CN113817655B - 伊短菌素高产工程菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程和微生物领域，具体公开了伊短菌素高产工程菌及应用。该工程菌以野生型短短芽孢杆菌为原始菌株，将启动子Pgrac、Pspc、Pshuttle‑09和P43与抗性基因ApraR连接，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素生物合成基因簇的天然启动子Pede分别替换为启动子Pgrac、Pspc、Pshuttle‑09和P43，得到相应的高产伊短菌素的短短芽孢杆菌工程菌。通过所述定向遗传修饰的短短芽孢杆菌工程菌能够提高伊短菌素的产量，培养方式简单、生产效率高，为实现伊短菌素在微生物源农药和医药中的开发与利用奠定了坚实的基础。

Description

伊短菌素高产工程菌株及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和微生物领域，具体涉及伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用。
背景技术
据统计，国际上生物农药类产品己经高达100多种，其中90％以上的有效成分是芽孢杆菌或其代谢产物。芽孢杆菌制剂除了能够防治虫害，还能够抑制或杀死病原菌，保护作物免受病原菌的危害。
伊短菌素(edeines)是由短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)产生的线性非核糖体类抑菌活性物质。Edeines由四种非蛋白氨基酸残基(β-Tyr/β-Phe、Isoserine、DAPA和DAHAA)、一个甘氨酸和一个聚胺组成，依其序列差异，可分为edeine A、B、D和F四种组分，各组分又有α（1）和β（2）两种同分异构体，区别在于β-异丝氨酸（Isoserine）中的羧基跟2,3-二氨基丙酸（DAPA）中的α位氨基还是β位氨基形成肽键。伊短菌素对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌等微生物具有广谱抑菌活性；此外，对肿瘤细胞也有抑制效果，而且还具有免疫抑制活性。正因为如此，伊短菌素具有开发为农用或医用抗生素的良好潜力。
然而，在野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素的产量较低，极大地阻碍了伊短菌素作为微生物源农药或生物医药的开发与应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用，该工程菌通过对短短芽孢杆菌进行定向遗传修饰，有效提高伊短菌素的产量。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种伊短菌素高产工程菌，其是利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为Pgrac、Pspc、Pshuttle-09和P43而得到的。
在具体实施方式中，所述启动子Pgrac的核苷酸序列GeneBank登录号为MH328010.1；启动子Pshuttle-09的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；启动子Pspc的核苷酸序列GeneBank登录号为EU864235.1；启动子P43的核苷酸序列GeneBank登录号为DQ264732.1。
本发明还提供所述的伊短菌素高产工程菌的制备方法，其特征在于，将启动子Pgrac、Pspc、Pshuttle-09或P43与抗性基因连接获得的融合片段，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为Pgrac、Pspc、Pshuttle-09和P43得到相应的短短芽孢杆菌工程菌。
优选地，所述抗性基因是ApraR。更具体地，所述抗性基因ApraR的核苷酸序列如SEQID NO：2所示；所述伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。
在一个具体实施方式中，所述同源重组整合载体以载体pE194为出发载体，与所述融合片段及野生型短短芽孢杆菌中的ede操纵子中天然启动子区的上、下游同源序列片段构建得到同源重组整合载体。
在一优选实施方式中，所述ede操纵子中天然启动子区的上游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；ede操纵子中天然启动子区的下游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
更进一步地，还包括对利用同源重组技术处理后的短短芽孢杆菌进行鉴定，所述鉴定的过程包括以抗性基因ApraR的引物为探针对其进行PCR检测，以确保原始启动子Pede为Pgrac、Pspc、Pshuttle-09和P43所替换。
本发明还提供所述的伊短菌素高产工程菌在制备伊短菌素中的应用，优选地，将所述伊短菌素高产工程菌发酵，获得发酵液上清液，从中纯化伊短菌素；更优选地，是将伊短菌素高产工程菌活化后，接种于NB液体培养基中进行发酵，再将所述发酵得到的发酵液上清液进行阳离子交换树脂吸附、氨水洗脱后，经旋转蒸发后，再进行高效液相色谱分离后得到所述伊短菌素。
