CN112028981B

CN112028981B - 重组白额高脚蛛毒素多肽及其制备方法

Info

Publication number: CN112028981B
Application number: CN202010993055.2A
Authority: CN
Inventors: 陈金军; 刘子昊; 刘学良; 朱伟仙
Original assignee: Huzhou Tianwang Biotechnology Co ltd; Hunan Agricultural University
Current assignee: Huzhou Tianwang Biotechnology Co ltd; Hunan Agricultural University
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2040-09-21
Also published as: CN112028981A

Abstract

重组白额高脚蛛毒素多肽及其制备方法，其重组白额高脚蛛毒素多肽由如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的任一核苷酸片段编码获得。本发明还公开了重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，包括：1)构建含白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组表达载体；2)将步骤1)得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；3)重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得白额高脚蛛毒素多肽。该重组白额高脚蛛毒素多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和沙门氏菌等常见微生物菌种具有抑菌活性，适用于制备抗菌饲料添加剂，以及果蔬种子的保存，或者添加至制备抗菌药物中，用于制备抗菌药物，其制备方法简单，成本低廉，工业应用前景广。

Description

重组白额高脚蛛毒素多肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及蜘蛛毒素多肽的重组表达方法，尤其是涉及重组白额高脚蛛毒素多肽及其制备方法。

背景技术

大多数蜘蛛都能分泌毒液，其毒液中含有许多具有生物学活性的物质，由于蜘蛛毒素具有高度的特异性和选择性，从而被广泛的应用于新药物研究开发和新型生物杀虫剂等方面。蜘蛛毒素的分类包括:(1)小分子物质,主要包括核苷酸、氨基酸、单胺类及多胺类物质，目前，蜘蛛毒液中研究最充分且最成熟的小分子物质是多胺类物质。酰基多胺是具有低分子量的毒素，其主要存在于Nephila属和Argiope属的某些编织类蜘蛛毒液中。这些毒素具有杀虫活性，它们通过可逆阻断昆虫神经肌肉接头以及昆虫和哺乳动物中的突触后谷氨酸敏感受体通道快速诱导昆虫麻痹。(2)大分子物质,主要包括多种活性酶，血蓝蛋白和一些毒素蛋白，毒素蛋白中最热门的是Latrodectus蜘蛛毒液中的毒素蛋白。Latrodectus蜘蛛的毒液中含有大量高分子量蛋白质和少数小分子多肽。已有研究表明Latrodectus毒液的神经毒性主要由高分子量蛋白质组分引起。(3)多肽类，大多数蜘蛛毒液的主要成分是多肽，有些物种甚至含有1000多种多肽，分子大小一般在2-8kDa之间。据保守估计，蜘蛛毒液中可能存在1000万种以上具有生物活性的多肽。蜘蛛毒液中的多肽具有多种药理活性，旨在调节猎物和捕食者神经系统中离子通道和受体的活性。大多数特征肽对特定的分子靶标具有高亲和力，并且对特定受体亚型具有选择性。这种选择性，功能多样性和生物稳定性使蜘蛛毒液多肽成为药物开发的重要资源之一。

白额高脚蛛(学名：Heteropoda venatoria)，高脚蛛科高脚蛛属动物。

白额高脚蛛体长约20mm～30mm，全长约100mm～130mm；全身密生黄灰色毛，其额区有一条白色横带，雄蛛背甲有一个很大的黑色V字形斑纹，雌蛛则没有这个斑纹；体色较深，体型也较大。白额高脚蛛属夜行性动物，喜欢出没于稍微阴暗的地方。广泛分布于全球热带和亚热带地区，包括亚洲、马斯克林群岛以及加勒比海周围地区，常栖息于室内、外墙壁。蜘蛛毒素中各个成分有着不同的作用，而我们重组毒素的研究得到了更有用活性的重组产物。

因此，鉴于重组蜘蛛毒素的优良性能和广泛的应用市场，亟需准确确定哪一种重组方案效率最高，并在此基础上提供一种最高效的蜘蛛毒素的重组表达方法以及有该重组表达方法获得的重组白额高脚蛛毒素多肽。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种制备成本低且抗菌活性高的重组白额高脚蛛毒素多肽，以及提供一种操作简单、且重组表达的发酵产物活性高的白额高脚蛛毒素多肽的制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

重组白额高脚蛛毒素多肽，所述重组白额高脚蛛毒素多肽由如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的任一核苷酸片段(编码基因)编码获得，或与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的任一核苷酸片段编码获得的多肽氨基酸序列同源性≥80％的白额高脚蛛毒素多肽。

