CN103910785B - 一种荧光假单胞菌TonB依赖型外膜受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子疫苗学领域，具体的说是一种荧光假单胞菌TonB依赖外膜受体及其应用。外膜受体为序列表SEQ？ID？No.1中的氨基酸序列所示。重组外膜受体蛋白的制备方法具体为以荧光假单胞菌TSS1为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pET259连接，获得质粒pEP796，质粒pEP796转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达含序列表SEQ？ID？No.1中的氨基酸的重组蛋白。本发明的TonB依赖型外膜受体重组蛋白作为疫苗能够有效地保护大菱鲆抵御荧光假单胞菌侵染。

Description

一种荧光假单胞菌TonB依赖型外膜受体及其应用
技术领域
本发明涉及分子疫苗学领域，具体的说是一种荧光假单胞菌TonB依赖外膜受体及其应用。
背景技术
荧光假单胞菌是一种营专性需氧的革兰氏阴性细菌，其在分类学上属于假单胞菌属。荧光假单胞菌具有多种鞭毛，生长环境非常广泛，包括：动植物、土壤、以及水体表面等。在水产养殖业中，荧光假单胞菌是多种鱼类的病原菌，有报道其可以感染草鱼、娃娃鱼、罗非鱼以及鲆蝶类等多种经济鱼类，感染后的鱼体会表现出赤皮病，表现为鳞片脱落和皮肤出血。
TonB依赖型外膜受体是跨细菌细胞间质的一类蛋白，其能够和位于内膜上的TonB-ExbB-ExbDd蛋白复合相互作用来获得能量。TonB依赖的外膜受体相互之间的晶体结构非常相似，主要由位于C端的22个β折叠组成的β桶结构域和位于N端的塞子结构域组成。TonB依赖的外膜受体可以跟Fe3+-铁载体复合物结合，结合后会引起受体空间构象的变化，进而引起Fe3+-铁载体复合物结合跨膜的转运。但是目前TonB依赖的外膜受体在荧假单胞菌中的作用还不甚清楚。
发明内容
本发明目的在于提供一种荧光假单胞菌TonB依赖型外膜受体及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种荧光假单胞菌TonB依赖型外膜受体，外膜受体为序列表SEQIDNo.1中的氨基酸序列所示。
荧光假单胞菌TonB依赖型外膜受体的制备方法，以荧光假单胞菌TSS1为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pET259连接，获得质粒pEP796，质粒pEP796转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达含序列表SEQIDNo.1中的氨基酸的重组蛋白。
所述引物为F1：5’-GATATCATGTACCGAGACAAGGTCAAGC-3’和R1：5’-GATATCCCAGTTGTAAGACACCGTACC-3’。
荧光假单胞菌TonB依赖型外膜受体的应用，所述受体的重组蛋白用于制备疫苗中的应用。
进一步的说，所述受体的重组蛋白用于制备抵御荧光假单胞菌的疫苗中的应用。
本发明具有如下优点：
1.有效保护性。本发明的TonB依赖型外膜受体P796作为疫苗对荧光假单胞菌的免疫保护效率达62%。
2.本发明的疫苗无需商业化佐剂。
附图说明
图1为本发明实施例提供的纯化的TonB依赖型外膜受体P796蛋白（泳道2）。泳道1，分子量标准。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法（SambrookandRussell:MolecularCloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001）；
3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。
实施例1
荧光假单胞菌TonB依赖型外膜受体P796为序列表SEQIDNo.1中的氨基酸序列所示（参见序列表1）。
序列表1
MTYGLQFITATTGVLLSTTVMAASATQHFAIAAGPLDNALSQFAAKANVILSFSPQQTARLNTPGLQGDYSVDQGFALLLQNSDLQAVAQAPGSYVLQPAPAGQMTLAPTTVSAYQQGGFNQEIGGDVGYKAQNSRIGTKTSTPLSETPRSVSVVTGQRIKDQKSQTLTEVLGYVPGIFAPPFAAGDGLAGDLFFIRGFNATDYGYGLLRDGLRVQGNRYDTTSEPYGLERVEIFRGPSSLLYGENAPGGLVNLVSKHPTATPQGEVQVSYGSNNRRQLGVDISGPLNDSDNILGRVVMLGRKSDTQTDHVPDDRLYIAPSLTLNFDDYNTLTLLANYQKDHTNLELGPPAAGTLLTNPNGKLSKHTLLGNPDWNTFEREAWSTGYEFSHSFNDDWQFRQNSRYMQSRINRHETWPGTLNNGGFGTRLNMNAYDRYNKSMVYSLDNQLEGKFQVGGVENTVLLGASYDRTSFNQDWDAGFAGTIDVYNPVYLRDPLTPLAVQNTLLEQQMKGVYAQVQSKYDHWLFLLGGRQDWVDSDYRDKVQPSSNINSQDRKFTYQGGVMYQFDNGLTPYVSYSTAFVPVQQISNAGSPLKPITSSQYEVGVKYEPIGWDTAMTLSVYDLRKQDDTYLDATTNSYRQVGESRAKGVEVEVNSDISANFNVTAAYTYTDARITKDSATSLVEGRQMTGVPRNQASVWGKYRFLDGQLKGFSLGGGVRYFDSTFSYTAPTLYGKLDAGSVTLVDAALGYQINPHWSVDLNAKNLFDKEYVSGCNDAGRCYWGDSRTLLGTVSYNW
（a）序列特征：
●长度：796
●类型：氨基酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：蛋白质
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：荧光假单胞菌TSS1
（f）特异性名称：P796
结构特征：该蛋白具有一个信号肽结构（氨基酸1－25）和一个TonB依赖型受体功能域（氨基酸557-795）。
实施例2
重组TonB依赖型外膜受体P796的制备
步骤1）TonB依赖型外膜受体P796表达载体pEP796的构建方法：