此外，本发明还提供一种菌剂，其含有所述的伊短菌素高产工程菌，其可用于抑菌，例如用于枯草芽孢杆菌的抑菌等。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：本发明通过构建同源重组整合载体，将野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede强启动子Pgrac、Pspc、Pshuttle-09和P43分别替换，成功构建了能够高产伊短菌素的短短芽孢杆菌工程菌；本发明构建的四种短短芽孢杆菌工程菌X23(Pede::Pgrac)、X23(Pede::Pspc)、X23(Pede::Psshuttle-09)和X23(Pede::P43)。发酵后伊短菌素的产量与原始菌株野生型短短芽孢杆菌X23相比分别提高了8.02倍、7.24、4.37和3.59；可见均有所提升，但用不同的启动子替换后获得的工程菌，其结果并不完全相同，以强启动子Pgrac进行替换的效果尤其显著，为实现伊短菌素在微生物源农药和医药中的开发与利用奠定了坚实的基础。
附图说明
图1是本发明中同源重组整合载体的构建流程图。利用Red/ET重组技术构建温度敏感的敲入载体。LLHR是线线重组的缩写。
图2是本发明中启动子Pgrac、Pspc、Pshuttle-09和P43分别与ApraR的PCR扩增及重叠延伸PCR图谱。其中A1：ApraR-Pgrac融合片段PCR图、A2：抗性片段Apra片段PCR图；A3、强启动子Pgrac片段PCR图；B4：ApraR-Pshuttle-09融合片段PCR图、B5：抗性片段Apra片段PCR图、B6：强启动子Pshuttle-09片段PCR图；C7：ApraR-Pgrac融合片段PCR图、C8：抗性片段Apra片段PCR图、C9：强启动子Pgrac片段PCR图；D10：ApraR-Pspc融合片段PCR图、D11：抗性片段Apra片段PCR图、D12：强启动子Pspc片段PCR图。
图3是本发明中同源重组整合载体的酶切鉴定图。其中1-3：pE194-edePC-ApraR-Pgrac酶切鉴定电泳图；4-6：pE194-edePC-ApraR-Pshuttle-09酶切鉴定电泳图；7-9：pE194-edePC-ApraR-Pspc酶切鉴定电泳图；10-11：pE194-edePC-ApraR-P43酶切鉴定电泳图。
图4是本发明中同源重组整合载体同源臂部分测序图谱。A：pE194-edePC-ApraR-Pgrac同源臂测序部分鉴定图；B：pE194-edePC-ApraR-Pshuttle-09同源臂测序部分鉴定图；C：pE194-edePC-ApraR-Pspc同源臂测序部分鉴定图；D：pE194-edePC-ApraR-P43同源臂测序部分鉴定图。
图5是本发明中融合片段整合到短短芽孢杆菌染色体上稳定遗传的示意图。
利用Red/ET重组技术构建了温度敏感的敲入载体。载体上的同源臂与短杆菌X23基因组上的同源序列发生交叉交换。获得了启动子工程菌株。Pede是Ede操纵子的启动子。Pcandidate表示待插入的4个强启动子。X23(Pede：：Pcandidate)是短链芽孢杆菌X23的启动子工程菌株。
图6是本发明获得的短短芽孢杆菌工程菌的菌落PCR双引物鉴定图，其中，A为双引物对鉴定示意图；B为PCR鉴定图：B1：工程菌X23(Pede::Pgrac)双引物鉴定；B2：工程菌X23(Pede::Pspc)双引物鉴定；B3：工程菌X23(Pede::Psshuttle-09)双引物鉴定；B4：工程菌X23(Pede::P43)双引物鉴定；
图7是本发明获得的短短芽孢杆菌工程菌发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制图。其中：A为平板对峙图：a(1-2)：X23野生型发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制效果、a(3-4)：23::Pgrac发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制效果、a(CK)：ddH2O；b(1-4)：X23(Pede::Pshuttle-09)酵液对枯草芽孢杆菌的抑制能力、b(CK)：X23野生型发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制能力；c(1-4)：X23(Pede::Pspc)酵液对枯草芽孢杆菌的抑制能力、c(CK)：X23野生型发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制能力；d(1-4)：X23(Pede::P43)酵液对枯草芽孢杆菌的抑制能力、d(CK)：X23野生型发酵液对枯草芽孢杆菌的抑制能力。B为抑菌半径数据统计图，小写字母表示显著性分析。
图8短短芽孢杆菌工程菌和原始菌株短短芽孢杆菌X23的生长曲线。
