CN108018304B - 一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌菌株和制备方法及其应用 - Google Patents

一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌菌株和制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌菌株和制备方法及其应用，本发明通过基因工程的方法通过在地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中插入ilvB基因，得到地衣芽孢杆菌DW2‑ilvB，相对于地衣芽胞杆菌DW2来说，该菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了11%以上。

Description

一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌菌株和制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌菌株和制备方法及其应用。
背景技术
杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，杆菌肽的组成氨基酸包括鸟氨酸（Orn），D-苯丙氨酸（D-Phe），异亮组氨酸（His）, D-天冬氨酸（D-Asp）, 天冬酰胺（Asn）、 赖氨酸（Lys）, D-谷氨酸（D-Glu），半胱氨酸（Cys），亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）11种氨基酸。杆菌肽为一种广谱抗菌素，其主要通过抑制细胞壁的合成来抑制细菌的生长。杆菌肽能够有效抑制革兰氏阳性菌，如梭状芽孢杆菌属、葡萄球菌属，链球菌属、棒状杆菌属和奈瑟球菌属等，对部分革兰氏阴性菌如脑膜炎双球菌、流感杆菌、放线菌也有较好的抑制作用。杆菌肽几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。
杆菌肽主要是由枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌通过非核糖体合成酶进行合成的。目前，鉴于组成杆菌肽的这12种氨基酸在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌内的含量并不清楚，哪种或哪几种氨基酸是限制杆菌肽高产的关键氨基酸也尚不清楚，再加上，细胞内的氨基酸具有严格、且复杂的调控机制，因此，想要通过调节氨基酸调控来提高杆菌肽产量并非易事。
乙酰羟酸合成酶是异亮氨酸合成途径的一个关键酶，其合成基因为IlvB基因。虽然，异亮氨酸虽然是组成杆菌肽的12种氨基酸之一，但是，其合成途径的强弱与杆菌肽产量之间的关系并无报道。异亮氨酸合成途径的关键酶有很多，乙酰羟酸合成酶也只是这些关键酶中的其中一个，因此，乙酰羟酸合成酶对异亮氨酸的影响并不清楚。并且，异亮氨酸的合成是受多方面因素调控的，单纯的对异亮氨酸的合成途径的其中一个关键酶进行强化，能否提高异亮氨酸的产量不可预知。另外，杆菌肽的合成也是受多方面因素调控和影响的，单纯提高异亮氨酸的含量是否能够杆菌肽的产量也不可预知。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法，此构建方法通过在地衣芽孢杆菌的基因组内插入ilvB基因，达到了提高杆菌肽产量的目的。
一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的构建方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ilvB基因片段；
（2）在ilvB基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的ilvB表达元件；
（3）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ilvB基因的上游同源臂和ilvB基因的下游同源臂；
（4）通过重叠延伸PCR将ilvB基因的上游同源臂、ilvB表达元件和ilvB基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：ilvB基因的上游同源臂-ilvB表达元件-ilvB基因的下游同源臂；
（5）采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
（6）准备质粒 T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
（7）将步骤（5）得到的酶切基因片段和步骤（6）得到的线性质粒片段经 DNA连接酶进行连接，得到整合质粒T2(2)-ilvB；
（8）将整合质粒T2(2)-ilvB转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；
（9）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ilvB基因的上游同源臂或ilvB基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（10）挑选ilvB基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株和ilvB基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到整合了ilvB基因的地衣芽孢杆菌DW2-ilvB（简称：Bacillus licheniformis DW2-ilvB）；
其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ilvB基因为SEQ ID NO.1中所示。
本发明人首次尝试构建强化ilvB基因表达的地衣芽孢杆菌DW2-ilvB，得到了提高地衣芽胞杆菌DW2的杆菌肽产量的技术效果，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。与地衣芽孢杆菌DW2相比，通过本发明构建得到的地衣芽孢杆菌DW2 –ilvB的杆菌肽产量提高了11%以上。本发明的研究结果表明：通过ilvB基因从而加强异亮氨酸的合成是一种十分有效的提高杆菌肽产量的方法。
本发明的另一目的在于提供一种根据上述高产杆菌肽的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB。其中，根据上述高产杆菌肽的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB，其保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M 2017555，保藏日期为2017年9 月27日。
本发明的目的之三在于根据上述高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB在抗菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。
所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO3和0.5-2 g/L (NH4)2SO4。
附图说明
图1为步骤（1）得到的ilvB基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为ilvB基因片段；
