CN115925552B - 一种伊短菌素衍生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于有机化学药物领域和植物保护领域，具体涉及一种伊短菌素衍生物作为杀菌剂的用途，具体涉及其在防治烟草青枯病中的应用。以其特征在于，以N‑叔丁氧羰基‑1,3‑丙二胺为底物，在甲基磺酰氯和吡啶的反应体系中反应得到所述亚精胺类似物；进一步通过前体饲喂以获得伊短菌素A的衍生物。其可作为青枯病菌防控提供绿色高效低毒的杀菌剂，能够解决现有青枯病化学杀菌剂存在的抗药性、环境污染等问题。本发明通过化学合成AEMED，再生物合成伊短菌素A的衍生物1，具有制备方便、成本较低等特点，且对烟草青枯病菌表现出较好的抑制作用，具有较大的应用价值。

Description

一种伊短菌素衍生物及其应用
技术领域
本发明属于有机化学药物领域和植物保护领域，具体涉及一种伊短菌素衍生物作为杀菌剂的用途，具体涉及其在防治烟草青枯病中的应用。
背景技术
烟草青枯病（Tobacco Bacterial Wilt）是由劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种传播快、易感染、危害大的细菌性土传病害，是全世界危害最严重的细菌性病害之一，在我国是烤烟生产过程中的常见病害。据皖南烟叶公司调查，2006年受害面积高达520 hm2，损失达293万元。路永恒统计了2004年至2007年云南省文山州烟草青枯病的危害情况，局部地区发病率高达80%以上，严重时可使整田烟草枯死，造成绝产、绝收。
目前，烟叶生产上用于防治烟草青枯病的化学药剂主要有噻菌铜、溴菌铜、石硫合剂、青枯灵以及灭菌净等。上述化学杀菌剂的长期使用，容易污染环境；而且化学农药的不合理使用容易导致青枯病菌产生耐药性，从而降低防治效果。因此，迫切需要开发新型高效低毒的农用杀菌剂。
伊短菌素A是短短芽孢杆菌X23产生的线性非核糖体抗菌肽，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌都具有较强的抑菌活性，但由于产量不高以及对模型动物（小鼠）具有较高的细胞毒性（脾细胞增殖有抑制作用），限制了其应用。伊短菌素A由四种非蛋白氨基酸残基(β-Tyr、Isoserine、DAPA和DAHAA)、一个甘氨酸和一个亚精胺组成。前期试验证明该化合物C端的聚胺是其活性所必需的。因此，通过化学合成亚精胺类似物，再通过前体饲喂获得抑菌活性提高的衍生物，是设计新型低毒、高效杀菌剂的有效方法。
发明内容
本发明的目的是针对化学合成亚精胺类似物（AEDAN），获得伊短菌素衍生物，并缓解现有青枯病化学杀菌剂存在的抗药性和环境污染等问题，为青枯病的防控提供绿色高效、低毒的杀菌剂。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种化学合成的方法获得亚精胺类似物AEDAN，如结构式I所示：
式I
因此，本发明提供一种化学合成的如式I所述亚精胺类似物的方法，
式I
其以N-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺为底物，在甲基磺酰氯和吡啶的反应体系中反应得到所述亚精胺类似物。
具体实施方式中，反应体系以无水二氯甲烷为溶剂。优选地，反应体系中N-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺和甲基磺酰氯的比例为1：1.0~1.1；具体的反应体系如权利要求1所述，反应时间4~8小时。
更优选地，还包括分离所述亚精胺类似物的步骤；具体的，将完成反应后的反应体系稀释于水和二氯甲烷中，分离有机相减压浓缩得到粗组分。
进一步优选地，所述粗组分与炔丙胺在乙醇中反应，回流，减压浓缩反应溶液以除去乙醇，将得到的组分通过快速柱色谱法纯化，用石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作为洗脱剂，得到粗产物。
更进一步地，将所述粗产物进一步用盐酸的甲醇溶液在室温下过夜反应，乙酸乙酯结晶获得所述亚精胺类似物的纯产物。
具体来说，本发明采用以下技术路线合成本发明的二苯醚酯类化合物：
