CN104725477B - 一种新型抗菌脂肽[△Leu3]Surfactin、制备方法及应用 - Google Patents
一种新型抗菌脂肽[△Leu3]Surfactin、制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物发酵生产领域，提供一种新型抗菌脂肽，命名为[ΔLeu3]Surfactin，共有3种组分，包括C13的抗菌脂肽类化合物1、包括C14的抗菌脂肽类化合物2、包括C15的抗菌脂肽类化合物3，分子量分别为909、923、937Da。本发明还提供产该抗菌脂肽工程菌枯草芽孢杆菌LS1菌株的构建方法及该抗菌脂肽的制备过程和应用。[ΔLeu3]Surfactin是一种新型surfactin类抗菌脂肽，相比于surfactin其具有较弱的溶血活性，但对短小芽孢杆菌、藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌都有抑制作用，能够防治多种植物病害，其毒性较低，在生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等方面具有应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵生产领域，涉及一种新型抗菌脂肽，命名为 [ΔLeu3]Surfactin，同时，本发明还涉及产该抗菌脂肽工程菌枯草芽孢杆菌LS1菌株的构建方法及该抗菌脂肽的制备过程和应用。
背景技术
随着检测技术的进步以及环保意识的提高，食品的微生物污染，植物病虫害，日益严重的致病菌抗药性与化学药剂的潜在危害之间的矛盾越来越突出，选择低毒、高效、选择性强、残留时间短、对环境污染小的微生物天然防腐剂和生防试剂成为当前研究的热点。细菌又作为自然界中分布最广泛的一类微生物，以其繁殖速度快、适应能力强、易于人工培养等优势，倍受微生物工作者越来越多的关注。从微生物中提取抗菌物质成本低、周期短、操作简单方便、容易实现工业化生产，而且微生物分泌的抗菌物质抑菌谱较宽，热稳定性较好，适用pH范围广，使用过程不易产生抗性菌和交叉拮抗性，因此可以发挥更大的工业应用价值。
Surfactin家族的脂肽类化合物是由含有七个氨基酸的肽链与β-羟基脂肪酸链(通常 C13-C16)交联形成的内酯环状结构。该家族成员包括表面活性素surfactin、地衣芽胞杆菌素lichenyishin、表面活性剂pumilacidin、埃斯波素esperin，其中地衣芽胞杆菌素pumilacidin和埃斯波素esperin主要应用于制药工业和环境治理方面。到目前为止表面活性素surfactin是研究的最多的surfactin家族的化合物，其典型结构为一个具有LLDLLDL的手性亲水七肽通过内酯键与亲油的脂肪酸链碳原子的β-羟基相连，亲水的氨基酸在 1、3、4、6、7位，而第1位和第5位分别为Glu、Asp两个酸性氨基酸，使surfactin分子带两个负电荷。
通过之前Mohamed A.Marahiel教授等人的研究，通过敲除其中的一个模块，在线性排列的基因簇中，删除腺苷酰化结构域A-,或者巯基化结构域PCP-,或者缩合结构域C-结构域,或者修饰结构域，就会产生少一个氨基酸的抗菌脂肽，从而筛选新型抗菌脂肽的方法，为以后新型抗菌脂肽的开发进行铺垫并提供技术手段。由于缺少了一个氨基酸的抗菌脂肽对应的合成酶是已经删除了大片段基因的，通过基因技术的改造，改造后的合成酶空间结构发生了比较大的变化，从而影响到合成酶的活性，使得新型抗菌脂肽的产量很低，这是急需解决的问题。
发明内容
本发明通过大量试验，经过pKS2质粒无痕敲除方法产生新型抗菌脂肽突变株从而产生一种新型抗菌脂肽，填补目前研究的空白。
1、本发明提供一种抗菌脂肽，该抗菌脂肽由β-羟基脂肪酸链与L型谷氨酸、L型亮氨酸、L型缬氨酸、L型天冬氨酸、D型亮氨酸、L型亮氨酸线性排列并环化形成的新型抗菌脂肽，是一系列环形抗菌脂肽类化合物的总称，命名为[ΔLeu3]Surfactin；共有3种组分，分别为：包括C13β-羟基脂肪酸链的抗菌脂肽类化合物1、C14β-羟基脂肪酸链的抗菌脂肽类化合物2、C15β-羟基脂肪酸链的抗菌脂肽类化合物3；经过液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振高分辨质谱LC-FTICR-MS鉴定，化合物1、2、3的分子量分别为909、923、937Da。
2、本发明还提供产上述1抗菌脂肽的工程菌的制备方法，该方法将目的基因D-Leu模块删除后的surfactinA上下序列与pKS2载体连接，获得重组载体 pKS2-srfA-A-ΔLeu；以重组载体pKS2-srfA-A-ΔLeu转化枯草芽孢杆菌PB2-L1，通过 PKS2质粒诱导敲除、筛选，获得产[ΔLeu3]Surfactin的工程菌枯草芽孢杆菌LS1菌株。
