CN106349336B

CN106349336B - 一种酶法合成环肽的方法

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Publication number: CN106349336B
Application number: CN201610846622.5A
Authority: CN
Inventors: 吴志猛; 程孝中; 刘少中
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-09-23
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2036-09-23
Also published as: CN106349336A

Abstract

本发明公开了一种酶法合成环肽的方法，属于环肽合成技术领域。所述方法是将线性肽与sortase A以25:1的摩尔比混合，在37℃下反应制备环肽。所得环肽产率70％‑93％，该方法产率高、步骤简单、并具有绿色环保等优点。制备获得的RGD线性肽和环肽具有抑制整合素αvβ3与胞外基质相互作用特性；制备获得的AKRHHGYKRKFH线性肽和环肽具有抑制白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌特性，具有广泛的应用价值。

Description

一种酶法合成环肽的方法

技术领域

本发明涉及一种酶法合成环肽的方法，属于环肽合成技术领域。

背景技术

环肽化合物具有多方面的生物活性，包括抗肿瘤、抗免疫等生物活性。与相应线性肽相比其在生物体内具有更好的抗酶解和抗化学降解的能力，可以延长体内半衰期从而发挥长效作用。常用的环合成方法是先用固相法合成线性肽，脱完Fmoc后用含三氟乙酸的切割液把线性肽从树脂上切割下来，进行HPLC纯化，得到较纯的有侧链保护基的线性肽，然后用缩合剂在液相里把线性肽首末端进行缩合形成环肽，HPLC纯化含有保护基的环肽，纯化后的产物再用含三氟乙酸的切割液将环肽侧链的保护基切割掉，乙醚沉淀后再经HPLC纯化得到产品。而酶法合成环肽时，从固相载体上用三氟乙酸切割线性肽时，同时将侧链保护基已经脱除，经HPLC纯化后，得到的线性肽直接用酶进行环化，再经HPLC纯化即可得到环肽产物，与酶法合成相比，传统环肽合成方法多了一步HPLC纯化，步骤相对复杂，最终产物得率较低，另外，传统方法环化时使用的缩合剂，例如：HBTU、DIC等，具有毒副作用，不利于环保。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种线性肽，其序列(a)或(b)所示：

(a)Gn(RGD)mLPETGGS；其中n＝7，m＝1；或n＝4,m＝2；或n＝1,m＝3；

(b)XGGAKRHHGYKRKFHLPETGGS，X包括：G、G₁、G₂、G₃；其中

本发明的第二个目的是提供一种合成环肽的方法，所述方法是将所述线性肽与sortase A以20-25:1的摩尔比混合，sortaseA酶活为130～150U/mL，在37℃下反应制备环肽。

在本发明的一种实施方式中，所述sortaseA酶活为135U/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液含有pH＝7.5的0.3mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，5mmol/L CaCl₂，2mmol/L巯基乙醇。

在本发明的一种实施方式中，所述方法在线性肽与sortase A合成前，还对线性肽进行HPLC纯化；所述HPLC纯化是以含1mL/L三氟乙酸的乙睛和含1mL/L三氟乙酸的超纯水作为流动相，以1mL/min进行梯度洗脱。

本发明的第三个目的是提供所述的方法制备的环肽，所述环肽包括GGGAKRHHGYKRKFHLPET、G₁GGAKRHHGYKRKFHLET、G₂GGAKRHHGYKRKFHLET、G₃GGAKRHHGYKRKFHLET、G7RGDLPET、G7RGDLPETG7RGDLPET、G4(RGD)2LPET、G4(RGD)2LPETG4(RGD)2LPET、G(RGD)3LPET；其中

有益效果：本发明设计了含有RGD、AKRHHGYKRKFH线性肽，并利用sortaseA对系列线性肽进行环化，所得环肽产率70％-93％，该方法产率高、步骤简单、并具有绿色环保等优点。制备获得的RGD线性肽和环肽具有抑制整合素αvβ3与胞外基质相互作用特性；制备获得的AKRHHGYKRKFH线性肽和环肽具有抑制白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌特性。

附图说明

图1为Sortase A合成RGD环肽合成示意图；

图2为Sortase A合成AKRHHGYKRKFH环肽示意图；A，Rink amide树脂合成的多肽；B，sortase A将线性肽环化。

具体实施方式

HPLC检测条件：色谱柱型号C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A：含1mL/L三氟乙酸的乙睛；流动相B：含1mL/L三氟乙酸的超纯水；流速:1.0mL/min；检测波长:220nm。下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步说明：

实施例1线性肽的设计

(1)对于含有RGD序列的线性肽，设计含有17个氨基酸的多肽序列，包括C段的sortaseA识别序列LPETGGS和N端的多聚甘氨酸序列，便于sortaseA识别并环化，序列中间含有1-3个RGD序列，多价的RGD以便提高肽的生物活性；制备获得的线性肽序列为Gn(RGD)mLPETGGS；其中n＝7，m＝1；或n＝4,m＝2；或n＝1,m＝3；合成的线性肽能够抑制整合素αvβ3与胞外基质相互作用。