在上述合成路线中，步骤I，在0℃条件下，向溶解N-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺(1.74g, 10.0mmol) 的无水二氯甲烷 (10mL) 溶液中加入甲基磺酰氯 (11.0mmol) 和催化量的吡啶，搅拌反应5小时。随后，反应液稀释于水 (10mL) 和二氯甲烷 (50mL) 中，分离有机相减压浓缩得到粗组分。
在上述合成路线中，步骤II，上一步所得组分与炔丙胺 (3当量) 在乙醇中反应，回流3小时，减压浓缩反应溶液以除去乙醇。将得到的组分通过快速柱色谱法纯化，用石油醚和乙酸乙酯 (V/V = 3:1) 的混合溶液作为洗脱剂，得到粗产物。
在上述合成路线中，步骤III，将粗产物进一步用7M盐酸的甲醇溶液在室温下过夜反应，乙酸乙酯结晶获得产物0.88g，总收率52.0%。总产物2（AEDAN）的NMR数据附录Figure1-3。
本发明还提供一种前体饲喂以获得伊短菌素A的衍生物的方法，其是在培养发酵菌株X23(ΔspeE)的培养基添加如式I所述亚精胺类似物以获得发酵液。任选地，进一步包括从发酵液分离的步骤；优选地，通过过滤除菌获得无菌发酵液，再采用阳离子交换树脂吸附，氨水洗脱后进行旋转蒸发，获得粗样品。
本发明进一步提供一种农用杀菌剂，其特征在于，由所述的方法制备得到。
本发明还提供一种伊短菌素A的衍生物在防止烟草青枯病中的应用，优选地，所述伊短菌素A的衍生物是由所述的方法制备得到的。
本发明具有以下优势：本发明的AEDAN前体化合物化学式简单，且制备方便，而且能够用于前体饲喂制备伊短菌素A的衍生物。本发明获得的伊短菌素A的衍生物对烟草青枯病菌致病力有较强的抑菌能力。
附图说明
图1 AEDAN化合物核磁波谱H谱分析。
图2 AEDAN化合物核磁波谱C谱分析。
图3 AEDAN化合物LC-MS分析。
图4 敲除载体酶切鉴定图。
图5 X23(ΔspeE)敲除流程示意图。
图6 转化子PCR双引物鉴定图。
图7 测序图。
图8 伊短菌素A衍生物的HPLC-MS检测。
图9 拮抗能力检测图与伊短菌素A及衍生物一级结构。
具体实施方式
在本文中所披露的范围和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
实施例1：化合物AEDAN的合成
步骤I：在0℃条件下，向溶解N-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺 (1.74g, 10.0mmol) 的无水二氯甲烷 (10mL) 溶液中加入甲基磺酰氯 (11.0mmol) 和催化量的吡啶，搅拌反应5小时。
步骤II：反应液稀释于水 (10mL) 和二氯甲烷 (50mL) 中，分离有机相减压浓缩得到粗组分。在上述合成路线中，上一步所得组分与炔丙胺 (3当量) 在乙醇中反应，回流3小时，减压浓缩反应溶液以除去乙醇。将得到的组分通过快速柱色谱法纯化，用石油醚和乙酸乙酯 (V/V = 3:1) 的混合溶液作为洗脱剂，得到粗产物。
步骤III：将粗产物进一步用7M盐酸的甲醇溶液在室温下过夜反应，乙酸乙酯结晶获得产物0.88g，总收率52.0%。
步骤IV：将化学合成的AEDAN配置成500 mM母液，过滤除菌备用。
取适当样品进行NMR检测，结果如图1所示的AEDAN化合物H谱分析；图2所示的AEDAN化合物C谱分析及图3所示的AEDAN化合物LC-MS分析。
实施例2：通过菌株的前体饲喂以获得伊短菌素A的衍生物
菌株X23(ΔspeE)的构建：
(1)PCR扩增筛选标记ApraR(Apramycin抗性)
以质粒PBR322-ErmB-194ori-ApraR为模板，用ApraR1与ApraR2为引物，扩增1kp左右的筛选标记抗性基因ApraR。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性39s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
引物序列如下：
ApraR1: taccgttcgtataatgtatgctatacgaagttattcagccaatcgactggcgagcg
ApraR2: taccgttcgtatagcatacattatacgaagttatgatctgcaatttgaataataacc
(2)PCR扩增目的基因speE的上下游两端同源臂：