所述重组白额高脚蛛毒素多肽为U1、U3、U4或U27中的任一一种，U1、U3、U4、U27的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

本发明解决其技术问题所采用的另一技术方案是：

含白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组菌，为含重组表达载体pVT102U/α的酿酒酵母，所述重组表达载体pVT102U/α含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4中的任一核苷酸序列片段。

具体地说，所述重组表达载体pVT102U/α包括pVT102U/α-U1、pVT102U/α-U3、pVT102U/α-U4和pVT102U/α-U27。

在某一示范实施例中，所述酿酒酵母为酿酒酵母S78。

本发明解决其技术问题所采用的另一技术方案是：

一种重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，包括以下步骤：

1)构建含白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组表达载体，所述白额高脚蛛毒素多肽如上所述；

2)将步骤1)得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；

3)重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得白额高脚蛛毒素多肽。

在某一示范实施例中，所述白额高脚蛛毒素多肽为U1、U3、U4或U27中的任一一种，U1、U3、U4、U27的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，分别由如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的编码基因编码。

所述步骤1)中构建重组表达载体的具体操作，包括引物设计、PCR扩增、获得目的片段和构建重组表达载体。

所述步骤2)中构建重组菌的具体操作为：取pVT102U/α-U1、pVT102U/α-U3、pVT102U/α-U4或pVT102U/α-U27中的任一重组表达载体，热击转化酿酒酵母S78，采用YSD营养缺陷筛选培养基进行营养缺陷筛选，其操作为：将重组表达载体质粒DNA 1.0μg；carrierDNA，10μg；上述菌悬液，20μL；PEG溶液(10×TE，1M LiAC,50％PEG 4000,以1:1:8的体积比混合)1.5mL加入10mL无菌管中，混合，30℃，200rpm，培养30min；42℃热击15min后，5000g，离心5min；弃上清，细胞沉淀用200μL 1×TE洗涤，5000g，离心5min；弃上清，细胞沉淀悬浮于200μL 1×TE溶液中；细胞悬浮液涂YSD板，30℃培养4-6天。

所述步骤3)中重组菌发酵培养表达的具体操作为：挑取2～4个3～5mm的重组菌于3mL YSD液体培养基中，28～32℃，220～280rpm，培养12～16h；按1:20～50的比例将制备的种子液接种入50mL YSD液体培养基中，28～32℃，220～280rpm，培养12～16h；再按1:20～50的比例将制备的种子液接种入1.0L YSD液体培养基中，28～32℃，220～280rpm，培养60～72h。

所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法还包括：

4)蛋白纯化：收集步骤3)发酵培养得到的发酵产物的上清，分离纯化；

所述蛋白纯化的具体操作为：将发酵产物的上清和预先用0.05M Tris·HCl(pH7.5)缓冲液混合，室温放置0.5～1h，然后用抽滤瓶抽滤，所得到的滤液，pH值调至7.5后，直接上预先用0.05M Tris·HCl(pH7.5)平衡好的DEAE阴离子交换柱，然后分别用含0.1M,0.3M,0.5M,1.0M NaCl的0.1M NaCl缓冲液进行洗脱，收集每个洗脱峰进一步采用RP-HPLC纯化，低温冻干。

本发明一种重组白额高脚蛛毒素多肽的有益效果：

1)重组白额高脚蛛毒素多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和沙门氏菌等常见微生物菌种具有高抑菌活性，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑菌活性显著高于现有的抗菌药物卡那霉素的抑菌活性，适用于制备抗菌饲料添加剂，以及果蔬种子的保存，或者添加至制备抗菌药物中，用于制备抗菌药物，其制备方法简单，成本低廉，具有良好的工业应用前景。

2)具有抗菌活性的重组白额高脚蛛毒素多肽的编码基因较多，显著降低了重组表达载体、重组菌的构建难度，便于后期工业规模化制备，且便于根据不同用途选择其中一种或多种用于制备抗菌药物或饲料用抗菌添加剂，能有效降低了饲料中化学合成的抗生素的使用量。

3)拓展了现有蜘蛛毒素应用的领域，尤其是拓展白额高脚蛛毒素的新应用。

本发明重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法的有益效果：

1)本发明重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法采用含白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组菌进行发酵获得毒素多肽，该重组菌可以含一个或多个重组白额高脚蛛毒素多肽的编码基因，相对单一编码基因的重组菌，本发明的重组菌的重组表达载体可选择性大，构建难度小，便于构建并筛选出符合工业化生产要求的重组菌，且其遗传稳定性好。

