CN104974234A - 新型环肽的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗病毒、细菌和真菌活性的环肽，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸残基序列Cyclo(CGESCVFIPCITTVLGCSCSIKVCYKNGSIP)，其中第1位和第17位的Cys、第5位和第19位的Cys、第10位和第24位的Cys分别形成三对二硫键，具有抗热变性和蛋白酶酶解的稳定性，其溶血毒性低，含有该环肽或其盐的药物组合物可用于预防或治疗人或者家畜感染甲型流感病毒、细菌和真菌等疾病的用途。

Description

新型环肽的用途

技术领域

本发明涉及一种具有抗病毒、细菌和真菌活性的环肽，含有6个半胱氨酸残基并形成三对二硫键，与环状骨架共同形成一个独特的环状半胱氨酸结，含有该环肽或其盐的药物组合物可用于预防或治疗人或者家畜感染甲型流感病毒、细菌和真菌等疾病的用途。 

背景技术

环肽(cyclotides)是一类结构新颖的植物环蛋白，通常由28～37个氨基酸组成，分子内部三个二硫键与环状骨架共同形成一个独特的环状半胱氨酸结。目前研究认为这类分子主要存在于堇菜科、茜草科、豆科和葫芦科植物中，环肽分子在植物中由环肽前体蛋白基因编码，转录表达成线性肽；然后在植物体内可能经过天冬酰胺内肽酶剪切环化合成（Aboye TL,2012）。截止2013年12月24日，环肽数据库CyBase(http://www.cybase.org.au/)收录了包括天然分离鉴定的环肽及其基因编码的环肽共计528个环肽分子，其结构保守，性质稳定，能够耐受常规的酶解和热变性（Colgrave ML,2004）；并且其生物活性多样，包括子宫收缩活性（Saether O,1995），血管紧张素抑制活性(Witherup KM,1994)，杀虫活性（Barbeta BL,2008），溶血毒性(Schoepke T,1993;Tang J,2010)，抗肿瘤活性（Herrmann A,2008），抗艾滋病病毒活性（非专利文献参见表1），抗微生物活性（非专利文献参见表2）等。综合文献分析，环肽分子具有抗HIV活性的分子较多，仅少数环肽分子具有抗菌活性。除本发明公布的这个环肽分子具有抗甲型流感病毒活性外，未见有文献报道。 

表1.具有抗HIV活性的天然环肽 

表2.具有抗菌活性的天然环肽 

甲型流感引起的传染病有突发性和难预测性，病毒变异可能形成致病性强的新毒株或因传染性强易形成爆发流行的疾病。如流感病毒不时造成急性传染病爆发的公共卫生事件：1918 年H1N1流感，1957年H2N2流感，1968年H3N2流感，1997年与2003年人感染高致病禽流感H5N1，其致死率高达65%；2009年甲型H1N1流感。2013年中国地区出现禽流感H7N9感染人的散发病例。这不仅给人们的生命健康带来威胁，其中禽流感也给畜牧业造成了巨大经济损失。目前，临床应用的抗流感病毒药物很有限，传统的抗流感病毒药物有离子通道M2阻滞剂（金刚乙胺、金刚烷胺）；神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦（oseltamivir）或达菲和扎那米韦（zanamivir）应用于临床。这些药物，其作用靶点均为病毒复制过程中的关键酶，特异性较强，但易产生耐药性；其次是抗病毒谱窄，只作用于一个病毒家族或者密切相关的几种病毒。因此，本发明的目的寻找新型的抗流感病毒的环肽药物。 

