CN108690121A - 一种奈米非肽液相制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种奈米非肽液相制备方法，包括以下步骤：1)以Dpm‑NH2和Fmoc‑Trp(Boc)‑OH制备中间体1H‑Trp(Boc)‑NH‑Dpm；2)制备中间体2H‑Gly‑Trp(Boc)‑NH‑Dpm；3)制备中间体3H‑Arg(Pbf)‑Gly‑Trp(Boc)‑NH‑Dpm；4)制备中间体4H‑4‑hydropro(OtBu)‑Arg(Pbf)‑Gly‑Trp(Boc)‑NH‑Dpm；5)制备中间体5H‑4‑Fphe‑4‑hydropro(OtBu)‑Arg(Pbf)‑Gly‑Trp(Boc)‑NH‑Dpm；6)制备奈米非肽粗品；7)反相色谱制备奈米非肽。本发明的方法纯化收率高，适合规模化生产。

Description

一种奈米非肽液相制备方法
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及奈米非肽液相制备方法。
背景技术
单相抑郁是一种常见的由于中枢神经系统化学物质变化产生的精神紊乱，属于内源性抑郁症。使用抗抑郁药物治疗单相抑郁在医学界已经得到广泛认可。奈米非肽是一种脑内源性多肽MIF-1的类似物，可通过作用5-HT再摄取而发挥抗单相抑郁作用，极大改变了5-HT的再摄取，作用快，可通过血脑屏障，且在脑内清除较慢。目前美国InnapMarma公司正在进行III期临床试验，其抗抑郁活性和安全性已得到临床证实。
奈米非肽，英文名：nemifitide；分子式：C33H43FN10O6；CAS：173240-15-8；是一种人工合成的五肽化合物，结构为4-氟-L-苯丙氨酰-(反式)4-羟基-L-脯氨酰-L-精氨酰-甘氨酰-L-色氨酰胺，见下式：
目前，奈米非肽的合成方法在国内外少有报道，原研专利报道了奈米非肽固相合成方法(US5589460，WO1995030430A1)，此方法是以Fmoc保护的氨基酸为反应原料，采用氨基树脂依次偶联，裂解后得到的粗肽经过HPLC纯化得到产品。经过本发明人研究发现，原研专利的方法可以得到合格产品，总收率只有40％。分析原因主要有以下几点：裂解后的粗肽产品纯度低，片段缺失肽杂质多，因此纯化收率不高，不适合规模化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种奈米非肽的液相制备方法，该方法合成条件温和、工艺简单且工艺稳定，适合工业化连续生产。
合成路线如下所示：
本发明奈米非肽的制备方法，包括以下步骤：
1)以Dpm-NH2和Fmoc-Trp(Boc)-OH制备中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm；
2)制备中间体2H-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
3)制备中间体3H-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
4)制备中间体4H-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
5)制备中间体5H-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
6)制备奈米非肽粗品；
7)反相色谱制备奈米非肽。
具体地，本发明一个方面提供了一种奈米非肽液相制备方法,其包括如下步骤,
1)以Dpm-NH2和Fmoc-Trp(Boc)-OH在缩合剂的作用下合成Fmoc-Trp(Boc)-NH-Dpm，脱除Fmoc保护基，获得中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm；
2)以中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm和Fmoc-Gly-OH在缩合剂的作用下合成Fmoc-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm，脱除Fmoc保护基，获得中间体2H-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
3)以中间体2和Fmoc-Arg(Pbf)-OH在缩合剂的作用下合成Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm，脱除Fmoc保护基，获得中间体3H-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
4)以中间体3和Fmoc-4-hydropro(OtBu)-OH在缩合剂的作用下合成Fmoc-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm，脱除Fmoc保护基，获得中间体4H-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
5)以中间体4和Fmoc-4-Fphe-OH在缩合剂的作用下合成Fmoc-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm，脱除Fmoc保护基，获得中间体5H-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
6)脱除OtBu、Pbf和Boc保护基。
在本发明的技术方案中，所述缩合剂选自HOBt、EDC.HCl、HATU、DCC、DIC、HBTU、HOAt、HOBt、PyBOP、BTC中的一种或多种，优选为HOBt和EDC.HCl的组合。
在本发明的技术方案中，脱除Fmoc保护基的试剂为DBU与二乙胺的混合液