2)该重组菌拓展了现有蜘蛛毒素应用的领域，尤其是拓展白额高脚蛛毒素多肽的新应用。

3)该重组菌的发酵表达工艺成熟，便于大批量的制备该重组菌发酵的活性产物。

4)用基因工程的方法重组表达得到了具有高抑菌活性的蜘蛛毒素，拓展了蜘蛛毒素多肽的获取途径；其工艺步骤简单，成本低廉，便于蜘蛛毒素多肽的工业化生产与应用。

5)该制备方法获得重组白额高脚蛛毒素多肽，纯度高，生产稳定性良好，采用本发明重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法获得的产物——重组白额高脚蛛毒素多肽，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和沙门氏菌等常见微生物菌种具有高抑菌活性，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑菌活性显著高于现有的抗菌药物卡那霉素的抑菌活性，适用于制备抗菌饲料添加剂，以及果蔬种子的保存，或者添加至制备抗菌药物中，用于制备抗菌药物，应用前景良好。

附图说明

图1—为实施例1～4中一种重组白额高脚蛛毒素多肽(自右至左分别为U1、U3、U4、U27)的SDS凝胶电泳图；

图2—为实施例1～4中重组白额高脚蛛毒素多肽(U1、U3、U4、U27)的抑菌活性检测分析图。

A.真核表达蜘蛛毒素对金黄色葡萄球菌的抑制作用；B.真核表达蜘蛛毒素对嗜水气单胞菌的抑制作用；C.真核表达蜘蛛毒素对大肠杆菌的抑制作用；D.真核表达蜘蛛毒素对沙门氏杆菌的抑制作用；CK：A,B：0.2mg/mL Amp；C,D：0.2mg/mL Kan。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽，所述重组白额高脚蛛毒素多肽由如SEQ IDNO.1所示的核苷酸片段(即编码基因)编码获得。

所述重组白额高脚蛛毒素多肽为U1(U1-sparatoxin-Hv1b的简称)，U1的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、所示。

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，包括以下步骤：

1)构建含白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组表达载体，所述编码基因为如SEQID NO.1所示中的任一核苷酸片段，用于编码白额高脚蛛毒素多肽；

构建重组表达载体的具体操作，包括：

a.引物设计

根据如SEQ ID NO.5所示的蜘蛛多肽毒素U1(U1-sparatoxin-Hv1b的简称)氨基酸序列设计引物，如表1所示，在序列的5’端和3’端分别引入核酸酶切位点XbaⅠ和HindⅢ和相应的保护碱基，并在序列的5’端引入蛋白酶切位点(LDKR)。

表1白额高脚蛛毒素多肽U1的引物序列

b.PCR扩增获得目的基因

以实验室保存的cDNA文库中pDNR-LIB-U1为模板，采用特异性引物通过PCR扩增分别得到目的基因U1。

通过1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒分别将目的片段U1进行回收，具体步骤如下：

(1)在凝胶成像系统下，观察到片段大小相符的单一条带后，迅速切下含有目的基因的胶块，放入事先称好重量的1.5mL离心管中，称重，得到胶块重量；

(2)加入与胶块等体积的PN buffer(0.1g＝100μL)，置于50℃水浴锅中，其间适当温和地晃动，确保胶块充分溶解；

(3)将吸附柱与收集管进行组装后，加入500μL BL buffer对吸附柱进行平衡，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的液体；

(4)将冷却至适温的凝胶溶液转入吸附柱，静置10min后，12,000rpm离心1min，将收集管中的凝胶溶液再次转入吸附柱静置几分钟，以确保回收率，12,000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液；

(5)在吸附柱中加入600μL PW buffer，12,000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液；

(6)重复步骤(5)；

(7)将吸附柱放入收集管，12,000rpm离心2min，去掉残留的PW buffer；

(8)去掉收集管，将吸附柱放入干净无菌的1.5mL离心管中，打开吸附柱的盖子，静置几分钟，等待吸附柱中的乙醇彻底挥发；

(9)在吸附柱中加入30μL EB buffer，静置几分钟后，12,000rpm离心1min；

(10)将离心管中的液体重新加入吸附柱，静置几分钟后，12,000rpm离心1min，去掉吸附柱，将得到的目的基因置于-20℃冰箱保存。

c.获得目的片段

①目的基因及表达载体pVT102U/α的酶切

采用限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ对目的基因U1及表达载体pVT102U/α进行酶切。

