CN112852838B - 一种PoPE1基因和蛋白的新应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种PoPE1基因及蛋白在诱导烟草抗性基因表达的应用，所述PoPE1基因由信号肽序列和非信号肽序列组成，其中，所述信号肽核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其非信号肽序列如SEQ ID NO.2所示；所述PoPE1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PoPE1基因及蛋白来源于溶磷草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)P8，保藏号CGMCC No.2272。通过基因测序和生物学功能验证等研究发现，上述PoPE1蛋白具有诱导烟草抗性基因表达的功能，并能诱导烟草产生过敏性性坏死及活性氧的爆发等植物过敏反应，为未来开发生物类蛋白农药提供重要资源，在农业生产上具有广阔应用前景。

Description

一种PoPE1基因和蛋白的新应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种PoPE1基因和蛋白的新应用。

背景技术

在病原物侵染寄主植物前和整个侵染过程中，植物以多种因素、多种方式、多道防线来抵抗病原物的侵染和危害。其中，植物抗病相关基因在植物抵抗外来病原物侵染时发挥着重要的作用。植物抗病相关基因指类似于PR基因，是植物受刺激或诱导后，体内表达量发生变化的一类基因。这类基因间接地参与了植物抗病性的产生，通常在植物抗病过程中起着不可或缺的作用。PR-1和PR-5等PR基因是受NPR1调控，而NPR1是SAR调节中心，控制着植物体内水杨酸途径与茉莉酸途径的协同与拮抗关系。

防御酶活性提高也是诱导植物抗病性的主要表现之一，当植物受到外界条件诱导或病原物侵染时，受诱导的植物体内还会激活一些与植物抗病相关的酶的活性，如过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸酶(PAL)等。

生物源蛋白激发子是主要由细菌或真菌分泌的能诱导植物产生抗性，能提高植物对病原菌的抵抗力的特殊化合物。由于其绿色、环保和无毒特性，在农作物病害的生物防治中受到广泛的关注。化学农药防治结合抗病育种是目前农作物防治病害的主要手段，病原菌致病能力与植物抗性协同进化，导致农药施用量逐年增加，并且农药残留导致农产品的安全问题接踵而至。随着科学技术的进步，微生物代谢物诱导植物抗性的研究逐渐引起农业科学家的广泛关注，并促进微生物农药的发展与应用。

蛋白多肽类物质是一类具有生防作用的物质，研究证明，病原菌在侵染植物会释放一些能诱导植物发生免疫反应的物质，如多糖、小分子肽等，其与植物细胞表面的受体蛋白结合，激活信号传导，诱导抗性相关基因的表达，从而诱导植物产生系统抗性。

青霉菌分布广泛，菌落大部分成灰绿色，分生孢子梗呈扫帚状分枝。营腐生生活，其营养来源极为广泛，是一类杂食性真菌，可生长在任何含有机物的基质上，导致水果如柑橘、苹果、梨腐烂，但其发酵液却可应用在大豆、玉米等植物上进行防治病害，预示着其中可能存在抗菌类物质。

本发明发明人在溶磷草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)P8，保藏号CGMCCNo.2272中发现一种PoPE1基因及其蛋白，通过大肠杆菌表达系统将蛋白表达，发现其可提高番茄对青枯病的抗性，发明人针对该基因及蛋白进行进一步研究，以期发现其新功能或潜在的新应用。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种PoPE1基因和蛋白在诱导烟草抗性基因表达的应用，通过研究发现，上述PoPE1蛋白具有诱导烟草抗性基因表达的功能，从而诱导烟草的过敏性坏死及活性氧的爆发等植物过敏反应，为未来开发生物类蛋白农药提供重要资源。

实现上述目的的技术方案如下：

一种PoPE1基因在诱导植物抗性基因表达的应用，所述PoPE1基因由信号肽序列和非信号肽序列组成，其中，所述信号肽核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其非信号肽序列如SEQ ID NO.2所示；或信号肽序列为如SEQ ID NO.1所示和非信号肽序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的核酸序列。

一种PoPE1蛋白在诱导植物抗性基因表达的应用，所述PoPE1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。

在其中一些实施例中，所述PoPE1基因及蛋白来源于溶磷草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)P8，保藏号CGMCC No.2272。

在其中一些实施例中，所述抗性基因为PR1、PR5、PAL和HSR203j中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述植物为烟草。

本发明的目的之一还在于提供一种PoPE1基因的重组表达载体在烟草中的应用；

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种PoPE1基因的重组表达载体，所述重组表达载体上插入有上述PoPE1基因。

在其中一些实施例中，所述重组表达载体为pET-28a(+)。

本发明的目的之一还在于提供上述重组表达载体在诱导烟草抗性基因表达的应用。

本发明的目的之一还在于提供一种诱导烟草抗性基因表达的方法。

实现上述目的的技术方案如下：

一种诱导烟草抗性基因表达反应的方法，该方法包括注射激发蛋白PoPE1溶液。在其中一些实施例中，所述激发蛋白PoPE1溶液引起烟草过敏性反应的最低注射浓度为1-300nM；

