CN111518163B - 一类脂肽化合物在抗新型冠状病毒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，发明了一类用于高效抗新型冠状病毒，尤指2019‑nCov或SARS‑Cov‑2的脂肽化合物，该脂肽化合物通过基因工程获得，表达产物经过质谱鉴定，该化合物的结构与已公布的surfactin结构一致。本发明所述的脂肽化合物主要为枯草芽孢杆菌代谢产生的脂肽或其钠盐，具有很强的抗新冠病毒的活性(参见图一),可以广泛用于抗新型冠状病毒的皮肤外用药剂、防护剂、清洗剂、洗涤剂、护肤品、个人护理用品、喷雾、体外纳米给药、衣物洗涤、医疗用品洗涤、防止家俱或固体表面新型冠状病毒吸附及工业洗涤等抑制或杀灭病毒的应用。因此，本发明是首次发现脂肽类化合物具有杀灭新冠病毒的强大活性，具有良好的应用价值、社会价值和市场前景。

Description

一类脂肽化合物在抗新型冠状病毒中的应用
技术领域
本发明涉及一类高效抗新型冠状病毒的脂肽化合物的应用，属于生命科学领域。
背景技术
脂肽类生物表面活性剂，是由革兰阳性芽胞杆菌产生的生物活性物质。该类化合物由含1个长链疏水烷基氨基酸通过其羧基和氨基与其他7-10个氨基酸以酰胺键或内酯的形式连接构成环肽，含有游离羧基的阴离子生物表面活性剂。这类物质主要包括表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和丰原素(fengycin)。它们在结构上的差异主要在于脂肪链中碳原子的个数、氨基酸的种类及脂肪酸链与肽链连接键的不同。
近年来，脂肽受到广泛的关注和研究，因其具有良好的表面活性、低皮肤刺激性和可生物降解性，多被应用于洗涤、纺织、印染、造纸、化妆品、采油、农业等领域。KhemRajMeena等通过纯化获得脂肽，研究其对癌细胞有很强的细胞毒性，而对正常细胞的毒性很小，这可能使其成为未来治疗癌症的一种合适和安全的分子(Antitumoral andAntimicrobial Activity of Surfactin Extracted from Bacillus subtilisKLP2015.International Journal of Peptide Research and Therapeutics(2019))。Lvfeng Yuan,Shuai Zhang等人通过试验证明脂肽是一种高效的膜融合抑制剂，抗病毒活性高，当脂肽插入病毒包膜结构后，溶解和破坏磷脂膜，有效降低病毒与上皮细胞的融合率，降低被病毒感染致病的风险。同时，以仔猪为模型验证了脂肽的低剂量口服给药能够有效抑制PEDV的感染(Surfactin Inhibits Membrane Fusion during Invasion ofEpithelial Cells by Enveloped Viruses.Joernal of Virology.November 2018Volume92Issue 21)。Bryan A.Johnson等研究表明肽聚糖和表面活性素联合作用能够破坏冠状病毒完整性，降低病毒感染能力(Peptidoglycan 1associated cyclic lipopeptidedisrupts viral infectivity.JVI Accepted Manuscript Posted Online 28August2019)。Jenn-Kan Lu等将Surfactin用于化妆品，能够抗皱、抗衰老、促进渗透等。YAN L I等将Surfactin用于葡萄霜霉病的生物防治(Surfactin and fengycin contribute to theprotection of a Bacillus subtilis strain against grape downy mildew by bothdirect effect and defence stimulation.Molecular Plant Pathology(2019)20(8),1037–1050)。2020年3月医学博士彼得·阿提亚最新提出，新型冠病毒SARA-CoV-2主要攻击一种叫做II型肺细胞的细胞。这种细胞的主要功能是合成并分泌surfactin(表面活性素,CAS:24730-31-2)，覆盖在肺泡表面，surfactin能够降低肺泡表面的张力，使肺泡能够张开，进行气体的交换，缺乏surfactin会导致呼吸衰竭。这种情况在老年人中更容易发生(>75％)(来自链接https://podcastnotes.org/the-drive-with-dr-peter-attia/covid-19-coronavirus/)。南非的AzarGen生物技术公司与ibio合作开发，治疗婴儿呼吸窘迫综合症的surfactin生物疗法(来自链接https://rybicki.blog/2020/04/04/plant-made-vaccines-and-reagents-for-sars-cov-2-in-south-africa/)。由姜世勃、石正丽等人解析了新冠病毒刺突蛋白(S)膜融合核心结构域的晶体结构，发现新冠病毒的膜融合能力远强于SARS病毒。也就是说，与SARS相比，新冠病毒进入细胞的效率更高。在全球面临新冠病毒严峻的威胁下，本发明首次提出了脂肽化合物可以作为高效抗2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2，或2019-nCoV)抑制剂或杀毒剂。
综上所述，截止目前为止，尚未发现关于将该类脂肽化合物用于新型冠状病毒的抑制或杀灭的作用的报道。该发明填补了该类物质在新冠防控中的国际空白，可以有效用于减少新冠病毒传染的危害，助力国家乃至全球攻坚克难，保护人民生命安全。
参考文献
1.Khem Raj Meena，Abhishek Sharma.Antitumoral and AntimicrobialActivity of Surfactin Extracted from Bacillus subtilis KLP2015.InternationalJournal of Peptide Research and Therapeutics(2019).
2.Bryan A.Johnson,Adam Hage.Peptidoglycan 1associated cycliclipopeptide disrupts viral infectivity.JVI Accepted Manuscript Posted Online28August 2019.
3.YAN L I,MARIE-CLAIRE HéLOIR.Surfactin and fengycin contribute tothe protection of a Bacillus subtilis strain against grape downy mildew byboth direct effect and defence stimulation.Molecular Plant Pathology(2019)20(8),1037–1050.
4.Jenn-Kan Lu.APPLICATIONS OF SURFACTIN IN COSMETIC PRODUCTS.US2016/0030322.
5.Lvfeng Yuan,Shuai Zhang.Surfactin Inhibits Membrane Fusion duringInvasion of Epithelial Cells by Enveloped Viruses.Joernal ofVirology.November 2018Volume 92Issue 21.