3.上述2提供的抗菌脂肽工程菌的制备方法，其中，目的基因D-Leu模块删除后的surfactinA上下游序列具体获得步骤如下(1)以枯草芽孢杆菌PB2-L1菌株总DNA 为模板，引物对5′srfA-A-ΔLeu-up-F和3′srfA-A-ΔLeu-up-R进行上游片段PCR扩增， 5′srfA-A-ΔLeu-down-F和3′srfA-A-ΔLeu-down-R进行下游片段PCR扩增；其中，5′srfA-A-ΔLeu-up-F序列为：5'-CAAGATACGTATCCT-3'、3′srfA-A-ΔLeu-up-R序列为：5'-AGTCGGAAGCGTCAG-3'；5′srfA-A-ΔLeu-down-F序列为 5'-CAGGAGGGAATGCTG-3'、3′srfA-A-ΔLeu-down-R序列为 5'-CCACTTGATGTAATC-3'；
(2)以步骤1)获得的上游和下游片段为模板、上下游连接序列引物： 5′srfA-A-ΔLeu(KpnI)-F和3′srfA-A-ΔLeu(XhoI)-R进行重叠PCR，获得D-Leu模块删除后的surfactinA上下游序列连接产物即重叠PCR连接产物；其中，5′srfA-A-ΔLeu (KpnI)-F的序列如5'-GGTACCCAAGATACGTATCCT-3'所示，3′srfA-A-ΔLeu(XhoI)-R 的序列如5'-CTCGAGCCACTTGATGTAATC-3'所示；
(3)将获得的重叠PCR连接产物与质粒PMD-19T重组，获得重组质粒 PMD-19T-ΔLeu；
(4)以KpnⅠ和XhoΙ双酶切重组质粒PMD-19T-ΔAsp获得目的基因D-Leu模块删除后的surfactinA上下游序列。
4、上述2提供的抗菌脂肽工程菌的制备方法，其中，PKS2质粒诱导敲除、筛选过程为：将转化了重组载体pKS2-srfA-A-ΔLeu的枯草芽孢杆菌PB2-L1单克隆接种到 LB液体培养基中，37℃下转接3代后，培养过夜，涂布5mg/L卡那霉素浓度的Kan 平板并置于37℃下培养，转接3代后，长出的枯草芽孢杆菌单菌落即为发生同源重组单交换的转化子；转接重组单交换的转化子到LB中，30℃下培养36h后，涂布到 LB平板，置于37℃下培养12h后随机挑取平板中3000个单菌落接种于Kan平板，选择Kan平板上不生长的对应的在LB平板上生长的单菌落就是疑似枯草芽孢杆菌敲除株。
5、上述4提供的抗菌脂肽工程菌的制备方法，其中，对疑似枯草芽孢杆菌进行PCR进一步鉴定获得枯草芽孢杆菌敲除株，其过程为：以疑似枯草芽孢杆菌敲除株单菌落总DNA为模板，上下游连接序列引物5′srfA-A-ΔLeu(KpnI)-F和3′srfA-A-ΔLeu (XhoI)-R引物、pKS2质粒验证引物PKS-1058-ERM-F和PKS-1058-ERM-R进行PCR 鉴定，如果扩增出1107bp条带，说明上下游连接序列已经成功导入到枯草芽孢杆菌基因组中，枯草芽孢杆菌敲除株成功获得。
6、本发明还提供根据上述2-5任一项方法制备的工程菌产抗菌脂肽 [ΔLeu3]Surfactin的生产方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌LS1活化，制成浓度为 107～108cfu/l的种子液；将枯草芽孢杆菌LS1种子液以5％浓度接种于Landy发酵培养基中，在30℃和150rpm条件下培养72h，得到抗菌物质[ΔLeu3]Surfactin发酵液。
7、上述6提供的抗菌脂肽的生产方法，其中，将上述抗菌物质发酵液在5000r/min下离心25min除去菌体，上清液调pH至2.0，低温4℃过夜，5000r/min离心20min 取沉淀，用甲醇溶解，调节pH至7.0，于磁力搅拌器上4℃低温搅拌5h，10000r/min 离心20min后得到的上清液即为[ΔLeu3]Surfactin粗提物。
8、上述7提供的抗菌脂肽的生产方法，其中，种子液制备过程是：将枯草芽孢杆菌LS1接种于试管斜面营养琼脂培养基上，30℃培养24h，将菌种活化；再将试管斜面活化的枯草芽孢杆菌LS1菌种接种于LB液体培养基，30℃、180rpm培养20～24h，至对数生长期，制成浓度为107～108cfu/l的种子液。
9、上述8提供的抗菌脂肽的生产方法，其中，将[ΔLeu3]Surfactin粗提物进一步进行纯化，过程为：将[ΔLeu3]Surfactin粗提物采用RP-C18柱进行HPLC分离纯化；洗脱液为含3.8mmol三氟乙酸的水和乙腈溶液，洗脱柱为4.6mmФ×250mm；梯度洗脱条件为：0～10min，60％体积B相、40％体积A相；10～20min，93％体积B相、 7％体积A相；流速为0.83ml/min；检测波长为210nm；HPLC洗脱保留时间为16～ 17min，获得纯化抗菌脂肽[ΔLeu3]Surfactin；其中，B相为3.8mmol三氟乙酸的乙腈溶液，A相为含3.8mmol三氟乙酸的水。
10本发明还提供上述1提供的抗菌脂肽在食品防腐、动物饲料添加剂、农产品储藏、农药生产方面的应用。
有益效果：
