，Stern和Howard从细菌Pseudomonas chlororaphis克隆到一个脂肪酶基因PueA(AF069748.1)，所编码的酶具有降解聚酯聚氨酯的作用(FEMS Microbiology Letters 2000,185:163-168)。不过，由于PueA基因在大肠杆菌中重组过表达时，蛋白容易错误折叠而聚集形成不可溶的包涵体，使得活性蛋白酶的产率极低，阻碍了PueA基因编码的酶在塑料生物降解处理技术之中的应用。自PueA基因被克隆时起，至今没有任何关于通过处理包涵体制备PueA重组酶的方法的报道。
传统的包涵体变性复性方法，多采用尿素、盐酸胍和十二烷基硫酸钠(SDS,CAS151-21-3)等强变性剂先使包涵体变性，然后再通过连续稀释的方法降低变性剂的浓度，使蛋白复性。这些方法在复性过程中，均需要大体积缓冲液稀释降低变性剂浓度，以使蛋白质复性，导致复性过程耗材耗时耗力，复性蛋白浓度低等缺点。目前为止，还没有很好的办法来替代大体积缓冲液稀释的复性方法。
因此，需要提供一种新的重组聚氨酯塑料降解酶制备方法以解决上述问题。
发明内容
针对目前聚氨酯塑料降解酶基因在大肠杆菌中重组表达将形成无活性包涵体，且缺乏基因重组表达聚氨酯塑料降解酶包涵体的高效变性复性方法的问题，本发明的目的在于提供一种变性方法温和，复性过程简便、效率高的重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种重组聚氨酯塑料降解酶-重组PueA酶的制备方法在聚氨酯塑料降解处理中的应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法，所述重组聚氨酯塑料降解酶为重组PueA酶，所述制备方法包括：
溶解包涵体：以含有SDS的Tris-HCl缓冲液作为变性剂溶解所述重组PueA酶的包涵体得到包涵体蛋白溶解液；
包涵体复性：向所述包涵体蛋白溶解液中加入KCl(CAS 7447-40-7)对所述包涵体蛋白溶解液进行复性，得到复性后的重组PueA酶。
本发明经研究发现，将KCl加入到含有SDS的重组PueA酶的包涵体蛋白溶解液中，可在保证重组PueA酶的包涵体蛋白中原有的二级结构不被破坏的同时，使SDS沉淀，降低溶液中SDS的浓度，获得高回收率的复性重组PueA酶。
本发明所述的重组PueA酶是利用基因工程技术，将目的基因PueA(NCBI编号：AF069748.1)重组到pET28a表达质粒，转化至大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中进行诱导表达后的产物。在溶解包涵体前可先将诱导表达重组PueA酶的大肠杆菌培养液离心后，收集菌体沉淀。每克菌体沉淀用5mL Tris-HCl缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，pH 7.5)重悬，对菌体重悬液进行超声破碎，再次离心，弃上清，收集沉淀得包涵体蛋白用于后续的溶解包涵体步骤。
优选的，所述的离心大肠杆菌培养液的离心参数为4000×g，10分钟，破碎方式为超声破碎，破碎功率为600w，每间隔4秒工作2秒，工作10分钟，破碎后离心收集包涵体蛋白沉淀的离心参数为10000×g，30分钟。
在本发明的一个实施例中，在用KCl对所述包涵体蛋白溶解液进行复性前，先将所述包涵体蛋白溶解液进行离心；优选的，离心参数为10000×g，30分钟。所述包涵体复性步骤为在所述包涵体蛋白溶解液的上清液中加入KCl。
在本发明的一个实施例中，所述变性剂为含有0.5-2％(w/v)SDS的Tris-HCl缓冲液，pH为7-8；其中所述变性剂中的SDS与所述重组PueA酶的包涵体的质量比为1：(50-200)，以利于既使包涵体充分变性溶解，又不会导致蛋白质变性程度太大、增加复性难度。
在本发明的一个实施例中，所述KCl与所述变性剂中的SDS的质量比为(1.5-6)：1，以既利于充分与SDS反应，生成沉淀，降低SDS在溶液中的浓度，便于蛋白质复性，又避免溶液中含盐量过高，导致复性后的重组PueA酶活性下降。
在本发明的一个实施例中，所述溶解包涵体的步骤通过在0-8℃下静置6-12小时完成，以利于蛋白质包涵体在溶解时不发生降解。
在本发明的一个实施例中，所述包涵体复性的步骤通过在0-8℃下静置6-12小时完成，以利于蛋白质在复性时不易发生降解。
在本发明的一个实施例中，以含有1％(w/v)SDS、pH为7.5的Tris-HCl缓冲液作为变性剂溶解所述重组PueA酶的包涵体，其中所述变性剂中的SDS与所述重组PueA酶的包涵体的质量比为1:100；所述KCl与所述变性剂中的SDS的质量比为3:1；所述溶解包涵体的步骤与所述包涵体复性的步骤都通过在4℃下静置12小时完成。
本发明还提供上述制备方法在聚氨酯塑料降解处理中的应用。
本发明所提供的一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法及应用具有如下有益的技术效果：
复性步骤操作简单，不需要进行大体积缓冲液连续稀释，快速高效，大大降低实验成本；复性条件温和，保护包涵体蛋白中原有的二级结构不被破坏，有利于保持聚氨酯塑料降解酶活性；纯化操作简单，回收率高；可应用于实验室研究以及工业化大量生产聚氨酯塑料降解酶，并进行聚氨酯塑料废弃物的酶降解处理。