②目的基因与表达载体pVT102U/α的连接

将切胶回收后的目的基因与表达载体通过T4连接酶连接,将配制好的连接体系置于恒温混匀仪中，16℃反应过夜。

d.构建重组表达载体

①大肠杆菌感受态制备

(1)在LB平板上活化菌种，挑取单菌落接种于10mL液体LB培养基，37℃过夜震荡培养，次日取菌液按1:50比例接种于50mL液体LB培养基，37℃震荡培养约1h，直至OD600达到0.4-0.6，将菌液放置于4℃冰箱，预冷15min；

(2)提前预冷低温冷冻离心机，取1.4mL预冷的菌液于1.5mL离心管中，4℃，5,000rpm，3min离心后，去上清，收集菌体；

(3)重复步骤(2)；

(4)取750μL 0.1mol/L的CaCl₂溶液将菌体重悬，冰盒上冰浴30min，4℃，5,000rpm，3min离心后，去上清，收集菌体；

(5)取200μL 0.1mol/L的CaCl₂溶液将菌体重悬，冰盒上冰浴20min，加50μL 60％甘油，置于-36℃冰箱保存。

②热激转化

(1)将目的基因的连接液加入100μL感受态细胞，冰浴30min；

(2)置于42℃水浴锅中热激90s后，迅速转入冰盒上冰浴2min；

(3)加入800μL新鲜液体LB培养基后，置于37℃培养箱中震荡培养1h；

将菌液离心，3,000rpm，3min，在超净工作台上去上清，留200μL左右的上清重悬菌体，将菌悬液均匀涂布于含100mg/L Amp的固体LB平板上，37℃培养箱中倒置培养12h。

③克隆子鉴定及测序

采用菌落PCR对克隆子进行鉴定，挑取转化平板上的单菌落，分别溶于20μL无菌的ddH₂O中，作为菌落PCR的模板。

④将测序鉴定后的含有重组质粒的菌株进行活化，挑取单菌落接种于含100mg/LAmp的液体LB培养基中，37℃震荡培养12h，采用质粒小提试剂盒提取重组质粒，具体操作如下：

(1)取1.4mL菌液于1.5mL离心管中，12,000rpm，1min离心，去上清；

(2)重复步骤(1)；

(3)彻底去除上清，加入250μL P1 buffer，重悬菌体后，加入250μL P2 buffer，轻轻混匀后加入350μL P3 buffer，轻轻混匀，放置3min，12,000rpm，10min离心，取上清；

(4)将吸附柱与收集管进行组装后，加入500μL BL buffer对吸附柱进行平衡，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的液体；

(5)将步骤(3)中的上清液转入吸附柱，静置10min后，12,000rpm离心1min，将收集管中的溶液再次转入吸附柱静置几分钟，12,000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液；

(6)在吸附柱中加入600μL PW buffer，12,000rpm离心1min后，倒掉收集管中的废液；

(7)重复步骤(6)；

(8)将吸附柱放入收集管，12,000rpm离心2min，去掉残留的PW buffer；

(9)去掉收集管，将吸附柱放入干净无菌的1.5mL离心管中，打开吸附柱的盖子，静置几分钟，等待吸附柱中的乙醇彻底挥发；

(10)在吸附柱中加入30μL EB buffer，静置几分钟后，12,000rpm离心1min；将离心管中的液体重新加入吸附柱，静置几分钟后，12,000rpm离心1min，去掉吸附柱，将得到的重组表达载体置于-20℃冰箱保存。

重组表达载体命名为pVT102U/α-U1。

j.酿酒酵母感受态的制备

(1)准备固体YPD固体培养基活化酿酒酵母S78，30℃倒置培养3-4天。挑取大而尖的白色菌落接种于液体YPD培养基中，30℃，200rpm震荡培养12h；

(2)将取1mL菌液接种于50mL新鲜的液体YPD培养基中，30℃，200rpm震荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6左右；

(3)将培养好的菌液静置15min后，转入无菌的50mL离心管，5,000rpm离心3min，去上清；

(4)离心管中加入20mL无菌水重悬菌体，5,000rpm离心3min，去上清；

(5)重复步骤(4)，收集菌体；

(6)准备溶液A，按10×TE溶液：1M LiAc溶液：ddH₂O＝1:1:8的比例配制，取1.5mL溶液A重悬重复步骤(5)中的菌体，制成菌悬液。

k.酿酒酵母转化及表达

(1)准备溶液B，按10×TE溶液：1M LiAc溶液：50％PEG4000＝1:1:8的比例配制；

(2)取无菌的10mL离心管，同时加入1.5mL溶液B、10μg carrier DNA、20μL菌悬液混匀，加入1μg重组表达载体pVT102U/α-U1，混匀后30℃，200rpm孵育30min；