1.研究表明，[ΔLeu3]Surfactin是一种新型surfactin类抗菌脂肽，相比于surfactin 其具有较弱的溶血活性，说明该脂肽的毒性与surfactin比较来说较小，可以为以后作为食品添加剂成为可能。并且，对短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、藤黄微球菌都有抑制作用，能够防治多种植物病害。在世界范围内还没有报道，可以在生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等方面非常具有应用潜。
2.[ΔLeu3]Surfactin是第一次通过分子技术手段成功改造缺少了第三位D型亮氨酸的抗菌脂肽，前人并没有该物质的报道。此次构建缺少了第三位D型亮氨酸的抗菌脂肽的分子克隆技术是运用了温敏型载体无痕敲除技术，大大缩短了敲除的时间；并且由于此技术并没有外源污染抗性基因在改造菌株中的残留，从而为改造后的菌株在食品产业中的应用提供了保障。
3.本发明提供的抗菌脂肽[ΔLeu3]Surfactin的制备方法相较于现有技术具有发酵时间短，发酵产物易于分离纯化，从而为新型抗菌抗菌脂肽的鉴定提供了基础。
4.本发明采用的B.subtilis是被美国环保署列为可商业上应用的微生物菌种之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种，并在农业领域已得到广泛的应用。枯草芽孢杆菌LS1抗菌脂肽[ΔLeu3]Surfactin抗菌脂肽属于人工改造微生物天然抗菌肽，对人类健康和食品安全性高，不会导致对环境的污染，可用于生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等。
附图说明
图1枯草要抱杆菌LS1产[ΔLeu3]Surfactin抗菌脂肽以及surfactin抗菌脂肽标样的ESI-MS图
A图是新型抗菌脂肽[ΔLeu3]Surfactin的一级质谱的鉴定；B图是surfactin抗菌脂肽标样的一级质谱
图2枯草芽孢杆菌LS1产[ΔLeu3]Surfactin抗菌脂肽-H2Om/z905.5668离子碎片分析图
图3枯草芽孢杆菌LS1产[ΔLeu3]Surfactin抗菌脂肽化学结构式及surfactin抗菌脂肽标样化学结构
A.枯草芽孢杆菌LS1产[ΔLeu3]Surfactin抗菌脂肽化学结构式；B.surfactin抗菌脂肽标样化学结构式
图4PKS2质粒诱导敲除流程；
其中，中方框为上游序列；黑白相间方框为下游序列；Kan指Kan抗性基因、RepA 指RepA温敏复制子基因。
图5删除D-Leu模块后的surfactinA上游、下游片段扩增结果
其中，1号泳道是删除D-Leu模块的surfactin A上游片段，2号泳道是删除D-Leu模块的surfactinA下游片段
图6重叠PCR连接产物扩增结果图
其中，1泳道是重叠PCR连接产物
图7PMD-19T-ΔLeu重组载体转化大肠杆菌阳性克隆子PCR扩增结果图
1、2号泳道是PMD-19T-ΔLeu载体转化大肠杆菌菌液PCR阳性克隆子1、2。
图8对pKS2-srfA-A-ΔLeu进行双酶切验证结果
图9在LB平板、Kan抗性平板、Erm抗性平板上对敲除株筛选
图10对删除D-Leu模块的surfactinA敲除株进行PCR电泳验证结果
1号泳道是为上下游连接序列；2号泳道是pKS2质粒验证
图11产脂肽的发酵培养产物的高效液相色谱分析
A、枯草芽孢杆菌PB2-L1菌株发酵产物的液相分析结果
B、敲除株枯草芽孢杆菌LS1发酵产物的液相分析结果
图12溶血性鉴定
1、加入[ΔLeu3]Surfactin的滤纸板；2、加入surfactin的滤纸板；3、加入甲醇的滤纸板
图13新型抗菌脂肽[ΔLeu3]Surfactin的抗菌谱
1、加入[ΔLeu3]Surfactin的滤纸板；2、加入surfactin的滤纸板；3、加入甲醇的滤纸板
A图为新型抗菌脂肽对短小芽孢杆菌抑菌效果
B图为新型抗菌脂肽对对藤黄微球菌抑菌效果
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可以很容易地从公开是商业渠道获得。
实施例1
新型抗菌活性枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LS1敲除载体的构建和敲除株的筛选与鉴定
1.引物设计与合成
针对NCBI上关于枯草芽孢杆菌surfactinA-A亚基公布的基因序列和温敏载体pKS2质粒的多克隆位点，利用Primer Premier 5软件进行引物设计，由生工(上海) 生物技术公司合成。引物序列如表1所示；其中，粗体斜体表示酶切位点，下划线表示引物融合PCR重叠区域。
其中引物5′srfA-A-ΔLeu(KpnI)-F中含有pKS2载体上的KpnⅠ酶切位点， GGTACC，引物3′srfA-A-ΔLeu(XhoI)-R含有XhoⅠ酶切位点CTCGAG。
表1本试验所用引物
2.枯草芽孢杆菌PB2-L1菌株总DNA的提取
用Sigma公司细菌基因组提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌PB2-L1菌株(由发明人所在实验室保存，其他同行出于研究目的，本实验室愿意提供该菌株)总DNA。
