CN104628869B - 一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物，这些融合肽衍生物为流感病毒融合肽中部分带负电荷、不带电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸及其类似物替代后所得到的。这些融合肽衍生物为兼具抗革兰阳性菌、革兰阴性菌、抗病毒作用的新型融合肽；其具有抗流感病毒活性，能够通过抑制流感病毒HA2亚基在酸性条件下的构象变化，达到阻断流感病毒进入宿主细胞内。这些多功能抗微生物多肽在病毒性感冒合并细菌感染存在潜在的应用的前景。

Description

一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物

技术领域

本发明涉及一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物。

背景技术

流行性感冒病毒是一种造成人、狗、马、猪及禽类等患流行性感冒的RNA病毒。在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。2003年12月中旬,由H5N1禽流感病毒(AIV)引起的高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza,HPAI)袭击了亚洲,在不到2个月的时间内,席卷了韩国、日本、中国和印度尼西亚等8个东亚和东南亚国家，导致死亡或淘汰的禽只总数近1亿只。在世界卫生组织报导的348例确诊人类感染的病例中，有216例死亡，占60％。2010年，甲型H1N1流感病毒大流行，全球有超过18337人被该病毒夺走生命。

除此之外，美国CDC的统计数据显示，在流感流行季节中，约50％的死亡病例死于肺炎，其中绝大部分是肺炎链球菌造成的。由此可知，不仅流感病毒本身带来严重危害，而且流感病毒的感染导致人体的免疫力降低因而使得细菌定植的机率增加，造成细菌并发感染，加重疾病。

流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。基质蛋白与病毒最外层的包膜紧密结合起到保护病毒核心和维系病毒空间结构的作用。基质蛋白构成病毒的外壳骨架，有基质蛋白(M1)和膜蛋白(M2)。包膜表面具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。

甲型流感病毒命名中的H代表流感病毒的融合蛋白——血凝素(hemagglutinin，HA)，HA是流感病毒的主要抗原，共有16个亚型，可以引起宿主强烈的免疫反应，为逃避宿主的免疫系统监视，HA不断突变。

目前，治疗流感病毒的药物有两类，作用于M2离子通道和神经氨酸酶2个靶点。(1)作用靶点为流感病毒表面的M2离子通道蛋白的代表药物有金刚烷胺和金刚烷乙胺，此类药物在80年代获得美国FDA批准用于治疗甲型禽流感。(2)神经氨酸酶抑制剂不仅对甲型流感病毒有抑制作用，还可以抗乙型禽流感病毒。此类药物不易引起耐受性且耐受性好，目前已上市的药物扎那米韦(zanamivir)和奥塞米韦(oseltamivir)，对9种亚型的NA都有抑制作用，不易引起耐药性。

HA蛋白由HA1和HA2两个亚基组成。在流感病毒感染宿主细胞的时候，血凝素前体HA0水解成HAl和HA2亚基，这是是禽流感病毒具有感染性的必要步骤。其中HA1识别并结合宿主细胞膜表面的唾液酸受体，HA2能够协助病毒包膜与细胞膜的融合。因此任何分子若能够阻止HA0的水解具有抗病毒感染的活性。

目前阻断血凝素前体HA0水解的融合抑制剂研究成果有：一些丝氨酸蛋白酶抑制剂，如抗蛋白酶肽，亮肽酶素，e-aminocaproic酸，萘莫司他，肺部表面活性剂(一种具有表面活性的脂蛋白复合物，磷脂蛋白，由小泡2型细胞产生)，人黏液蛋白酶抑制剂都能够在细胞模型和动物模型上通过抑制HA0的水解达到抗流感病毒的感染。抗碱性氨基酸蛋白酶的拟肽抑制剂(dec-R-V-K-R-cmk)有抗H7高致病性禽流感病毒的活性，能够抑制病毒复制。后来研究发现拟肽抑制剂(dec-R-V-K-R-cmk)还可以抑制广泛存在的2型跨膜丝氨酸蛋白酶MPSL/TMPRSSl3和其他胰岛素蛋白酶如胞浆素。Kilo等人报道了MPSL/TMPRSSl3能够水解H5亚型和H7亚型。因此，人体中MPSL/TMPRSSl3的天然抑制剂能够作为先导化合物来开发以血凝素为靶点的抗病毒药物。

目前多肽化合物抑制流感病毒有以下三个方面的研究(1)设计唾液酸类似物多肽竞争性与HA1结合Teruhiko et al等报道他们从一个随机肽库中筛选针对出H1和H3病毒株的小分子多肽。筛选出来的多肽对HA有亲和性。随后他们又设置子肽库并随机进行第二和第三次筛选以找出能具有更好的与HA作用的多肽。对于最后找出来的多肽，他们利用分子对接模拟实验显示它们具有与唾液酸类似的结构，可以竞争性与HA1的受体结合口袋结合。其中C₁₇H₃₅CO-ARLPRTMV-NH₂和C₁₇H₃₅CO-ARLPR-NH₂表现出阻止禽流感病毒H1N1进入宿主的高活性，其IC50分别是3.0和1.9μM。

在2006年,Jeremy C.Jones等从纤维母细胞生长因子中发现一个20个氨基酸的多肽EB(NH2-RRKKAAVALLPAVLLALLAP-COOH)能特异性地与HA1结合，阻止HA与细胞表面的受体结合，在体内和体外都表现出广谱的抗流感病毒活性。不久，一个更短的多肽P1(CNDFRSKTC)具有与EB同样的抑制机制被开发出来。(2)屏蔽宿主细胞膜上的唾液酸受体是另一种策略Teruhiko Matsubara等报道，他们从一个噬菌体随机肽库中确定一个具有对细胞表面唾液酸亲和力的几个多肽，并通过丙氨基酸扫描发现这几个多肽中的7个氨基酸残基对多肽与唾液酸的识别起到关键性作用。这些肽与细胞表面的唾液酸结合可以明显抑制禽流感病毒在体内的复制扩散。他们通过对来自N端固醇化的两个多肽化合物C18-c01(GWWYKGRARPVSAVA)和C18-c03(RAVWRHSVATPSHSV)的多肽部分c01和c03分别进行烷基化，发现可以提高它们与唾液酸受体的结合能力，它们的IC50分别为3.2和6.5μM。(3)以HA2为靶点的多肽由于流感病毒与HIV病毒同属于I类膜蛋白，有相同的进入机制，现在已经有许多科学家正尝试开发类似恩夫韦肽的抗禽流感病毒的多肽。但是，要复制恩夫韦肽不是一件容易的事情。相比较HIVgp41在胞外的中性条件下介导的膜融合，HA介导的膜融合是细胞内的酸性条件下。因而，为了阻止融合过程，来自HA2的HR2区域的活性肽必须事先透过细胞膜进入胞内，并在酸性条件下保持稳定的结构。但到目前为止，仅有一组科学家报道说来自HA2并连接胆固醇的多肽能阻止禽流感病毒和细胞膜融合和病毒感染。他们假设由于胆固醇的作用，多肽能穿过细胞膜，在细胞胞吞的过程中进入胞内从而阻止禽流感病毒和细胞的膜融合。