图9是本发明获得的短短芽孢杆菌工程菌与野生型短短芽孢杆菌X23生成的伊短菌素HPLC检测图。其中：A：比较了野生型X23和启动子工程菌株的伊短菌素产量。HPLC-MS分析表明，伊短菌素A和伊短菌素B的保留时间分别为1.2min和1.5min(箭头表示)；B：伊短菌素A和伊短菌素B质谱图谱，伊短菌素A和伊短菌素B分子离子[M+H]+分别为755.4413和797.4635；C：野生型X23和启动子工程菌株的伊短菌素A和B的产量变化。数据以三个独立实验的平均值表示。误差条表示标准偏差(SD)。百分数表示提高倍数。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
实施例中用到的生物材料来源如下：野生型短短芽孢杆菌X23：由湖南农业大学植物保护学院提供；载体pE194，即pBR322-ErmB-194ori由湖南省微生物研究院保存；强启动子序列参考参考GeneBank登录号和相关文献；携带强启动子质粒：011-tyrocidine-edePC-Pgrac、011-tyrocidine-edePC-Pshuttle、011-tyrocidine-edePC-Pspc和011-tyrocidine-edePC-P43由湖南省微生物研究院保存（含有的启动子是已知的）。
抗性基因ApraR：含有阿伯拉霉素抗性基因ApraR的质粒pSET152由湖南省微生物研究院保存。
限制性内切酶Bam HI/Hind III/Kpn I购自NEB公司。
实施例1
利用野生型短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)X23作为原始菌株，将4个强启动子，通过构建同源重组整合载体，将融合片段整合到短短芽孢杆菌X23基因组中，实现伊短菌素的高效表达。
(1)PCR扩增融合基因启动子Pgrac。
根据011-tyrocidine-edePC-Pgrac质粒序列，设计引物Pgrac-ede-1和Pgrac-ede-2，序列如下所示：
Pgrac-ede-1：CGCTCGCCAGTCGATTGGCTGAGGTACGTACGATCTTTCAGC
Pgrac-ede-2：ATTGCTTCTTATCCTGATGCATGGATCCTTCCTCCTTTAATTGG
根据011-tyrocidine-edePC-Pshuttle-09质粒序列，设计引物Pshuttle-09-ede-1和Pshuttle-09-ede-2，序列如下所示：
Pshuttle-09-ede-1：cgctcgccagtcgattggctgagatcgtcacaatgcgccatcaaac
Pshuttle-09-ede-2：attgcttcttatcctgatgcatgtttcctctctcccctctaatcg
根据011-tyrocidine-edePC-Pspc质粒序列，设计引物Pspc-ede-1和Pspc-ede-2，序列如下所示：
Pspc-ede-1: CGCTCGCCAGTCGATTGGCTGATACACAGCCCAGTCCAGACTA
Pspc-ede-2: attgcttcttatcctgatgcatAcctgcttcctccttaag
根据011-tyrocidine-edePC-P43质粒序列，设计引物P43-ede-1和P43-ede-2，序列如下所示：
P43-ede-1: cgctcgccagtcgattggctgagatcctgataggtggtatgtt
P43-ede-2: attgcttcttatcctgatgcatgtgtacattcctctcttac
分别扩增强启动子Pgrac、Pspc、Pshuttle-09和P43，其PCR图谱见图1中C所示，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s；35个循环；72℃延伸10min。
(2)PCR扩增筛选标记ApraR(Apramycin抗性)
以质粒PBR322-ErmB-194ori-ApraR为模板，用ApraR1(edePC)分别与ApraR2(edePgrac)、ApraR2(edePshuttle-09)、ApraR2(edePspc)和ApraR2(edeP43)为引物，扩增1kp左右的筛选标记抗性基因ApraR，其PCR图谱见图1中B所示；反应条件为
94℃预变性5min；94℃变性39s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
引物序列如下：
ApraR1(edePC): TGACACTATAGAAGAGTCATCGGATCTGCAATTTGAATAATAACC
ApraR2(edePgrac): GCTGAAAGATCGTACGTACCTCAGCCAATCGACTGGCGAGCG
ApraR2(edePshuttle-09)： gtttgatggcgcattgtgacgatctcagccaatcgactggcgagcg
ApraR2(edePspc)：TAGTCTGGACTGGGCTGTGTATCAGCCAATCGACTGGCGAGCG
ApraR2(edeP43)： aacataccacctatcaggatctcagccaatcgactggcgagcg
(3)重叠延伸PCR将抗性基因ApraR分别与强启动子Pgrac、Pspc、Pshuttle-09和P43拼接：