3.枯草芽孢杆菌D-Leu模块删除后surfactinA的上游、下游片段扩增
以步骤2提取的枯草芽孢杆菌PB2-L1菌株DNA为模板，分别以步骤1设计的引物对5′srfA-A-ΔLeu-up-F和3′srfA-A-ΔLeu-up-R、5′srfA-A-ΔLeu-down-F和 3′srfA-A-ΔLeu-down-R进行PCR扩增；其中，5′srfA-A-ΔLeu-up-F和 3′srfA-A-ΔLeu-up-R扩增上游片段，5′srfA-A-ΔLeu-down-F和3′srfA-A-ΔLeu-down-R 扩增下游片段。
PCR扩增体系：50μl体系，PCR Mixture 25μL,正反向引物各1μL，枯草芽孢杆菌PB2-L1菌株总DNA 1μL，Taq酶0.6μL,超纯水22.4μL。PCR扩增条件为：97℃预变性7min，95℃变性1min，60℃复性1min，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸7min。进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，D-Leu模块删除后surfactinA的上游、下游片段分别通过PCR扩增出单一条带，上游序列大小为594bp、如1号泳道；下游序列大小513bp、如2号泳道。说明引物特异性很好，能够成功扩增出D-Leu模块删除后的surfactinA的上游、下游片段。以生工(上海)生物科技有限公司生产的胶回收试剂盒对获得的上、下游片段进行回收，成功回收删除D-Leu模块后的surfactinA的上、下游片段。
删除D-Leu模块后的surfactinA上、下游片段的连接方法为重叠PCR方法：上下游连接序列引物5′srfA-A-ΔLeu(KpnI)-F和3′srfA-A-ΔLeu(XhoI)-R进行PCR，得到上游、下游片段的连接产物即重叠PCR连接产物，用于与温敏载体pKS2质粒进行连接。 PCR反应体系(50μL)为：PCR Mixture 25μL,引物5′srfA-A-ΔLeu(KpnI)-F和 3′srfA-A-ΔLeu(XhoI)-R引物各1μL，上、下游片段各2μL，Taq酶0.6μL,超纯水22.4μL。 PCR程序为：94℃4min；94℃30s,55℃30s,72℃10min,循环25次；72℃10min。扩增后以琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，如图6所示，上游、下游片段通过重叠PCR扩增出上游、下游片段的连接产物，重叠PCR连接产物，大小为1107bp。
4.PMD-19T-ΔLeu重组质粒的构建
以载体PMD-19T(购自TaKaRa公司)、重叠PCR连接产物为反应物，利用T载体试剂盒(购自TaKaRa公司)进行PMD-19T-ΔLeu重组载体的构建，使得枯草芽孢杆菌删除D-Leu模块后的surfactinA的上下游连接产物获得粘性末端。
将重组载体PMD-19T-ΔLeu 10μl加至大肠杆菌Mach1T1感受态细胞100μl中,冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，37℃，120r/min，孵育1h。取100μl转化菌液涂布于含氨苄霉素(100ug/ml)的LB平板上，37℃温箱孵育过夜。取1μl大肠杆菌菌液作模板进行PCR扩增，PCR扩增程序、体系同步骤3重叠PCR方法所述。琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，筛选能够扩增出删除D-Leu模块的surfactinA菌株，此菌株筛选阳性克隆送金斯瑞公司测序。在www.ncbi.nlm.nlh.gov网站中使用BLASTN2.211，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因库中进行同源性搜索，所得结果中相似性最高的只有1个菌株，比较结果如表2所示，从表可见与删除D-Leu模块的surfactinA(即连接后的上下游序列)菌株相似度最高的前1株菌为枯草芽孢杆菌168，而且相似性达到 99％，说明构建的删除D-Leu模块的surfactinA序列完全正确，没有错误，可以进行下一步试验。
表2删除D-Leu模块后的surfactinA菌株测序结果
5.PKS2重组载体的构建
1)质粒的提取
接种含有温度敏感载体pKS2(包括Kan抗性基因和Erm抗性基因)的大肠杆菌JM110(JM110是去甲基化的大肠杆菌，是商品化的)于10ml含卡纳青霉素(50ug/mL) 的LB培养基中，37℃培养10h左右，然后用质粒提取试剂盒提取pKS2载体，提取产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
接种含有PMD-19T-ΔLeu的大肠杆菌Mach1T1于10ml含氨苄青霉素(100ug/mL) 的LB培养基中，37℃培养10h左右，然后用质粒小提试剂盒提取PMD-19T-ΔLeu，提取产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