此外抗流感病毒药物研究还有：靶向血凝素的DNA疫苗、靶向血凝素的病毒载体疫苗、靶向血凝素的类病毒粒子疫苗、靶向血凝素的重组亚单位疫苗和靶向血凝素保守序列的疫苗。

在抗菌方面，抗菌肽(AMPs)是宿主免疫系统抵抗病原微生物入侵的保守组成部分。它们代表着一组新的抗菌药物家族，在细菌、真菌、植物和动物等生物体中广泛存在。如今，由于细菌耐药株的产生，人类迫切需要研发新的、具有更好效能的抗生素来替代老的药效已经降低或者失效的抗生素。在这点上，因为具有快速杀菌速率和不易产生耐药性的优点，抗菌肽被认为是取代传统抗生素的新一代候选化合物。抗菌肽的来源很广泛，除了天然的防御肽，还有合理设计的合成肽。与天然的宿主防御肽相比，合成肽更易获得、免疫原性较低并且成本更低。

抗菌肽的出现为人们寻找理想的抗菌药物提供新的领域，因此抗菌肽具有巨大的应用潜力。自从Boman等人在1972年首先在果蝇中发现了抗菌肽，随后1981年Steiner等人又从美国天蚕中成功地分离到两种抗菌肽Cecropin-A和Cecropin-B后，截止2014年初，已发现的天然AMPs超过2000条。近年来，计算机辅助药物分子设计技术的发展，极大的促进了抗菌肽的研究和开发，已有超过十个根据天然阳离子抗菌肽合成的类似物进入临床或临床前的试验阶段，典型的代表是蛙皮提取的Magainins是第一种进入药品开发程序的抗菌肽，美国马盖宁制药公司已经开发筛选出对细菌、病毒和肿瘤细胞均有明显的杀伤作用的两种新型抗菌肽：Pexiganan(MSI-78)和MAI1278现已进入临床Ⅲ期试验，可以预测在不久的将来抗菌肽将会成为寻找新药的重要领域。TriPep公司正在研制的小肽GPG，已经在欧洲进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验，治疗两周以上发现，病毒复制减慢，显示出一定的抗HIV应用前景；口服抗菌肽Ambicin和Isegangn已成功地完成Ⅰ期安全性评价；加拿大MicroLogix生化技术公司的两种抗菌肽MBI-226和MBI-594进入Ⅱ期或Ⅲ期的严重粉刺感染的临床研究，其中MBI-226Ⅲ期临床试验结果表明，在诱导期只有极小的刺激反应，与阴性组对照，蓄积刺激反应更小。最引人注目的Trimeris公司的抗HIV抗菌肽Enfuvritide(T20)已在数年前成功上市。

两类治疗流感病毒的药物存在不足:其中金刚烷胺、金刚烷乙胺等药物只能抑制甲型禽流感，对乙型禽流感无效，用药产生副作用大，而且其只作用于离子通道M2靶点，容易产生耐药性。同时，目前在临床上已经观察到奥塞米韦的耐药株。2009年大流行的猪流感病毒(H1NI)就对奥塞米韦耐药，而且这种耐药突变获得稳定遗传。扎那米韦对奥赛米韦的耐药株仍然有效。科学家在用奥塞米韦治疗高致病性禽流感H5NI患者，虽然能降低患者病毒载量，但最终不能有效降低致死率。

一些抑制HA0水解的抗蛋白酶，氨基酸序列长，成本高，机体用药容易产生抗原免疫反应。本研究的多肽最长只有22个氨基酸，相对来说，成本低，不容易产生免疫反应。

目前以HA2作为靶点抑制流感病毒进入宿主的研究少，仅有一组科学家报道说来自HA2并连接胆固醇的多肽能阻止禽流感病毒和细胞膜融合和病毒感染。他们假设由于胆固醇的作用，多肽能穿过细胞膜，在细胞胞吞的过程中进入胞内从而阻止禽流感病毒和细胞的膜融合。本研究中的多肽能够通过抑制HA2在酸性条件下的构象变化，抑制流感病毒进入宿主细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物。

本发明所采取的技术方案是：

一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物，该类融合肽衍生物源于对流感病毒中融合肽的修饰改造，具体包括以下修饰改造后的氨基酸序列：

GLFGAIAGFI_NGW_GMI_G；GLFGAIAGFI__GW_GMV_G；

GLFGAIAGFI_GGW Q GMV_G；GLFGAIAGFI_G GWP GLV_G；

GLFGAIAGFI__GWP GLV_G；GLFGAIAGFI_NGW_GMI_GWY；

GLFGAIAGFI__GW_GMV_GWY；GLFGAIAGFI_GGW Q GMV_GWY；

GLFGAIAGFI_G GWP GLV_GWY；GLFGAIAGFI__GWP GLV_GWY；

GLFGAIAGFI_NGW_GMI_GWYG；GLFGAIAGFI__GW_GMV_GWYG；

GLFGAIAGFI_GGW Q GMV_GWYG；GLFGAIAGFI_G GWP GLV_GWYG；

GLFGAIAGFI__GWP GLV_GWYG；

I_NGW_GMI_GWYG；I_NGW_GMI_GWY；I__GW_GMV_GWYG；

I_GGW Q GMV_GWYG；I__GW_GMV_GWY；I_GGW Q GMV_GWY；

I_G GWP GLV_GWYG；I__GWP GLV_GWYG；I_G GWP GLV_GWY；

I__GWP GLV_GWY；

GLFGAIAGFI_NG；GLFGAIAGFI__G；GLFGAIAGFI_GG；

I_N GW_GMI_GWYG；I_N GW_G MI_GWY；I__GW_GMV_GWYG；

I_GGW Q GMV_GWYG；I__GW_GMV_GWY；I_GGW QGMV_GWY；

I_GGWPGLV_GWYG；I__GWP GLV_GWYG；I_GGWP GLV_GWY；

I__GWP GLV_GWY；

上述序列中横线位置独立为带正电荷的氨基酸、或其类似物、或其异构体、或其盐、或其衍生物、或其络合物、或其水合物中的一种，所述异构体包括几何异构体和光学异构体；

上述斜体加阴影表示的甘氨酸G还可以独立替换成丙氨酸、D-丙氨酸、β-丙氨酸、N-甲基丙氨酸、亮氨酸、D-亮氨酸、高亮氨酸、D-高亮氨酸、N-甲基亮氨酸、正亮氨酸、D-正亮氨酸(D-Nle)、N-甲基正亮氨酸中的一种，或者为前述氨其酸的异构体、盐、衍生物、络合物、水合物中的一种，所述异构体包括几何异构体和光学异构体。

进一步的，上述的带正电荷的α－氨基酸包括赖氨酸、D-赖氨酸、单甲基赖氨酸、双甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、精氨酸、D-精氨酸、高精氨酸、单甲基精氨酸、对称双甲基精氨酸、不对成双甲基精氨酸、鸟氨酸、D-鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸。

一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物该类融合肽衍生物为对上述所述的融合肽衍生物进行脂化、糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、N-酰化、通过二硫键环化、转化成酸加成盐、二聚体化、多聚体化或/和缀合化修饰后所得到的新的融合肽衍生物。

进一步的，上述脂化中所用到的脂质基团选自脂肪酸，磷脂基团，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰胆碱，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯，胆固醇，五环三萜类基团中至少一种。