抗生素的发现使人们进入了控制、治疗细菌感染性疾病的时代。但是大量广谱抗生素的使用同时加强了对致病菌的筛选作用，加速了致病菌的进化，使得细菌的耐药率逐步增加，耐药谱也不断扩大，最终导致了超级耐药细菌的出现。超级耐药细菌(超级细菌）正在全球蔓延。据报道，超级细菌对目前临床上使用的抗生素不敏感(替加环素和多粘菌素除外)，其携带有超级耐药的新德里金属β-内酰胺酶-I(New Delhi metalIo-β-lactamase-1，NDM-I)基因（Shakil S,2011）。近期研究表明，在院内感染病人中分离出含NDM_1基因(质粒编码）的超级细菌，其耐药性大多是细菌在接触抗生素后获得的，并可通过耐药基因的转移而传播和扩散，也可通过耐药基因的复制而传给细菌下一代（Johnson AP，2013）。因此，寻求新的抗耐药性病原菌感染的药物，特别是抗超级耐药细菌(超级细菌）的药物在临床上具有重要意义。由于抗微生物多肽具有广谱的抗菌活性和广泛的生物学功能促进其作为抗菌药物的基础研究（Mulder KC,2013）。但是多数抗菌肽进入人体易被蛋白酶水解，目前临床实验研究仅限于局部应用阶段。本发明中所示的环肽具有抗消化道的代谢蛋白酶酶解和热变性的稳定性等特点，可以发展为口服的抗菌肽类药物。 

非专利文献： 

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发明内容

针对现有技术存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一种具有抗甲型流感病毒、抗细菌和抗真菌活性的如SEQ ID NO:1Cyclo(CGESCVFIPCITTVLGCSCSIKVCYKNGSIP)所示的环肽，其具有抗消化酶酶解和热变性的稳定性，同时其溶血毒性很低，该环肽分子可用于预防或治疗人或家畜感染甲型流感病毒、细菌和真菌的疾病。。 

本发明涉及环肽的分子骨架是一个含有氨基酸残基的多肽分子，而不含有自由的氨基端或羧基端，即氨基酸残基通过肽键连接。环状的分子骨架还包括6个半胱氨酸残基之间形成的三对二硫键，图1所示环肽分子二硫键的连接方式是第1位和第17位的Cys、第5位和第19位的Cys、第10位和第24位的Cys分别形成三对二硫键。 

本发明首先了提供了具有抗甲型流感病毒、抗细菌和抗真菌活性环肽的分离纯化和结构鉴定的方法。采集新鲜的药用植物紫花地丁，用95%乙醇提取获得总提取物，然后用不同极性的溶剂进行萃取，即获得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水相四个极性部分；含有环肽的正丁醇部分减压浓缩后再用水重悬，样品经Sephadex LH-20柱层析采用甲醇:水梯度洗脱。结合质谱分析获得天然的环肽分子。 

环肽分子的结构鉴定：利用二硫苏糖醇（DTT）还原的方法打开分子内的二硫键，然后用还原剂碘乙酰胺进行烷基化保护游离的的巯基，再利用不同的蛋白酶如胰蛋白酶（Trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）、谷氨酸内肽酶（Endo Glu-C）、赖氨酸内肽酶（Endo Lys-C）进行单一酶解或者不同的蛋白酶组合酶解，经HPLC分离纯化获得肽段；利用MALDI TOF/MS 4700质谱仪进行肽段的质谱分析，然后利用质谱图上所对应的碎片离子，即b-离子或y-离子进行结构解析，结果获得了SEQ ID NO:1的环肽分子。 

本发明中的一个实施例利用沸水（100℃）热变性环肽分子，再结合RP-HPLC色谱法分析确定了热变性处理的环肽分子与对照具有相同的洗脱峰，说明所公开的环肽分子具有耐热变性的稳定性。 

本发明的另一个实施例说明环肽分子具有抗胰蛋白酶（trypsin）和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)等丝氨酸蛋白酶的稳定性。 

本发明中的一个实施例公开了体外的环肽抗菌活性评价方法：采用3株G-菌、2株G⁺菌和1株真菌为受试菌株，制备10⁵cells/100μl的受试菌悬液，与不同浓度的环肽在37℃孵育2.5h，然后稀释铺在琼脂平板上，培养24h，菌落记数，与对照相比，致死浓度为对应>99.9%，同时以防御素HNP-1为阳性对照，抗菌活性见表3。说明SEQ ID NO:1具有抗G⁺、G^-和真菌的生物活性。 