6.Bagcinele Dlamini.Downstream purification of surfactin produced byBacillus subtilis ATCC 21332
发明内容
本发明提供了一类高效抗新型冠状病毒的脂肽化合物及其应用。为了达到上述目的，本发明提出的技术方案如下：
一类高效抗新型冠状病毒的脂肽化合物，所述的脂肽化合物为枯草脂肽表活素或其钠盐中的至少一种；所述脂肽化合物1，通常当n＝0至2时，R1，R2＝-CH3，或R1＝-H，R2＝-CH2CH3，其脂肪侧链分别为C13、C14、C15支链脂肽或直链脂肽；位置2、4、7的氨基酸也可以分别地被异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、取代。M可以表示为(1)2H+；或(2)2Na+或(3)1H++1Na+。所述的脂肽化合物1可以是其中的任意一种，或任意两种混合物(3H++1Na+或1H++3Na+)，或三种混合物。
所述枯草芽孢杆菌(命名为BITAFS-BS2020)，即Bacillus subtilis BIF-S，是一株基因工程枯草芽孢杆菌，其构建方法如下：提取BS02(菌种保藏号CGMCC No.2947)的基因组，根据NCBI中脂肽合成关键基因srfa的序列设计引物，以BS02基因组为模板进行srfa基因的PCR，获得BIT-Sr。将pHT 01的启动子PgroE替换成p43。将BIT-Sr与pHT 01-p43形成重组质粒pHT 01-AFS，将其转入B.subtilis 168菌株，获得重组菌BITAFS-BS2020。
所述化合物1的制备是通过基因工程构建的枯草芽孢杆菌(命名为BITAFS-BS2020)进行高密度发酵工艺得来，发酵工艺为有氧的条件下，温度32-37℃，pH 6.7-7.5，液体培养基，按重量百分比计，含有豆粉或大豆蛋白5-20、酵母提取物0.5-2、蔗糖或麦芽糖10-40，K2HPO41-8，七水合硫酸镁0.1-1，无水氯化钙0.005-0.04，硫酸亚铁0.005-0.04，氯化锰0.01-0.1，余量为水。进行分批补料发酵培养，培养21-32h后，在1吨发酵罐的基础上，产量可以达到5.6g/L。
所述化合物1的分离是通过酸沉淀法实现，通过摇瓶培养获得的发酵液，经过8000rpm，10min低温离心取上清，弃沉淀，利用5mol/l盐酸调节pH至2，4℃冰箱放置过夜，第二天将酸沉溶液8000rpm，20min低温离心，目标化合物1可以达到70％左右的纯度。
所述化合物1的进一步纯化，是通过使用非极性离子交换树脂D101、X-7、X-5中的一种，采用预装柱的方式进行分离，使用50-100％的乙醇作为流动相进行化合物1的洗脱，洗脱流速2ml/min，可以达到95％以上的纯度，可以直接用于人体或物品表面的防护用品制剂。
化合物的抑制新冠病毒(SARS-CoV-2)S蛋白质介入的细胞-细胞融合抑制试验是由复旦大学传染病研究所进行评估的，条件为：制备并培养靶细胞。以含有绿色荧光蛋白标记的细胞的磷酸盐(PBS)溶液为阴性对照。在效应细胞加入化合物1样品，恒温37℃培养2h。通过荧光显微镜的绿色荧光通道观察并记录细胞的融合情况。试验表明，化合物1具有中等程度抗新冠病毒融合的活性(IC50＝1.59μM)。具有一定的阻断新冠病毒侵入人体健康细胞的作用。
化合物1的抑制新冠病毒生长的试验是由中国科学院武汉病毒所进行评估所得。具体条件为，制备具有一定病毒载量的细胞，37℃恒温培养，以不同浓度的化合物1为药剂处理该细胞，以水为对照组，测定24h内对细胞病毒载量变化。试验表明，所述化合物1及其混合物，在18-25μM浓度下，35-37℃，1-2小时，可以100％杀死新型冠状病毒。该组试验说明，所述化合物1对破坏新型冠状病毒包膜的完整性具有更强大的作用，从而导致病毒在温和条件下死亡。
化合物1可以制成霜剂、水基凝胶、皮肤表面喷雾剂。也可以制成纳米微乳液或纳米水溶胶(参见图9)。这些制剂，可以直接用作抗新冠病毒防护用品，相当于在人体表面镀上一层隔膜，可以有效阻断新型冠状病毒的侵入，即使吸附了或碰到了病毒，由于该类化合物8个Val,Leu,Alkanyl烷基侧链同新冠病毒的包膜之间具有较强的亲和力，可以在1-2小时内即杀死病毒，从而防止病毒的感染。
该类产品由于已经广泛用于化妆品中，在于其毒性小，生物可降解，以成年人体重60kg计算，即使体内摄入终浓度25μM下使用，也完全无毒副作用；文献(来自文献Low-Toxicand Nonirritant Biosurfactant Surfactin and its
Performances in Detergent Formulations)报道小鼠的LD50，96小时>1000mg/kg，因此是极为安全的外用药或抑菌杀毒剂的有效成分。因此，作为外用药或抗新冠病毒护肤产品，具有安全可靠的优点；尤其在护肤用品使用中，更为安全可靠。
所述化合物用于外用抗各类冠状病毒，尤其是抗新型冠状病毒有奇效。杀菌防护用品中的使用浓度<2.5g/L，基本没有皮肤刺激性，安全可靠；作为抗病毒防护用品优选0.5-1g/L。
所述外用抗冠状病毒防护产品制剂，由于需要保持权利1中化合物脂肪侧链的向外裸露性，优选水基制剂为主，可以是防护霜，防护露，其特点是，由于制剂中无脂肪类化合物和蛋白质，避免了长链油脂和蛋白质烷基侧链对化合物1的抗病毒活性的缓冲效应干扰。
所述制剂，也可以制成纳米防护凝露或纳米水溶胶，直接用作抗新冠病毒防护用品，相当于在人体表面镀上一层隔膜，可以有效阻断新型冠状病毒的侵入，即使吸附了或碰到了病毒，由于该类化合物8个Val,Leu,Alkanyl烷基侧链同新冠病毒的包膜之间具有较强的亲和力，可以在1-2小时内即杀死病毒，从而防止病毒的感染。
所述的脂肽生物表活素优选适于固体表面的抗病毒清洁剂，具有用量少，全面杀死新型冠状病毒的优良特性，包括用于被新冠病毒污染的衣物的洗涤、医疗用品洗涤、工业洗涤、办公家俱的固体表面防护。
所述的脂肽化合物抑制2019新型冠状病毒的应用，所述的脂肽化合物在人体正常温度范围内(35-37℃)，在该温度下，可以形成马鞍状最佳构型，从而有效破坏新型冠状病毒的磷脂胆碱(PC)包膜结构，导致新冠病毒完整性的破坏。
可广泛用于抑制与2019新型冠状病毒相同包膜结构的其他已知或未知病毒。尤其包膜结构以磷脂胆碱(PC)为主的病毒更为有效。
由于所述化合物尤为独特的是，该类化合物在人体体温条件下，具有杀病毒的最佳构型，可以在人体表面形成一层有效防护膜，相当于为手带上了手套，为脸带上了面罩。在口罩未覆盖的裸露部位，形成一层优良的防御层，即使接触上冠状病毒，在没来及洗手的情形下，在1-2小时以后，病毒一旦被防护霜吸附，也会被有效杀灭。因此，是一类绝佳的外用抗新型冠状病毒防护产品，尤其是对具有磷脂酰胆碱(PC)包膜结构的绝大多数冠状病毒具有极为有效的杀毒作用。
本发明的有益效果在于：
①本发明提出了脂肽类化合物抑制2019新型冠状病毒的应用。为国内首次将脂肽及其钠盐应用于抑制2019新型冠状病毒，为预防和抑制新冠病毒提供了新的药物组合成分和新方法。
②本发明提出了脂肽类化合物抑制2019新型冠状病毒的应用。依据本发明所述的脂肽及其钠盐的结构特点、抑制新型冠状病毒作用机理，本发明提出的生物活性物质脂肽及其钠盐更可以用抑制于其他类型病毒，应用于其他病毒的防护领域。
③目前国内外市售的抗病毒产品，主要是乙醇、含次氯酸氧化剂、含氯化合物、有毒季铵盐等化学合成物，对皮肤刺激性强，作用时间短。本发明提出的脂肽类化合物，能够通过破坏冠状病毒包膜的整体性及膜结构，有效杀灭2019新型冠状病毒。
因此，化合物1可以用于制备一系列抗新冠防护用品，其中包括作为抑制2019新型冠状病毒的皮肤外用药、皮肤防护用品、个人护理用品、化妆品、喷雾剂、体外纳米药物递放系统的有效成分，在抗新冠病毒领域具有广阔的应用前景；
由于所述化合物1没有其它含氯、含高浓度酒精、高浓度化学表面活性剂外用品的刺激性和毒副作用，具有用量小，低毒，无腐蚀、非粉尘状态无刺激，是很好的绿色环保杀菌抗毒产品，因此对于医护人员，学校学生，聚会场所，会展旅游业的高人流商业活动中，乃至军队户外训练或军事野营，均具有广泛的应用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明进行详细描述，其中：
图1 BIT-BS02基因组电泳图谱
图2 PCR获得目的片段BIT-Sr电泳图谱