(3)将步骤(2)中的混合液置于42℃水浴锅中，热激15min，迅速转到冰盒上冰浴2min，5,000rpm离心3min，去上清，收集菌体；

(4)取200μL 1×TE溶液重悬菌体，5,000rpm离心3min，去上清，收集菌体；

(5)再次取200μL 1×TE溶液重悬菌体，5,000rpm离心3min，去掉大部分上清，留取200μL左右上清重悬菌体，将菌液均匀的涂布于缺陷型筛选培养基YSD上，30℃倒置培养5-6天；

3)重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得白额高脚蛛毒素多肽:

从步骤2)的转化平板上挑取3-4个状态较好的单菌落接种于10mL液体YSD培养基中，30℃，200rpm震荡培养12h；

将培养好的菌液按1:50的比例接种于50mL液体YSD培养基继代培养，30℃，200rpm震荡培养12h；

再次将培养好的菌液按1:50的比例接种于液体YSD培养基中，30℃，200rpm震荡培养3-4天，10,000rpm离心10min，收集上清(粗蛋白)，分装封口，-36℃保存；

将冷冻好的样品通过真空冷冻干燥机进行冻干，收集粗蛋白干粉，即得到白额高脚蛛毒素多肽U1，-36℃保存。

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法获得的重组白额高脚蛛毒素多肽的纯度为10-30％。

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法获得的重组白额高脚蛛毒素多肽，进行Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测，其操作方法和结果如下。

Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测的具体操作为：

(1)取适量粗蛋白样品溶于ddH₂O中，充分混匀；

(2)配制Tricine-SDS-PAGE凝胶：

(3)参照生工生物小分子量蛋白凝胶制备试剂盒说明书，配制16.5％分离胶和4％浓缩胶，按表格中配方，配制分离胶，水压凝结，待分离胶完全凝固后，继续按配方配制浓缩胶，插上梳子，待胶凝固后在电泳槽底部加入阳极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间加入阴极缓冲液；

(4)样品处理：将样品与上样缓冲液按1:1的比例混匀，置于恒温混匀仪中95℃处理8min，冷却至室温后，12,000rpm离心3min，取上清；

(5)将样品加入点样孔后，设置电泳参数：30V，45min；180V，80min；电泳全程应在冰浴或4℃进行；

电泳结束后，取出凝胶，加入固定液没过凝胶，置于摇床上固定1h，蒸馏水洗净固定液后，加入染色液没过凝胶，置于摇床上染色2-3h，用蒸馏水洗净染色液，加入脱色液没过凝胶，置于摇床上脱色，约0.5h换干净的脱色液，直至条带清晰可见，其Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测结果如图1中的泳道5所示，本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽U1的大小约为5.9kD。

实施例2

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽，由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段编码基因编码获得。

所述重组白额高脚蛛毒素多肽为U3，U3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6所示。

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，与实施例1中一种重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法相比，存在以下不同：

根据如SEQ ID NO.6所示的蜘蛛多肽毒素U3(U3-sparatoxin-Hv1b的简称)氨基酸序列设计引物。

表2白额高脚蛛毒素多肽U3的引物序列

目的基因为U3，以实验室保存的cDNA文库中pDNR-LIB-U3为模板，其表达载体构建的其他步骤和方法同实施例1。

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽，其Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测结果如图1中的泳道4所示，对照泳道1的marker，本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽U3的大小约为6.9kD。

重组表达载体命名为pVT102U/α-U3。

实施例3

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽，由如SEQ ID NO.3所示的核苷酸片段编码基因编码获得。

所述重组白额高脚蛛毒素多肽为U4，U4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、所示。

根据如SEQ ID NO.6所示的蜘蛛多肽毒素U4(U4-sparatoxin-Hv1b的简称)氨基酸序列设计引物。

表3白额高脚蛛毒素多肽U4的引物序列

目的基因为U4，以实验室保存的cDNA文库中pDNR-LIB-U4为模板，重组表达载体命名为pVT102U/α-U4，其表达载体构建的其他步骤和方法同实施例1。

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽，其Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测结果如图1中的泳道3所示，对照泳道1的marker，本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽U4的大小约为9.5kD。