2)目的基因与质粒的酶切
回收后的PMD-19T-ΔLeu和pKS2载体分别用KpnⅠ和XhoΙ进行酶切，20μl酶切体系：限制性内切酶各1μl，缓冲液2μl，重组载体5μl，水补足20μl。37℃作用6h，分别用DNA快速纯化试剂盒【生工(上海)生物科技有限公司】回收完整的酶切产物即删除D-Leu模块后的surfactinA上下游(含有酶切粘性末端)和酶切后的pKS2载体，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，能得到1107bp(删除D-Leu模块后的surfactinA 上下游序列)和5058bp(酶切后的pKS2载体)大小的条带，则说明酶切产物正确。
3)目的基因与载体连接
连接体系(10μl)：酶切后的PKS2载体1μl、删除D-Leu模块后的surfactinA上下游序列(含有完整的含有酶切粘性末端)4μl、T4DNA连接酶和10×缓冲液各1μl，加无菌去离子水至10μl连接体系，于16℃连接过夜获得连接产物，重组载体 PKS2-srfA-A-ΔLeu。
4)连接产物转化
将步骤3)获得的重组载体PKS2-srfA-A-ΔLeu10μl加至大肠杆菌JM110感受态细胞100μl中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，37℃，120r/min，孵育1h。取 100μl转化菌液涂布于含卡纳霉素(50ug/ml)的LB平板上，37℃温箱孵育过夜。
5)阳性克隆鉴定
随机挑取单菌落，接种于2ml含氨苄霉素(100ug/ml)的LB液体培养基中，37℃培养过夜，取1μl菌液作模板进行PCR扩增，筛选阳性克隆，进行重组质粒的双酶切鉴定，如图8所示，从图中可以看出重组载体被切开，条带大小分别为1107bp、1058bp，说明重组载体pKS2-srfA-A-ΔLeu通过双酶切成功酶切出目的条带，即大小为1107bp 的D-Leu模块后的surfactinA亚基(含有完整的酶切粘性末端)，重组载体 pKS2-srfA-A-ΔLeu成功构建。
6.对枯草芽孢杆菌PB2-L1进行感受态制备与转化
1)前一天晚上挑取宿主菌枯草芽孢杆菌PB2-L1接种于5mL LB液体培养基中， 37℃摇床培养过夜。
2)第二天早上从过夜培养物中取500μL菌液，接种至用50mL三角瓶配好的25mLSPI培养基中，37℃摇床培养，3h后开始测OD 600，当培养物生长到对数末期时(OD＝1.4左右)，快速取2.5ml接种到25mL SPII培养基中，于37℃， 100rpm摇床培养1.5h，获得感受态枯草芽孢杆菌PB2-L1培养液。
3)加275μl 100×EGTA溶液于上述感受态菌株培养液中，于37℃100rpm摇床培养10min，用2mL离心管分装成500μl每管。向离心管中加入1μg的重组载体PKS2-srfA-A-ΔLeu，轻轻混匀，于37℃100rpm摇床培养30min。
4)取出离心管并加入700μl LB培养基，转移到200rpm摇床，37℃培养 1.5h。以5000rpm/min离心收集转化后的菌体，弃部分上清液，留150μL重悬菌体，涂卡纳霉素(10ug/ml)LB抗性选择平板，37℃培养过夜(12-16h)，之后取出平板观察菌落,并挑取单克隆。
8.PKS2质粒诱导敲除方法
将步骤7获得的枯草芽孢杆菌单克隆接种到LB液体培养基中，37℃下转接3代，此时，温度敏感载体pKS2不复制，与待敲除菌株PB2-L1基因组进行第一次单交换，第一次单交换的位置在上游或下游同源片段区域随机发生。之后，培养过夜，涂布Kan 平板(5mg/L卡那霉素浓度)，筛选出成功进行第一次单交换的菌株。置于37℃下培养，转接3代后，长出的枯草芽孢杆菌单菌落即为发生同源重组单交换的转化子。转接重组单交换的转化子到LB中，30℃下培养36h后，此时，通过降温处理，整合在基因组的温敏载体开始复制，在基因组中发生第二次单交换，如果第一单交换发生在上游，那么第二次单交换就发生在下游，反之亦然。培养后，将发生二次单交换的菌株涂布到LB平板，置于37℃下培养12h后随机挑取平板中3000个单菌落接种于Kan平板，选择Kan平板上不生长的对应的在LB平板上生长的单菌落就是疑似枯草芽孢杆菌敲除株，敲除筛选原理流程如图4、9。此时Kan平板上不生长，说明质粒pKS2已经不存在于枯草芽孢杆菌菌体中。为加强筛选，同时，也进行Erm(红霉素)筛选，方法同Kan筛选一样。