图3 酶切产物回收的电泳图谱
图4 pHT01-srfA质粒构建图谱
图5 重组子转化涂布血琼脂平板形成溶血圈
图6 调取血平板上重组菌落进行测序鉴定结果(EMBOSS_002为BIT-Sr)
图7 P43启动子扩增产物
图8 脂肽MS鉴定结果，脂肽MS鉴定结果(a)，脂肽化合物C13/C14/C15的MS鉴定结果(b)；
图9 HPLC法测定脂肽含量
图10 脂肽经过大孔树脂纯化后的HPLC图谱
图11 脂肽抑菌性能评价
图12 脂肽抑制新冠病毒S蛋白质介入的细胞-细胞融合试验；注：图中BIT-AFS为脂肽，IC50浓度为1.596μM。检测由上海复旦大学传染病研究所提供。
图13 不同温度和脂肽浓度对抑制新型冠状病毒载量的影响；(A)温度对脂肽抑制病毒作用的影响；(B)脂肽浓度对其抑制病毒作用的影响；检测委托中国科学院武汉病毒所进行。
图14 激光粒度仪(Mastrsizer 2000)测得纳米凝露的粒径分布；检测委托中国科学院大连化物所检测中心测定。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效，对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
高产脂肽的基因重组枯草芽胞杆菌BITAFS-BS2020的构建
所述枯草芽孢杆菌(命名为BITAFS-BS2020)，即Bacillus subtilis BIF-S，是一株基因工程枯草芽孢杆菌，其构建方法如下：提取BS02(菌种保藏号CGMCC No.2947)的基因组(使用生工的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒进行基因组提取，具体方法见试剂盒使用说明书)(见图1所示，基因组DNA所示条带为提取得到的BS02基因组)，根据NCBI中脂肽合成关键基因srfa的序列设计引物(SEQ ID NO.1-2)，以BS02基因组为模板进行srfa基因的PCR，获得BIT-Sr(SEQ ID NO.3)(见图2所示，PCR结果所示条带为BIT-Sr)。将质粒pHT 01(从柯雷生物科技有限公司购置，货号kl-zl-0940)的启动子PgroE进行更换成p43(SEQ IDNO.4)。使用BamH1，Xho1将BIT-Sr与pHT 01-p43分别进行双酶切，利用TAKARA公司酶切回收试剂盒进行产物回收(见图3所示，从左向右依次为酶切后的pHT01，未酶切的pHT01，BIT-SrPCR产物的酶切产物，未酶切的BIT-Sr PCR产物)，采用T4连接酶体系进行酶切产物的连接(见图4所示，连接后的pHT 01-AFS质粒图谱)，形成重组质粒pHT 01-AFS，将其转入B.subtilis 168菌株(ATCC 23857)，在哥伦比亚血琼脂培养基(购买于江门市凯林贸易有限公司)上进行涂布，血平板含有氨苄青霉素钠(终浓度25μg/ml)、氯霉素(终浓度25μg/ml)抗性，37℃过夜培养转化子(见图5所示，转化子在血平板上的生长情况，挑取溶血圈＞1mm的菌株)，挑取透明圈大的菌落进行测序鉴定(见图6所示，EMBOSS_001为BS02-srfa碱基序列，EMBOSS_002为BIT-Sr的碱基序列)，经测序对比二者一致，最终获得重组菌BITAFS-BS2020。
所述的pHT 01-p43的构建方法为，根据NCBI获得P43序列(SEQ ID NO.4)，并进行序列的化学合成，以P43为模板设计引物(SEQ ID NO.5-6),通过PCR的方式扩增P43(见图7所示，1为P43 PCR产物，M为DNA marker)，经鉴定P43大小正确。将P43与pHT 01进行BamHⅠ、KpnⅠ双酶切，回收酶切产物，将回收产物进行连接，获得pHT 01-p43。
SrfA-F CGGGATCCATGGAAATAACTTTTTACCCTTTAACG(SEQ ID NO.1)
SrfA-R CCGCTCGAGTTGACCGCTCGCATAAGACAG(SEQ ID NO.2)
ATGGAAATAACTTTTTACCCTTTAACGGATGCACAAAAACGAATTTGGTACACAGAAAAATTTTATCCTCACACGAGCATTTCAAATCTTGCGGGGATTGGTAAGCTGGTTTCAGCTGATGCGATTGATTATGTGCTTGTTGAGCAGGCGATTCAAGAGTTTATTCGCAGAAATGACGCCATGCGCCTTCGGTTGCGGCTAGATGAAAACGGGGAGCCTGTTCAATATATTAGCGAGTATCGGCCTGTTGATATAAAACATACTGACACTACTGAAGATCCGAATGCGATAGAGTTTATTTCACAATGGAGCCGGGAGGAAACGAAGAAACCTTTGCCGCTATACGATTGTGATTTGTTCCGTTTTTCCTTGTTCACCATAAAGGAAAATGAAGTGTGGTTTTACGCAAATGTTCATCACGTGATTTCTGATGGTATCTCCATGAATATTCTCGGGAATGCGATCATGCACATTTATTTAGAATTAGCCAGCGGCTCAGAGACAAAAGAAGGAATCTCGCATTCATTTATCGATCATGTTTTATCTGAACAGGAATATGCTCAATCGAAGCGGTTTGAAAAGGACAAGGCGTTTTGGAACAAACAATTTGAATCGGTGCCTGAACTTGTTTCCTTGAAACGGAATGCATCCGCAGGGGGAAGTTTAGATGCTGAGAGGTTCTCTAAAGATGTGCCTGAAGCGCTTCATCAGCAGATTCTGTCGTTTTGTGAGGCGAATAAAGTCAGTGTTCTTTCGGTATTTCAATCGCTGCTCGCCGCCTATTTGTACAGGGTCAGCGGCCAGAATGATGTTGTGACGGGAACATTTATGGGCAACCGGACAAATGCGAAAGAGAAGCAGATGCTTGGCATGTTTGTTTCTACGGTTCCGCTTCGGACAAACATTGACGGCGGGCAGGCGTTTTCAGAATTTGTCAAAGACCGGATGAAGGATCTGATGAAGACACTTCGCCACCAAAAGTATCCGTATAATCTCCTAATCAACGATTTGCGTGAAACAAAGAGCTCTCTGACCAAGCTGTTCACGGTTTCTCTTGAATATCAAGTGATGCAGTGGCAGAAAGAAGAGGATCTTGCCTTTTTGACTGAGCCGATTTTCAGCGGCAGCGGATTAAATGATGTCTCAATTCATGTAAAGGATCGATGGGATACTGGGAAACTCACCATAGATTTTGATTACCGCACTGATTTATTTTCACGTGAAGAAATCAACATGATTTGTGAGCGCATGATTACCATGCTGGAGAACGCGTTAACGCATCCAGAACATACAATTGATGAATTAACACTGATTTCTGATGCGGAGAAAGAGAAGCTGCTTGCGAGGGCCGGCGGTAAATCTGTGAGCTACCGTAAGGACATGACGATACCAGAGCTGTTCCAAGAAAAGGCTGAACTGCTTTCTGATCATCCAGCGGTTGTATTTGAAGATCGCACATTGTCCTATCGAACGTTACATGAGCAATCTGCACGCATCGCCAATGTGCTGAAACAGAAAGGGGTTGGCCCGGACAGTCCTGTCGCGGTTTTGATTGAACGCTCTGAACGGATGATTACAGCTATCATGGGAATTTTAAAAGCCGGCGGAGCCTATGTGCCGATTGATCCGGGTTTTCCTGCTGAGCGCATTCAATATATTTTGGAGGACTGCGGGGCGGATTTCATCCTGACTGAATCGAAGGTTGCGGCGCCTGAAGCCGATGCTGAGCTGATTGACTTAGATCAGGCGATTGAGGAAGGTGCAGAAGAAAGCCTGAATGCAGATGTGAACGCTCGGAACCTTGCCTACATTATTTACACATCGGGAACAACCGGACGCCCGAAAGGCGTTATGATCGAGCATCGCCAGGTTCATCATTTGGTTGAATCTCTGCAGCAGACGATTTATCAAAGCGGCAGCCAAACCCTGCGGATGGCATTGCTTGCGCCGTTCCACTTTGATGCGTCAGTGAAGCAGATCTTCGCGTCGCTTCTTTTGGGCCAAACCCTTTATATCGTACCGAAGAAAACAGTGACGAACGGGGCCGCCCTTACTGCATATTATCGGAAGAACAGCATTGAGGCGACGGACGGAACACCGGCTCATTTGCAAATGCTGGCAGCAGCAGGCGATTTTGAAGGCCTAAAACTGAAGCACATGCTGATCGGAGGAGAAGGCCTGTCATCTGTTGTTGCGGACAAGCTGCTGAAGCTGTTTAAAGAAGCCGGCACAGCGCCGCGTTTGACTAATGTGTACGGGCCGACTGAAACGTGCGTTGACGCGTCTGTTCATCCGGTTATCCCTGAGAATGCAGTTCAATCAGCGTATGTGCCGATCGGGAAAGCGCTGGGGAATAACCGCTTATATATTTTGGATCAAAAAGGCCGGCTGCAGCCTGAAGGCGTGGCGGGTGAGCTTTATATCGCGGGAGACGGTGTGGGCCGAGGCTATTTACATTTGCCTGAATTAACGGAAGAGAAGTTTTTACAAGATCCATTCGTGCCGGGCGATCGCATGTACCGGACCGGGGACGTGGTGCGCTGGCTTCCAGATGGAACAATCGAATATTTAGGCAGAGAGGATGACCAGGTCAAAGTCCGCGGATACCGGATTGAGCTTGGGGAAATTGAAGCCGTGATTCAGCAGGCGCCAGACGTTGCAAAAGCCGTTGTTTTGGCACGCCCTGACGAACAGGGAAATCTTGAGGTTTGCGCATATGTTGTGCAGAAGCCTGGAAGCGAATTTGCGCCAGCCGGTTTGAGGGAGCATGCGGCCAGACAGCTTCCTGACTATATGGTGCCGGCTTACTTTACAGAAGTGACAGAAATTCCGCTTACACCAAGCGGCAAAGTCGACCGCCGCAAGCTGTTTGCACTAGAGGTGAAGGCTGTCAGCGGCACTGCCTATACAGCGCCGCGAAATGAGACTGAAAAAGCAATCGCAGCCATTTGGCAGGACGTGCTGAACGTTGAGAAGGCGGGGATCTTTGACAATTTCTTTGAAACTGGCGGACATTCATTAAAAGCCATGACCCTTTTAACAAAGATTCATAAGGAAACAGGCATTGAGATTCCGCTTCAATTTTTGTTTGAGCATCCGACGATTACGGCTCTTGCAGAGGAAGCTGATCACAGAGAAAGCAAAGCTTTTGCGGTGATTGAACCTGCTGAAAAACAGGAGCATTACCCGCTTTCATTGGCACAGCAGCGAACATATATCGTCAGCCAGTTCGAGGATGCGGGAGTCGGCTATAACATGCCAGCAGCAGCAATTCTGGAAGGGCCTTTAGATATTCAAAAGCTGGAGCGCGCATTTCAGGGATTAATCCGACGCCACGAGTCATTGAGAACATCATTTGTTCTTGAAAACAGCACGCCGAGACAGAAAATTCACGATAGCGTTGATTTCAACATCGAAATGATTGAAAGAGGCGGCCGCTCAGATGAGGCAATTATGGCTTCATTCGTTCGGACATTTGATTTGGCGAAAGCTCCGCTGTTCAGAATCGGTTTGCTGGGGCTTGAAGAGAACCGTCATATGCTGCTGTTTGACATGCACCATTTGATTTCTGACGGTGTATCCATTGGCATTATGCTGGAGGAGTTAGCACGCATTTATAAAGGCGAACAGCTTCCTGATCTTCGTCTCCAGTATAAGGACTACGCTGTATGGCAAAGCAGACAGGCTGCTGAAGGGTACAAGAAGGACCAGGCTTATTGGAAGGAAGTCTTTGCAGGCGAGCTCCCGGTGCTTCAGCTTCTGTCCGATTACCCAAGACCACCTGTTCAAAGCTTTGAAGGGGATCGGGTGTCAATCAAGCTGGATGCGGGGGTAAAGGATCGCCTCAATCGTTTGGCTGAACAAAACGGCGCCACTTTATATATGGTGATGCTTTCCGCTTACTATACGCTTTTGTCAAAGTATACGGGGCAGGATGACATCATTGTCGGGACACCGTCAGCGGGCAGAAATCACTCCGATACAGAGGGCATTATCGGGATGTTCGTCAATACGCTTGCGATTCGCAGTGAGGTGAAGCAGAATGAGACGTTTACCCAATTGATCTCGCGTGTCCGCAAACGGGTGCTGGATGCCTTTTCTCATCAGGACTATCCGTTTGAGTGGCTTGTTGAAGATTTGAACATCCCGCGTGATGTTAGCAGGCATCCGCTGTTTGACACGATGTTCAGCCTTCAAAACGCGACAGAGGGCATTCCGGCTGTCGGCGATCTTTCCTTGTCTGTTCAAGAGACCAATTTCAAGATTGCCAAATTTGATTTGACGGTGCAGGCGAGAGAAACCGATGAAGGCATTGAGATTGATGTGGATTACAGCACAAAGCTGTTTAAACAAAGCACGGCAGACAGGCTGCTTACGCATTTTGCGCGTTTGCTTGAAGATGCTGCGGCTGATCCAGAGAAGCCGATTTCTGAGTATAAGCTTCTTTCTGAAGAGGAGGCTGCTTCGCAAATTCAGCAGTTTAACCCGGGCAGAACACCTTATCCGAAAGATAAAACAATTGTTCAGCTGTTTGAGGAGCAAGCGGCGAATACGCCAGACCACACTGCGCTTCAATATGAAGGCGAATCACTCACTTATCGTGAACTGAATGAACGGGCCAATCGTTTAGCCCGCGGCATTCTTTCTCTTGGAGCTGGCGAAGGCAGAACTGCGGCTGTCTTATGCGAGCGGTCAA(SEQ IDNO.3)
TGTCGACGTGCATGCAGGCCGGGGCATATGGGAAACAGCGCGGACGGAGCGGAATTTCCAATTTCATGCCGCAGCCGCCTGCGCTGTTCTCATTTGCGGCTTCCTTGTAGAGCTCAGCATTATTGAGTGGATGATTATATTCCTTTTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTAAATACAGCCATTGAACATACGGTTGATTTAATAACTGACAAACATCACCCTCTTGCTAAAGCGGCCAAGGACGCTGCCGCCGGGGCTGTTTGCGTTTTTACCGTGATTTCGTGTATCATTGGTTTACTTATTTTTTTGCCAAAGCTGTAATGGCTGAAAATTCTTACATTTATTTTACATTTTTAGAAATGGGCGTGAAAAAAAGCGCGCGATTATGTAAAATATAAAGTGATAGCGGTACCATTATA(SEQ ID NO.4)
P43-F CCTCTAGATGATAGGTGGTATGTTTTCC(SEQ ID NO.5)
P43-R CTCTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCCT(SEQ ID NO.6)
实施例2
含脂肽的发酵液进行酸沉处理得到脂肽粗提物
采用LB培养基进行BITAFS-BS2020摇瓶培养，摇瓶培养条件：37℃，180rpm，16h恒温培养。LB培养基成分：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，余量为水。