(2)对于含有抗菌肽AKRHHGYKRKFH的线性肽，在抗菌肽C段带上sortase A识别序列LPETGGS，N段为多聚甘氨酸序列，在多聚甘氨酸序列的最后一个甘氨酸进行了结构修饰，分别用三种甘氨酸类似物替换正常甘氨酸，以便提高产率，制备获得的线性肽序列为：XGGAKRHHGYKRKFHLPETGGS，X包括：G、G₁、G₂、G₃；其中其特性为具有广谱抗菌作用，可以抑制白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

实施例2线性肽G7RGDLPETGGS在sortaseA酶催化下合成RGD环肽

线性肽合成：称取Fmoc-Ser(tBu)-Wang树脂于二甲基甲酰胺(DMF)溶液中溶胀过夜，20％(V/V)哌啶脱掉Fmoc，依次用二氯甲烷(DCM)、MeOH和DMF清洗树脂，取少量树脂用茚三酮显色法检测，加热至100℃检测树脂显蓝色，说明Fmoc脱除干净。将5eq(树脂为1eq)的氨基酸，5eq缩合剂O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和10eq二异丙基乙胺(DIPEA)溶于DMF中，加入固相合成管中进行反应2h，依次用DCM、MeOH、DMF清洗树脂，取少量树脂用茚三酮显色法检测树脂显黄色，说明游离氨基与氨基酸上的羧基反应完全。重复以上步骤直至所有氨基酸缩合完成，最后哌啶脱Fmoc。将清洗后的树脂抽干，加入由95％三氟乙酸(TFA)、2.5％三异丙基硅烷(TIS)、2.5％H₂O组成的切割试剂脱去侧链保护基，并把多肽从树脂上切割下来。加入十倍体积切割液的冰乙醚进行沉淀，得到粗肽进行HPLC纯化。

酶催化合成环肽：100μL酶反应体系中，取线性肽G7RGDLPETGGS 0.25mM；sortaseA10μM；反应缓冲液为0.3M Tris-HCl(PH＝7.5)，0.15M NaCl，5mM CaCl₂，2mM巯基乙醇，37℃反应20h。反应结束后，超滤过滤除酶，所得滤液进行HPLC纯化和质谱鉴定，HPLC梯度洗脱：流动相A从5％到50％洗脱20min；G7RGDLPETGGS反应所得的环肽分子量分别为1168.2、2336.4，其特性为抑制整合素αvβ3与胞外基质相互作用。产率见表1。

实施例3线性肽G4(RGD)2LPETGGS在sortaseA酶催化下合成RGD环肽

线性肽合成：方法同实例1

酶催化合成环肽：100μL酶反应体系中，取线性肽G4(RGD)2LPETGGS 0.25mM；sortase A 10μM；反应缓冲液为0.3M Tris-HCl(PH＝7.5)，0.15M NaCl，5mM CaCl₂，2mM巯基乙醇，37℃反应20h。反应结束后，超滤过滤除酶，所得滤液进行HPLC纯化和质谱鉴定，HPLC梯度洗脱：流动相A从5％到50％洗脱20min；G4(RGD)2LPETGGS反应所得的环肽分子量分别为1325.4、2650.7，其特性为抑制整合素αvβ3与胞外基质相互作用。产率见表1。

实施例4线性肽G(RGD)3LPETGGS在sortaseA酶催化下合成RGD环肽

线性肽合成：方法同实例1

酶催化合成环肽：100μL酶反应体系中，取线性肽G(RGD)3LPETGGS 0.25mM；sortase A10μM；反应缓冲液为0.3M Tris-HCl(PH＝7.5)，0.15M NaCl，5mM CaCl₂，2mM巯基乙醇，37℃反应20h。反应结束后，超滤过滤除酶，所得滤液进行HPLC纯化和质谱鉴定，HPLC梯度洗脱：流动相A从5％到50％洗脱100min；G(RGD)3LPETGGS反应所得的环肽分子量分别为1482.5，其特性为抑制整合素αvβ3与胞外基质相互作用。产率见表1。