以短短芽孢杆菌X23菌株总DNA为模板，设计引物speE-KO-F1和speE-KO-F2扩增1kb左右上游同源臂HAF；speE-KO-R1与speE-KO-R2扩增1kb左右下游同源臂HAR，引物序列如下所示：
speE-KO-F1: aggcacacgaaaaacaagttaagggatgcagtttatgcatcccttaacgagctggctcggttacattct；
speE-KO-F2: agtcgattggctgaataacttcgtatagcatacattatacgaacggtagtgtaccacaattccatgttc；
speE-KO-R1: tcaaattgcagatcataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtactgcctaactttgtggctgag；
speE-KO-R2: atgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcactattatgattgtactgac；
反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸10min，用PCR回收试剂盒回收，得到上游同源序列片段HAF和下游同源序列片段HAR。
(3)同源重组整合载体的构建:
将HAF、ApraR、HAR和出发载体PBR322-ErmB-194ori(pE194)片段适量混合，加入适量DNA polymerase和缓冲液，通过程序：30℃、20min，75℃、20min，50℃、30min进行体外连接，然后连接产物进行过膜去除盐离子，再将产物通过电击转入E.coli GB05-dir细胞，ApraR抗性筛选阳性转化子，转化子经限制性内切酶BamHI/Hind III/Kpn I酶切鉴定正确，酶切鉴定图见图4，再进行测序进一步鉴定，得到敲除载体pE194-speE-KO-ApraR。
(4)基因重组短短芽孢杆菌工程菌的构建:
制备短短芽孢杆菌感受态细胞：从-80℃冰箱中取适量野生型短短芽孢杆菌X23甘油菌液，划线于LB平板，30℃培养18h；挑取单菌落接种于1mL的LB培养基中，放置于恒温振荡器上，30℃，900rpm，培养过夜；取40 μL过夜培养菌液，转接到1.3mL新鲜LB液体培养基中，900rpm，培养4.5h，OD600约2.0；将培养液在4℃，9000rpm，离心1分钟，去上清，获得感受态细胞。
将步骤(3)中正确构建的同源重组整合载体，参考文献(Liu, Q.; Zhang, L.;Wang, Y.; Zhang, C.; Liu, T.; Duan, C.; Bian, X.; Guo, Z.; Long, Q.; Tang,Y.; Du, J.; Liu, A.; Dai, L.; Li, D.; Chen, W. (2022) Enhancement of edeineproduction in Brevibacillus brevis X23 via insitu promoter engineering.Microb Biotech.15, 577-589.)的方法转入野生型短短芽孢杆菌X23中，敲除示意图见图5，将转化子在含有ApraR(10ug/mL)的固体LB上筛选，30℃倒置培养2d。挑取转化子做菌液PCR，采用ApraR抗性基因的引物(ApraR-F和ApraR-R)作为探针检测同源重组质粒已经成功转入短短芽孢杆菌X23中引物，ApraR-F和ApraR-R的序列如下所示：
ApraR-F：tgcaatacgaatggcgaaaagc；
ApraR-R：tcagccaatcgactggcgagcg；
将正确的转化子，接种于37℃、不含抗生素的LB培养基中培养14h，以丢失温敏型替换载体，然后在LB平板上划线，长出单菌落后，挑取单菌落分别划线到阿伯拉霉素(Apra)平板和红霉素(Erm)平板上划线，筛选只能在阿伯拉霉素抗性上生长、不能在红霉素平板上生长的转化子，即有可能是正确敲除的转化子；将筛选得到的转化子于1mL含Apra的LB培养基中过夜培养，随后进行两对引物(P1/P2和P3\P4，引物序列如下)的菌液PCR检测，结果都能检测出理论大小的条带。PCR检测结果如图6，并将PCR产物进行测序鉴定，测序结果如图7，最终鉴定正确的转化子命名为X23(ΔspeE)。
P1：gactggatcaagggtcgtat；