表3环肽的最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration,MIC）(μM) 

本发明中的另一个实施例也公开了环肽分子体外抗甲型流感病毒的活性评价：受试环肽药物分子用无血清DMEM培养基配制，从最大安全浓度起始，2倍稀释，加入长成单层的MDCK细胞96孔培养板中，每浓度4个孔，其中1孔为药物对照孔，其余3孔每孔加入100μL100TCID₅₀病毒，药物对照孔加入100μL维持液。35℃、5%CO₂培养3天，观察细胞病变。用1%中性红染色，540nm测定OD值。阳性药物为达菲，以药物抑制病毒的半数有效浓度（IC₅₀）和病毒抑制率作为药物评价指标（见表4）。 

表4药物抑制病毒的半数有效浓度（IC₅₀） 

本发明中的另一个实施例也公开了环肽分子的溶血毒性：利用人的血红细胞为溶血实验材料，以具有抗菌活性的蜂毒肽为参照，体外分析结果表明环肽分子具有较低的溶血毒性。 

用于本发明说明书、权利要求书和附图中有关氨基酸残基的缩写，是根据IUPAC-IUB生 化命名委员会规定的缩写，如表5所示。值得注意的是氨基酸残基可能存在旋光异构体时，除非有其他说明，该异构体为L-型。 

表5氨基酸残基的缩写 

附图说明

图1.SEQ ID NO:1环肽的结构示意图 

图2.SEQ ID NO:1环肽的MALDI TOF/MS质谱图 

图3.SEQ ID NO:1肽段（VCYK）的MALDI TOF/MS质谱解析。SEQ ID NO:1环肽经还原和烷基化保护后，再利用赖氨酸内肽酶（endo Lys-C）煎切后产生m/z569.2589Da肽段的MALDI TOF MS/MS图，氨基酸残基序列根据b-离子和y-离子进行解析。 

图4.SEQ ID NO:1肽段（NGSIPCGESCVFIPCITTVLGCSCSIK）的MALDI TOF/MS质谱解析。SEQ ID NO:1环肽经还原和烷基化保护后，再利用赖氨酸内肽酶（endo Lys-C）煎切后产生m/z3019.0217Da肽段的MALDI TOF MS/MS图，氨基酸残基序列根据y-离子进行解析。 

图5.SEQ ID NO:1肽段（ITTVLGCSCSIK）的MALDI TOF/MS质谱解析。SEQ ID NO:1环肽经还原和烷基化保护后，再利用胰蛋白酶（Trypsin）煎切后产生m/z1338.8212Da肽段的MALDI TOF MS/MS图，部分氨基酸残基序列根据y-离子进行解析。 

图6.SEQ ID NO:1肽段（VCYKNGSIPCGESCVFIPC）的MALDI TOF/MS质谱解析。SEQ ID NO:1环肽经还原和烷基化保护后，再利用胰蛋白酶（Trypsin）煎切后产生m/z2247.8716Da肽段的MALDI TOF MS/MS图，部分氨基酸残基序列根据b-离子进行解析。 

图7.SEQ ID NO:1肽段（KNGSIPCGESCVF）的MALDI TOF/MS质谱解析。SEQ ID NO:1环肽经还原和烷基化保护后，再利用胰凝乳蛋白酶（Trypsin）煎切后产生m/z1454.9119Da肽段的MALDI TOF MS/MS图，部分氨基酸残基序列根据b-和y-离子进行解析。 

图8.SEQ ID NO:1肽段（GCSCSIKVCY）的MALDI TOF/MS质谱解析。SEQ ID NO:1环肽经还原和烷基化保护后，再利用胰凝乳蛋白酶（Trypsin）煎切后产生m/z1233.8733Da肽段的MALDI TOF MS/MS图，部分氨基酸残基序列根据b-和y-离子进行解析。 

图9.SEQ ID NO:1耐热稳定性色谱分析.1：0min耐热反应样品；2：10min耐热反应样品；3：20min耐热反应样品；4：30min耐热反应解样品。 

图10.SEQ ID NO:1耐热变性分析结果. 