进一步的，上述脂化中所用到的脂质基团为脂肪酸，所述脂肪酸为C6～C20脂肪酸。

进一步的，上述C6～C20脂肪酸为月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸或花生酸。

一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物，该类融合肽衍生物的序列分别为：

HA-FP-1：GLFGAIAGFIKNGWKGMI KG(SEQ ID NO:1)；

HA-FP-2：GLFGAIAGFIKGGWQGMVKG(SEQ ID NO:2)；

HA-FP-2-1：GLFGAIAGFIKKGWKGMVKG(SEQ ID NO:3)；

HA-FP-3：GLFGAIAGFIKGGWP GLVKG(SEQ ID NO:4)；

HA-FP-3-1：GLFGAIAGFIKGGWP GL VKG(SEQ ID NO:5)；

HA-FP-1-22：GLFGAIAGFIKNGWKGMI KGWY(SEQ ID NO:6)；

HA-FP-1-13:IKNGWKGMI KGWY(SEQ ID NO:7)；

HA-FP-1-13-1:IKNAWKAMI KAWY(SEQ ID NO:8)；

HA-FP-1-13-2:IKNLWKLMI KLWY(SEQ ID NO:9)。

本发明的有益效果是：

本发明修饰改造得到的融合肽衍生物在测试范围内对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有抑制作用，成其是HA-FP-1、HA-FP-2、HA-FP-3-1表现出很好的抗菌活性。而且这些融合肽衍生物具有抗流感病毒活性，能够通过抑制流感病毒HA2亚基在酸性条件下构象变化，达到阻断流感病毒进入宿主细胞内。这些多功能抗微生物多肽在病毒性感冒合并细菌感染存在潜在的应用的前景。

附图说明

图1为相关多肽二级结构的预测(A)和螺旋轮投影(B)，其中肽二级结构的预测使用http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/PEP-FOLD/中的工具；

图2为融合肽衍生物的杀菌速率；

图3为融合肽衍生物在中性和酸性条件下的圆二色谱CD光谱曲线，圆二色谱CD检测实验中各融合肽衍生物的浓度为0.02mM，溶剂为50％(v/v)TFE(pH 7)或50％TFE(pH 5)，每次检测重复4次；

图4为PI吸收实验；A表示在有HA-FP-1存在的条件下，PI荧光染料进入细菌S.aureus内与细菌DNA结合，发出红色荧光；B为TritonX-100阳性对照，PI荧光染料进入细菌体内；C为PBS阴性对照PI荧光染料未能进入细菌体内；

图5为融合肽衍生物对MDCK细胞的细胞毒性实验结果(A)及溶血活性检测结果(B)；

图6为融合肽衍生物抑制H5N1假病毒感染MDCK细胞的能力检测；

图7为融合肽衍生物抑制VSVG假病毒感染MDCK细胞的检测；

图8为qRT-PCR检测融合肽衍生物对活毒A/PR8/34(H1N1)HA基因复制的影响情况；其中cell表示MDCK细胞，virus表示活毒A/PR8/34(H1N1)；

图9为融合肽衍生物对HA抗原引发凝血现象的影响情况；“+”表示阳性对照组，加入HA1抗体；“-”表示阴性对照组，加入PBS；浓度200μg/mL～0.39μg/mL表示融合肽衍生物的浓度；每一个孔都加有HA抗原和鸡红细胞；

图10为不同比例的HA-FP-1和HA-FP-O混合物对H5N1假病毒进入细胞的抑制作用；其中，HA-FP-1曲线表示只有25μg/mL HA-FP-1对病毒的抑制率；HA-FP-O曲线表示只有HA-FP-O存在时，对病毒的抑制率；HA-FP-1+HA-FP-O曲线表示HA-FP-1与不同浓度HA-FP-O对病毒的抑制率，横坐标的比例表示HA-FP-1与HA-FP-O的浓度比；

图11为计算机模拟模型展示融合肽衍生物与HA的相互作用，A表示在酸性条件下HA2发生了构象变化，摸拟了流感病毒通过HA进行隔膜的过程；B表示在有本发明融合肽衍生物存在的条件下，本发明融合肽衍生物能与HA2N端的多肽相互结合，HA2在酸性条件下的构象变化将被阻断，即流感病毒的隔膜过程被抑制；C-Ⅰ表示HA-FP-1和HA2N端的结合；C-Ⅱ表示HA-FP-O和HA2N端的结合。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物

本发明将流感病毒不同HA亚型中N端的融合肽进行修饰改造获得相应的兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物。

一、基于截取融合肽的N端20位氨基酸序列设计的融合肽衍生物

(1)、基于H3亚型的融合肽得到融合肽衍生物

H3亚型的融合肽序列(23位氨基酸)为：GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG，去掉序列中最后三个氨基酸(GLFGAIAGFIENGWEGMIDG)，将11号位谷氨酸(Glu)、15号位谷氨酸(Glu)和19号位的天冬氨酸(Asp)用赖氨酸(Lys)、D-赖氨酸(D-Lys)、单甲基赖氨酸[Lys(Me)]、双甲基赖氨酸[Lys(Me2)]、三甲基赖氨酸[Lys(Me3)]、精氨酸(Arg)、D-精氨酸(D-Arg)、高精氨酸(Har)、单甲基精氨酸[Arg(Me)]、对称双甲基精氨酸(SDMA)、不对成双甲基精氨酸(ADMA)、鸟氨酸(Orn)、D-鸟氨酸(D-Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)等类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物(如氨基酸或其异构体、或其盐、或其衍生物、或其络合物、或其水合物，所述异构体包括几何异构体和光学异构体)替代得到融合肽衍生物。

11、15和19号位氨基酸被上述氨基酸或者氨基酸类似物替代得到一大类融合肽衍生物:

GLFGAIAGFI_NGW_GMI_G

横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

(2)、基于H5亚型的融合肽得到融合肽衍生物

H5亚型的融合肽序列为：GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG，去掉序列中最后三个氨基酸(GLFGAIAGFIEGGWQGMVDG)，将11号位谷氨酸(Glu)、12号位甘氨酸(Gly)、15号位谷氨酰胺(Gln)和19号位的天冬氨酸(Asp)或者11号位谷氨酸(Glu)、19号位的天冬氨酸(Asp)用赖氨酸(Lys)、D-赖氨酸(D-Lys)、单甲基赖氨酸[Lys(Me)]、双甲基赖氨酸[Lys(Me2)]、三甲基赖氨酸[Lys(Me3)]、精氨酸(Arg)、D-精氨酸(D-Arg)、高精氨酸(Har)、单甲基精氨酸[Arg(Me)]、对称双甲基精氨酸(SDMA)、不对成双甲基精氨酸(ADMA)、鸟氨酸(Orn)、D-鸟氨酸(D-Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)等类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物(如氨基酸或其异构体、或其盐、或其衍生物、或其络合物、或其水合物，所述异构体包括几何异构体和光学异构体)替代得到融合肽衍生物。