用PCR回收试剂盒回收两次PCR的产物，并以相应两种回收产物为模板，以Pgrac-ede-1/ApraR2(edePgrac)、Pspc-ede-1/ApraR2(edePspc)、P43-ede-1/ApraR2(edeP43)和Pshuttle-09-ede-1/ApraR2(edeP shuttle-09)为引物，
采用重叠延伸拼接的方法扩增相应融合片段(ApraR-Pgrac、ApraR-Pspc、ApraR-Pshuttle-09和ApraR-P43)，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min，得到ApraR-Pgrac融合片段，其PCR图谱见图1中A所示。
(4)PCR扩增Ede簇操纵子中天然启动子区的上下游两端同源臂：
以短短芽孢杆菌X23菌株总DNA为模板，设计引物edePC-F1和edePC-F2扩增1kb左右上游同源臂；edePC-R2分别与Pgrac-ede-R1、Pshuttle-09-ede-R1、Pspc-ede-R1和P43-ede-R1扩增1kb左右下游同源臂，引物序列如下所示：
edePC-F1: CGAAAAACAAGTTAAGGGATGCAGTTTATGCATCCCTTAACGGATCCGGA
GATAGTGAAGTGGCTAAAC；
edePC-F2: GGTTATTATTCAAATTGCAGATCCGATGACTCTTCTATAGTGTCA；
edePC-R2: ATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGT
TCCAATTCTT GAGCCAGCAA；
Pgrac-ede-R1: CCAATTAAAGGAGGAAGGATCCATGCATCAGGATAAGAAGCAAT；
Pshuttle-09-ede-R1：attagaggggagagaggaaacatgcatcaggataagaagcaat；
Pspc-ede-R1： cttaaggaggaagcaggTatgcatcaggataagaagcaat；
P43-ede-R1： gtaagagaggaatgtacacatgcatcaggataagaagcaat；
反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸10min，用PCR回收试剂盒回收，得到上游同源序列片段HAF和下游同源序列片段HAR。
(5)同源重组整合载体的构建:
如图2所示，将HAF、ApraR-Pgrac\ApraR-Pspc\ApraR-Pshuttle-09\ApraR-P43、HAR-Pgrac\HAR-Pshuttle-09\HAR-Pspc\HAR-P43和出发载体PBR322-ErmB-194ori(pE194)片段适量混合，加入适量DNA polymerase和缓冲液，通过程序：30℃、20min，75℃、20min，50℃、30min进行体外连接，然后连接产物进行过膜去除盐离子，再将产物通过电击转入E.coliGB05-dir细胞，ApraR抗性筛选阳性转化子，转化子经限制性内切酶BamHI/Hind III/Kpn I酶切鉴定正确，酶切鉴定图见图3，再进行测序进一步鉴定，得到同源重组整合载体pE194edePC-ApraR-Pgrac，pE194-edePC-ApraR-Pshuttle-09、pE194-edePC-ApraR-Pspc和pE194-edePC-ApraR-P43；其同源臂部分测序图谱见图4。
(6)基因重组短短芽孢杆菌工程菌的构建:
制备短短芽孢杆菌感受态细胞：从-80℃冰箱中取适量野生型短短芽孢杆菌X23甘油菌液，划线于LB平板，30℃培养24h；挑取单菌落接种于1mL的LB培养基中，放置于恒温振荡器上，30℃，900rpm，培养过夜；取40 μL过夜培养菌液，转接到1.3mL新鲜LB液体培养基中，900rpm，培养4h，OD600约2.0；将培养液在4℃，9000rpm，离心1分钟，去上清，获得感受态细胞。
将步骤(5)中正确构建的同源重组整合载体，参考Brevibacillus ExpressionSystemII&#x2d(宝生物工程：短短芽孢杆菌表达系统II宝生物工程)的方法转入野生型短短芽孢杆菌X23中，
融合片段整合到短短芽孢杆菌染色体上稳定遗传的示意图见图5，将转化子在含有ApraR(10ug/mL)的固体LB上筛选，30℃倒置培，有对应条带的为阳性转化子，如图6所示，表明同源重组整合载体养48h；挑取转化子做菌液PCR，采用ApraR抗性基因的引物(ApraR-F和ApraR-R)作为探针检测同源重组质粒已经成功转入短短芽孢杆菌X23中引物，ApraR-F和ApraR-R的序列如下所示：
ApraR-F：tgcaatacgaatggcgaaaagc
ApraR-R：tcagccaatcgactggcgagcg
将正确的转化子，接种于37℃、不含抗生素的LB培养基中培养14h，以丢失温敏型替换载体，然后在LB平板上划线，长出单菌落后，挑取单菌落分别划线到阿伯拉霉素(Apra)平板和红霉素(Erm)平板上划线，筛选只能在阿伯拉霉素抗性上生长、不能在红霉素平板上生长的转化子，即有可能是正确的启动子替换的转化子；将筛选得到的转化子于1mL含Apra的LB培养基中进行两对引物(ApraR-F和ApraR-R)的菌液PCR检测，结果都能检测出理论大小的条带。PCR检测结果如图6，说明短短芽孢杆菌X23中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede成功被强启动子Pgrac、Pspc、Pshuttle-09和P43分别替换，得到短短芽孢杆菌工程菌X23(Pede::Pgrac)、X23(Pede::Pspc)、X23(Pede::Psshuttle-09)和X23(Pede::P43)。