图11.SEQ ID NO:1酶解稳定性色谱分析.A:1：0min Trypsin酶解样品；2：30min Trypsin酶解样品；3：60min Trypsin酶解样品；4：120min Trypsin酶解样品。B:1：0min Chymotrypsin酶解样品；2：30min Chymotrypsin酶解样品；3：60min Chymotrypsin酶解样品；4：120min Chymotrypsin酶解样品。 

图12.SEQ ID NO:1耐酶解分析结果. 

图13.药物的病毒抑制率.1对照药达菲;2.SEQ ID NO:1。 

图14.SEQ ID NO:1的溶血毒性.1对照蜂毒肽（melittin）;2.SEQ ID NO:1。 

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法。 

实施例1 

天然环肽的分离纯化和结构鉴定 

样品的提取和环肽的分离采集新鲜的紫花地丁，用榨汁机打碎，然后用95%乙醇浸提3次，每次24h，合并提取液，减压浓缩回收乙醇；提取物用水重悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；含有环肽的正丁醇部分减压浓缩后再用水重悬，样品经Sephadex LH-20柱层析采用10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%甲醇水梯度洗脱。利用质谱跟踪确定含有环肽的洗脱部分为30%的馏分。再次减压浓缩后，利用Agilent1200系统和GRACE VYDAC蛋白多肽半制备C18柱(250×10mm,5μm,)对样品进行分离纯化，其色谱条件：流动相A：0.5%的三氟乙酸(TFA)-水溶液；流动相B：90%的乙腈-水溶液；紫外检测：220nm；进样量：100μl/次；流速：2ml·min^-1；梯度洗脱。收集洗脱峰，再用MALDI TOF/MS进行分析确认环肽分子。 

半制备色谱柱液相色谱（RP-HPLC）洗脱条件 

收集获得的含有环肽分子的洗脱峰，再减压浓缩并冷干后，再取少量样品利用Agilent1200系统和GRACE VYDAC蛋白多肽分析型C18柱(250×4.6mm,5μm,)进行梯度洗脱；紫外检测：220nm；进样量：100μl/次；流速：1ml·min^-1；进行样品的纯度分析；利用MALDI TOF/TOF MS进行检测分析，分离获得目的环肽冷藏保存。经过质谱分析获得了m/z3200.7161 Da的环肽分子（图2和3）。 

分析型色谱柱液相色谱（RP-HPLC）洗脱条件 

环肽分子的还原与烷基化保护对环肽分子进行结构解析,首先进行还原与烷基化保护反应。取50μg的环肽样品溶于100μl100mmol·L^-1碳酸氢铵缓冲液(pH8.0)中，加入等体积含有摩尔比30倍过量DTT(约0.46mg)的碳酸氢铵缓冲液后于37℃反应2h；再加入等体积含有还原巯基摩尔比2.5倍过量碘乙酰胺(约1.38mg)的碳酸氢铵缓冲液，室温下避光反应12h。还原和烷基化后的样品直接注入RP-HPLC C18分析柱，进行梯度洗脱（见上述分析柱洗脱色谱条件），收集样品峰，取0.5μl样品点样于MALDI样品板上，再与等体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）混匀，进行MALDI TOF/TOF MS质谱分析。 

赖氨酸内肽酶（Endo Lys-C）、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶解将还原和烷基化的环肽样品通过RP-HPLC系统C18分析柱，进行梯度洗脱纯化，冷干。将环肽分子溶解在100μl100mmol·L^-1Tris-HCl（pH7.5）中，加入蛋白酶Lys-C或胰蛋白酶，37℃下酶解12h；或者将环肽分子溶解在100μl100mM Tris-HCl,10mM CaCl₂,pH7.8用胰凝乳蛋白酶，37℃下酶解12h。将酶解后的样品直接注入RP-HPLC C18分析柱，进行梯度洗脱纯化，纯化的样品利用MALDI TOF/TOF MS进行质谱分析。 