11、12、15、19与11、19号位氨基酸被上述氨基酸和氨基酸类似物替代得到两大类融合肽衍生物：

GLFGAIAGFI__GW_GMV_G；GLFGAIAGFI_GGW Q GMV_G；

横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

(3)、基于H9亚型的融合得到融合肽衍生物

H9亚型的融合肽序列为：GLFGAIAGFIEGGWPGLVAGWYG，去掉序列中最后三个氨基酸(GLFGAIAGFIEGGWPGLVAG)，将11号位谷氨酸(Glu)、19号位的丙氨酸(Ala)或者11号位谷氨酸、12号位甘氨酸(Gly)和19号位的丙氨酸用赖氨酸(Lys)、D-赖氨酸(D-Lys)、单甲基赖氨酸[Lys(Me)]、双甲基赖氨酸[Lys(Me2)]、三甲基赖氨酸[Lys(Me3)]、精氨酸(Arg)、D-精氨酸(D-Arg)、高精氨酸(Har)、单甲基精氨酸[Arg(Me)]、对称双甲基精氨酸(SDMA)、不对成双甲基精氨酸(ADMA)、鸟氨酸(Orn)、D-鸟氨酸(D-Orn)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨基丙酸(Dap)等类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物(如氨基酸或其异构体、或其盐、或其衍生物、或其络合物、或其水合物，所述异构体包括几何异构体和光学异构体)替代得到融合肽衍生物。

11、12、19与11、19号位氨基酸被上述氨基酸和氨基酸类似物替代得到两大类融合肽衍生物：

GLFGAIAGFI_G GWP GLV_G；GLFGAIAGFI__GWP GLV_G；

横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

二、基于截取融合肽的N端22位氨基酸序列设计的融合肽衍生物

(1)、基于H3亚型的融合肽得到融合肽衍生物

H3亚型的融合肽序列(23位氨基酸)为：GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG，去掉序列中最后1个氨基酸(GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWY)，将11号位谷氨酸(Glu)、15号位谷氨酸(Glu)和19号位的天冬氨酸(Asp)用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:

GLFGAIAGFI_NGW_GMI_GWY

横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

(2)、基于H5亚型的融合肽得到融合肽衍生物

H5亚型的融合肽序列为：GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG，去掉序列中最后1个氨基酸(GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWY)，将11号位谷氨酸(Glu)、12号位甘氨酸(Gly)、15号位谷氨酰胺(Gln)和19号位的天冬氨酸(Asp)或者11号位谷氨酸(Glu)、19号位的天冬氨酸(Asp)用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:

GLFGAIAGFI__GW_GMV_GWY；GLFGAIAGFI_GGW Q GMV_GWY；

横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

(3)、基于H9亚型的融合得到融合肽衍生物

H9亚型的融合肽序列为：GLFGAIAGFIEGGWPGLVAGWYG，去掉序列中最后三个氨基酸(GLFGAIAGFIEGGWPGLVAG)，将11号位谷氨酸(Glu)、19号位的丙氨酸(Ala)或者11号位谷氨酸、12号位甘氨酸(Gly)和19号位的丙氨酸用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:

GLFGAIAGFI_G GWP GLV_GWY；GLFGAIAGFI__GWP GLV_GWY；

横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

三、基于融合肽的N端23位氨基酸序列设计的融合肽衍生物

(1)、基于H3亚型的融合肽得到融合肽衍生物

H3亚型的融合肽序列为：GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG,将11号位谷氨酸(Glu)、15号位谷氨酸(Glu)和19号位的天冬氨酸(Asp)用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:

GLFGAIAGFI_NGW_GMI_GWYG

横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

(2)、基于H5亚型的融合肽得到融合肽衍生物

H5亚型的融合肽序列为：GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG，将11号位谷氨酸(Glu)、12号位甘氨酸(Gly)、15号位谷氨酰胺(Gln)和19号位的天冬氨酸(Asp)或者11号位谷氨酸(Glu)、19号位的天冬氨酸(Asp)用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:

GLFGAIAGFI__GW_GMV_GWYG；GLFGAIAGFI_GGW Q GMV_GWYG；

横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

(3)、基于H9亚型的融合得到融合肽衍生物

H9亚型的融合肽序列为：GLFGAIAGFIEGGWPGLVAGWYG，将11号位谷氨酸(Glu)、19号位的丙氨酸(Ala)或者11号位谷氨酸、12号位甘氨酸(Gly)和19号位的丙氨酸用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:

GLFGAIAGFI_G GWP GLV_GWYG；GLFGAIAGFI__GWP GLV_GWYG；

横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

四、基于截取融合肽的C端13和14位氨基酸序列设计两类融合肽衍生物

(1)、基于H3亚型的融合肽得到融合肽衍生物

H3亚型的融合肽序列为：GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG,截取得到氨基酸序列IENGWEGMIDGWYG和IENGWEGMIDGWY，将新序列的2号位谷氨酸(Glu)、6号位谷氨酸(Glu)和10号位的天冬氨酸(Asp)用上述“一”中所述的氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:

I_NGW_GMI_GWYG；I_NGW_GMI_GWY；

横线位置用上述“一”中所述的氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

(2)、基于H5亚型的融合肽得到融合肽衍生物

H5亚型的融合肽序列为：GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG，截取得到氨基酸序列IEGGWQGMVDGWYG和IEGGWQGMVDGWY，将新序列2号位谷氨酸(Glu)、3号位甘氨酸(Gly)、6号位谷氨酰胺(Gln)和10号位的天冬氨酸(Asp)或者2号位谷氨酸(Glu)、10号位的天冬氨酸(Asp)用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:

I__GW_GMV_GWYG；I_GGW Q GMV_GWYG；I__GW_GMV_GWY；

I_GGW Q GMV_GWY；

横线位置用上述“一”中所述的氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

(3)、基于H9亚型的融合得到融合肽衍生物

H9亚型的融合肽序列为：GLFGAIAGFIEGGWPGLVAGWYG，截取得到氨基酸序列IEGGWPGLVAGWYG和IEGGWPGLVAGWY，将新序列的2号位谷氨酸(Glu)、10号位的丙氨酸(Ala)或者2号位谷氨酸、3号位甘氨酸(Gly)和10号位的丙氨酸用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:

I_G GWP GLV_GWYG；I__GWP GLV_GWYG；

I_G GWP GLV_GWY；I__GWP GLV_GWY；

横线位置用上述“一”中所述的氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

五、基于截取融合肽的C端13和14位氨基酸序列的进一步改造得到融合肽衍生物

基于截取融合肽的C端13和14位氨基酸序列的进一步改造获得的融合肽衍生物为：

I_N GW_GMI_GWYG；I_N GW_G MI_GWY；I__GW_GMV_GWYG；

I_GGW Q GMV_GWYG；I__GW_GMV_GWY；I_GGW QGMV_GWY；

I_GGWPGLV_GWYG；I__GWP GLV_GWYG；I_GGWP GLV_GWY；

I__GWP GLV_GWY；

横线位置依然用上述“一”中所述的氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代；同时，斜体加阴影表示的甘氨酸G还可以独立替换成丙氨酸(Ala)、D-丙氨酸(D-Ala)、β-丙氨酸(β-Ala)、N-甲基丙氨酸(N-Me-Ala)等化学结构、化学性质相似的氨基酸或者氨基酸类似物替代，或者用亮氨酸(Leu)、D-亮氨酸、高亮氨酸(HomoLeu)、D-高亮氨酸(D-HomoLeu)、N-甲基亮氨酸(N-Me-Leu)、正亮氨酸(Nle)、D-正亮氨酸(D-Nle)、N-甲基正亮氨酸(N-Me-Nle)等化学结构、化学性质相似的氨基酸或者氨基酸类似物替代。