实施例4

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽，由如SEQ ID NO.4所示的核苷酸片段编码基因编码获得。

所述重组白额高脚蛛毒素多肽为U27，U27的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、所示。

根据如SEQ ID NO.8所示的蜘蛛多肽毒素U27(U27-sparatoxin-Hv1b的简称)氨基酸序列设计引物。

表4白额高脚蛛毒素多肽U27的引物序列

目的基因为U27，以实验室保存的cDNA文库中pDNR-LIB-U27为模板，重组表达载体命名为pVT102U/α-U27。

其表达载体构建的其他步骤和方法同实施例1。

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽，其Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测结果如图1中的泳道2所示，对照泳道1的marker，本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽U27的大小约为6.9kD。

实施例5

与实施例1相比，存在的不同之处为：

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，还包括：

本实施例的重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法制备获得的重组白额高脚蛛毒素多肽的纯度高达95％，明显高于实施例1的重组白额高脚蛛毒素多肽的纯度。

申请人对实施例1～4所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法分别所制备得到的重组白额高脚蛛毒素多肽U1、U3、U4、U27，对其抑菌活性进行了检测分析，其具体操作如下：

(1)取粗蛋白U1、U3、U4、U27干粉溶于无菌水至0.5mg/mL；

(2)准备固体LB平板活化受试菌种大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、嗜水气单胞菌，37℃培养过夜((金黄色葡萄球菌培养24h))，挑取一个单菌落分别接种于液体LB培养基中，37℃，180rpm震荡培养过夜(金黄色葡萄球菌培养24h)

(3)分别取1mL培养好的菌液加入50mL已融化的固体LB培养基，充分混匀后倒入培养皿，待其冷却凝固，制成含菌平板；

(4)打孔，分别加入步骤(1)中粗蛋白U1、U3、U4、U27的饱和溶液，置于37℃培养后观察抑菌圈大小，并测量其直径。

同时，金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌以0.2mg/mL Kan(卡那霉素)为对照，大肠杆菌和沙门氏杆菌以0.2mg/mL Amp(氨苄青霉素)为对照，其抑菌效果统计结果如图2所示。

由图2可知，四种表达产物对金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌均有不同程度的抑制作用，且U1、U3、U4、U27对金黄色葡萄球菌的抑菌强度显著优于常规的抗菌药剂0.2mg/mL Kan(卡那霉素)，U3、U27对嗜水气单胞菌和大肠杆菌的抑菌强度与常规的抗菌药剂0.2mg/mL Kan(卡那霉素)相当，U1、U3、U4、U27对沙门氏杆菌的抑菌强度相对常规的抗菌药剂0.2mg/mL Amp(氨苄青霉素)较弱，但其抗菌活性也能达到常规抗菌药剂的65％左右。因此，本发明的重组白额高脚蛛毒素多肽对革兰氏阳性菌体有显著抗菌效果，同时，对革兰氏阴性菌也具有一定的抗菌效果，具有制备广谱抗菌药物的应用前景，也适用于制备抗菌饲料添加剂，以及果蔬种子的保存或者添加至制备抗菌药物中，工艺步骤简单，成本低廉，应用前景良好。

本发明的重组白额高脚蛛毒素多肽，除了实施例1～4例举的氨基酸序列如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示U1、U3、U4、U27这四种多肽，还包括与上述四种多肽氨基酸序列同源性≥80％、且来自白额高脚蛛的毒素多肽。

本发明的重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其中一些实验步骤中的药剂、用量，可以根据常规实验试剂的作用进行替换和调整，以及PCR扩增等操作的参数可以根据实际制备的需求进行调整，不受本发明中实施例给出的具体参数的限制，以上技术特征的改变，本领域的技术人员通过文字描述可以理解并实施，故不再另作附图加以说明。