测试例1：
抑菌试验：将各短短芽孢杆菌工程菌和原始菌株短短芽孢杆菌X23在LB液体培养基中发酵2d的发酵液高速离心，上清液经过孔径为0.22μm的细菌过滤器进行过滤获得发酵滤液，将滤纸片均匀放于添加了枯草芽孢杆菌的LB平板上，分别将10μL的各短短芽孢杆菌工程菌和原始菌株短短芽孢杆菌X23的发酵滤液加入滤纸片上，37℃过夜培养，平板对峙结果如图7A，抑菌圈半径如图7B，其中具体数据见表1。本发明得到的短短芽孢杆菌工程菌对枯草芽孢杆菌的抑制效果明显优于短短芽孢杆菌X23。
表1
测试例2：
将各短短芽孢杆菌工程菌和原始菌株短短芽孢杆菌X23在LB平板划线，然后将每个菌株的单个菌落在1.0mL液体LB培养基中以30℃培养过夜，再转移到50mL新鲜液体发酵培养基(NB)中，达到初始的密度(OD600)0.1，用T6分光光度计每隔12h测定一次，连续48h，重复发酵实验3次，每次平行测定3次。生长曲线结果如图8。在培养12h(指数期)和24h(稳定期)时，启动子工程菌株与X23-WT菌株的细胞密度没有显著差异。然而，4个启动子工程菌株在36和48h(衰退期)的细胞密度(OD600值)比X23-WT低7.5%~15.3%，表明启动子替换对X23的生长和生物量都有影响。结果还表明，抑菌活性的提高不是由于生物量的增加。
测试例3：
将各短短芽孢杆菌工程菌和原始菌株短短芽孢杆菌X23在LB液体培养基中发酵2d后，上清液9000g离心10min，4℃(5910R，Eppendorf)离心10min，419与5mL Workbe100S(Bioworks)混合搅拌2h。色谱柱用200mL蒸馏水洗涤，然后用15mL氢氧化铵(0.1M)洗脱。将洗脱液混合冷冻干燥，再溶于1mL蒸馏水中，得到粗提物。采用ODS425柱(AgilentXBD-C18，2.1×10 0 mm，5μm)，梯度洗脱。紫外光谱在二极管阵列检测器(DAD)上检测到，波长范围为200~600 427 nm。高效液相色谱参数为：溶剂A，含0.1%三氟乙酸的水，溶剂B，428甲醇，梯度流速1mL/min，42910~18min，10%B，18~20min，42910%~95%B，20~22min，95%B，22~25min，10%B，检测波长278 nm。使用配有定性分析软件的四极飞行时间质谱仪(UPLC-QTOF；Agilent6545)进行HPLC-MS分析。质心模式为200~1500 m/z，正433电离模式，MS2+自动裂解。用HPLC和HPLC-MS-MS测定纯度。用Bruker Avance 600型核磁共振波谱仪在600 MHz、437(1H)和150 MHz(13C)下进行检测。检测图谱见图9A-B。通过数据分析可知，处理结果见图9C，本发明得到的短短芽孢杆菌工程菌X23(Pede::Pgrac)、X23(Pede::Pspc)、X23(Pede::Psshuttle-09)和X23(Pede::P43)与短短芽孢杆菌X23相比，伊短菌素A的产量分别提高了约8.02倍、7.24、4.37和3.59。因此，本发明的工程菌，尤其是短短芽孢杆菌工程菌X23(Pede::Pgrac)、X23(Pede::Pspc)能够实现短短芽孢杆菌发酵高效生产伊短菌素，使得短短芽孢杆菌的抗菌肽产量更高。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
<110> 湖南农业大学；湖南省微生物研究院
<120>伊短菌素高产工程菌株及其应用
<160> 27
<170> Patent-In 3.3
<210> 1
<211> 219
<212> DNA
<213>启动子Pshuttle-09核苷酸序列
<400> 1
gatcgtcacaatgcgccatcaaaccgttgacaagcgtccccgtcagatggccgggagccggatgaaccaccattccgcgcggcttgttgacgacaagaacgtcctgatcttattataatataagcaaaaaactcataaaaaggaaaagcattgacctgaaaacttatcggtaaagtatgatataatacaaaaagaccgattagaggggagagaggaaac
<210>2
<211> 219
<212> DNA
<213>抗性基因ApraR的核苷酸序列
<400> 2
