CN103993021B - 一种十字花科黑腐病菌的iii型效应物基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种十字花科黑腐病菌的III型效应物基因及其应用。本发明提供的十字花科黑腐病菌的III型效应物基因具有下述核苷酸序列之一：(1)SEQIDNO:1所示的DNA序列；(2)与序列表中SEQIDNO:1所限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。本发明提供的十字花科黑腐病菌III型效应物基因的应用于植物病害的防治。本发明提供了一种新的十字花科黑腐病菌致病相关基因，提供了可能的防治植物病害的药物靶标；其致病试验表明，XC2210基因的Tn5gusA5插入突变体的致病性显著降低。
Description
技术领域
本发明涉及植物病原细菌的致病相关基因，尤其涉及的是一种十字花科黑腐病菌的III型效应物基因及其应用。
背景技术
III型分泌系统(T3SS)是存在于多种动、植物病原菌中可向寄主细胞内分泌致病效应物的蛋白分泌系统，在病原菌致病过程中起决定性作用。T3SS通常由成簇存在的hrp基因簇编码，在染色体上形成所谓的“毒岛”或“致病性岛”。在十字花科黑腐病菌中，位于hrp基因簇旁侧的hrpG和hrpX是最关键的调控基因，HrpG调控hrpX，HrpX调控包括hrp基因簇调控单元在内的大多数HrpG调控元基因的表达，大部分HrpX调控元基因的启动子区都存在PIP-box(植物诱导启动子盒)。根据“基因对基因”理论，寄主关系的建立取决于病原体与植物的亲和识别，而效应物蛋白对寄主的识别属于寄主胞内识别，不同类型的效应物有不同的寄主胞内靶点，效应物与寄主胞内靶点相互识别及作用的结果决定了细菌的致病性和寄主专一性。
植物病害一直是农作物减产、品质降低的主要因子之一。十字花科黑腐病菌是一种革兰氏阴性细菌，能在全球范围内引起十字花科植物黑腐病，导致农产品的产量和品质严重下降。目前，还没有很有效的生物农药对该病有有效的防治作用，而随着病原菌对药物抗性的增强，农药用量在不断增加，这不仅加剧了环境污染、药物残留，也大大提高了农业成本，因此，亟待研发新的防病治病策略和新型的无公害药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在防治十字花科植物黑腐病中存在的不足，提供了一种十字花科黑腐病菌的III型效应物基因及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种十字花科黑腐病菌的III型效应物基因，具有下述核苷酸序列之一：
(1)SEQIDNO:1所示的DNA序列；
(2)与SEQIDNO:1所限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
所述的III型效应物基因，其自5’端的第501-4667位核苷酸为开放阅读框。
所述的十字花科黑腐病菌的III型效应物基因在植物病害防治中的应用。
所述的十字花科黑腐病菌的III型效应物基因的序列已在国立生物技术信息中心(NCBI)公布，基因组序列号NC_007086，该基因编码蛋白序列号YP_243285。携带该基因的质粒pET2210已在广西大学生命科学与技术学院保存。
SEQIDNO:1所示的DNA是十字花科黑腐病菌8004菌株的DNA，由4667个碱基组成。含完整的III型分泌效应物基因，自5’端的第501-4667位核苷酸为该基因的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)，自5’端的第501-503位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5’端的第4665-4667位核苷酸为终止密码子TAG。
序列表中SEQIDNO:2所示的蛋白质是十字花科黑腐病菌的III型效应物基因XC2210的编码产物，由1388个氨基酸组成。
本发明提供了一种新的十字花科黑腐病菌致病相关基因，提供了可能的防治植物病害的药物靶标。其致病试验表明，XC2210基因的Tn5gusA5插入突变体的致病性显著降低。
附图说明
图1为XC2210基因启动子区和分泌转运区及XC2210基因克隆酶切电泳凝胶图；图中，M：100bp标准DNA；1：XC2210基因启动子区和分泌转运区PCR扩增片段；2：XC2210启动子区和分泌转运区片段克隆pXC2210酶切电泳图谱。
图2为XC2210基因转运鉴定菌株的酶切电泳凝胶图；图中，M：λ/HindIII标准DNA(片段大小从大到小依次为23.1kb，9.4kb，6.6kb，4.36kb，2.4kb，2.0kb)；1-2：Xcc8004*/pJJA2210和8004*ΔhrcV/pJJA2210。
图3为XC2210基因插入突变体044A05的PCR验证凝胶图；图中，M1：100bp标准DNA；1-4：XC2210基因插入突变体044A05的4个单克隆；M2：λ/HindIII标准DNA(片段大小从大到小依次为23.1kb，9.4kb，6.6kb，4.36kb，2.4kb，2.0kb)。
图4为XC2210基因Tn5gusA5插入突变体的致病性试验；图中，8004为野生型Xcc菌株，044A05为XC2210基因的Tn5gusA5插入突变体。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichiacoli)株系JM109；克隆载体pUC19及柯斯质粒pLAFR3、pLAFRJ为本研究室保存；限制性内切酶、修饰酶等试剂购自Promega、Stratagene、QIAGEN公司。