图2为步骤（2）得到的ilvB表达元件和步骤（3）得到的ilvB基因的上游同源臂和下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为ilvB基因的上游同源臂，泳道3为ilvB表达元件，泳道4为ilvB基因的下游同源臂；
图3为步骤（4）得到的目的基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为目的基因片段；
图4为步骤（7）得到的整合质粒T2(2)-ilvB进行菌落PCR验证图；其中，泳道1为DNAmarker，泳道2为整合质粒T2(2)-ilvB进行菌落PCR验证的条带；
其中，上述DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000 bp，3000 bp，2000 bp，1500 bp，1000 bp，750bp，500 bp，250 bp，100 bp。
具体实施方式
一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的构建方法，包括以下步骤：
一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ilvB基因片段；
（2）在ilvB基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的ilvB表达元件；
（3）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ilvB基因的上游同源臂和ilvB基因的下游同源臂；
（4）通过重叠延伸PCR将ilvB基因的上游同源臂、ilvB表达元件和ilvB基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：ilvB基因的上游同源臂-ilvB表达元件-ilvB基因的下游同源臂；
（5）采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
（6）准备质粒 T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
（7）将步骤（5）得到的酶切基因片段和步骤（6）得到的线性质粒片段经 DNA连接酶进行连接，得到整合质粒T2(2)-ilvB；
（8）将整合质粒T2(2)-ilvB转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；
（9）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ilvB基因的上游同源臂或ilvB基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（10）挑选ilvB基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株和ilvB基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到整合了ilvB基因的地衣芽孢杆菌DW2-ilvB（简称：Bacillus licheniformis DW2-ilvB）；
其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M2011344；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ilvB基因为SEQUENCE LISTING中所示。
一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法的具体实施方式如下：
1、步骤（1）的具体操作步骤为：
根据地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的ilvB基因的基因序列，设计ilvB基因的上游引物（ilvB-F）和下游引物（ilvB-R）；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以ilvB基因的上游引物、下游引物进行PCR扩增得到ilvB基因片段（1725bp）；
其中，ilvB-F和ilvB- R的序列为：
ilvB-F ：aaaagaataaagccgaagtcGCGGAATTTCCAATTTCATG、
ilvB-R ：CGAGAATGGCATCAAATGAGATCACCCGCGATACCGTC；
2、步骤（2）的具体操作步骤为：
以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR分别扩增得到P43启动子（所用引物为P43-F和P43-R）和淀粉酶终止子（所用引物为TamyL-F和TamyL-R），随后将启动子、目的基因和终止子通过SOE-PCR连到一起（所用引物为P43-F和TamyL-R），构成完整的ilvB表达元件（2358 bp）；
其中，P43-F、P43-R、TamyL-F、TamyL-R的序列为：
P43-F ：GACAGCAGCCCGCAAGTTTtctgaaccgtctggatg、
P43-R ：CATGAAATTGGAAATTCCGCGACTTCGGCTTTATTCTTTT、
TamyL-F ：gacggtatcgcgggtgatcTcatttgatgccattctcg、
TamyL-R ：ATCGTATTCCACGCTTTC；
3、步骤（3）的具体操作步骤为：
根据地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的ilvB基因的上、下游序列，设计ilvB基因的上游同源臂引物（A-F和A-R）、下游同源臂引物（B-F和B-R）；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以ilvB基因的上游同源臂引物、下游同源臂引物进行PCR扩增得到ilvB基因的上游同源臂（582 bp）和ilvB基因的下游同源臂（506 bp）；
其中，A-F、A-R、B-F、B-R的序列为：
A-F ：CGGGATCCCAGACACTTTTTCAAGGATGAGCGG、
A-R ：CATCCAGACGGTTCAGAAAACTTGCGGGCTGCTGTC、
B-F ：GAAAGCGTGGAATACGATTATTCTGTTCTGACCGATGTGC、
B-R ：GCTCTAGATGTCCAATCGGTCTCAGCAGCCTTT；
4、步骤（4）的具体操作步骤为：
通过重叠延伸PCR将ilvB基因的上游同源臂、ilvB表达元件和ilvB基因的下游同源臂连接到一起（所用引物为A-F和TamyL-R），构成目的基因片段（3466bp），该目的基因片段的排列顺序为：ilvB基因的上游同源臂-ilvB表达元件-ilvB基因的下游同源臂；
5、步骤（5）的具体操作步骤为：
采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段（3460bp）；
6、步骤（6）的具体操作步骤为：
准备质粒 T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori（其中，质粒T2(2)-ori的构建方法为：将来自pE194质粒的194-ori、来自于pDG780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pBluescript II SK(+)-X52328的pUC-ori通过PCR反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，pUC-ori的顺序连接。此构建方法参考文献下述文献：郭兴华,熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002)短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报18(4):438-441）进行双酶切得到线性质粒片段（4250bp）；其中，所述的限制性内切酶BamHI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