酸沉：通过摇瓶培养获得的发酵液，经过10℃，8000rpm，10min离心取上清，弃沉淀，向上清中滴加5mol/l氢氧化钠至溶液pH为11，10℃，5000rpm，30min离心收集上清，利用5mol/l盐酸调节pH至2，4℃冰箱放置过夜，第二天将酸沉溶液10℃，8000rpm，20min离心，收集沉淀，获得脂肽粗提物。
实施例3
采用质谱鉴定重组菌株BIT AFS-BS2020代谢产物
对上述实施例2得到的酸沉样品进行半制备液相(依利特，UV1201)纯化，进行纯化后脂肽样品的质谱鉴定，具体方法为：将脂肽纯化样品用甲醇溶液配成30mg/ml的水溶液，使用依利特SinoChrom ODS AP
Figure BDA0002442883490000101
(10×250mm,5μm)或同等色谱柱。流动相为含体积浓度0.1％CH3COOH的MeOH:H2O(5:1,V:V)混合溶液。柱温为室温，流速4.8ml/min，进样体积0.5ml，运行时间40min。最终收集得到脂肽纯化样品。
进行MALDI-TOF-MS鉴定。MALDI-TOF-MS以Bruker Reflex MALDI-TOF仪记录，使用337nm氮源光源解吸附和电离，基质为α-氰-4-羟肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamicacid)。利用MALDI-TOF源后衰变(Post source decay,PDS)质谱分析质量分析器分析。
经过鉴定，通过重组菌株BIT AFS-BS2020发酵得到的脂肽化合物的结构与文献《Downstream purification of surfactin produced by Bacillus subtilis ATCC21332》中所描述的surfactin结构一致。(见图8所示，a为BIT AFS-BS2020发酵所得的脂肽化合物的质谱鉴定结果，b为脂肽化合物C13、C14、C15的MS鉴定结果)
实施例4
采用HPLC测定重组菌株BIT AFS-BS2020代谢产物脂肽含量
取实施例2得到的酸沉淀样品按照1:1(w/v)用色谱级甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，取过滤后透过滤膜的溶液准备上样。HPLC的试验条件为：
1)流动相：A为水溶液，B为含体积浓度0.1％TFA的乙腈溶液
2)等洗脱梯度：A：B＝15％：85％(v/v)
3)温度：室温(15℃)；进样量：10μl；流速：1ml/min；检测波长：210nm
重组菌株BIT AFS-BS2020通过摇瓶培养得到的脂肽，经过酸沉后HPLC定量(见图9)，脂肽产量可以稳定在4.19g/L。
实施例5
脂肽的规模化发酵生产，使用上述实施例1得到的重组菌BITAFS-BS2020，优化发酵条件，得到1t规模化发酵工艺。
其中，
摇瓶种子制备：取-80℃冰箱保藏的重组菌株BIT AFS-BS2020甘油管菌种，移取600μL接种于含有600mL液体LB培养基(具有Amp氨苄和Cm氯霉素双抗性，其中Amp终浓度25μg/ml、Cm终浓度20μg/ml)的2L摇瓶中，37℃恒温，180rpm培养12h。
发酵培养基(g/L)：大豆粉10，K2HPO4 5，七水合硫酸镁0.5，无水氯化钙0.018，酵母提取物1，蔗糖25，硫酸亚铁0.025，氯化锰0.040，缬氨酸0.005，亮氨酸0.005，异亮氨酸0.005，余量为水；
发酵条件：装液量600L/t(L/吨发酵罐)；温度37℃；质量接种量0.1％；pH7.0。通过调节通气量和转速，控制溶氧不低于20％。发酵过程保证罐压0.05Mpa，发酵进行至第7h开始，产生的气泡自然外排至无菌的储罐中。发酵时长26h。
补料方式及补料培养基：当发酵培养至8h时，采用分批补料方式进行补料，分别在第8h、12h、17h、22h补料四次，每次100L。补料培养基：蔗糖50g/L；大豆粉20g/L；酵母粉5g/L；硫酸亚铁0.025g/L；氯化锰0.040g/L，余量为水。
结果：1t(1吨发酵罐)规模发酵连续3个批次，发酵过程基本稳定，通过发酵液的吸光度值、表面张力以及产物酸沉干重记录每批次发酵结果。其中发酵液的吸光度值利用分光光度计测定600nm条件下的发酵液吸光度，表面张力由全自动表界面张力仪(JYW-200C)测定得到，使用实施例2所述的酸沉方法处理发酵液得到的产物干重5.59g/L。三批次生产数据见下表。
表1. 1t规模发酵生产数据
Figure BDA0002442883490000121
实施例6
脂肽的纯化方法
通过上述发酵方式获得含脂肽的发酵液通过实施例2所述的酸沉淀法，脂肽化合物1可以达到70％左右的纯度。所述化合物1的进一步纯化，是通过使用非极性离子交换树脂D101，采用湿法装柱完毕的大孔树脂D101，柱床体积40cm3，用水冲洗，将实施例2中酸沉得到的脂肽用5mol/l的氢氧化钠调至pH8.5的粗提液以1.0ml/min的流速进行上样，上样结束后使用体积浓度50％的乙醇作为流动相进行脂肽化合物1的洗脱，洗脱流速2ml/min，收集流出液，流出液经过实施例4所述的HPLC检测方法定量，可以达到95％以上的纯度(见图10)。
实施例7
脂肽抑菌实验
a将供试菌株(铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923和表皮葡萄球菌ATCC12228)分别活化后，用生理盐水制备菌悬液，活菌数＞106cfu/mL；
b将LB固体培养基融化后倒入三个培养皿(见附图11)，待冷却凝固后，分别在在平板背面用记号笔划分6个区域(1、2、3、4、5、6)，标记菌种和牛津杯位置，见附图11((A)金黄色金黄色葡萄球菌ATCC25923、(B)铜绿假单胞菌ATCC27853、(C)表皮葡萄球菌ATCC12228)
c吸取100μL步骤a制备的三种菌悬液分别涂布平板；
d在三个固体培养基表面6个区域的中心摆放已经灭菌的牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙；
e在三个固体培养基的6个区域的牛津杯中分别对应加满不同稀释度(见图11，①50μM；②40μM；③30μM；④20μM；⑤15μM；⑥8μM)的枯草脂肽水溶液(pH 7)，置于37℃恒温箱过夜培养。
由图11可见，中图11(A)中分区1有直径20mm的透明圈，分区2透明圈直径在15mm左右，分区3透明圈不清晰，分区4亦有透明圈；图11(B)分区1、2有直径16mm的显著透明圈，分区3、4有透明圈；图11(C)分区1、4有透明圈，分区2、3不显著。实验结果表明，脂肽水溶液对(A)金黄色金黄色葡萄球菌ATCC25923、(B)铜绿假单胞菌ATCC27853、(C)表皮葡萄球菌ATCC12228均有抑制和杀灭作用，最小抑菌浓度MIC 20μM。浓度在40μM以上对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌有杀灭作用，且抑菌圈的直径与脂肽的浓度呈现正相关。
实施例8
脂肽对由SARS-CoV-2介导的细胞融合抑制实验(该实验,包括实验中涉及的所有实验材料均由上海复旦大学传染病研究所姜世勃实验室提供并完成检测)。
具体方法为：进行细胞融合前，使用含有质量浓度10％FBS的10ml DMEM培养基传代培养细胞Huh-7。融合前7h铺板，取出正在培养的细胞培养瓶，弃去培养基，PBS缓冲液洗去残留的FBS。向75ml罗口细胞瓶中加入1ml 0.3％(终质量浓度)胰蛋白酶溶液进行消化，胰蛋白酶溶液中含有EDTA(终质量浓度0.02％)，37℃，5min。终止消化后，进行800rpm离心，弃上清。再次向细胞瓶中加入4ml DMEM培养基轻吹悬浮细胞，调整细胞浓度为5*105/ml。96孔板每孔加入100微升细胞悬液，37℃培养7-8h备用。
293T/SARS-CoV-2/GFP的制备，转染前将含有SARS-CoV-2/GFP的质粒pAAV(实验方法参考Inhibition of SARS-CoV-2infection by a highly potent cholesterol-conjugated pan-coronavirus fusion inhibitor targeting spike protein with highcapacity to mediate membrane fusion)50μg与2.5M CaCl2溶液融合，混合均匀，加入50μl 2*HBS(含293T)中，轻弹混匀，室温放置5-10min。随后，将1ml混合液逐滴、均匀地加入10ml DMEM培养基中。12-16h后给转染的293T细胞换液。转染48h后准备进行融合试验。