对疑似枯草芽孢杆菌敲除株菌落进行PCR进一步鉴定，其中，PCR扩增体系：上下游连接序列引物5′srfA-A-ΔLeu(KpnI)-F和3′srfA-A-ΔLeu(XhoI)-R引物、pKS2质粒验证引物PKS-1058-ERM-F和PKS-1058-ERM-R各1μL，疑似枯草芽孢杆菌敲除株单菌落总DNA 1μL，Taq酶0.6μL,超纯水22.4μL。PCR程序为：94℃4min；94℃30s, 55℃30s,72℃1min40s,循环35次；72℃10min。试验重复3次，扩增后以琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果(如图10)。经PCR验证，1号泳道为上下游连接序列，大小为1107bp。 2号泳道为pKS2质粒验证，1号泳道成功PCR出上下游连接序列，说明上下游序列已经成功导入到基因组中；2号泳道没有出现条带，说明质粒已经在菌体中不存在了， pKS2质粒已经从菌体基因组中成功摆脱。根据1号泳道、2号泳道的结果，可以说明经PCR验证，成功筛选出了含有D-Leu模块删除后的surfactinA的菌株，即枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LS1。
实施例2
枯草芽孢杆菌LS1产[ΔLeu3]Surfactin的发酵和分离鉴定
1.1产脂肽的发酵培养
枯草芽孢杆菌LS1产[ΔLeu3]Surfactin的发酵：将枯草芽孢杆菌LS1接种于试管斜面营养琼脂培养基上，30℃培养24h，将菌种活化；再将试管斜面活化的枯草芽孢杆菌LS1菌种接种于LB液体培养基，30℃、180rpm培养20～24h，至对数生长期，制成浓度为107～108cfu/l的种子液；将枯草芽孢杆菌LS1种子液以5％浓度接种于Landy发酵培养基中，在30℃和150rpm条件下培养72h，得到抗菌物质发酵液。
1.2枯草芽孢杆菌LS1产[ΔLeu3]Surfactin的分离
取上述发酵液在5000r/min下离心25min除去菌体，上清液调pH至2.0，低温过夜，5000r/min离心20min取沉淀，用甲醇溶解，调节pH至7.0，于磁力搅拌器上低温4℃搅拌5h，10000r/min离心20min后得到的上清液即为[ΔLeu3]Surfactin粗提物。 1.3产脂肽枯草芽孢杆菌LS1的高效液相色谱分析(HPLC)
[ΔLeu3]Surfactin和枯草芽孢杆菌PB2-L1发酵产物的高效液相色谱分离、检测条件：色谱柱为Agilent C18柱，4.6mm×250mm×0.5μm；进样量20μL；柱温35℃；检测波长210nm；流速0.84mL·min-1；检测时间25min，[ΔLeu3]Surfactin的HPLC洗脱保留时间分别约为16～17min。洗脱液为含3.8mmol三氟乙酸的水和含3.8mmol三氟乙酸乙腈溶液(三氟乙酸和乙腈为MERK公司产品)，溶剂：B相为加1‰质量的三氟乙酸的乙腈溶液(含3.8mmol三氟乙酸乙腈溶液)，A相为纯净水中加1‰质量的三氟乙酸(含3.8mmol三氟乙酸的水)；色谱检测梯度变化条件如表3所示。
表3[ΔLeu3]surfactin检测时的流动相
Table 3Mobile phase for detecting surfactin
通过产surfactin菌株枯草芽孢杆菌PB2-L1的发酵产物的液相分析，图11A上可以看出在13分钟之后有四个特征峰出现，并且mAU峰值很高，说明有surfactin产生，可以确定枯草芽孢杆菌PB2-L1菌株是一株产surfactin的菌株。
对敲除株枯草芽孢杆菌LS1的发酵产物的液相分析，图11B可以看出，与枯草芽孢杆菌PB2-L1菌株surfactin的四个特征峰明显消失，但枯草芽孢杆菌LS1菌株的发酵产物在17分钟左右出现一个新峰形，说明敲除D-Leu模块后产生的物质出峰时间比枯草芽孢杆菌PB2-1发酵产生的surfactin提前了。通过与surfactin的四个特征峰的比较，可以发现，枯草芽孢杆菌LS1的发酵产物与surfactin的四个特征峰有明显的差异，由于新物质的HPLC峰型和保留时间与与surfactin的四个特征峰有明显的区别，所以说可以初步判定为产生了一个新物质，该物质是否是未知的新物质还需要进行质谱的检测。
1.4新型抗菌脂肽的LC-MS/MS鉴定
1)液质联用(LC-MS)实验
质谱实验的基本原理是使所研究的物质形成离子，然后使所形成的离子按质荷比m/z(mass-charge ratio)进行分离。利用质谱与高效液相联用，可以定性、定量分析物质的组成。
采用液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振高分辨质谱仪(LC-FTICR-MS)测定样品的分子量，条件如下：
液相色谱条件
a)质谱柱：C18-MS-Ⅱ2.6mmФ×250mm，TSK；
b)柱温：25℃；
c)进样体积：10μL；
流动相为乙腈(A)和水(B)，流速为0.2mL/min，梯度洗脱条件为：0-10min，A40％，B60％；10-20min，A 7％，B 93％；
质谱条件
ESI离子源,采用正离子检测模式；喷雾电压3.5kV；毛细管温度275℃；鞘气 (N 2)流速35arb；辅助气(N 2)流速10arb；扫尾气(N 2)流速3arb；管状透镜: 110V；碰撞能量35V；扫描范围100～2000u；扫描方式:LTQ采用全扫描方式M S5 扫描,且MS2采用数据相关扫描模式对m/z 923进行碰撞诱导解离(CID)全扫描, MS3～MS5则依次对上一级谱图中最强离子峰进行CID全扫描；FT采用全扫描方式 MS2扫描,且MS2采用Data Dependent Scan模式对m/z 923进行CID全扫描。