六、基于截取融合肽的N端13位氨基酸序列设计的融合肽衍生物

(1)、基于H3亚型的融合肽得到融合肽衍生物

截取H3亚型的融合肽序列：GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG氮端13位氨基酸得到氨基酸序列为GLFGAIAGFIENG，将11号位谷氨酸(Glu)用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:

GLFGAIAGFI_NG

横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

(2)、基于H5亚型的融合肽得到融合肽衍生物

H5亚型的融合肽序列：GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG氮端13位氨基酸得到氨基酸序列为GLFGAIAGFIEGG，将11号位谷氨酸(Glu)和12号位甘氨酸(Gly)用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物替代得到融合肽衍生物:

GLFGAIAGFI__G；GLFGAIAGFI_GG；

横线位置用上述氨基酸或者类似性质的氨基酸、与氨基酸结构类似或者与氨基酸化学性质类似的化合物任意组合替代。

七、对上述所有融合肽衍生物序列的修饰

除了以上所有融合肽衍生物氨基酸序列以外，还可以对其氮端、碳端、或/和任一氨基酸残基进行修饰改造得到仍具有抗菌抗流感病毒的新融合肽衍生物。例如，融合肽衍生物的脂化(例如，脂肪酸化)、糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、N-酰化、通过二硫键环化、转化成酸加成盐、二聚体化或多聚体化、缀合化。举例来说，本发明所述融合肽衍生物可以是脂化衍生物。所含的脂质分子可以包括本领域己知的任何脂质，例如，脂肪酸，磷脂基团，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰胆碱，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯和胆固醇基团。优选地，所述脂化衍生物是脂肪酸衍生物，所述脂肪酸分子可以是任何C6-C20脂肪酸，例如，月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸或花生酸等。所述脂肪酸还可以在任意碳原子上任选地包含其他官能团，例如，一个或多个氨基，一个或多个羧基。所述脂肪酸分子可以附着在本发明融合肽衍生物任何适当的部分。例如，在本发明的多肽氨基端、羧基端、或氨基和羧基两端包括脂肪酸分子。脂肪酸分子可以直接或通过连接体附着到本发明的融合肽衍生物。此外还包括胆甾醇等环戊烷多氢菲和五环三萜类分子的氨基端衍生化。

实施例2

本实施例中所涉及的相关实验方法如下：

1.菌株、细胞和培养条件

本研究使用的菌株:Staphylococcus aureus(ATCC12600),Escherichia coli(ATCC25922),Pseudomonas aeruginosa(ATCC25853)和Streptococcus mutans(ATCC25175)。所有菌种保存在-80℃冰箱(Microbank vials)。培养条件：S.aureus、S.mutans用TH培养基(Todd-Hewitt broth)在37℃下培养，E.coli、P.aeruginosa用LB培养基(Luria-Bertani broth)在37℃下培养。除了S.mutans在厌氧条件下培养，其余三个菌在需氧条件下培养。

MDCK细胞、293T细胞来源于ATCC，用DMEM培养基(含谷氨酰胺、10％FBS)在37℃、5％CO₂条件下培养。

2.多肽合成

肽都是通过酰胺MHBA树脂使用标准9-芴甲基羰基Fmoc固相合成方法合成。序列的合成是在ABI 433A多肽合成仪中进行。肽伸长反应条件为：以标准HBTU/HOBt为耦合试剂，以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，2倍过量的二异丙基乙胺(DIEA)，8倍过量的含Fmoc保护基团的氨基酸或10倍过量的游离脂肪酸。脂肪酸是耦合使用标准用于所有合成氨基酸耦合条件。肽都是使用试剂M从树脂裂解,试剂M包括87.5％三氟乙酸,2.5％乙二硫醇,5％茴香硫醚和5％去离子水(3h,室温),粗产品沉淀在甲基叔丁基醚，相同的溶剂洗两次。肽荧光标记进行氨基酸相同的耦合过程采用罗丹明作为酸溶剂，反应12个小时。每个肽的分子量通过电喷雾电离质谱(ESI-MS,Waters)证实。结果如表1中详细说明。肽纯化使用RP-HPLC,实验条件：流速1mL/min；流动相溶液A水(0.1％三氟乙酸)溶液B乙腈(0.1％三氟乙酸)；梯度从15％到20％B(2min)，从20％到60％B(6min)，从60％到80％B(4min)，从80％到90％B(4min)。

3.最低抑菌浓度测试

细菌37℃过夜培养得1×10⁸CFU/mL，培养基稀释到1×10⁵CFU/mL。肽浓度从125μg/mL稀释到1.95μg/mL，再加入100μL 1×10⁵细菌中。在37℃培养17到20小时后记录最低抑菌浓度。所有实验平行四到六个独立重复实验。

4.时间杀菌测定法

S.aureus(1×10⁶CFU/mL)用25μM药物在25℃下分别处理0、30、60、90、150、和240分钟，处理后，培养液1：50稀释，置于冰上。取20μL稀释液置于TH琼脂培养基上，37℃培养24小时，记录菌落数。所有实验平行独立重复3到4次。

5.均一脂质体(SVUs)的制备

根据文献报道的方法进行脂质提取：S.aureus 50mL菌液摇床过夜培养。菌液6000rpm离心15min，弃去上清液，得到菌体。菌体加入双蒸水重悬，6000rpm离心5min,重复洗两次。清洗后，倒去水，依次加入总体积40mL有机溶剂(氯仿：甲醇:水＝1：2：0.8)。每加入一种溶剂，涡旋振荡15s以充分分散，全部溶剂加入完毕，间隔摇18h。提取后，混浊液加入有机溶剂(氯仿：甲醇:水＝1：1：0.9)萃取，得到氯仿层。氯仿层蒸发旋转仪蒸干，再用真空干燥仪除去剩余的溶剂，如此，可以得到0.127g脂质。

脂质用KPB溶剂(0.1M磷酸钾缓冲溶液0.1mM EDTA pH7.2)涡旋振荡溶解，得到10mg/mL脂质溶液。脂质溶液反复用超声仪超声得到SVUs。

6.色氨酸荧光实验

使用RF-5301仪器(Shimadzu Japan)进行荧光测试。激发光、发射光通过的狭缝分别为3nm、5nm。实验中，多肽的浓度为5μM。多肽在SUVs溶剂体系为实验组，仅在KPB溶剂体系为对照组，两组分别在280nm激发，发射波长扫描范围是290nm到500nm。

7.PI吸收实验

PI荧光试剂检测多肽与细胞膜的作用。分别取10μL 250μM HA-FP-1、10μL 1％triton X-100(阳性对照)加入到80μL S.aureus(1×10⁷CFU/mL)菌液中。实验组在室温下作用15min，阳性对照组作用5min。作用后，离心，弃去上清液，用PBS清洗两次。取2μL液体制临时装片，用荧光显微镜(Nikon Japan)观察。