gatctgcaatttgaataataaccactcctttgtttatccaccgaactaagttggtgttttttgaagcttgaattagatatttaaaagtatcatatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattgaaataaacatttattttgtatatgatgagataaagttagtttattggataaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaaggaggcatatcaaatgcaatacgaatggcgaaaagccgagctcatcggtcagcttctcaaccttggggttacccccggcggtgtgctgctggtccacagctccttccgtagcgtccggcccctcgaagatgggccacttggactgatcgaggccctgcgtgctgcgctgggtccgggagggacgctcgtcatgccctcgtggtcaggtctggacgacgagccgttcgatcctgccacgtcgcccgttacaccggaccttggagttgtctctgacacattctggcgcctgccaaatgtaaagcgcagcgcccatccatttgcctttgcggcagcggggccacaggcagagcagatcatctctgatccattgcccctgccacctcactcgcctgcaagcccggtcgcccgtgtccatgaactcgatgggcaggtacttctcctcggcgtgggacacgatgccaacacgacgctgcatcttgccgagttgatggcaaaggttccctatggggtgccgagacactgcaccattcttcaggatggcaagttggtacgcgtcgattatctcgagaatgaccactgctgtgagcgctttgccttggcggacaggtggctcaaggagaagagccttcagaaggaaggtccagtcggtcatgcctttgctcggttgatccgctcccgcgacattgtggcgacagccctgggtcaactgggccgagatccgttgatcttcctgcatccgccagaggcgggatgcgaagaatgcgatgccgctcgccagtcgattggctga
<210>3
<211> 303
<212> DNA
<213>启动子Pede的核苷酸序列
<400> 3
ctaatcacattcatccttccagggggtgtttttgccaatatattacattttatcctacgtgaaaagacagccaaaatcaatagcgtgcacaaaattttttccattctatgcagcgctagaaaatggaaaaaagagatggaattcatctaattttcagaaataacatttaatggaaaattcatttgacactatagaagagtcatcgatatagttgggatggaagtatttgtaatcaattagattttttgccatatccgaattgtgattacatctgcacaattccgaaaggggggaaatgcattg
<210>4
<211> 1011
<212> DNA
<213>启动子Pede上游同源序列片段核苷酸序列
<400> 4
ggagatagtgaagtggctaaacacggcagactgtaaatctgctccctccgggttcggcggttcgaatccgtctctccccaccattgattttctattgatgatgtgctattttttcatagtttcacatgccggtgtggcggaatggcagacgcgcgcgactcaaaatcgtgagggaaaccgtgggggttcaagtcccttcaccggcaccatattaaaaacgaatgcacactaaccatgatgtttacagacacatggaaggtgtgcttttttcatatacggaaaacaattcaaacagcggcgagtctaagacttgatttttaggtcttaggtcgccgctgtttcattttcggggaacgaaaatagctagcttaaaagttcaattctgcaatcgtctcgccaaacagaaccatgccatttttttgaaatccgagtgaagcgtaaaggttttctgctgcgatattggctggagcataaccaatgacaattttttgacaatcgtcttttgctttcagtatatcaatgacttgcgaaatcgcagcacgtccgtagccttggcgttgatagttggcatcaactaagagtctgtaaatccagtagtttccatcgtcggggtcaagcccatacatgacaaagccaaccatcgtgtcctcatggtatatggccaaagggacaaatgtagtttgaaactttgcttcggctatggagtagaggttcggggcaacaaactcactctgttcaggagtaggttccagttcaatacactcttcccagttttccagggttacttcacgaagtgtcacagacatctaatcacattcatccttccagggggtgtttttgccaatatattacattttatcctacgtgaaaagacagccaaaatcaatagcgtgcacaaaattttttccattctatgcagcgctagaaaatggaaaaaagagatggaattcatctaattttcagaaataacatttaatggaaaattcatttgacactatagaagagtcatcg
<210>5
<211> 1008
<212> DNA
<213>启动子Pede下游同源序列片段核苷酸序列
<400> 5