实施例5线性肽GGGAKRHHGYKRKFHLPETGGS-NH₂在sortase A酶催化下合成GGGAKRHHGYKRKFHLPET环肽

线性肽合成：称取Rink amide Resin于DMF中溶胀过夜，20％(V/V)哌啶脱掉Fmoc，依次用二氯甲烷(DCM)、MeOH和DMF清洗树脂，取少量树脂用茚三酮显色法检测，加热至100℃检测树脂显蓝色，说明Fmoc脱除干净。将5eq(树脂为1eq)的氨基酸，5eq缩合剂TBTU和10eq二异丙基乙胺(DIPEA)溶于DMF中，加入固相合成管中进行反应2h，依次用DCM、MeOH、DMF清洗树脂，取少量树脂用茚三酮显色法检测树脂显黄色，说明游离氨基与氨基酸上的羧基反应完全。重复以上步骤直至所有氨基酸缩合完成，最后20％(V/V)哌啶脱Fmoc。将清洗后的树脂抽干，加入由95％三氟乙酸(TFA)、2.5％三异丙基硅烷(TIS)、2.5％H₂O组成的切割试剂脱去侧链保护基，并把多肽从树脂上切割下来。加入十倍体积切割液的冰乙醚进行沉淀，得到粗肽进行HPLC纯化。

酶催化环肽合成：100μL酶反应体系中，取线性肽GGGAKRHHGYKRKFHLPETGGS-NH₂0.2mM；sortaseA20μM；反应缓冲液为0.3M Tris-HCl(PH＝7.5)，0.15M NaCl，5mM CaCl₂，2mM巯基乙醇，37℃反应20h。反应结束后，超滤过滤除酶，所得滤液进行HPLC纯化和质谱鉴定，HPLC梯度洗脱：流动相A从10％到40％洗脱60min；GGGAKRHHGYKRKFHLPETGGS-NH₂反应所得的环肽分子量为2158.4，其特性为一种广谱抗菌多肽，可以抑制白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。产率见表1。

实施例6线性肽G₁GGAKRHHGYKRKFHLETGGS-NH₂在sortase A酶催化下合成G₁GGAKRHHGYKRKFHLET环肽

线性肽合成：称取Rink amide Resin于DMF中溶胀过夜，20％(V/V)哌啶脱掉Fmoc，依次用二氯甲烷(DCM)、MeOH和DMF清洗树脂，取少量树脂用茚三酮显色法检测，加热至100℃检测树脂显蓝色，说明Fmoc脱除干净。将5eq(树脂为1eq)的氨基酸，5eq缩合剂TBTU和10eq二异丙基乙胺(DIPEA)溶于DMF中，加入固相合成管中进行反应2h，依次用DCM、MeOH、DMF清洗树脂，取少量树脂用茚三酮显色法检测树脂显黄色，说明游离氨基与氨基酸上的羧基反应完全。重复以上步骤至合成到倒数第二个氨基酸，脱掉Fmoc，缩合形成最后甘氨酸类似物G₁时，首先取10eq的叔丁基咔唑(Boc-NH-NH₂)与10eqN,N'-羰基二咪唑(CDI)在室温下反应3h，然后将该反应液加入多肽合成管中与树脂反应2h。清洗后的树脂抽干，加入由95％三氟乙酸(TFA)、2.5％三异丙基硅烷(TIS)、2.5％H₂O组成的切割试剂脱去侧链保护基，并把多肽从树脂上切割下来。加入十倍体积切割液的冰乙醚进行沉淀，得到粗肽进行HPLC纯化。

酶催化环肽合成：；100μL酶反应体系中，取线性肽G₁GGAKRHHGYKRKFHLETGGS-NH₂0.2mM；sortase A20μM；反应缓冲液为0.3M Tris-HCl(PH＝7.5)，0.15M NaCl，5mMCaCl₂，2mM巯基乙醇，37℃反应20h。反应结束后，超滤过滤除酶，所得滤液进行HPLC纯化和质谱鉴定，HPLC梯度洗脱：流动相A从10％到40％洗脱60min；G₁GGAKRHHGYKRKFHLETGGS-NH₂反应所得的环肽分子量为2159.4，其特性为一种广谱抗菌多肽，可以抑制白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。产率见表1。

实施例7线性肽G₂GGAKRHHGYKRKFHLETGGS-NH₂在sortase A酶催化下合成G₂GGAKRHHGYKRKFHLET环肽

线性肽合成：称取Rink amide Resin于DMF中溶胀过夜，20％(V/V)哌啶脱掉Fmoc，依次用二氯甲烷(DCM)、MeOH和DMF清洗树脂，取少量树脂用茚三酮显色法检测，加热至100℃检测树脂显蓝色，说明Fmoc脱除干净。将5eq(树脂为1eq)的氨基酸，5eq缩合剂TBTU和10eq二异丙基乙胺(DIPEA)溶于DMF中，加入固相合成管中进行反应2h，依次用DCM、MeOH、DMF清洗树脂，取少量树脂用茚三酮显色法检测树脂显黄色，说明游离氨基与氨基酸上的羧基反应完全。重复以上步骤至合成到倒数第二个氨基酸，脱掉Fmoc，缩合形成最后甘氨酸类似物G₂时，取20eq的溴乙酸与24eqN,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入到上述树脂中，75℃反应10min，用DMF、DCM将树脂分别洗三次，然后加入20eq Boc-NH-NH₂到树脂中，室温反应6h，将清洗后的树脂抽干，加入由95％三氟乙酸(TFA)、2.5％三异丙基硅烷(TIS)、2.5％H₂O组成的切割试剂脱去侧链保护基，并把多肽从树脂上切割下来。加入十倍体积切割液的冰乙醚进行沉淀，得到粗肽进行HPLC纯化。