8.MTT实验

1×10⁴/孔MDCK细胞于96孔板培养过夜后，加入多肽与MDCK细胞在37℃共同孵化48h,弃去上清液，每孔加入100μL 0.5×10-3mg/mL MTT，再在37℃中孵育4h。最后，弃去MTT溶液，加入150μL DMSO溶解甲瓒晶体，用酶标仪在570nm测其吸收度。细胞存活率的百分比计算：AT/AC×100(AT：实验组的吸光度AC：对照组的吸光度)。

9.病毒滴度降低实验

多肽抗活毒活性用病毒滴度降低实验测试。药物与病毒A/PR8/34(H1N1)、A/Aichi/2/68(H3N2)在100TCID50中37℃孵育30min，随后，药物与病毒混合液加入到MDCK细胞中，孵育60min。孵育后，细胞用PBS洗两遍以除去没有吸附的病毒，最后再加入维持液孵育48h。处理48h后，移去维持液，加入100μL 0.5mg/mL的MTT孵育4h。孵育后，移去MTT溶液，每孔加入150μL DMSO，在570nm处，酶标仪测试吸光度。

抑制率的计算：

10.定量实时PCR实验(qRT-PCR)

qRT-PCR检测病毒HA基因复制情况。经活毒/PR8/34感染后的MDCK细胞分别用50、100μg/mL多肽孵育24h。孵育后，提取总RNA后逆转录为cDNA，随后进行实时PCR实验。

11.抗H5N1假病毒感染活性的检测

100μL/孔1x105/mL MDCK细胞接种到96孔细胞培养板中，5％CO₂，37℃培养过夜。用培养即将假病毒2倍稀释成6个稀释度，加入96孔细胞培养板中，加化合物每个稀释度3个复孔，终体积为200μL。设置细胞对照，不加假病毒。在5％CO₂，37℃条件下培养48h后，弃去培养基，200mL/孔,PBS洗涤1次。按照荧光素酶检测试剂盒说明书，检测假病毒的感染能力，具体如下：

A.每孔加入50μL裂解液，轻轻摇晃，在室温下静置20min，取409L细胞裂解液加入到96孔平底荧光素酶检测板中；

B.每孔加入60μL荧光素酶底物，用Genios Pro型Tecan酶标仪检测荧光素酶化学发光值。

以细胞对照孔化学发光值的2.5倍作为cutoff值，化学发光值大于cutoff均视为阳性。

12.抗凝血实验

实验孔、对照孔分别加入25μL源于H5的HA抗原。多肽药物用PBS倍比稀释得到200μg/mL到0.39μg/mL，加入50μL/孔0.5％鸡红细胞。阳性对照孔加入25μL HA1抗体，阴性对照为PBS。在室温下与鸡红细胞孵育1h后，观察结果。

13.圆二色谱实验

圆二色谱实验使用的仪器是J-810分光偏振仪。光路比色皿为2nm，CD光谱扫描范围是190-270nm,扫描速度为100nm/min，带宽是1.71nm。多肽的浓度为0.02mM，分别溶解在50％pH7与pH5的三氟乙醇(TFE)中。每次扫描重复4次。

α螺旋度计算:

本实施例中的相关实验结果如下：

(1)、融合肽衍生物的设计

融合肽是流感病毒包膜蛋白HA2的一个片段，它在病毒包膜与细胞膜的融合中起着重要的作用。融合肽可以通过干扰细胞膜的稳定并且破坏细胞膜屏障来帮助病毒进入宿主细胞内，随后，病毒借助宿主细胞进行扩增。使用圆二色谱仪、红外光谱仪和计算机模拟可以观察到融合肽在插入到细胞膜的时候形成α螺旋或者部分α螺旋结构(图1A)。同时α螺旋投影示意图显示，融合肽的结构与抗菌肽的结构十分相似(图1B)。虽然融合肽的结构与抗菌肽相似，并且具有破坏细胞膜稳定性的性质，但是与抗菌肽相比，大多数融合肽是带负电荷的。抗菌肽与细菌细胞膜作用的时候，多肽中带正电荷基团与细胞膜中带负电荷的磷脂相互作用，因此我们考虑将融合肽中部分带负电荷、不带电荷的氨基酸用带正电荷的氨基酸替代。例如，将原型融合肽HA-FP-O(H3亚型融合肽序列N端20位氨基酸GLFGAIAGFIENGWEGMIDG)中11、15、19位谷氨酸、天冬氨酸用赖氨酸替代，如此，得到融合肽衍生物HA-FP-1(表1)，将H5亚型的融合肽序列的N端20位氨基酸GLFGAIAGFIEGGWQGMVDG的11、19位(下划线)氨基酸用赖氨酸替代，得到融合肽衍生物HA-FP-2(表1)；将H5亚型的融合肽序列的N端20位氨基酸GLFGAIAGFIEGGWQGMVDG的11、12、15、19位(下划线)氨基酸用赖氨酸替代，得到融合肽衍生物HA-FP-2-1(表1)；将H9亚型的融合肽序列的N端20位氨基酸GLFGAIAGFIEGGWPGLVAG的11、19位(下划线)氨基酸用赖氨酸替代，得到融合肽衍生物HA-FP-3(表1)；将H9亚型的融合肽序列的N端20位氨基酸GLFGAIAGFIEGGWPGLVAG的11、12、19位(下划线)氨基酸用赖氨酸替代，得到融合肽衍生物HA-FP-3-1(表1)；实施例1中其他所述的融合肽衍生物也进行了本实施例中相关实验研究，结果与表1中的5种融合肽衍生物的结果相似，在此不一一赘述。上述多肽合成的方法，见上述方法部分的第2点。

表1从甲型流感病毒中的融合肽获得相应的融合肽衍生物

^a表示所有多肽序列的C端被酰胺化，其分子量的计算采用http:// www.peptidesynthetics.co.uk/tools/中的工具；

^bPI等电点的计算采用http://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool中的工具；

^cRt(retention time,minutes)表示在RP-HPLC分析中各多肽的相对保留时间；

^d％α表示螺旋性(Helicity)，通过圆二色谱CD测定获得相关数据；

^eNA表示无活性。

(2)、融合肽衍生物的抗菌活性

最小抑菌浓度MIC实验测试融合肽及其融合肽衍生物对革兰氏阳性菌(S.mutansS.aureus)、革兰氏阴性菌(P.aeruginosaE.coli)的最小抑菌浓度MIC(具体操作见上述方法部分的第3点)。从表2中，我们可以知道原型融合肽HA-FP-O在125μg/mL对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均没有活性，在测试范围内，融合肽衍生物HA-FP-1、HA-FP-2-1、HA-FP-3-1表现出较好抗菌活性，其中对S.mutans最低抑菌浓度为3.9μg/mL，对S.aureus最低抑菌浓度为7.8μg/mL。融合肽衍生物HA-FP-1-22、HA-FP-1-13、HA-FP-1-13-1、HA-FP-1-13-2对S.mutans具有较好的抑制效果。

上述融合肽衍生物HA-FP-1-22(GLFGAIAGFIKNGWKGMI KGWY)为H3亚型融合肽序列N端20位氨基酸GLFGAIAGFIENGWEGMIDG)中11、15位谷氨酸(E)、第19位天冬氨酸(D)用赖氨酸(K)替代所得到的融合肽衍生物；