本发明所提供的重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法可从原包涵体蛋白中获得具有活性的重组PueA酶，所得复性重组PueA酶可在0.05mg/mL浓度下30分钟内实现降解聚氨酯乳液的理想效果。
附图说明
图1为本发明实施例1的重组PueA酶的SDS-PAGE图；其中，条带1为重组PueA酶包涵体，条带2为1％(w/v)SDS、pH为7.5的Tris-HCl缓冲液处理后的重组PueA酶包涵体蛋白溶解液(SDS与所述重组PueA酶的包涵体的质量比为1:100)，条带3为KCl处理后复性重组PueA酶(KCl与所述变性剂中的SDS的质量比为3:1)；
图2为应用本发明方法制备所得复性重组PueA酶降解聚氨酯乳液凝胶形成的水解圈效果照片；
图3为应用本发明方法制备所得重组PueA酶降解聚氨酯乳液的OD400数值变化图，其中横坐标为时间/分钟(Time/min)；
图4为应用本发明方法制备所得重组PueA酶降解聚氨酯乳液的澄清度变化照片。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
将来源于假单胞菌属的聚氨酯塑料降解酶基因PueA进行基因化学合成(基因序列见SEQ ID No.1，NCBI编号：AF069748.1)，通过分子克隆连接到pET28a载体上，转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主中进行诱导表达，在不同诱导条件下均形成了包涵体，并进一步以本发明的方法进行包涵体的复性，获得具有活性的聚氨酯降解酶PueA。
具体步骤如下：
步骤一：将诱导培养的菌液于4000×g离心10min，弃上清液，获得菌体。每克菌体沉淀用5mL Tris-HCl缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，pH 7.5)重悬，随后进行超声破碎，600w功率下每间隔4s工作2s，持续10min。
步骤二：将超声破碎后的重悬液于10000×g离心30min，倒去上清液，用1％(w/v)SDS Tris-HCl缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，pH 7.5)重悬，SDS与所述重组PueA酶的包涵体的质量比为1:100，4℃静置12h。
步骤三：将SDS溶解的重组PueA酶包涵体溶液于10000×g离心30min，取上清液，向上清液中加入KCl粉末(震荡混匀)，使其与所述变性剂中的SDS的质量比为3:1，4℃静置12h。
步骤四：将KCl处理后的复性重组PueA酶溶液于10000×g离心30min，取上清液作为复性重组PueA酶液。
本实施例进一步对各阶段的重组PueA酶进行SDS-PAGE电泳。参见图1可知，本发明的方法处理重组PueA酶包涵体可以获得高收率的重组PueA酶。
将本实施例获得的未经变性复性处理的重组PueA酶包涵体与复性重组PueA酶溶液分别滴入聚氨酯乳液固体凝胶中，30min后，降解效果如图2所示，其中BL21为未经变性复性处理的重组PueA酶包涵体，PueA为本实施例的复性重组PueA酶溶液。两者对比说明本实施例制备的复性重组PueA酶对聚氨酯有理想的降解效果。
在2.8mL含有1％聚氨酯乳液的Tris-HCl缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，pH 7.5)中加入终浓度为0.05mg/mL本实施例的复性重组PueA酶溶液，每隔几分钟记录溶液OD400数值的变化(BL21为未经变性复性处理的重组PueA酶包涵体处理聚氨酯乳液的情况)，并在30min后观察溶液澄清度的变化。最终经过30min，用本实施例制备的PueA酶处理的含有1％聚氨酯乳液的Tris-HCl缓冲液几乎澄清(参见图4)且OD400数值明显降低(参见图3)，证明复性后的PueA具有理想的活性。
实施例2
本实施例采用与实施例1相同的方法获得复性重组PueA酶液，区别仅在于：步骤二中，用0.5％(w/v)SDS Tris-HCl缓冲液重悬，SDS与所述重组PueA酶的包涵体的质量比为1:200，4℃静置12h。
经重组PueA酶SDS-PAGE电泳验证，本实施例获得了浓度低于实施例1的复性重组PueA酶。
实施例3
本实施例采用与实施例1相同的方法获得复性重组PueA酶液，区别仅在于：步骤二中，用2％(w/v)SDS Tris-HCl缓冲液重悬，SDS与所述重组PueA酶的包涵体的质量比为1:50，4℃静置12h。
经重组PueA酶SDS-PAGE电泳验证，本实施例获得了较高收率的重组PueA酶。经实施例1的聚氨酯降解效果验证，本实施例的复性重组PueA酶的聚氨酯降解活性低于实施例1。
实施例4
本实施例采用与实施例1相同的方法获得复性重组PueA酶液，区别仅在于：步骤三中，KCl与变性剂中的SDS的质量比为1.5:1，4℃静置12h。
经重组PueA酶SDS-PAGE电泳验证，本实施例获得了较高收率的重组PueA酶。经实施例1的聚氨酯降解效果验证，本实施例的复性重组PueA酶的聚氨酯降解活性低于实施例1。
实施例5
本实施例采用与实施例1相同的方法获得复性重组PueA酶液，区别仅在于：步骤三中，KCl与变性剂中的SDS的质量比为6:1，4℃静置12h。