MALDI TOF MS/MS分析为了鉴定酶解的肽段氨基酸残基序列，利用ABI4700MALDITOF/TOF^TM系统采用正离子模式进行，利用50%乙腈/0.1%TFA配置8mg·ml^-1CHCA作为MALDI介质，质谱仪的扫描范围m/z500-4000，用于测定每个样品中肽段的质荷比。首先采用反射手动模式测定分子离子质荷比，其激光强度设置在肽段分子离子化的阈值强度，一级质谱激光总照射(laser shots)为800次；为了对肽段进行MS测序，激光强度升高约10%，加速电压设置为1kV，激光总照射为2000次，每个肽段的撞击诱导解离(CID)的质谱结果都按单电荷的反射模式记录，撞击室内气压分别设置为（无、中、高）3中工作状态，若撞击室内没有气压时系统运行采用源后衰变（PSD）模式；其中母离子与二级质谱的mass error范围分别为m/z±0.05和m/z±0.02。肽段氨基酸残基序列的解析利用ABI公司DataExplore v3.5系统采用质谱图上y离子或b离子人工解析，根据相邻离子的分子量差求出氨基酸残基的分子量得到多肽的氨基酸残基序列。 

其中m/z3200Da的环肽分子经还原和烷基化后，经Endo Lys-C酶解后产生2个肽段m/z569.2589Da和m/z3019.0217Da肽段，然后依据碎片离子峰分别解析出的氨基酸残基序列分别为VCYR、NGSIPCGESCVFIPCITTVLG的肽段（图3和4）。利用Trypsin酶切产生了m/z1338.8212Da和m/z2247.8716Da的肽段，然后依据碎片离子峰分别解析出的部分氨基酸残基序列分别为ITTVLGCS、ESCVFIPC（图5和6）。利用Chymorypsin酶切产生了m/z1454.9119Da和m/z1233.8733Da的肽段，然后依据碎片离子峰分别解析出的部分氨基酸残基序列分别为KNGSIPCGESCVF、CSCSIKVCY（图7和8）。根据三组不同的酶解获得肽段进行重叠拼接最终 确定SEQ ID NO:1Cyclo(CGESCVFIPCITTVLGCSCSIKVCYKNGSIP)。 

实施例2 

SEQ ID NO:1耐热稳定性试验 

(1).多肽SEQ ID NO:1溶液：45μL1μg/μL的多肽加180μL过膜的无菌水，混匀； 

(2).0min耐热反应试验样品：取出50μL步骤(1)中的混合液； 

(3).不同耐热反应时间的试验样品：将步骤(1)中的混合液分装成50μL的三份样品，放置于100℃沸水浴中，分别约10min，20min,30min取出一份样品，立即放入冰上冷却10min，而后离心； 

(4).将样品(2)和(3)进利用色谱柱（YMC-Pack,ODS-A,250×4.6mm）进行HPLC分析(图9)，液相色谱洗脱条件如下： 

注：A相:0.5%TFA B相:90%AcN，0.5%TFA；检测波长：220nm 

(5).结果:以0min SEQ ID NO:1多肽的峰面积为100%，计算X min相对于0min残留的峰面积，结果表明EQ ID NO:1在100℃沸水浴中加热30min，多肽相对稳定，残留量在80%以上(图10和下表)。说明环肽分子具有很高的耐热变性稳定性。 

实施例3 

SEQ ID NO:1耐酶解稳定性试验 

1.溶液的配制 

(1).多肽SEQ ID NO:1：1μg/μL,用过膜的无菌水配制； 

(2).胰蛋白酶（Trypsin）试验用Buffer:100mM Tris-HCl,pH8.0;Trypsin酶：0.5μg/μL； 

(3).胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）试验用Buffer:100mM Tris-HCl,10mM CaCl₂,pH7.8；Chymotrypsin酶：0.5μg/μL； 