序列表

<110> 湖州眺旺生物科技有限公司、湖南农业大学

<120> 重组白额高脚蛛毒素多肽及其制备方法

<130> 2020

<141> 2020-09-21

<150> 2020109340521

<151> 2020-09-08

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 448

<212> RNA

<213> Heteropoda venatoria

<400> 1

cggggaagaa ctgaatcact tataaaggga ctctttaaga aaaaatgaag atagctctgc 60

tttttgcgct tagcctcttt cttgtttaca ccatggctgg agaaaaggaa gcagtgagat 120

acggggaaat gatatttgat gatccaagcg attatatatt tgacgacgat gcaaatgaag 180

atgatccgtg cttgatatat gctcactgcg catataactg tgacgaaggt attccgtgtg 240

cgtgtgagtg taagacctca gttccctaag aatgaaatcc gagcgaacat ataatattat 300

gcagaacatc gaaagcaact ttaaatcaat gaaacatata ctgtttatgc atattgtact 360

attgtatgct gttgctgttt tatgatcgca catatatgca aataaaaagt tcacaagcaa 420

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 448

<210> 2

<211> 417

<212> RNA

<213> Heteropoda venatoria

<400> 2

cgggggaaga aaacacatct tcaagatgaa agcagcaatc tttttagttc tgttagtttg 60

cgtgttgctc gcagacgccg gtcagccgtg cgcaagtggc gagtgtggag aaaacgaatg 120

ttgcgctgga ggatcttacc atcgttactg cagaaggctc ggaaatgacg gtgagccatg 180

cgaagaaccg aacagattca attcatacct gaatgcatgt ccatgtggcg aaggattgtt 240

ttgcagcgtt ataaatcgtt gccagaaacc gtgagaagcc tcttgtgcag aagaattttt 300

gataaccagc gactgaaaaa tcacttttta tgaaataaag acttaaaaat tatgatttaa 360

ataaaatctg tttactttta aaaaaagaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 417

<210> 3

<211> 407

<212> RNA

<213> Heteropoda venatoria

<400> 3

cgggggcaaa tctttctaaa ctcgtccaac atgaaagtca ctcttctgtg tttggttctc 60

tccggaatat tgggggtttc cctggcttac acatcgtgca cgaagcaatc cgattgcgcg 120

gaggacgagt gctgcctgga tactttgttt ttcaaacgag cttattgtga gaggaggtat 180

ccagcaggaa gcgcatgtcc tacagcgtct gtatacaagc ctgaggaaga catgttttat 240

cttgcctgtc cttgcgttcc tatgtacgag tgccttggga aaggagtgac aggagaagat 300

ggaaagactt acatgaagga caccaaatgt attatgccac tttaggtaaa cgaatgaata 360

aaagtatttg aaaatataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 407

<210> 4

<211> 411

<212> RNA

<213> Heteropoda venatoria

<400> 4

cggggtcggc tcttcttcaa gaactataga aagacgatga ggaccttcct gctgctctgc 60

tgcctgctgg tgggcgcgtc cgtcgtgaag gtgacgcagg actgccactt cagcaacgag 120

tacttcctgg ccagccagtc catatgcgac cagtgcgggg agctgatcgc cgaagagaac 180

atcggagaga agtgcgagga aaactgcttc cggaacgaag ctatggaacg ttgtcttgac 240

gttgtgatac aacgccagaa tgagggatag agtgcttgct ttcatctgta aaatggctcg 300

aaccaagcga ttatttgcca cgtctcattt ctgtactgct tattttacaa ggaaataaag 360

atgagattct gtttcttcac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 411

<210> 5

<211> 74

<212> PRT

<213> Heteropoda venatoria

<400> 5

Met Lys Ile Ala Leu Leu Phe Ala Leu Ser Leu Phe Leu Val Tyr Thr

1 5 10 15

Met Ala Gly Glu Lys Glu Ala Val Arg Tyr Gly Glu Met Ile Phe Asp

20 25 30

Asp Pro Ser Asp Tyr Ile Phe Asp Asp Asp Ala Asn Glu Asp Asp Pro

35 40 45

Cys Leu Ile Tyr Ala His Cys Ala Tyr Asn Cys Asp Glu Gly Ile Pro

50 55 60

Cys Ala Cys Glu Cys Lys Thr Ser Val Pro

65 70

<210> 6

<211> 82

<212> PRT

<213> Heteropoda venatoria

<400> 6

Met Lys Ala Ala Ile Phe Leu Val Leu Leu Val Cys Val Leu Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ala Gly Gln Pro Cys Ala Ser Gly Glu Cys Gly Glu Asn Glu Cys