在本发明的技术方案中，步骤6)中，脱保护基试剂为为TFA、H2O、EDT、PhOMe、苯甲硫醚的混合物；优选为，TFA：H2O：EDT：PhOMe＝90-95：1-5：1-5：3-8，更优选为TFA：H2O：EDT：PhOMe＝92：2：2：4。
在本发明的技术方案中，其还包括纯化步骤，所述纯化步骤位为7)，
7)反相色谱进行纯化，优选地，反相高压液相色谱法为以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
在本发明的技术方案中，步骤1)-5)中的溶剂独立地选自二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯中的一种或多种，优选为三氯甲烷。
在本发明的技术方案中，步骤1)-5)中，脱除Fmoc保护基前以甲醇进行析晶、过滤和清洗，脱除Fmoc保护基后以乙腈进行析晶、过滤和清洗。
在本发明的技术方案中，步骤6)中，脱除保护基后，以甲醇进行析晶、离心和清洗。
在本发明的技术方案中，所述的奈米非肽液相制备方法包括以下步骤：
1)将Dpm-NH2和Fmoc-Trp(Boc)-OH以CHCl3溶解，加入HOBt、EDC.HCl，反应至完全，去除溶剂，加入甲醇，析出固体、过滤，固体以甲醇清洗后溶解于氯仿，依次加入DBU、二乙胺，反应至完全，去除溶剂，剩余物中加入乙腈，析出固体、过滤、以乙腈清洗并干燥，得中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm；
2)将中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm和Fmoc-Gly-OH以CHCl3溶解，加入HOBt、EDC.HCl，反应至完全，去除溶剂，加入甲醇，析出固体、过滤，固体以甲醇清洗后溶解于氯仿，依次加入DBU、二乙胺，反应至完全，去除溶剂，剩余物中加入乙腈，析出固体、过滤、以乙腈清洗并干燥，得中间体2H-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
3)将中间体2H-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm和Fmoc-Arg(Pbf)-OH以CHCl3溶解，加入HOBt、EDC.HCl，反应至完全，去除溶剂，加入甲醇，析出固体、过滤，固体以甲醇清洗后溶解于氯仿，依次加入DBU、二乙胺，反应至完全，去除溶剂，剩余物中加入乙腈，析出固体、过滤、以乙腈清洗并干燥，得中间体3H-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
4)将中间体3H-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm和Fmoc-4-hydropro(OtBu)-OH以CHCl3溶解，加入HOBt、EDC.HCl，反应至完全，去除溶剂，加入甲醇，析出固体、过滤，固体以甲醇清洗后溶解于氯仿，依次加入DBU、二乙胺，反应至完全，去除溶剂，剩余物中加入乙腈，析出固体、过滤、以乙腈清洗并干燥，得中间体H-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
5)将中间体H-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm和Fmoc-4-Fphe-OH以CHCl3溶解，加入HOBt、EDC.HCl，反应至完全，去除溶剂，加入甲醇，析出固体、过滤，固体以甲醇清洗后溶解于氯仿，依次加入DBU、二乙胺，反应至完全，去除溶剂，剩余物中加入乙腈，析出固体、过滤、以乙腈清洗并干燥，得中间体5H-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
6)将中间体5H-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm溶解于TFA：H2O：EDT：PhOMe＝92：2：2：4混合溶液中，反应至完全，将滤液缓慢加入冰乙醚中沉淀、离心、以冰乙醚清洗并干燥得奈米非肽粗品；
7)将步骤6)所得奈米非肽粗品用反相高效液相纯化制备；以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得奈米非肽。
有益效果
本发明的方法适合工业上制备，产率相比于固相合成方法效率和产率均有较高的提高。
具体实施方式
实施例1中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm的制备
将Dpm-NH2(14.4mmol)、Fmoc-Trp(Boc)-OH(16.2mmol)加入到反应器中，用CHCl3(150mL)溶解，然后加入HOBt(14.4mol)、EDC.HCl(28.8mmol)。混合液搅拌反应3小时，TLC点板检测反应结束。减压蒸除溶剂，加入甲醇120mL，析出固体，过滤，固体用甲醇200mL洗三遍。将固体溶解于150mL氯仿中，依次加入DBU(14.4mmol)、二乙胺150(mmol)，搅拌反应1小时，反应结束。减压蒸除溶剂，剩余物中加入乙腈50mL，析出固体，过滤。固体用乙腈50mL洗三次，减压干燥得中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm14.0mmol，收率97％。
实施例2中间体2H-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm的制备