7、步骤（7）的具体操作步骤为：
将步骤（5）得到的酶切基因片段和步骤（6）得到的线性质粒片段经 DNA 连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：T2-F和T2-R）。若转化子的PCR验证结果为：在3718 bp处出现电泳条带，说明整合表达载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：整合表达载体T2(2)-ilvB)；
8、步骤（8）的具体操作步骤为：
将整合表达载体T2(2)-ilvB转入地衣芽孢杆菌DW2中，在37℃的条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：T2-F和T2-R）。若转化子的PCR验证结果为：在3718 bp处出现电泳条带，证明：整合表达载体T2(2)-ilvB成功转入地衣芽孢杆菌DW2中，此时，该转化子为阳性转化子（即转入了整合表达载体T2(2)-ilvB的地衣芽孢杆菌DW2）；
9、步骤（9）的具体操作步骤为：
将步骤（8）得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12 h，并以T2-F和IlvB-KY为引物（或以T2-R与IlvB-KYF为引物）进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1340 bp或3698 bp长度的条带，即证明为单交换菌株；
其中，IlvB-KYF和IlvB-KYR的序列为:
IlvB-KYF： TCCGATGCACATCAGGTTTGCAA、
IlvB-KYR： CGGCTGCCCCGTGCCGTTTCT；
10、步骤（10）的具体操作步骤为：
将步骤（9）得到的PCR检测出现1340 bp条带的单交换菌株和步骤（9）得到的PCR检测出现3698 bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证（引物为IlvB-KYF和IlvB-KYR）。若转化子的PCR验证结果为：在1328 bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽孢杆菌DW2；在3678 bp处出现电泳条带时，说明ilvB基因成功整合到地衣芽孢杆菌DW2的基因组上，该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的ilvB整合菌株（即地衣芽胞杆菌DW2-ilvB）。
本发明另一目的在于提供一种根据上述高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2- ilvB。其中，根据上述低异味产杆菌肽地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的一株地衣芽胞杆菌DW2- ilvB，其保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M 2017555，保藏日期为2017年9 月27日。
本发明的目的之三在于根据上述高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建构建得到的地衣芽胞杆菌DW2- ilvB在抗菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
本发明人根据上述地衣芽胞杆菌DW2- ilvB在抗菌肽生产中的应用步骤提供了14种实施例，并在表1中分别列举了实施例1-实施例14的种子培养基和发酵培养基的配方。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，上述实施例中均采用保藏编号为M 2017555的DW2- ilvB菌株；种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽孢杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5mL LB培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种于种子发酵的培养基后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液；生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入25～150mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2%（体积百分比），转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。
本发明人采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用Agilent 1200液相色谱仪检测；色谱柱为Hypersil BDS C18(5μm,4.6 mm×250 mm) ；流动相为A:B＝35:65(A相：100 mL pH6.0磷酸盐缓冲液到300 mL水中混合均匀；B相：520 mL甲醇与40 mL乙腈混合均匀)；流速：1.0mL/min；柱温30°C；紫外检测器波长：254 nm；进样量20μL。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中杆菌肽的产量（见表2）。
表2
Figure 265469DEST_PATH_IMAGE002
从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽孢杆菌DW2来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌DW2- ilvB的生产发酵的菌液中杆菌肽效价有了大幅提升（提高11%以上），说明：本发明的技术方案在提高地衣芽孢杆菌杆菌肽产量方面具有重大应用价值。
序列表
<110> 绿康生化股份有限公司
<120> 一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌菌株和制备方法及其应用
<130> DS-P17277
<141> 2018-01-05
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1725
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌DW2(Bacillus licheniformis)
<400> 1
atggggacga atgtacagtt ggatgctgaa aatgcccaat gtacacaaac aatggcaggg 60
gcgtcaatgc tgattgaggc tttaaaaaag gaaaatgtcg aagtgatcta cgggtatccc 120
ggcggtgcgg tcctgtcgat ttatgacaaa ctctacggat cggggatgtt tcatgtactg 180
acgcgccatg aacaaggcgc tatccacgca gccgaaggat atgcgaggat ttcggggaaa 240
ccgggtgtcg tcatcgccac atccggtccg ggagcgacca accttgtaac gggtctggcc 300