(4).酶解终止液：10%TFA,用相应的反应buffer配制。 

2.SEQ ID NO:1耐Trypsin酶解试验 

(1).多肽SEQ ID NO:1溶液：25μL1μg/μL的多肽加95μL buffer，混匀； 

(2).Trypsin酶解反应工作液：0.35μL0.5μg/μL的多肽加3.15μL buffer，混匀； 

(3).将溶液(1)和(2)放置于37℃培养箱中5min； 

(4).0min酶解试验样品：取出25μL步骤(1)中的混合液，并加入3.75μL的buffer； 

(5).不同酶解时间的试验样品：取84μL步骤(1)中的混合液加入到步骤(2)中，迅速混匀，分装成25μL的三份样品，放置于37℃培养箱中，分别约30min，60min,120min取出一份样品，立即加入3.75μL10%TFA迅速混匀，终止反应； 

(6).将样品(4)和(5)进HPLC分析,如图11A. 

3.SEQ ID NO:1耐Chymotrypsin酶解试验 

(1).多肽SEQ ID NO:1溶液：25μL1μg/μL的多肽加97.5μL buffer，混匀； 

(2).Chymotrypsin酶解反应工作液：0.175μL0.5μg/μL的多肽加1.575μL buffer，混匀； 

(3).将溶液(1)和(2)放置于37℃培养箱中5min； 

(4).0min酶解试验样品：取出25μL步骤(1)中的混合液，并加入3.75μL的buffer； 

(5).不同酶解反应时间的试验样品：取85.75μL步骤(1)中的混合液加入到步骤(2)中，迅速混匀，分装成25μL的三份样品，放置于37℃培养箱中，分别约30min，60min,120min取出一份样品，立即加入3.75μL10%TFA迅速混匀，终止反应； 

(6).将样品(4)和(5)进HPLC分析，如图11B 

4.SEQ ID NO:1耐酶解试验结果 

以0min SEQ ID NO:1多肽的峰面积为100%，计算X min相对于0min残留的峰面积，结果表明EQ ID NO:1在1h内对Trypsin酶和Chymotrypsin酶相对稳定，残留量在80%以上，在2h内残留量在70%以上(图12和下表)。说明环肽分子具有很高的耐酶解稳定性。 

实施例4 

抗微生物活性分析 

采用3株G-菌Escherichia coli ATCC25922、Pseudomonas aeruginosa ATCC27853和Klebsiella oxytoca ATCC49131，2株G+菌Streptococcus gallolyticus ATCC49147和Enterococcus faecalis ATCC29212，1株真菌Candida albicans ATCC14053为受试菌株，分别采用ATCC使用说明进行细胞培养，制备10⁵cells/100μl的受试菌悬液，与不同浓度的环肽在37℃孵育2.5h，然后稀释铺在相应的琼脂平板上，培养24h，菌落记数，与对照相比，致死浓度为对应>99.9%，同时以防御素HNP-1为阳性对照，最小抑菌浓度见表3。说明SEQ ID NO:1具有抗G⁺、G^-和真菌的生物活性。 

表3环肽的最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration,MIC）(μM) 

实施例5 

抗甲型流感病毒H1N1活性 

实验材料： 

1.受试药物：SEQ ID NO：1和达菲（阳性药对照）。 

2.细胞：MDCK细胞系。 

3.病毒：甲型H1N1-CA7尿囊液（A/California/7/09）。 

4.培养液：DMEM培养基、10%胎牛血清、2%双抗（Hyclone）。 

5.维持液：DMEM培养基、2%双抗（Hyclone） 

6.试剂：中性红（Sigma）。 

病毒滴定： 

甲型H1N1病毒10倍稀释至10^-8接种于MDCK细胞96孔培养板，每孔200μL，每浓度4个复孔，35℃、5%CO2培养3天，观察细胞病变，用1%中性红染色，540nm测定OD值，计算病毒半数感染量（TCID₅₀）。 