融合试验前，调整细胞DMEM培养基的pH 7，用该pH的DMEM培养基重悬293T/SARS-CoV-2/GFP。抽弃Huh-7的细胞培养基，将重悬后的293T/SARS-CoV-2/GFP细胞加入到含有Huh-7细胞的培养容器中(每孔104个细胞)，在效应细胞(293t/S/GFP)加入不同浓度的脂肽，含5％CO2的空气、37℃培养2-4h。293T/EGFP细胞的磷酸盐(PBS)溶液为阴性对照。随后通过荧光显微镜观察细胞融合情况。实验结果附图(图12)。
通过添加不同浓度的脂肽化合物抑制293T/SARS-CoV-2/GFP与Huh-7结合的能力可看出，随着加入脂肽浓度的增加，抑制上述两种细胞融合的抑制能力在增加，由图可知，加入的脂肽的半抑制浓度，即IC50＝1.596μM。
实施例9
不同实验温度和脂肽浓度对抑制新型冠状病毒载量的影响。
将Vero E6细胞添加SARS-Cov-2病毒使其附着2小时。37℃恒温培养，病毒载量达到105copies。
1.考察不同温度条件，脂肽BIT-AFS对病毒载量的影响。
配制100mM的脂肽BIT-AFS无菌水溶液。
取上述37℃恒温培养的Vero E6细胞培养管6份；
取2份加入等量的无菌水作为对照；
其余4份，各移取预先配置好的脂肽水溶液至培养管中，使脂肽终浓度达到为25μM。实验分为两组，每组2份培养管。一组置于30℃，另一组置于37℃；
随着时间(0h、0.5h、1h、1.5h、2h)的延长测定病毒载量的变化。
2.考察不同脂肽浓度条件，脂肽BIT-AFS对病毒载量的影响。
配制100mM的脂肽BIT-AFS无菌水溶液。
取37℃恒温培养的Vero E6细胞培养管10份；
取其中2份加入等量的无菌水作为对照，即脂肽BIT-AFS浓度为0μM；
其余8份，每2份一组，共分为四组。每组分别加入预先配制好的的脂肽BIT-AFS无菌水溶液，使脂肽BIT-AFS终浓度分别达到10μM、15μM、25μM、50μM；
实验模拟人体温度，恒温37℃培养24h。
脂肽处理细胞试验结束后，利用quantitative real-time RT-PCR(qRT-PCR)法(使用TaKaRa生产的一步法荧光定量PCR试剂盒进行检测，具体操作见试剂盒说明书)进行病毒拷贝数检测。
(SEQ ID NO.7)
Primer_S-F GGTTYAATGGYATTGGAGTTAC
Primer_S-R GARCTRAGTTGTTTAACAAG
Probe_S AAYGTTCTCTATGAGAAYCAAAA
由图13(A)可知，随着时间延长0h-2h，终浓度为25μM脂肽在30℃和37℃下都能够有效的抑制新冠病毒，降低细胞病毒载量。当温度为30℃时，0.5h病毒载量3个log的下降，0.5-1h病毒载量有1个log的下降，2h后病毒载量不足1个log。当温度为37℃时，0.5h病毒载量有4个log的下降，0.5h-1h病毒载量有1个log的下降，2h以后病毒载量不足1个log。结果显示，37℃更有利于脂肽BIT-AFS抑制新冠病毒，脂肽BIT-AFS浓度25μM1.5-2小时内新冠病毒全部被杀死。
由图13(B)可知，37℃条件下，对照组病毒载量(以病毒RNA拷贝数计)为105copies。当脂肽BIT-AFS使用浓度为10μM时，24h之内病毒载量降低至104copies；脂肽BIT-AFS使用浓度25μM-50μM，可100％杀死病毒。
委托武汉病毒研究所P4实验室提供检测。
应用例1
制备一种新型抗菌抗病毒的防护凝露，包含以下组分：
Figure BDA0002442883490000161
Figure BDA0002442883490000171
其可采用的组方：按重量百分比计，抗病毒成分0.05-0.1％，润肤保湿成分1.9-6％，助表面活性剂2.6-3.3％，余量为去离子水。
以微生物代谢产生的生物表面活性素脂肽或其钠盐为抗病毒成分，加入润肤成分、助表面活性剂等共同形成纳米凝露，实现长效的抗病毒作用。其中润肤保湿成分为海藻提取物、海茴香、合草根、洋甘菊花萃取物、琉璃苣提取物、库拉索芦荟、泛醇、透明质酸钠、几丁聚糖、粘多糖、甘露醇中的至少一种；助表活剂可以为鼠李糖脂、丙二醇中的至少一种。
上述组方获得的产品，经过激光粒度仪(Mastrsizer 2000)检测粒径分布。由图14可知，本品的粒径分布为130-250nm，判定样品达到纳米级。检测委托中国科学院大连化物所检测中心完成。
对比例1
本发明所述的抗病毒脂肽与常见消毒产品或其主要成分的性能对比。
Figure BDA0002442883490000181
Figure BDA0002442883490000191
序列表
<110> 大连百奥泰科技有限公司
<120> 一类脂肽化合物在抗新型冠状病毒中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgggatccat ggaaataact ttttaccctt taacg 35
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgctcgagt tgaccgctcg cataagacag 30
<210> 3
<211> 4696
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaaataa ctttttaccc tttaacggat gcacaaaaac gaatttggta cacagaaaaa 60
ttttatcctc acacgagcat ttcaaatctt gcggggattg gtaagctggt ttcagctgat 120
gcgattgatt atgtgcttgt tgagcaggcg attcaagagt ttattcgcag aaatgacgcc 180
atgcgccttc ggttgcggct agatgaaaac ggggagcctg ttcaatatat tagcgagtat 240
cggcctgttg atataaaaca tactgacact actgaagatc cgaatgcgat agagtttatt 300
tcacaatgga gccgggagga aacgaagaaa cctttgccgc tatacgattg tgatttgttc 360
cgtttttcct tgttcaccat aaaggaaaat gaagtgtggt tttacgcaaa tgttcatcac 420
gtgatttctg atggtatctc catgaatatt ctcgggaatg cgatcatgca catttattta 480
gaattagcca gcggctcaga gacaaaagaa ggaatctcgc attcatttat cgatcatgtt 540
ttatctgaac aggaatatgc tcaatcgaag cggtttgaaa aggacaaggc gttttggaac 600
aaacaatttg aatcggtgcc tgaacttgtt tccttgaaac ggaatgcatc cgcaggggga 660
agtttagatg ctgagaggtt ctctaaagat gtgcctgaag cgcttcatca gcagattctg 720
tcgttttgtg aggcgaataa agtcagtgtt ctttcggtat ttcaatcgct gctcgccgcc 780
tatttgtaca gggtcagcgg ccagaatgat gttgtgacgg gaacatttat gggcaaccgg 840
acaaatgcga aagagaagca gatgcttggc atgtttgttt ctacggttcc gcttcggaca 900
aacattgacg gcgggcaggc gttttcagaa tttgtcaaag accggatgaa ggatctgatg 960
aagacacttc gccaccaaaa gtatccgtat aatctcctaa tcaacgattt gcgtgaaaca 1020
aagagctctc tgaccaagct gttcacggtt tctcttgaat atcaagtgat gcagtggcag 1080