将实施例1制得的中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm14.0mmol、Fmoc-Gly-OH14.0mmol加入到反应器中，用CHCl3(150mL)溶解，然后加入HOBt(14.0mol)、EDC.HCl(28.0mmol)。混合液搅拌反应3小时，TLC点板检测反应结束。减压蒸除溶剂，加入甲醇120mL，析出固体，过滤，固体用甲醇200mL洗三遍。将固体溶解于150mL氯仿中，依次加入DBU(14.0mmol)、二乙胺150(mmol)，搅拌反应1小时，反应结束。减压蒸除溶剂，剩余物中加入乙腈50mL，析出固体，过滤。固体用乙腈50mL洗三次，减压干燥得中间体2H-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm13.8mmol，收率99％。
实施例3中间体3H-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm的制备
将实施例2制得的中间体2H-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm13.8mmol、Fmoc-Arg(Pbf)-OH13.8mmol加入到反应器中，用CHCl3(150mL)溶解，然后加入HOBt(13.8mol)、EDC.HCl(28.0mmol)。混合液搅拌反应3小时，TLC点板检测反应结束。减压蒸除溶剂，加入甲醇120mL，析出固体，过滤，固体用甲醇200mL洗三遍。将固体溶解于150mL氯仿中，依次加入DBU(13.8mmol)、二乙胺150(mmol)，搅拌反应1小时，反应结束。减压蒸除溶剂，剩余物中加入乙腈50mL，析出固体，过滤。固体用乙腈50mL洗三次，减压干燥得中间体3H-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm13.6mmol，收率99％。
实施例4中间体4H-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm的制备
将中间体3H-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm13.6mmol、Fmoc-4-hydropro(OtBu)-OH13.6mmol加入到反应器中，用CHCl3(130mL)溶解，然后加入HOBt(13.6mol)、EDC.HCl(27.8mmol)。混合液搅拌反应3小时，TLC点板检测反应结束。减压蒸除溶剂，加入甲醇120mL，析出固体，过滤，固体用甲醇200mL洗三遍。将固体溶解于150mL氯仿中，依次加入DBU(13.6mmol)、二乙胺145(mmol)，搅拌反应1小时，反应结束。减压蒸除溶剂，剩余物中加入乙腈50mL，析出固体，过滤。固体用乙腈50mL洗三次，减压干燥得中间体4H-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm 13.0mmol，收率95％。
实施例5中间体5H-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm的制备
将中间体4H-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm 13.0mmol、Fmoc-4-Fphe-OH13.0mmol加入到反应器中，用CHCl3(140mL)溶解，然后加入HOBt(13.0mol)、EDC.HCl(27.5mmol)。混合液搅拌反应3小时，TLC点板检测反应结束。减压蒸除溶剂，加入甲醇120mL，析出固体，过滤，固体用甲醇200mL洗三遍。将固体溶解于150mL氯仿中，依次加入DBU(13.0mmol)、二乙胺140(mmol)，搅拌反应1小时，反应结束。减压蒸除溶剂，剩余物中加入乙腈50mL，析出固体，过滤。固体用乙腈50mL洗三次，减压干燥得中间体5H-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm12.5mmol，收率96％。
实施例6奈米非肽粗品的制备
将实施例5制得的中间体5H-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm12.5mmol溶解于TFA：H2O：EDT：PhOMe＝92：2：2：4混合溶液20ml中，室温反应2小时，将滤液缓慢加入200ml冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到奈米非肽粗品10.5mmol，收率85％。
实施例7奈米非肽的制备
将实施例6得到的粗肽用反相高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品8.8g(9.5mmol)，收率90％，纯度大于99％。

Claims (9)

1.一种奈米非肽液相制备方法,其包括如下步骤,
1)以Dpm-NH2和Fmoc-Trp(Boc)-OH在缩合剂的作用下合成Fmoc-Trp(B oc)-NH-Dpm，脱除Fmoc保护基，获得中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm；
2)以中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm和Fmoc-Gly-OH在缩合剂的作用下合成Fmoc-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm，脱除Fmoc保护基，获得中间体2H-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
3)以中间体2和Fmoc-Arg(Pbf)-OH在缩合剂的作用下合成Fmoc-Arg(Pb f)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm，脱除Fmoc保护基，获得中间体3H-Arg(Pbf)-Gly-T rp(Boc)-NH-Dpm；