通过高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(LC-FTICR-MS)的分析，图1A中可以明显看出923m/z峰，该物质为改造后的菌株枯草芽孢杆菌LS1产生的物质，物质的保留时间与HPLC出峰时间是一致的；而对照组surfactin(分子量分别为1008、 1022、1036Da，本实验室制备)中没有923m/z峰出现，说明枯草芽孢杆菌LS1的发酵产物为新物质。同时，图1A也可以看出[ΔLeu3]Surfactin分子量分别为909、923、 937Da。而对照组，图1-B中，标准样品[ΔLeu3]Surfactin分子量分别为1008、1022、 1036Da。可以确定通过敲除株枯草芽孢杆菌LS1进行了次级代谢产物合成得到的。新物质[ΔLeu3]surfactin通过LC的出峰时间是16.69min，[ΔLeu3]Surfactin+[H+]的分子量为m/z 923.6033。通过二级MS鉴定，图2上可以看到新物质[ΔLeu3]Surfactin断裂碎片，从离子碎片分析图中可以看出可以看出，905峰是[ΔLeu3]Surfactin抗菌脂肽-H2O 的分子量，810峰是在905峰基础之上去掉一个亮氨酸，697峰是在810峰基础之上去掉一个亮氨酸，之后依次去掉[ΔLeu3]Surfactin组成中的氨基酸(箭头表明的碎片大小就是理论上各个氨基酸的分子量)，说明[ΔLeu3]Surfactin的断裂碎片的方式是与预测结果一致的。
根据已有surfactin结构式如图3-B所示，结合上述二级MS结果，推测[ΔLeu3]Surfactin结构式如图3-A所示，其中，n＝13、14、15，R为[ΔLeu3]Surfactin肽键连接方式；SrfA-A为第一个亚基，包含组成L型谷氨酸、L型亮氨酸，其缺少一个D型亮氨酸的模块；SrfA-B为第二个亚基，包含组成L型缬氨酸、L型天冬氨酸和L型亮氨酸的模块；SrfA-C为第三个亚基，包含组成L型亮氨酸的模块。
1.5新型抗菌脂肽的溶血活性鉴定
以本领域惯用的溶血性试验对[ΔLeu3]Surfactin的溶血性进行定性检测。
血平板制作：在100mL灭菌的LB培养基冷却到50℃左右后，加入5mL脱纤维羊血，混合均匀后，倒入灭菌的培养皿中，制作血平板。
在血平板上放置高温灭菌的滤纸片，分别将20μL的纯化的[ΔLeu3]Surfactin和surfactin加入滤纸片中，分别为第1组即含有纯化的[ΔLeu3]Surfactin滤纸片、第2组即含有纯化的surfactin滤纸片，37℃下过夜培养，拍照记录，实验重复三次。
溶血性结果如图13：根据溶血圈的大小，可以看出新物质[ΔLeu3]Surfactin与surfactin都具有溶血性，但与surfactin溶血性相比，[ΔLeu3]Surfactin溶血能力相对较弱，说明[ΔLeu3]Surfactin的毒性与surfactin比较来说较小，为以后作为食品添加剂提供可能。
1.6新型抗菌脂肽的抗菌谱鉴定
以大肠埃希氏杆菌作为指示菌，将纯化后的[ΔLeu3]Surfactin待测样品，用0.45μm 细菌滤器过滤，采用牛津杯平板扩散法(双层营养琼脂：下层10mL，上层5mL)，在上层琼脂中混入0.2mL菌量为106浓度的指示菌，取滤液200μL加入牛津杯中，37℃培养24h，观察抑菌效果并记录抑菌圈直径大小。通过对短小芽孢杆菌的抑制效果，可以看出[ΔLeu3]Surfactin以及surfactin都对短小芽孢杆菌有抑制作用，[ΔLeu3]Surfactin抑菌圈直径为25.96mm，surfactin抑菌圈直径为24.16mm，甲醇没有抑菌圈。通过对藤黄微球菌抑菌效果，可以看出[ΔLeu3]Surfactin以及surfactin都对藤黄微球菌有抑制作用， [ΔLeu3]Surfactin抑菌圈直径为10.66mm，surfactin抑菌圈直径为12.26mm，甲醇没有抑菌圈。抗菌谱：对短小芽孢杆菌、藤黄微球菌的抑菌活性进行比较发现，[ΔLeu3]Surfactin 都具有抑菌活性且抑菌性比surfactin更强。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：将目的基因D-Leu模块删除后的surfactinA上下游序列与pKS2载体连接，获得重组载体pKS2-srfA-A-△Leu；以重组载体pKS2-srfA-A-△Leu转化枯草芽孢杆菌PB2-L1，通过PKS2质粒诱导敲除、筛选，获得产[△Leu3]Surfactin的工程菌枯草芽孢杆菌LS1菌株；将枯草芽孢杆菌LS1活化，制成浓度为107～108cfu/l的种子液；将枯草芽孢杆菌LS1种子液以5％浓度接种于Landy发酵培养基中，在30℃和150rpm条件下培养72h，得到抗菌脂肽发酵液；将抗菌脂肽发酵液在5000r/min下离心25min