抗病毒实验： 

受试药物用无血清DMEM培养基配制，从最大安全浓度起始，2倍稀释，加入长成单 层的MDCK细胞96孔培养板中，每浓度4个孔，其中1孔为药物对照孔，其余3孔每孔加入100μL100TCID₅₀病毒，药物对照孔加入100μL维持液。35℃、5%CO₂培养3天，观察细胞病变。用1%中性红染色，540nm测定OD值。 

药物效果计算： 

（1）病毒半数感染量（TCID₅₀）的计算： 

${\mathrm{TCID}}_{50}=\mathrm{Anti}\log (D+\frac{50-B}{A-B}\×C)$

A:大于50%细胞感染百分率，B：小于50%细胞感染百分率，C：log（稀释倍数），D:log（小于50%细胞感染率所对应的病毒稀释度） 

（2）病毒抑制百分率： 

（3）药物抑制病毒半数有效浓度（IC₅₀） 

${\mathrm{IC}}_{50}=\mathrm{Anti}\log (D+\frac{50-B}{A-B}\×C)$

A:大于50%病毒抑制率，B:小于50%细胞病毒抑制率，C:log（稀释倍数），D:log（小于50%病毒抑制率所对应的药物稀释度） 

药效评价指标： 

药效评价以药物抑制病毒的半数有效浓度（IC₅₀）和病毒抑制率作为药物评价指标；最大安全浓度的确定是以对细胞没有损伤的最高药物浓度为药物的起始安全浓度。 

实验结果： 

1.H1N1病毒滴定结果： 

按Reed-Meuench法计算甲型H1N1病毒的浓度为：1.58×10⁶TCID₅₀/ml，选择100TCID₅₀作为该药效研究的病毒感染剂量。 

2.药物对甲型H1N1病毒的抑制作用： 

表4药物抑制病毒的半数有效浓度（IC₅₀） 

结果： 

起始浓度为药物的最大无毒浓度，药物的病毒抑制率见图13，说明SEQ ID NO:1对甲型 H1N1病毒有抑制作用。 

实施例6 

溶血毒性：取新鲜的人血红细胞1,000rpm离心去上清，用50mM磷酸钠缓冲液（PBS）（pH7.4）漂洗3次，环肽SEQ ID NO:1溶解在水中，然后用PBS缓冲液稀释，取20μl环肽样品加入到80μl重悬的红细胞（1%V/V）中,在37℃孵育1h，再1,000rpm离心6min，取60μl反应样品到U-型底的96孔板，在415nm测定吸收值，以1%Triton X-100的完全溶血为阳性对照，以PBS缓冲液为阴性对照，以合成的蜂毒肽（melittin）为参照，计算环肽的50%溶血活性(HD₅₀)。环肽SEQ ID NO:1的HD₅₀为12.8μM，而参照样品蜂毒肽的HD₅₀为1.55μM（图14）。 

Claims (17)

1.一种环肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸残基序列

Cyclo(CGESCVFIPCITTVLGCSCSIKVCYKNGSIP)，其中第1位和第17位的Cys、第5位和第19位的Cys、第10位和第24位的Cys分别形成三对二硫键，并且其中一个或多个非Cys的氨基酸残基可替换为相同性质的氨基酸残基。