实施例1XC2210基因启动子区以及分泌转运区的克隆及序列测定
根据XC2210的基因序列，设计引物P2210-F/P2210-R(ggggaattcccagcaacaaggccagcgtg/gggggtaccttggcgacgccgggagatcc)，以野油菜黄单胞菌总DNA为模板，用PCR法扩增该基因启动子区以及分泌转运区序列(20μL扩增体系：10×Buffer2μL，ExTaqDNA聚合酶0.5μL，2.5mmol/LdNTPmixture2μL，10μmol/LP2210-F1μL，10μmol/LP2210-R1μL，模板DNA2μL，ddH2O11.5μL；扩增条件：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，30cycles；72℃5min)，并将其克隆至克隆载体pUC19中，获得了含该基因启动子区以及分泌转运区序列的重组质粒pXC2210。该质粒用EcoRI和KpnI酶切，除了一个2.7kb的载体条带外，还有一个1.022kb的插入片段(见图1)。送华大公司测序，结果正确。
实施例2候选效应物转运鉴定菌株的构建
将XC2210基因的启动子区以及分泌转运区分别克隆到大肠杆菌和Xcc之间的穿梭质粒pJJA(该质粒是将cyaA基因中具有腺苷酸环化酶活性的区域克隆至pLAFR3衍生质粒pLAFRJ上)，酶切并测序验证后将pJJA重组质粒分别引入Xcc8004*和8004*ΔhrcV中，得到候选效应物转运鉴定菌株，酶切验证后(见图2)，通过检测菌株在甘蓝京丰1号的腺苷酸环化酶活性判断所克隆的基因是否为依赖III型分泌系统分泌的效应物基因，本发明涉及一个新的III型分泌效应物基因--XC2210基因。
实施例3腺苷酸环化酶活性检测
实验所用寄主植物为甘蓝京丰1号，所用的接种方法为压渗法。XC2210基因的效应物转运鉴定菌株和对照菌株在28℃下进行液体培养15-18h。用钝端塑料注射器吸取约10μL用10mmol/L磷酸钠缓冲液(5.8mmol/L的磷酸氢二钠和4.2mmol/L的磷酸二氢钠，pH7.0)悬浮生物细菌悬浮液(1×107CFU/mL)接种到甘蓝京丰1号叶的背面。将接种的植物置于温室中，保持12h光照周期和28℃的恒定温度，24h后收集1cm2的叶片，置液氮中研磨，等液氮挥发完后，加入323μL的1.1mol/LHClO4继续磨，等叶片彻底磨碎后，15000g离心10min，取上清280μL加入37.3μL6mol/LK2CO3，15000g离心10min。取上清200μL，用真空冷冻抽干机干燥，干燥后置-80℃保存。按照Amersham的cAMPBiotrakEnzymeimmunoassay(EIA)System试剂盒的使用说明书，检测待测菌株的腺苷酸环化酶活性。试验表明，XC2210基因的效应物转运鉴定菌株的腺苷酸环化酶活性明显高于对照(见表1)，表明XC2210是依赖III型分泌的效应物基因。
表1压渗24h后检测甘蓝cAMP水平的检测结果
实施例4甘蓝黑腐病黄单胞菌突变体库的构建
以大肠杆菌和Xcc之间的穿梭质粒pLAFR1为载体将Tn5gusA5引入Xcc8004野生型菌株，然后通过引入不相容质粒pPH1JI驱赶pLAFR1，通过抗生素(卡那霉素)抗性标记筛选Xcc::Tn5gusA5插入突变体，结合Xcc全基因组序列和TAIL-PCR(ThermalAsymetricInterlaced-PCR)技术，确定Tn5gusA5在基因组上的插入位置，并对插入位置进行PCR验证。通过考察突变体的致病性、胞外酶活性、胞外多糖合成等表型的变化，筛选致病相关基因，本发明涉及其中一个新的致病相关基因--XC2210基因，其插入突变体编号为044A05。
实施例5XC2210基因插入突变体044A05的验证
对插入突变体044A05进行TAIL-PCR测序定位，发现其插在XC2210基因内。用转座子Tn5上IS50R侧的一条引物sp1(ccgccgaagagaacacagattta)和下游基因XC2211的一条引物(tcgccagctccgttatgccg)配对进行PCR验证，产物预期大小4.442kb(见图3)。
实施例6XC2210基因Tn5gusA5插入突变体的致病性检测
实验所用寄主植物为满身红萝卜苗(种名为RaphanussativusL.var.radiculusPers.)，所用接种方法为剪叶法。XC2210基因Tn5gusA5插入突变体和野生型菌株在28℃下进行液体培养15-18h。用NYGB稀释到OD600＝0.2，用灭过菌的剪刀在菌液浸泡5s后，在健康叶片距叶尖1-2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5s，被接种的植物在25-30℃培养10d后观察结果，正对照选用野油菜黄单胞菌野生型8004菌株，负对照用清水。致病试验表明，XC2210基因的Tn5gusA5插入突变体的致病性显著降低(见图4)。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (1)
1.一种十字花科黑腐病菌III型效应物基因在满身红萝卜苗十字花科黑腐病害防治中的应用；所述十字花科黑腐病菌的III型效应物基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
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