20 25 30

Cys Ala Gly Gly Ser Tyr His Arg Tyr Cys Arg Arg Leu Gly Asn Asp

35 40 45

Gly Glu Pro Cys Glu Glu Pro Asn Arg Phe Asn Ser Tyr Leu Asn Ala

50 55 60

Cys Pro Cys Gly Glu Gly Leu Phe Cys Ser Val Ile Asn Arg Cys Gln

65 70 75 80

Lys Pro

<210> 7

<211> 104

<212> PRT

<213> Heteropoda venatoria

<400> 7

Met Lys Val Thr Leu Leu Cys Leu Val Leu Ser Gly Ile Leu Gly Val

1 5 10 15

Ser Leu Ala Tyr Thr Ser Cys Thr Lys Gln Ser Asp Cys Ala Glu Asp

20 25 30

Glu Cys Cys Leu Asp Thr Leu Phe Phe Lys Arg Ala Tyr Cys Glu Arg

35 40 45

Arg Tyr Pro Ala Gly Ser Ala Cys Pro Thr Ala Ser Val Tyr Lys Pro

50 55 60

Glu Glu Asp Met Phe Tyr Leu Ala Cys Pro Cys Val Pro Met Tyr Glu

65 70 75 80

Cys Leu Gly Lys Gly Val Thr Gly Glu Asp Gly Lys Thr Tyr Met Lys

85 90 95

Asp Thr Lys Cys Ile Met Pro Leu

100

<210> 8

<211> 77

<212> PRT

<213> Heteropoda venatoria

<400> 8

Met Arg Thr Phe Leu Leu Leu Cys Cys Leu Leu Val Gly Ala Ser Val

1 5 10 15

Val Lys Val Thr Gln Asp Cys His Phe Ser Asn Glu Tyr Phe Leu Ala

20 25 30

Ser Gln Ser Ile Cys Asp Gln Cys Gly Glu Leu Ile Ala Glu Glu Asn

35 40 45

Ile Gly Glu Lys Cys Glu Glu Asn Cys Phe Arg Asn Glu Ala Met Glu

50 55 60

Arg Cys Leu Asp Val Val Ile Gln Arg Gln Asn Glu Gly

65 70 75

Claims

1.一种重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建含白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体pVT102U/α含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的任一核苷酸序列；

2)所述重组菌为含重组表达载体pVT102U/α的酿酒酵母，将步骤1)得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；

3)重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得白额高脚蛛毒素多肽，所述重组白额高脚蛛毒素多肽为U1、U3、U4或U27中的任意一种，U1、U3、U4、U27的氨基酸序列分别如SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

2.如权利要求1所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述重组表达载体pVT102U/α为pVT102U/α-U1、pVT102U/α-U3、pVT102U/α-U4或pVT102U/α-U27。

3.如权利要求2所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中构建重组表达载体的具体操作，包括引物设计、PCR扩增、获得目的片段和构建重组表达载体。

4.如权利要求1所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中构建重组菌的具体操作为：取pVT102U/α-U1、pVT102U/α-U3、pVT102U/α-U4和pVT102U/α-U27中的任一重组表达载体，热击转化酿酒酵母，采用YSD营养缺陷筛选培养基进行营养缺陷筛选，其操作为：将重组表达载体质粒DNA1.0μg；carrier DNA，10μg；酿酒酵母菌悬液，20μL；PEG溶液(10×TE，1M LiAC,50％PEG 4000,以1:1:8的体积比混合)1.5mL加入10mL无菌管中，混合，30℃，200rpm，培养30min；42℃热击15min后，5000g，离心5min；弃上清，细胞沉淀用200μL 1×TE洗涤，5000g，离心5min；弃上清，细胞沉淀悬浮于200μL 1×TE溶液中；细胞悬浮液涂YSD板，30℃培养4-6天。

5.如权利要求1所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中重组菌发酵培养表达的具体操作为：挑取2～4个3～5mm的重组菌于3mL YSD液体培养基中，28～32℃，220～280rpm，培养12～16h；按1:20～50的比例将制备的种子液接种入50mL YSD液体培养基中，28～32℃，220～280rpm，培养12～16h；再按1:20～50的比例将制备的种子液接种入1.0L YSD液体培养基中，28～32℃，220～280rpm，培养60～72h。

6.如权利要求1～5任一项所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法还包括：

4)蛋白纯化：收集步骤3)发酵培养得到的发酵产物的上清，分离纯化。

7.如权利要求6所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述蛋白纯化的具体操作为：将发酵产物的上清和预先用0.05M Tris·HCl(pH7.5)缓冲液混合，室温放置0.5～1h，然后用抽滤瓶抽滤，所得到的滤液，pH值调至7.5后，直接上预先用0.05MTris·HCl(pH7.5)平衡好的DEAE阴离子交换柱，然后分别用含0.1M,0.3M,0.5M,1.0M NaCl的0.1M NaCl缓冲液进行洗脱，收集每个洗脱峰进一步采用RP-HPLC纯化，低温冻干。