以荧光假单胞菌TSS1为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增。扩增的序列为编码序列表SEQIDNo.1中氨基酸539-795。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,50℃60s,72℃60s,5个循环；然后94℃40s,58℃60s,72℃60s,25个循环后再在72℃延伸反应10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259（pET259构建过程参见HuYH,ZhengWW,SunL.Identificationandmolecularanalysisofaferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol2010;28:678-86）用限制性内切酶EcoRV酶切后与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含卡那霉素（50ug/ml）的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pEP796。DNA测序表明pEP796含有编码序列表SEQIDNo.1中氨基酸539-795序列的基因。
所述LB组成成分按重量百分比计：1.0%蛋白胨,0.5%酵母粉,1.0%氯化钠,97.5％蒸馏水；所述菌株TSS1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.2329，分类命名为荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）。
所述引物为F1：5’-GATATCATGTACCGAGACAAGGTCAAGC-3’和R1：5’-GATATCCCAGTTGTAAGACACCGTACC-3’。
步骤2）重组TonB依赖型外膜受体P796的诱导表达和纯化：
将上述的质粒pEP796用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)（购自于“天根生化科技有限公司”，北京），在含有Ap(100ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取一个转化子，将其命名为BL21/pEP796。将BL21/pEP796于含有Ap(100ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有Ap(100ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6,加入终浓度为1mM的IPTG，37℃继续以转速160rpm摇动培养4－5h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用HisTrapHPColumns（购于美国GEHealthcare公司）回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测（8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h），测定其分子量大小（参见图1）。
所述裂解液含10mMNaH2PO4、10mMTris和8M尿素,pH8.0。
实施例3
重组TonB依赖型外膜受体P796作为疫苗的应用
步骤1）佐剂及疫苗混合液的制备。
佐剂对照液的制备：将5%（质量比）NaOH和5%（质量比）Al2(SO4)3以2：5体积比混合，将混合物以10,000g离心5分钟。将沉淀悬浮于PBS中至0.2mg/ml，即为佐剂。将PBS与佐剂等体积混合，即为佐剂对照液。
疫苗混合液制备：将上述实施例2纯化的重组TonB依赖型外膜受体P796蛋白在PBS中稀释至100ug/ml，将稀释后的蛋白与佐剂等体积混合。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8%NaCl,0.02%KCl,0.358%Na2HPO4.12H2O,0.024%NaH2PO4，余量为水。
步骤2）疫苗的免疫应用。将60条大菱鲆（每条重约12.9g）随机分为2组，每组30条。将这2组分别命名为A和B组。将A组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1）的疫苗混合液，将B组的每条鱼分别腹腔注射100ul上述步骤1）的佐剂对照液。
步骤3）荧光假单胞菌悬液的制备。在LB培养基中培养荧光假单胞菌TSS1至OD600为1,然后离心（5000g，4℃）10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x107cfu/ml。
步骤4）疫苗免疫保护效应检测。在步骤2）免疫注射后的第30天，用上述步骤3）的荧光假单胞菌悬液腹腔注射步骤2）的2组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，8条；B组,21条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：
RPS=100x(1－免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)
根据此公式算出P796疫苗的免疫保护效率为62％。因此，重组TonB依赖型外膜受体P796作为疫苗能够有效地保护大菱鲆抵御荧光假单胞菌侵染。

Claims (3)

1.一种荧光假单胞菌TonB依赖型外膜受体，其特征在于：外膜受体为序列表SEQIDNo.1中的氨基酸539-795序列所示。
2.按权利要求1所述的荧光假单胞菌TonB依赖型外膜受体的制备方法，其特征在于：以荧光假单胞菌TSS1为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pET259连接，获得质粒pEP796，质粒pEP796转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达含序列表SEQIDNo.1中的氨基酸539-795的重组蛋白；
所述菌株TSS1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.2329，分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)；
所述引物为F1：5’-GATATCATGTACCGAGACAAGGTCAAGC-3’和R1：5’-GATATCCCAGTTGTAAGACACCGTACC-3’。
3.按权利要求1所述的荧光假单胞菌TonB依赖型外膜受体的应用，所述受体的重组蛋白用于制备抵御荧光假单胞菌的疫苗中的应用。
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