catcaggataagaagcaatggaatggcggatatcctttaagtcatccacaaaagcgtatctggtatacggaaaaattacatccacagcttcctgtccatacgttaggggggatggtgcgggttcaaggaaaagtgaaactggatgtacttgaagcggccattcacctgttcattcaaaagaacgatgctttgcgactcaactatcaagaagaagagacagtccttcagtttgttggggagtatgaaccgcagccattgcaggtatttgatttcagacaagaaccgaatgcccctgatcggtgcagacaattcctgcaagctttgtttgcaaaaccattttcgatcggacaggagcctctattctacttttgtctgattcaactgagtgacgaagaagcgggatattttgtaaagtttcatcatttgattgctgatggttggtccatctccgttatgacagaacaaattgctcactattatgacacgttgttagcaggcggtaccgttcatgtaggagatgaacacgcgtatcaagcttttgtcgacagggagcatgcctattctcagtctgagagatttgaaaaggacaagagatattggcgggacaagtttcagagcttgcctgtgatcacgacattagcaaaggcaacagatacgaccgagggcaagcgcaaagtctatgcattcaaccgtgaagattcgacaagaatacgccaatttgcagaccagatgaaatgctcgctaaattccttgtttgtggctctcgtcagtctttaccttcagcgttgtacgaggcaagaagagatcgtgattggtacgccgctgttaaatcgttcaggcaaagtggagcgcaaaatattcgggatgttcaccagcactatgccatttcgtctggcagttccgatggaaatggatgccttcgattatgttaaacatgtcaacagggaattgacttcctgtttttttcatcagaaatatccgtacgatttgctggctcaagaattggaa
<210>6
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列ApraR-F
<400> 6
TGCAATACGAATGGCGAAAAGC
<210>7
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列ApraR-R
<400>7
TCAGCCAATCGACTGGCGAGCG
<210>8
<211>42
<212> DNA
<213>人工序列Pgrac-ede-1
<400>8
CGCTCGCCAGTCGATTGGCTGAGGTACGTACGATCTTTCAGC
<210>9
<211>44
<212> DNA
<213>人工序列Pgrac-ede-2
<400>9
ATTGCTTCTTATCCTGATGCATGGATCCTTCCTCCTTTAATTGG
<210>10
<211>46
<212> DNA
<213>人工序列Pshuttle-09-ede-1
<400>10
CGCTCGCCAGTCGATTGGCTGAGATCGTCACAATGCGCCATCAAAC
<210>11
<211>45
<212> DNA
<213>人工序列Pshuttle-09-ede-2
<400>11
ATTGCTTCTTATCCTGATGCATGTTTCCTCTCTCCCCTCTAATCG
<210>12
<211>43
<212> DNA
<213>人工序列Pspc-ede-1
<400>12
CGCTCGCCAGTCGATTGGCTGATACACAGCCCAGTCCAGACTA
<210>13
<211>40
<212> DNA
<213>人工序列Pspc-ede-2
<400>13
ATTGCTTCTTATCCTGATGCATACCTGCTTCCTCCTTAAG
<210>14
<211>43
<212> DNA
<213>人工序列P43-ede-1
<400>14
CGCTCGCCAGTCGATTGGCTGAGATCCTGATAGGTGGTATGTT
<210>15
<211>41
<212> DNA
<213>人工序列P43-ede-2
<400>15
ATTGCTTCTTATCCTGATGCATGTGTACATTCCTCTCTTAC
<210>16
<211>45
<212> DNA
<213>人工序列ApraR1(edePC)
<400>16
TGACACTATAGAAGAGTCATCGGATCTGCAATTTGAATAATAACC
<210>17
<211>42
<212> DNA
<213>人工序列ApraR2(edePgrac)
<400>17
GCTGAAAGATCGTACGTACCTCAGCCAATCGACTGGCGAGCG
<210>18
<211>46
<212> DNA
<213>人工序列ApraR2(edePshuttle-09)
<400>18