2.权利要求1所述的环肽，其中1-10个非Cys的氨基酸残基可替换为相同性质的氨基酸残基，选自以下的一种或多种：

第2位的Gly替换为Ala、Ile；

第3位的Glu替换为Asp；

第4位的Ser替换为Thr、Gly和Arg，

第6位Val替换为Phe、Thr、Ala、His、Leu、Ile、Arg、Tyr，

第7位Phe替换为Trp、Gly、Tyr、Leu、Thr、Lys、Ile、Val、Arg、Glu、His、Met，

第8位Ile替换为Gly、Leu、Phe、Ala、Asn、Lys、Met、Pro、His、Val，

第9位Pro替换为Thr、Lys、Ser、Asn、Gly、Trp、Arg、Glu、Phe、Val，

第11位Ile替换为Asn、Tyr、Leu、Thr、Phe、Val、Arg、Trp、His，

第12位Thr替换为Ser、Val、Leu、Ala、Asn、Asp、Leu、Tyr，

第13位Thr替换为Ser、Ala、Gly、Glu、His、Lys、Tyr、Val，

第14位Val替换为Ala、Leu、Ile、Pro、Thr、Glu、Lys，

第15位Leu替换为Pro、Ile、Val、Ala、Lys、Met、Phe、Asn、Gly、Gln、Glu、Gly、Ser、Thr，

第16位Gly替换为Asn、Tyr、Arg、Gln、Ser、Thr，

第18位Ser替换为Thr、Gly、Ala、Lys、Ile、Phe、Pro、Tyr、Val，

第20位Ser替换为Thr、Lys、Asp、Arg、Asn、Glu、Gln、Val，

第21位Ile替换为Ser、Asn、Trp、Asp、Pro、Thr、Tyr、Lys、Arg、Ala、Glu、His、Gly、Leu、Val，

第22位Lys替换为Pro、Arg、Asn、Gly、Gln、Ser、Met、Phe、Glu、His、Leu，

第23位Val替换为Leu、Ile、Ser、Phe、Arg、Glu、Met，

第25位Tyr替换为Thr、Lys、Met、Ser、Ala、Phe、Val、Arg、Gln、Leu，

第26位Lys替换为Arg、Leu、His、Gly、Tyr、Phe、Trp，

第27位Asn替换为Asp，

第28位Gly替换为Ser、Lys、Ala、Thr、Asp，

第29位Ser替换为Thr、Val、Gly、Ala、Leu、Asn、Asp、Phe，

第30位Ile替换为Leu、Val、Ala、Phe、Thr、His、Pro、Arg、Asn、Asp、Gln，

第31位Pro替换为Phe、Leu、Gly、Ser、Ala、Arg、Val、Asp、Asn、Gln。

3.权利要求2所述的环肽，其中第2位的Gly优选替换为Ala。

4.权利要求2所述的环肽，其中第4位的Ser优选替换为Thr。

5.权利要求2所述的环肽，其中第7位Phe优选替换为Trp或His，再优选替换为Trp。

6.权利要求2所述的环肽，其中第11位Ile优选替换为Leu、或Phe、或Val，再优选替换为Val。

7.权利要求2所述的环肽，其中第13位Thr优选替换为Ser、或Ala、或Tyr、或Val，再优选替换为Ala。

8.权利要求2所述的环肽，其中第14位优选Val替换为Ala、或Leu、或Ile，再优选替换为Leu。

9.权利要求2所述的环肽，其中第15位Leu替换为Pro、或Ile、或Val，再优选替换为Val。

10.权利要求2所述的环肽，其中第21位Ile替换为Asp、或Tyr，再优选替换为Asp。

11.一种药物组合物，包含前述权利要求中任一项所述的一种环肽或其药学上可接受的盐以及一种药学上可接受的载体或赋形剂。

12.根据前述权利要求中任一项所述的环肽或药物组合物，具有抗病毒、细菌和真菌的活性。

13.根据前述权利要求12，所述的病毒为甲型H1N1流感病毒。

14.根据前述权利要求12，所述的细菌为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

15.根据前述权利要求12，所述的真菌选自白色念珠菌。

16.根据前述权利要求中任一项所述的环肽或药物组合物，可用于预防或治疗人或家畜感染甲型流感病毒、细菌和真菌的疾病。

17.根据前述权利要求中任一项所述的环肽或药物组合物，可用于食品或化妆品的防腐剂或添加剂。