经重组PueA酶SDS-PAGE电泳验证，本实施例获得了较高收率的重组PueA酶。经实施例1的聚氨酯降解效果验证，本实施例的复性重组PueA酶的聚氨酯降解活性低于实施例1。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京理工大学
<120> 一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法及应用
<130> KHP191113349.2
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1854
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggtgtgt ttgactacaa gaacttcact gcaagtgact ccaaggcgct gttttccgat 60
gcgctggcga tcaccctgta ctcctaccac aacatcgaca acggctttgc cgagggctac 120
cagcacaacg gcttcggcct gggcctgccg gcgaccctgg tcacggcgct gatcggcagc 180
ggcaattccc agggggtaat ccccggcatt ccctggaacc ccgactccga gaaggccgcg 240
ctggatgccc tgcaccaggc cggctggtcc accatcagcg cccagcaact gggctacgac 300
ggcaaggtcg atggccgggg aaccttcttt ggcgagaagg ccggctacgg cacggcccag 360
gtggaaatcc tcggcaagta cgatgctcag ggccacctgg aatccatcgg cattgccttt 420
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ggcaagctgc tgggagatgt cgccgccttc gcccaggcca atggcctgtc gggcaaggat 600
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cagggcggca gcggcaacga ctacctggaa ggccgggccg gcaacgatac gttccgcgac 1200
agcggcggct acaacatcat cctcggcggc cagggcagca acaccctgga cctgcagcag 1260
tcggtcaaga actacagctt tgccagcgac ggcgccggga ccctgtacct gcgtgacgcc 1320
aatggcggta tcagcatgac ccgcgacatt ggcgcgatcc agagcaagga gccgggcttt 1380
ctctggggcc tgttcaagga cgatgtgatc caccaggtca ccgaccaggg cctcaaggcc 1440
ggcgggcagc ttacccagta cgcctcgtcg gtcaggggcg atgcgggcga caacgtgctc 1500
aaggcccatg ccggcggcga ctggctgttc ggcctggacg gcaacgacca cctgatcggc 1560
ggccagggca acgacgtgtt cgttggcggt gccggcaacg acctgatgga agccggaggc 1620
ggcaacaata cctttctgtt caccgggcat tttggccagg accgcatcct cggctaccag 1680
ggtggcgaca agctggtgtt catgggggtg agcggcgtgc tgccggacca ggactatcgg 1740
gctcatgcca gcagcagtgg taacgacacg gtgctgacct tcggccagga ctcggtgacc 1800
ctggtggggg tcagcctgga gcacctcaac ggttccggca tcgttctcgc ctga 1854

Claims (2)

1.一种重组聚氨酯塑料降解酶的制备方法，其特征在于，所述重组聚氨酯塑料降解酶为重组PueA酶，所述重组PueA酶来源于假单胞菌属，所述制备方法包括：
溶解包涵体：以含有SDS的Tris-HCl缓冲液作为变性剂溶解所述重组PueA酶的包涵体得到包涵体蛋白溶解液；所述变性剂为含有1％w/v SDS的Tris-HCl缓冲液，pH为7.5；其中所述变性剂中的SDS与所述重组PueA酶的包涵体的质量比为1：100；所述溶解包涵体的步骤通过在4℃下静置12小时完成；
包涵体复性：向所述包涵体蛋白溶解液中加入KCl对所述包涵体蛋白溶解液进行复性，得到复性后的重组PueA酶；所述KCl与所述变性剂中的SDS的质量比为3：1；所述包涵体复性的步骤通过在4℃下静置12小时完成。
2.权利要求1所述的制备方法在聚氨酯塑料降解处理中的应用。
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