酶催化环肽合成：100μL酶反应体系中，取线性肽G₂GGAKRHHGYKRKFHLETGGS-NH₂0.2mM；sortaseA20μM；反应缓冲液为0.3M Tris-HCl(PH＝7.5)，0.15M NaCl，5mM CaCl₂，2mM巯基乙醇，37℃反应20h。反应结束后，超滤过滤除酶，所得滤液进行HPLC纯化和质谱鉴定，HPLC梯度洗脱：流动相A从10％到40％洗脱60min；G₂GGAKRHHGYKRKFHLETGGS-NH₂反应所得的环肽分子量分别为2173.4，产率见表1。

实施例8线性肽G₃GGAKRHHGYKRKFHLETGGS-NH₂在sortase A酶催化下合成G₃GGAKRHHGYKRKFHLET环肽

线性肽合成：称取Rink amide Resin于DMF中溶胀过夜，20％(V/V)哌啶脱掉Fmoc，依次用二氯甲烷(DCM)、MeOH和DMF清洗树脂，取少量树脂用茚三酮显色法检测，加热至100℃检测树脂显蓝色，说明Fmoc脱除干净。将5eq(树脂为1eq)的氨基酸，5eq缩合剂TBTU和10eq二异丙基乙胺(DIPEA)溶于DMF中，加入固相合成管中进行反应2h，依次用DCM、MeOH、DMF清洗树脂，取少量树脂用茚三酮显色法检测树脂显黄色，说明游离氨基与氨基酸上的羧基反应完全。重复以上步骤至合成到倒数第二个氨基酸，脱掉Fmoc，最后一个氨基酸加入的是甘氨酸的类似物G₃，缩合时加入5eq的G₃，5eq缩合剂TBTU和10eq二异丙基乙胺(DIPEA)反应2h，用20％(V/V)哌啶脱掉Fmoc。将清洗后的树脂抽干，加入由95％TFA、2.5％TIS、2.5％H₂O组成的切割试剂脱掉侧链保护基以及把肽从树脂上切割下来。加入十倍体积切割液的冰乙醚进行沉淀，得到粗肽进行HPLC纯化。

酶催化环肽合成：100μL酶反应体系中，取线性肽G₃GGAKRHHGYKRKFHLETGGS-NH₂0.2mM；sortase A20μM；反应缓冲液为0.3M Tris-HCl(PH＝7.5)，0.15M NaCl，5mMCaCl₂，2mM巯基乙醇，37℃反应20h。反应结束后，超滤过滤除酶，所得滤液进行HPLC纯化和质谱鉴定，HPLC梯度洗脱：流动相A从10％到40％洗脱20min；G₃GGAKRHHGYKRKFHLETGGS-NH₂反应所得的环肽分子量分别为2172.4，其特性为一种广谱抗菌多肽，可以抑制白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。产率见表1。

表1 Sortase A合成不同环肽的产率

相比于化学法合成环肽，本发明的方法制备获得的环肽产率达75％以上，制备含有2种环肽产物的产率之和均达到88％，经HPLC检测，几乎没有其它副产物。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种线性肽，其特征在于，序列如(a)或(b)所示：

(a)Gn(RGD)mLPETGGS；其中n＝7，m＝1；或n＝4,m＝2；或n＝1,m＝3；

(b)GGGAKRHHGYKRKFHLPETGGS。

2.一种合成环肽的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述线性肽与sortaseA以20-25:1的摩尔比混合，在37℃下反应制备环肽；所述sortase A酶活为130～150U/mL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应是在缓冲液中进行的，所述缓冲液含有：pH＝7.5的0.3mol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，5mmol/L CaCl₂，2mmol/L巯基乙醇。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法在线性肽与sortase A合成前，还对线性肽进行HPLC纯化；所述HPLC纯化是以含1mL/L三氟乙酸的乙睛和含1mL/L三氟乙酸的超纯水作为流动相，以1mL/min进行梯度洗脱。

5.根据权利要求2-4任一所述的方法制备的环肽。

6.根据权利要求5所述的环肽，其特征在于，包括GGGAKRHHGYKRKFHLPET、G₇RGDLPET、G₇RGDLPETG₇RGDLPET、G₄(RGD)₂LPET、G₄(RGD)₂LPETG₄(RGD)₂LPET、 G(RGD)₃LPET。