P2：cgatgccaacacgacgctgc；
P3：tgcaggcgagtgaggtggca；
P4：cactattatgattgtactgac；
前体饲喂以获得伊短菌素A的衍生物:
LB平板活化发酵菌株X23(ΔspeE)，37℃培养1d。挑取单菌落于10 mL LB的三角瓶，30℃，180rpm震荡培养12 h，取适当AEDAN母液至三角瓶，使终浓度为2mM，继续培养36h。将10 mL发酵液转移至50 mL的离心管，12000 rpm，离心8 min，取上清液进行过滤除菌，获得无菌发酵液。取200 μL进行HPLC-MC检测，剩余的则-20℃保存备用。
将发酵液上清采用阳离子交换树脂吸附，氨水洗脱后进行旋转蒸发，获得粗样品；将粗样品溶解后粗样品直接进行HPLC检测，以野生型X23菌株为对照1，以X23(ΔspeE)菌株不添加AEDAN为对照2。结果如图8，添加AEDAN的X23(ΔspeE)菌株发酵液中检索到分子量为793.4534的目标化合物（即伊短菌素A衍生物1：AEDAN）。
实施例3：伊短菌素A的衍生物对烟草青枯病的抑制活性检测
以烟草青枯病病原细菌R. solanacearum GMI1000菌株作为活性测定的靶标菌。GMI1000含菌平板的制作：首先平板活化指示菌GMI1000，挑取单克隆于1 mL LB培养基中，置于恒温混匀仪上，30℃，900 rpm/min，培养14 h。然后取10 μL过夜菌液（108 cfu/mL）与冷却至45℃的200 mL NB 固体培养基混合，倒平板（定量：每个平板约17.5 mL），用直径8.0mm的无菌打孔器在平板上面打孔，得GMI1000含菌平板备用。然后，将实施例2中所得无菌发酵上清液（100 μL）加入孔中，以无菌LB培养基（100 μL）为空白对照（CK），30℃，培养18 h，测量抑菌圈直径。试验三次重复，抑菌强弱通过抑菌半径表示。结果如图9所示。通过抑菌半径表示。野生型X23的抑菌圈半径为7.6 mm；X23(ΔspeE)的抑菌圈为0mm，在添加AEMED后，产生抑菌圈，半径为6.2 mm，相比野生型仅降低了18.1%。抑菌活性的恢复，说明产生了相应目标伊短菌素A衍生物1即AEMED，且具有较好的抑菌活性。
综上所述，本发明通过化学合成AEMED，再生物合成伊短菌素A的衍生物1，制备方便、成本较低等特点，且对烟草青枯病表现出较好的抑制作用，具有进一步研究与开发的价值。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种前体饲喂以获得伊短菌素A的衍生物的方法，其特征在于，在培养发酵菌株X23(ΔspeE)的培养基添加如式I所述亚精胺类似物以获得发酵液；
所述菌株X23(ΔspeE)是短短芽孢杆菌X23菌株中敲除基因speE得到。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括从发酵液分离伊短菌素A的衍生物的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，从发酵液分离伊短菌素A的衍生物的步骤是通过过滤除菌获得无菌发酵液，再采用阳离子交换树脂吸附，氨水洗脱后进行旋转蒸发，获得粗样品。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述伊短菌素A的衍生物的结构式如下：
5.一种农用杀菌剂，其特征在于，由如权利要求4所述的方法制备得到。
6.一种伊短菌素A的衍生物在防止烟草青枯病中的应用，所述伊短菌素A的衍生物是由如权利要求4所述的方法制备得到的。
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Development of Irreversible Inactivators of Spermine Oxidase and N1-Acetylpolyamine Oxidase;Shun-suke Moriya etal;《Biol. Pharm. Bull.》;20141231;475–480 *
烟草青枯病生防菌X23 中非核糖体肽类抗生 素edeines 的高产改造;张亮;《湖南农业大学硕士论文》;20220515;全文 *

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