HA-FP-1-13为将H3亚型的融合肽序列C端13位氨基酸序列IENGWEGMIDGWY的2号位谷氨酸(E)、6号位谷氨酸(E)和10号位的天冬氨酸(D)用赖氨酸(K)替代所得到的融合肽衍生物；

HA-FP-1-13-1(IKNAWKAMI KAWY)为将H3亚型的融合肽序列C端13位氨基酸序列IENGWE GMID GWY的2号位谷氨酸(E)、6号位谷氨酸(E)和10号位的天冬氨酸(D)用赖氨酸(K)替代，并且第4、7、11号的甘氨酸(G)被丙氨酸(A)替代所得到的融合肽衍生物；

HA-FP-1-13-2(IKNLWKLMI KLWY)为将H3亚型的融合肽序列C端13位氨基酸序列IENGWE GMID GWY的2号位谷氨酸(Glu)、6号位谷氨酸(Glu)和10号位的天冬氨酸(Asp)用赖氨酸替代，并且第4、7、11号的甘氨酸(G)被亮氨酸(L)替代所得到的融合肽衍生物。

表2融合肽衍生物的抗菌活性

注：NT表示没有测试。

(3)、融合肽衍生物的杀菌速率

虽然融合肽衍生物HA-FP-1、HA-FP-2-1、HA-FP-3-1对革兰氏阳性菌、阴性菌的最低抑菌浓度没有区别，但是三个多肽对S.aureus表现出不同的杀菌速度(具体实验方法见上述方法部分的第4点)，将1×10⁶cfu/mL S.aureus的菌液中分别加入不同的融合肽衍生物，使融合肽衍生物浓度均为25μM，然后置于25℃条件下培养，检测不同培养时间后菌体的浓度，检测结果如图2所示，其中HA-FP-1在30min内杀灭70％的S.aureus，而HA-FP-3-1在30min内没有杀菌活性(图2)。

(4)、圆二色谱实验

圆二色谱实验的具体方法见上述方法部分的第14点，实验结果显示HA-FP-3-1在30min内没有表现出杀菌活性，我们猜想可能是因为HA-FP-3-1的15位有一个脯氨酸，这个脯氨酸能够一定程度上破坏它的α螺旋结构。又或者，HA-FP-3-1有可能与抗菌肽buforinⅡ一样，作用在细胞内某一靶点。通过圆二色谱实验发现HA-FP-1、HA-FP-2-1、HA-FP-3-1的中性和酸性条件下的CD光谱曲线呈现的趋势相似，只有小小的区别(如图3的所示)。根据 计算，可知HA-FP-1、HA-FP-2-1、HA-FP-3-1的α螺旋度不同(如表1所示)。其中HA-FP-3-1的α螺旋度最小，这或许能够解释HA-FP-3-1在30min内的杀菌速度慢。

(5)、融合肽衍生物破坏细胞膜通透性

大多数抗菌肽通过与细胞膜相互作用达到破坏细胞膜完整性杀菌，为了考察融合肽衍生物的杀菌机制，我们做了色氨酸荧光实验(具体方见上述第6点)和PI吸收实验(具体方见上述第7点)。在SUVs(SVUs的制备方法见上述第5点)中，HA-FP-1、HA-FP-2-1蓝移分别是17nm、15nm,HA-FP-3-1的蓝移是9nm,这表明HA-FP-1在疏水性环境中改变最大。在同样实验条件下，HA-FP-O的蓝移最小(表3)。以上结果表明HA-FP-1与细胞膜的作用效果最强，这与融合肽衍生物杀菌速率快慢相符。

表3融合肽衍生物在不同溶剂中的色氨酸基发射最大荧光值的波长

^b表示当溶剂为SUVs时，融合肽衍生物和脂质的用量比为10mg/mL脂质与0.625mg/mL多肽的体积比为197:3(V/V)；^c表示融合肽衍生物在不同溶剂中的色氨酸发射最大荧光值的波长的差值，即蓝移情况。

我们以HA-FP-1进一步研究融合肽衍生物与S.aureus细胞膜的作用。在细胞膜通透性增大时，PI能够进入细胞膜内，与DNA结合，发出红色荧光。实验中，PBS组为阴性对照(图4C)，PI荧光染料不能进入细胞膜内。Triton X-100为阳性对照(图4B)，它是一种表面活性剂，能够溶解脂质，增加细胞膜的通透性，促使PI荧光染料进入细胞膜内。25μM HA-FP-1与细菌作用15min后，PI荧光染料进入细胞膜内，与细菌DNA结合，发出红色荧光(图4A)。以上结果显示，融合肽衍生物能够破坏细菌细胞膜的完整性。

(6)、融合肽衍生物溶血毒性和细胞毒性低

在抗菌肽的研发中，毒性是重要的考虑因素。为了测试本发明融合肽衍生物的毒性和选择性，我们做了溶血毒性实验(具体方法见上述第13点)和MTT试验(具体方法见上述第8点)。MTT试验中，我们测试了融合肽衍生物对MDCK细胞的毒性，结果显示融合肽衍生物细胞毒性低，HA-FP-1、HA-FP-2-1、HA-FP-3-1的CC50分别为144.4、195.1、209.9μg/mL(图5A)。溶血实验中，HA-FP-1在250μg/mL只有20％溶血率，而在125μg/mL溶血率低于10％(图5B)。说明本发明融合肽衍生物溶血毒性和细胞毒性低。

(7)、融合肽衍生物能够抑制H5N1假病毒进入宿主细胞，对VSVG假病毒没有抑制活性

融合肽在病毒包膜和细胞膜融合过程中起着不可或缺的作用，那么这些来源于融合肽的衍生肽可不可以与HA相互作用起到抑制病毒进入细胞的作用呢？带着这个疑问，我们利用A/Thailand/Kan353/2004H5N1毒株假病毒筛选模型进行抗流感病毒感染活性测试(具体方法见上述第11点)，测试结果表明融合肽衍生物有抗H5N9假病毒效果，其中HA-FP-1、HA-FP-2-1抗病毒活性最高，HA-FP-1抗H5N1假病毒IC50为26.5μg/mL(图6)，对VSVG假病毒无活性(图7)。从以上实验，可以知道融合肽衍生物可以阻断N5N1假病毒进入宿主细胞内。

(8)、融合肽衍生物具有抗活毒流感病毒活性，且能够抑制其复制。

为了进一步确证融合肽衍生物的抗病毒活性，我们进行活毒测试(具体方法见上述第9点)。利用病毒滴度降低法检测融合肽衍生物的抗病毒活性，实验中，首先多肽先与病毒共孵30分钟，再用病毒感染MDCK细胞。实验结果显示，流感病毒中的原始融合肽片段HA-FP-O对活毒A/PR8/34(H1N1)、A/Aichi/2/68(H3N2)无抑制作用，而本发明合成的融合肽衍生物HA-FP-1、HA-FP-2、HA-HP-2-1、HA-FP-3、HA-FP-3-1、HA-FP-1-13-1和HA-FP-1-13-2对活毒H1N1、H3N2病毒均具有很好的抑制作用。尤其是融合肽衍生物HA-FP-1抗H1N1、H3N2的IC50分别为9.61±1.15μg/mL、5.90±0.62μg/mL，其药效已经接近阳性药利巴韦林抗H1N1、H3N2的IC50(3.22±0.76μg/mL、0.63±0.018μg/mL)(表4)。