除去菌体，上清液调pH至2.0，低温4℃过夜，5000r/min离心20min取沉淀，用甲醇溶解，调节pH至7.0，于磁力搅拌器上4℃低温搅拌5h，10000r/min离心20min后得到的上清液即为[△Leu3]Surfactin粗提物；将[△Leu3]Surfactin粗提物进一步进行纯化，过程为：将[△Leu3]Surfactin粗提物采用RP-C18柱进行HPLC分离纯化；洗脱液为含3.8mmol三氟乙酸的水和乙腈溶液，洗脱柱为4.6mmΦ×250mm；梯度洗脱条件为：0～10min，60％体积B相、40％体积A相；10～20min，93％体积B相、7％体积A相；流速为0.83ml/min；检测波长为210nm；HPLC洗脱保留时间为16～17min，获得纯化抗菌脂肽[△Leu3]Surfactin；其中，B相为3.8mmol三氟乙酸的乙腈溶液，A相为含3.8mmol三氟乙酸的水；
其中，产[△Leu3]Surfactin的工程菌枯草芽孢杆菌LS1菌株得构建方法如下：(1)以枯草芽孢杆菌PB2-L1菌株总DNA为模板，引物对5′srfA-A-△Leu-up-F和3′srfA-A-△Leu-up-R进行上游片段PCR扩增，5′srfA-A-△Leu-down-F和3′srfA-A-△Leu-down-R进行下游片段PCR扩增；其中，5′srfA-A-△Leu-up-F序列为：5′-CAAGATACGTATCCT-3′、△srfA-A-△Leu-up-R序列为：5′-AGTCGGAAGCGTCAG-3′；5′srfA-A-△Leu-down-F序列为5′-CAGGAGGGAATGCTG-3′、3′srfA-A-△Leu-down-R序列为5′-CCACTTGATGTAATC-3′；
(2)以步骤(1)获得的上游和下游片段为模板、上下游连接序列引物：5′srfA-A-△Leu(KpnI)-F和3′srfA-A-△Leu(XhoI)-R进行重叠PCR，获得D-Leu模块删除后的surfactinA上下游序列连接产物即重叠PCR连接产物；其中，5′srfA-A-△Leu(KpnI)-F的序列如5′-GGTACCCAAGATACGTATCCT-3′所示，3′srfA-A-△Leu(XhoI)-R的序列如5′-CTCGAGCCACTTGATGTAATC-3′所示；
(3)将获得的重叠PCR连接产物与质粒PMD-19T重组，获得重组质粒PMD-19T-△Leu；
(4)以Kpn I和XhoI双酶切重组质粒PMD-19T-△Asp获得目的基因D-Leu模块删除后的surfactinA上下游序列；
所述的PKS2质粒诱导敲除、筛选过程为：将转化了重组载体pKS2-srfA-A-△Leu的枯草芽孢杆菌PB2-L1单克隆接种到LB液体培养基中，37℃下转接3代后，培养过夜，涂布5mg/L卡那霉素浓度的Kan平板并置于37℃下培养，转接3代后，长出的枯草芽孢杆菌单菌落即为发生同源重组单交换的转化子；转接重组单交换的转化子到LB中，30℃下培养36h后，涂布到LB平板，置于37℃下培养12h后随机挑取平板中3000个单菌落接种于Kan平板，选择Kan平板上不生长的对应的在LB平板上生长的单菌落就是疑似枯草芽孢杆菌敲除株；对疑似枯草芽孢杆菌进行PCR进一步鉴定获得枯草芽孢杆菌敲除株，其过程为：以疑似枯草芽孢杆菌敲除株单菌落总DNA为模板，上下游连接序列引物5′srfA-A-△Leu(KpnI)-F和3′srfA-A-△Leu(XhoI)-R引物、pKS2质粒验证引物PKS-1058-ERM-F和PKS-1058-ERM-R进行PCR鉴定，如果扩增出1107bp条带，说明上下游连接序列已经成功导入到枯草芽孢杆菌基因组中，枯草芽孢杆菌敲除株LS1成功获得。
2.根据权利要求1所述的抗菌脂肽的制备方法，其特征在于，种子液制备过程是：将枯草芽孢杆菌LS1接种于试管斜面营养琼脂培养基上，30℃培养24h，将菌种活化；再将试管斜面活化的枯草芽孢杆菌LS1菌种接种于LB液体培养基，30℃、180rpm培养20～24h，至对数生长期，制成浓度为107～108cfu/l的种子液。
3.按照权利要求1所述的制备方法制备的抗菌脂肽，其特征在于：该抗菌脂肽由β-羟基脂肪酸链与L型谷氨酸、L型亮氨酸、L型缬氨酸、L型天冬氨酸、D型亮氨酸、L型亮氨酸线性排列并环化形成的新型抗菌脂肽，是一系列环形抗菌脂肽类化合物的总称，命名为[△Leu3]Surfactin；共有3种组分，分别为：包括C13β-羟基脂肪酸链的抗菌脂肽类化合物1、C14β-羟基脂肪酸链的抗菌脂肽类化合物2、C15β-羟基脂肪酸链的抗菌脂肽类化合物3；经过液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振高分辨质谱LC-FTICR-MS鉴定，化合物1、2、3的分子量分别为909、923、937Da。
4.权利要求3所述的抗菌脂肽在制备食品防腐、动物饲料添加剂、农产品储藏、农药产品方面的应用。
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