aaagaagagg atcttgcctt tttgactgag ccgattttca gcggcagcgg attaaatgat 1140
gtctcaattc atgtaaagga tcgatgggat actgggaaac tcaccataga ttttgattac 1200
cgcactgatt tattttcacg tgaagaaatc aacatgattt gtgagcgcat gattaccatg 1260
ctggagaacg cgttaacgca tccagaacat acaattgatg aattaacact gatttctgat 1320
gcggagaaag agaagctgct tgcgagggcc ggcggtaaat ctgtgagcta ccgtaaggac 1380
atgacgatac cagagctgtt ccaagaaaag gctgaactgc tttctgatca tccagcggtt 1440
gtatttgaag atcgcacatt gtcctatcga acgttacatg agcaatctgc acgcatcgcc 1500
aatgtgctga aacagaaagg ggttggcccg gacagtcctg tcgcggtttt gattgaacgc 1560
tctgaacgga tgattacagc tatcatggga attttaaaag ccggcggagc ctatgtgccg 1620
attgatccgg gttttcctgc tgagcgcatt caatatattt tggaggactg cggggcggat 1680
ttcatcctga ctgaatcgaa ggttgcggcg cctgaagccg atgctgagct gattgactta 1740
gatcaggcga ttgaggaagg tgcagaagaa agcctgaatg cagatgtgaa cgctcggaac 1800
cttgcctaca ttatttacac atcgggaaca accggacgcc cgaaaggcgt tatgatcgag 1860
catcgccagg ttcatcattt ggttgaatct ctgcagcaga cgatttatca aagcggcagc 1920
caaaccctgc ggatggcatt gcttgcgccg ttccactttg atgcgtcagt gaagcagatc 1980
ttcgcgtcgc ttcttttggg ccaaaccctt tatatcgtac cgaagaaaac agtgacgaac 2040
ggggccgccc ttactgcata ttatcggaag aacagcattg aggcgacgga cggaacaccg 2100
gctcatttgc aaatgctggc agcagcaggc gattttgaag gcctaaaact gaagcacatg 2160
ctgatcggag gagaaggcct gtcatctgtt gttgcggaca agctgctgaa gctgtttaaa 2220
gaagccggca cagcgccgcg tttgactaat gtgtacgggc cgactgaaac gtgcgttgac 2280
gcgtctgttc atccggttat ccctgagaat gcagttcaat cagcgtatgt gccgatcggg 2340
aaagcgctgg ggaataaccg cttatatatt ttggatcaaa aaggccggct gcagcctgaa 2400
ggcgtggcgg gtgagcttta tatcgcggga gacggtgtgg gccgaggcta tttacatttg 2460
cctgaattaa cggaagagaa gtttttacaa gatccattcg tgccgggcga tcgcatgtac 2520
cggaccgggg acgtggtgcg ctggcttcca gatggaacaa tcgaatattt aggcagagag 2580
gatgaccagg tcaaagtccg cggataccgg attgagcttg gggaaattga agccgtgatt 2640
cagcaggcgc cagacgttgc aaaagccgtt gttttggcac gccctgacga acagggaaat 2700
cttgaggttt gcgcatatgt tgtgcagaag cctggaagcg aatttgcgcc agccggtttg 2760
agggagcatg cggccagaca gcttcctgac tatatggtgc cggcttactt tacagaagtg 2820
acagaaattc cgcttacacc aagcggcaaa gtcgaccgcc gcaagctgtt tgcactagag 2880
gtgaaggctg tcagcggcac tgcctataca gcgccgcgaa atgagactga aaaagcaatc 2940
gcagccattt ggcaggacgt gctgaacgtt gagaaggcgg ggatctttga caatttcttt 3000
gaaactggcg gacattcatt aaaagccatg acccttttaa caaagattca taaggaaaca 3060
ggcattgaga ttccgcttca atttttgttt gagcatccga cgattacggc tcttgcagag 3120
gaagctgatc acagagaaag caaagctttt gcggtgattg aacctgctga aaaacaggag 3180
cattacccgc tttcattggc acagcagcga acatatatcg tcagccagtt cgaggatgcg 3240
ggagtcggct ataacatgcc agcagcagca attctggaag ggcctttaga tattcaaaag 3300
ctggagcgcg catttcaggg attaatccga cgccacgagt cattgagaac atcatttgtt 3360
cttgaaaaca gcacgccgag acagaaaatt cacgatagcg ttgatttcaa catcgaaatg 3420
attgaaagag gcggccgctc agatgaggca attatggctt cattcgttcg gacatttgat 3480
ttggcgaaag ctccgctgtt cagaatcggt ttgctggggc ttgaagagaa ccgtcatatg 3540
ctgctgtttg acatgcacca tttgatttct gacggtgtat ccattggcat tatgctggag 3600
gagttagcac gcatttataa aggcgaacag cttcctgatc ttcgtctcca gtataaggac 3660
tacgctgtat ggcaaagcag acaggctgct gaagggtaca agaaggacca ggcttattgg 3720
aaggaagtct ttgcaggcga gctcccggtg cttcagcttc tgtccgatta cccaagacca 3780
cctgttcaaa gctttgaagg ggatcgggtg tcaatcaagc tggatgcggg ggtaaaggat 3840
cgcctcaatc gtttggctga acaaaacggc gccactttat atatggtgat gctttccgct 3900
tactatacgc ttttgtcaaa gtatacgggg caggatgaca tcattgtcgg gacaccgtca 3960
gcgggcagaa atcactccga tacagagggc attatcggga tgttcgtcaa tacgcttgcg 4020
attcgcagtg aggtgaagca gaatgagacg tttacccaat tgatctcgcg tgtccgcaaa 4080