GTTTGATGGCGCATTGTGACGATCTCAGCCAATCGACTGGCGAGCG
<210>19
<211>43
<212> DNA
<213>人工序列ApraR2(edePspc)
<400>19
TAGTCTGGACTGGGCTGTGTATCAGCCAATCGACTGGCGAGCG
<210>20
<211>43
<212> DNA
<213>人工序列ApraR2(edeP43)
<400>20
AACATACCACCTATCAGGATCTCAGCCAATCGACTGGCGAGCG
<210>21
<211>69
<212> DNA
<213>人工序列edePC-F1
<400>21
CGAAAAACAAGTTAAGGGATGCAGTTTATGCATCCCTTAACGGATCCGGA
GATAGTGAAGTGGCTAAAC
<210>22
<211>45
<212> DNA
<213>人工序列edePC-F2
<400>22
GGTTATTATTCAAATTGCAGATCCGATGACTCTTCTATAGTGTCA
<210>23
<211>69
<212> DNA
<213>人工序列edePC-R2
<400>23
ATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGTTCCAATTCTTGAGCCAGCAA
<210>24
<211>45
<212> DNA
<213>人工序列Pgrac-ede-R1
<400>24
CCAATTAAAGGAGGAAGGATCCATGCATCAGGATAAGAAGCAAT
<210>25
<211>43
<212> DNA
<213>人工序列Pshuttle-09-ede-R1
<400>25
ATTAGAGGGGAGAGAGGAAACATGCATCAGGATAAGAAGCAAT
<210>26
<211>41
<212> DNA
<213>人工序列Pspc-ede-R1
<400>26
CTTAAGGAGGAAGCAGGTATGCATCAGGATAAGAAGCAAT
<210>27
<211>41
<212> DNA
<213>人工序列P43-ede-R1
<400>27
GTAAGAGAGGAATGTACACATGCATCAGGATAAGAAGCAAT

Claims (11)

1.伊短菌素高产工程菌，其特征在于，其是利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为Pgrac而得到的；所述启动子Pgrac的核苷酸序列GeneBank登录号为MH328010.1。
2.根据权利要求1所述的伊短菌素高产工程菌的制备方法，其特征在于，将启动子Pgrac与抗性基因连接获得的融合片段，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为Pgrac得到相应的短短芽孢杆菌工程菌。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述抗性基因是ApraR。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述抗性基因ApraR的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede的核苷酸序列如SEQID NO：3所示。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述同源重组整合载体以载体pE194为出发载体，与所述融合片段及野生型短短芽孢杆菌中的ede操纵子中天然启动子区的上、下游同源序列片段构建得到同源重组整合载体。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述ede操纵子中天然启动子区的上游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；ede操纵子中天然启动子区的下游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
7.根据权利要求2至6任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括对利用同源重组技术处理后的短短芽孢杆菌进行鉴定，所述鉴定的过程包括以抗性基因ApraR的引物为探针对其进行PCR检测，以确保原始启动子Pede为Pgrac所替换。
8.权利要求1所述的伊短菌素高产工程菌在制备伊短菌素中的应用。
9.权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述伊短菌素高产工程菌发酵，获得发酵液上清液，从中纯化伊短菌素。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于，将伊短菌素高产工程菌活化后，接种于LB液体培养基中进行发酵，再将所述发酵得到的发酵液上清液进行阳离子交换树脂吸附、氨水洗脱后，经旋转蒸发后，再进行高效液相色谱分离后得到所述伊短菌素。
11.一种菌剂，其特征在于，含有如权利要求1所述的伊短菌素高产工程菌。
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