同时，RT-PCR实验(具体方法见上述第10点)证明了融合肽衍生物能抑制流感病毒的复制，实验条件下测得病毒本身mRNA水平将近80％，加入50μg/mL HA-FP-1后，病毒mRNA水平降到40％左右(图8)。这进一步确证了融合肽衍生物的抗流感病毒作用。

表4融合肽衍生物具有抗活毒活性检测

^aA/Puerto Rico/8/34(H1N1).利巴韦林作为阳性对照；^bA/Aichi/2/68(H3N2).利巴韦林作为阳性对照；^c NA:无活性NT:没有测试

(9)、融合肽衍生物可能作用靶点不是HA1

病毒包膜与细胞膜融合的时候需要借助HA蛋白，这个过程由HA蛋白中HA1和HA2共同完成。HA1能识别唾液酸受体，并与其结合，随后HA2在酸性条件下发生构象变化，融合肽从其“疏水口袋”中露出，插入到细胞膜，促使病毒包膜与细胞膜的融合。从前面的实验结果得到融合肽衍生物是通过抑制病毒进入细胞从而达到抗病毒效果的。那么融合肽衍生物是作用在HA1还是HA2上呢？

由于HA1可以与红细胞表面受体结合，发生凝血现象，因此我们通过抗凝血实验(具体操作见上述方法部分的第12点)来检测融合肽衍生物是否作用在HA1上。实验孔、对照孔分别加入25μL源于H5的HA抗原(Invtrogen)。本发明融合肽衍生物用PBS倍比稀释得到浓度为200μg/mL～0.39μg/mL，加入50μL/孔0.5％鸡红细胞。阳性对照孔加入25μL HA1抗体，阴性对照为PBS。在室温下与鸡红细胞孵育1h后，观察结果。抗凝血实验结果显示(图9)，融合肽衍生物没有发生与阳性对照相似的抗凝血作用，因此可以推测融合肽衍生物并非通过屏蔽HA1来达到阻断病毒进入细胞。

(10)、原型融合肽拮抗融合肽衍生物HA-FP-1的抗病毒活性

经抗凝血实验排除融合肽衍生物作用在HA1上的可能性后，我们进行融合抑制实验(即抗病毒感染活性的检测，具体操作见上述方法部分的第11点)，测试本发明融合肽衍生物是否作用在N端含有融合肽的HA2上。实验中，在同时加入HA-FP-1和HA-FP-O实验组中，HA-FP-1的浓度为25μg/mL，HA-FP-O(HA-FP-O是H3亚型中HA2亚基的融合肽的一部分)的浓度呈倍数递减分别为75、50、25、12.5、7.5μg/mL，即HA-FP-1与HA-FP-O的浓度比分别为1：3、1：2、1：1、1：0.5、1：0.3(如图10横坐标所示)。当只有HA-FP-1存在时，25μg/mL HA-FP-1的病毒抑制率为60％～70％(如图10中的HA-FP-1曲线所示)，随着HA-FP-O的浓度比例增加，HA-FP-1的抗病毒作用减弱，当HA-FP-1与HA-FP-O的浓度比为1:3时，25μg/mL HA-FP-1的病毒抑制率只有20％(如图10中的HA-FP-1+HA-FP-O曲线所示)，当只有HA-FP-O存在时，75、50、25、12.5、7.5μg/mL HA-FP-O的病毒抑制率为3.18～11.32％(如图10中的HA-FP-O曲线所示)。上述结果说明了加入的流感病毒HA2亚基能与本发明融合肽衍生物发生相互作用，从而抑制本发明融合肽衍生物与病毒间的作用，产生了竞争性抑制效果。提示本发明融合肽衍生物很可能通过与流感病毒HA2亚基的相互作用，从而起到抑制流感病毒的作用。

(11)、计算机模拟模型展示融合肽衍生物与HA的相互作用

甲型流感病毒在与细胞膜融合过程中，HA2会在酸性条件下发生构象变化(图11A)。当外来类似物与HA2的N端的融合肽相互结合，HA2构象变化将被阻断(图11B)，如此，病毒包膜与细胞膜的融合受到抑制。在计算机模拟模型中，融合肽衍生物HA-FP-1的11、15、19位赖氨酸与HA2N端谷氨酸通过形成氢键、盐桥相互作用(图11C-Ⅰ)，其他融合肽衍生物与HA2亦存在相同的作用力。而原型融合肽HA-FP-O与HA2只有氢键作用(图11C-Ⅱ)。因此，融合肽衍生物HA-FP-1与HA2有更强的作用力，能够阻断HA2在酸性条件下的构象变化。

实施例1中的GLFGAIAGFI RRG、IKGGWPGLVKGWYG；、GLFGAIAGFIRRGWR GMVRGWYG等融合肽衍生物也进行了实施例2中相关实验研究，结果与上述融合肽衍生物结果相似，在此不一一赘述。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。

<110> 南方医科大学

<120> 一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工合成多肽

<400> 1

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Lys Asn Gly Trp Lys Gly

1 5 10 15

Met Ile Lys Gly

20

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工合成多肽

<400> 2

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Lys Gly Gly Trp Gln Gly

1 5 10 15

Met Val Lys Gly

20

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工合成多肽

<400> 3

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Lys Lys Gly Trp Lys Gly

1 5 10 15

Met Val Lys Gly

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工合成多肽

<400> 4

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Lys Gly Gly Trp Pro Gly

1 5 10 15

Leu Val Lys Gly

20

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工合成多肽

<400> 5

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Lys Gly Gly Trp Pro Gly

1 5 10 15

Leu Val Lys Gly

20

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成多肽

<400> 6

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Lys Asn Gly Trp Lys Gly

1 5 10 15

Met Ile Lys Gly Trp Tyr

20

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成多肽

<400> 7

Ile Lys Asn Gly Trp Lys Gly Met Ile Lys Gly Trp Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成多肽

<400> 8

Ile Lys Asn Ala Trp Lys Ala Met Ile Lys Ala Trp Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成多肽

<400> 9

Ile Lys Asn Leu Trp Lys Leu Met Ile Lys Leu Trp Tyr

1 5 10

Claims (1)

1.一类兼具抗菌和抗流感病毒活性的融合肽衍生物，其特征在于：该类融合肽衍生物的序列分别为：

HA-FP-1：GLFGAIAGFIKNGWKGMIKG(SEQ ID NO:1)；

HA-FP-2：GLFGAIAGFIKGGWQGMVKG(SEQ ID NO:2)；

HA-FP-2-1：GLFGAIAGFIKKGWKGMVKG(SEQ ID NO:3)；

HA-FP-3：GLFGAIAGFIKGGWPGLVKG(SEQ ID NO:4)；

HA-FP-3-1：GLFGAIAGFIKKGWPGLVKG(SEQ ID NO:5)；

HA-FP-1-22：GLFGAIAGFIKNGWKGMIKGWY(SEQ ID NO:6)。