cgggtgctgg atgccttttc tcatcaggac tatccgtttg agtggcttgt tgaagatttg 4140
aacatcccgc gtgatgttag caggcatccg ctgtttgaca cgatgttcag ccttcaaaac 4200
gcgacagagg gcattccggc tgtcggcgat ctttccttgt ctgttcaaga gaccaatttc 4260
aagattgcca aatttgattt gacggtgcag gcgagagaaa ccgatgaagg cattgagatt 4320
gatgtggatt acagcacaaa gctgtttaaa caaagcacgg cagacaggct gcttacgcat 4380
tttgcgcgtt tgcttgaaga tgctgcggct gatccagaga agccgatttc tgagtataag 4440
cttctttctg aagaggaggc tgcttcgcaa attcagcagt ttaacccggg cagaacacct 4500
tatccgaaag ataaaacaat tgttcagctg tttgaggagc aagcggcgaa tacgccagac 4560
cacactgcgc ttcaatatga aggcgaatca ctcacttatc gtgaactgaa tgaacgggcc 4620
aatcgtttag cccgcggcat tctttctctt ggagctggcg aaggcagaac tgcggctgtc 4680
ttatgcgagc ggtcaa 4696
<210> 4
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtcgacgtg catgcaggcc ggggcatatg ggaaacagcg cggacggagc ggaatttcca 60
atttcatgcc gcagccgcct gcgctgttct catttgcggc ttccttgtag agctcagcat 120
tattgagtgg atgattatat tccttttgat aggtggtatg ttttcgcttg aacttttaaa 180
tacagccatt gaacatacgg ttgatttaat aactgacaaa catcaccctc ttgctaaagc 240
ggccaaggac gctgccgccg gggctgtttg cgtttttacc gtgatttcgt gtatcattgg 300
tttacttatt tttttgccaa agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacattt 360
ttagaaatgg gcgtgaaaaa aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc 420
attata 426
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctctagatg ataggtggta tgttttcc 28
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctctacattc ctctcttacc tataatggta ccct 34

Claims (13)

1.一类脂肽化合物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，其特征在于：所述的脂肽化合物为surfactin化合物；结构式为：
Figure 189129DEST_PATH_IMAGE001
化合物1
所述脂肽化合物1，其中n=0、1或2，R1、R2=-CH3，或R1=-H、R2=-CH2CH3；
二个M分别表示为H或Na离子中的一种或二种。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：
脂肽类化合物为化合物1中亚甲基n=0、1或2中的任意一种或任意两种或三种。
3.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：
该脂肽化合物可于基因工程菌的表达产物中获得，采用的基因工程菌为枯草芽孢杆菌BITAFS-BS2020；
所述枯草芽孢杆菌，命名为BITAFS-BS2020的构建方法如下：提取BS02的基因组，采用引物SEQ ID NO.1-2，以BS02基因组为模板进行srfa基因的PCR，获得BIT- Sr 即SEQ IDNO.3；将质粒pHT 01的启动子PgroE进行更换成p43即SEQ ID NO.4；使用BamH1、Xho1将BIT-Sr与pHT 01- p43分别进行双酶切，回收酶切产物，采用T4连接酶体系进行酶切产物的连接，形成重组质粒pHT 01-AFS，将其转入B.subtilis 168菌株ATCC 23857，进行氨苄青霉素钠、氯霉素的双抗筛选，最终获得重组菌BITAFS-BS2020；
所述的pHT 01- p43的构建方法为，将P43与pHT 01进行BamHⅠ、KpnⅠ双酶切，回收酶切产物，将回收产物进行连接，获得pHT 01- p43。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：
枯草芽孢杆菌BITAFS-BS2020培养条件：在有氧的条件下，温度32-37℃，pH 6.7-7.5；液体培养基，按重量百分比计g/L，含有豆粉和/或大豆蛋白5-20、酵母提取物0.5-2、蔗糖和/或麦芽糖10-40，K2HPO4 1-8，七水合硫酸镁0.1-1，无水氯化钙0.005-0.04，硫酸亚铁0.005-0.04，氯化锰0.01-0.1，余量为水；进行发酵培养，培养21-32h后，脂肽化合物产量可以达到5.6g/L。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于：
枯草芽孢杆菌BITAFS-BS2020发酵液中化合物1粗品可以通过使用酸沉淀法得到进一步精制，可以达到65-75%的纯度，回收率~90%；进一步使用极性或者非极性离子交换树脂X-5、X-7、D101中一种或二种以上进行纯化，纯度>95%的产品。
6.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述脂肽化合物在33-38℃，有体外抑制或杀灭病毒的作用。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述脂肽化合物在35-37℃，有体外抑制或杀灭病毒的作用。
8.按照权利要求1-7任意所述的应用，其特征在于：所述脂肽化合物广泛用于抑制2019新型冠状病毒的外用药物。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：所述脂肽化合物用于抗新冠病毒感染的外用防护的液体、乳液、霜剂、膏状、固体以及喷雾形式的任意一种或二种以上产品中。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于：所述脂肽化合物用于抗新冠病毒感染的外用药、或护肤品、或个人护理用品、或抗新冠病毒防护用品、或抗病毒清洁剂抗新冠病毒产品的应用。
11.按照权利要求10所述的应用，其特征在于：个人护理用品包括洁牙、洁面、洁肤、沐浴用的水或乳或喷雾任意一种或二种以上产品。
12.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述脂肽化合物用于外用抗新型冠状病毒产品;防护用品中的使用浓度<2.5g/L；
或，所述制剂，或制成纳米防护凝露或纳米水溶胶，直接用作抗新冠病毒防护用品；
或，所述的脂肽化合物适于固体表面的抗病毒清洁剂，包括用于被新冠病毒污染的衣物的洗涤、医疗用品洗涤、工业洗涤或办公家俱的固体表面防护。
13.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述脂肽化合物用于防护用品中的使用浓度0.5-1 g/L；
所述外用抗冠状病毒防护产品为防护霜或防护露。
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