4)以中间体3和Fmoc-4-hydropro(OtBu)-OH在缩合剂的作用下合成Fmo c-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm，脱除Fmoc保护基，获得中间体4H-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
5)以中间体4和Fmoc-4-Fphe-OH在缩合剂的作用下合成Fmoc-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm，脱除Fmoc保护基，获得中间体5H-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
6)脱除OtBu、Pbf和Boc保护基。
2.根据权利要求1所述的奈米非肽液相制备方法，其中所述的缩合剂选自HOBt、EDC.HCl、HATU、DCC、DIC、HBTU、HOAt、HOBt、PyBOP、BT C中的一种或多种，优选为HOBt和EDC.HCl的组合。
3.根据权利要求1所述的奈米非肽液相制备方法，脱除Fmoc保护基的试剂为DBU与二乙胺的混合液。
4.根据权利要求1所述的奈米非肽液相制备方法，步骤6)中，脱保护基试剂为为TFA、H2O、EDT、PhOMe、苯甲硫醚的混合物；优选为，TFA：H2O：EDT：PhOMe＝90-95：1-5：1-5：3-8，更优选为TFA：H2O：EDT：Ph OMe＝92：2：2：4。
5.根据权利要求1所述的奈米非肽液相制备方法，其还包括纯化步骤，所述纯化步骤为7)，
7)反相色谱进行纯化，优选地，反相高压液相色谱法为以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
6.根据权利要求1所述的奈米非肽液相制备方法，步骤1)-5)中的溶剂独立地选自二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯中的一种或多种，优选为三氯甲烷。
7.根据权利要求1所述的奈米非肽液相制备方法，步骤1)-5)中，脱除F moc保护基前以甲醇进行析晶、过滤和清洗，脱除Fmoc保护基后以乙腈进行析晶、过滤和清洗。
8.根据权利要求1所述的奈米非肽液相制备方法，步骤6)中，脱除保护基后，以甲醇进行析晶、离心和清洗。
9.根据权利要求1所述的奈米非肽液相制备方法，
1)将Dpm-NH2和Fmoc-Trp(Boc)-OH以CHCl3溶解，加入HOBt、EDC.HCl，反应至完全，去除溶剂，加入甲醇，析出固体、过滤，固体以甲醇清洗后溶解于氯仿，依次加入DBU、二乙胺，反应至完全，去除溶剂，剩余物中加入乙腈，析出固体、过滤、以乙腈清洗并干燥，得中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm；
2)将中间体1H-Trp(Boc)-NH-Dpm和Fmoc-Gly-OH以CHCl3溶解，加入HOBt、EDC.HCl，反应至完全，去除溶剂，加入甲醇，析出固体、过滤，固体以甲醇清洗后溶解于氯仿，依次加入DBU、二乙胺，反应至完全，去除溶剂，剩余物中加入乙腈，析出固体、过滤、以乙腈清洗并干燥，得中间体2H-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
3)将中间体2H-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm和Fmoc-Arg(Pbf)-OH以CHCl3溶解，加入HOBt、EDC.HCl，反应至完全，去除溶剂，加入甲醇，析出固体、过滤，固体以甲醇清洗后溶解于氯仿，依次加入DBU、二乙胺，反应至完全，去除溶剂，剩余物中加入乙腈，析出固体、过滤、以乙腈清洗并干燥，得中间体3H-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
4)将中间体3H-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm和Fmoc-4-hydropro(Ot Bu)-OH以CHCl3溶解，加入HOBt、EDC.HCl，反应至完全，去除溶剂，加入甲醇，析出固体、过滤，固体以甲醇清洗后溶解于氯仿，依次加入DBU、二乙胺，反应至完全，去除溶剂，剩余物中加入乙腈，析出固体、过滤、以乙腈清洗并干燥，得中间体H-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
5)将中间体H-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm和Fmo c-4-Fphe-OH以CHCl3溶解，加入HOBt、EDC.HCl，反应至完全，去除溶剂，加入甲醇，析出固体、过滤，固体以甲醇清洗后溶解于氯仿，依次加入DBU、二乙胺，反应至完全，去除溶剂，剩余物中加入乙腈，析出固体、过滤、以乙腈清洗并干燥，得中间体5H-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dpm；
6)将中间体5H-4-Fphe-4-hydropro(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Trp(Boc)-NH-Dp m溶解于TFA：H2O：EDT：PhOMe＝92：2：2：4混合溶液中，反应至完全，将滤液缓慢加入冰乙醚中沉淀、离心、以冰乙醚清洗并干燥得奈米非肽粗品；
7)将步骤6)所得奈米非肽粗品用反相高效液相纯化制备；以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干，得奈米非肽。
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