gacgcgatga tcgattcatt gcctctcgtc gtattcaccg gtcaggttgc gacctcggtt 360
atcggatctg acgcatttca agaagctgat gtcatcggaa ttacgatgcc gattacaaag 420
cacagctacc aggttcgcca tgcagaagat ctgccgagaa ttattaaaga agcatttcat 480
atcgcaacaa caggaagacc gggccccgtt ttaatcgata ttcctaaaga catcgccgtt 540
gtagaaggag aattccgcta cgaccatgag attcaccttc ctggctatca gccgacgaag 600
gaaccgaatt atctgcagat cagaaagctt gtggaagcgg tcagtgcagc gaaaaagccg 660
gtaattttag cgggcgcggg cgtcttgcac gggaaagcgt cagaagaatt aaaaaattat 720
gtcgaacagc agcaaattcc ggtggcgcat acgctgttag gcttgggagg atttccagcc 780
gaccatccgc ttttcctcgg gatggccgga atgcacggaa cgtatgcggc caacatggct 840
ctgtatgaaa gcgatctgtt aatcagcatc ggtgcgagat tcgatgatcg ggtcacaggg 900
aacttgaagc attttgcaaa atatgcgaaa gtcgctcaca ttgacatcga tccggctgaa 960
attggcaaaa tcgttcatac gcacattccg gttgtcggcg acagcaagct tgtactgaca 1020
gagctgatca agcaaaacgg caaaccgagc gattccgatg aatggaaaaa gcagcttgct 1080
gactggaaaa acgaatatcc gctctggtat gaagagaatg aagcagaagg attcaaaccg 1140
cagaagctga tcgaatatat ccaccgctat acaaaaggcg aagctatttt aacgacggac 1200
gtcggacagc atcaaatgtg ggccgcgcaa ttttatcagt tccaaaaagc cgacaggtgg 1260
gtcacttccg gcgggctcgg cacgatgggc ttcggacttc cggcggcaat cggggcacag 1320
cttgcggata aggatgcgac agttgtatcg atactcggcg acggaggatt ccagatgaca 1380
ctgcaggagc tgtccgtcat tcgcgatctg aaccttccga tcaaagtcgt ggtcttaaac 1440
aaccgctgcc tcggaatggt ccggcaatgg caggagatct tttacgatga gcgctattca 1500
cactccaagt tcgcatcaca gcctgatttt atcaagctgt ctgaagcata cggcatcaaa 1560
ggtgtccgaa tcacatctga aaaagaagcg gaagaaaagc tggaagcggc gctaacgtcg 1620
aatgaaccgg tggtcatcga tgttcaggtt gcacaagctg aaaaagtatt tccaatggtt 1680
gcgcctggaa aagggctgca cgaaatggtg ggggtgaaac cttga 1725

Claims (6)

1.一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的构建方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ilvB基因片段；
（2）在ilvB基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的ilvB表达元件；
（3）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ilvB基因的上游同源臂和ilvB基因的下游同源臂；
（4）通过重叠延伸PCR将ilvB基因的上游同源臂、ilvB表达元件和ilvB基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：ilvB基因的上游同源臂-ilvB表达元件-ilvB基因的下游同源臂；
（5）采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
（6）准备质粒 T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
（7）将步骤（5）得到的酶切基因片段和步骤（6）得到的线性质粒片段经 DNA连接酶进行连接，得到整合质粒T2(2)-ilvB；
（8）将整合质粒T2(2)-ilvB转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；
（9）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ilvB基因的上游同源臂或ilvB基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（10）挑选ilvB基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株和ilvB基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到整合了ilvB基因的地衣芽孢杆菌DW2-ilvB；
其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ilvB基因为SEQ ID NO.1中所示。
2.根据权利要求1所述的一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB。
3.根据权利要求2所述的一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB，其保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2017555，保藏日期为2017年9 月27日。
4.根据权利要求2所述的一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB在抗菌肽生产中的应用，其特征在于，该应用步骤包括： A种子发酵，B生产发酵。
5.根据权利要求4所述的一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB在抗菌肽生产中的应用，其特征在于，所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。
6.根据权利要求4所述的一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-ilvB在抗菌肽生产中的应用，其特征在于，所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO3和0.5-2 g/L (NH4)2SO4。
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