在其中一些实施例中，所述注射部位优选为烟草叶片。

在其中一些实施例中，所述烟草抗性基因为PR1、PR5、PAL和HSR203j中的至少一种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明发明人发现PoPE1基因及其蛋白可以诱导烟草抗性基因表达，并诱导烟草的过敏性坏死及活性氧的爆发等植物过敏反应，为未来开发生物类蛋白农药提供重要资源，因而在农业生产上具有广阔应用前景。

附图说明

图1为实施例1中蛋白PoPE1的SDS-PAGE图，泳道Line1和Line2皆为表达的目标蛋白PoPE，红星标记为纯化蛋白PoPE1，分子量大小约为34kDa左右。

图2为实施例2中PoPE1蛋白诱导植物过敏反应效果对比图。

图3为实施例2中PoPE1蛋白诱导烟草HR反应结果图，其中a-f分别代表的PoPE1蛋白注射量为，a：蛋白缓冲液，b：10μM，c：1μM，d：300nM，e：200nM，f：100nM。

图4为实施例2中烟草氧爆发的DAB染色结果图，其中a-f分别代表的PoPE1蛋白注射量为，a：蛋白缓冲液，b：10μM，c：1μM，d：300nM，e：200nM，f：100nM。图5为实施例3中处理组抗性基因表达情况柱状统计图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本发明所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明的术语"包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

除非特别说明或另有定义，本发明所使用的“第一、第二…”仅仅是用于对名称的区分，不代表具体的数量或顺序。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本发明所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

本发明所述PoPE1基因及蛋白来源于溶磷草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)P8，保藏号为CGMCC No.2272，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所述PoPE1基因由信号肽序列和非信号肽序列组成，其中，所述信号肽核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其非信号肽序列如SEQ ID NO.2所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的核酸序列的序列。

SEQ ID NO.1：

ATGGCTCCTACTAAGTGGTTCACCGCGGCGCTGGCAAGCTGCCTCGCCGGAGCAGTCTTGGCT

SEQ ID NO.2：

GCGCCAACTGCGACCACCGATACCCTGATCGTCAAGCGTGCCAACATCAACGATGCGGCAACAGGTTTCGCAAGCCAGAATGGCGGCACCACCGGCGGCGCCGGCGGGACCACCACCACCGTCTCATCCTACGCAGCTTTTACGCAGGCAGTCCAGGGCGATGCAAAGAAGGTGGTCATTGTGTCAGGAACCATCACCCAGACTGCGGATCAAGCCCGAGTTGGCAGCAATACCAGCATCATCGGCAAGGATGCCAATGCCAAGCTGGTGAACTTTGGCGTTCTTATCAAGGGCGCCTCGAATGTCATCATTCGTAACCTGGGCATCTCCAAAGTTCTGGCTGCCAACGGAGATGCCATTGGCATTCAGAAGTCCAAGAATGTCTGGGTGGATCACTGCGATGTCTCTTCCGATATGAACCACGACAAGGACTACTACGATGGTCTCATTGACATCACCCACGCTTCGGACTACGTCACCGTGTCCAACACTTATATCCACGACCACTGGAAGGCTTCTCTGATCGGCCACTCCGACAACAACGGCGCCGAGGATAAGGGTCATCTCCATGTCACCCAGAACAACAATTACTGGAAGAACATCCACTCGCGCACTCCCTCGATCCGCTTCGGCACAGGCCACATCTACAACAGCTACTTTGAGGTTGACGACGGTATCAACACCCGCGATGGCGCCCAGGTCCTGGTGGAATCGAACGTGTTTGTCGGTTCCAACAAACCCCTCTATTCGACCGATGCCGGCTACGCCGTCGCCAAGGACAACGACTTTGGTTCCGGTGCCAACAAGGCCTCCGCTGGTACACTCACTTCTGTCCCGTATTCGTACTCGCTGCTGGGTTCCAAGAATGTCAAGAGCGCTGTTGTCGGTAGCGCGGGTCAGACTCTGAAGTTTTGA

应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述碱基序列进行修改，也属于本发明的保护范围。

本发明PoPE1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3：

实施例1 PoPE1基因的表达与纯化

1、原核表达载体的构建

针对PoPE基因设计特异性引物，引物序列具体为：PoPE1-F：CCATGGGCGCCAACTGCGACCAC，SEQ ID NO.4；PoPE1-R：CTCGAGAAACTTCAGAGTCTGA，SEQ IDNO.5，通过植物真菌RNA提取试剂盒(全式金，北京)对溶磷草酸青霉菌(PenicilliumoxalicumP8，保藏号为CGMCC No.2272)的菌丝体进行RNA提取，后采用RNA反转录试剂盒(全式金，北京)进行cDNA的合成，并以此为模板取2μL，前后引物各2μL，superMIX 2X 25μL,补充去离子水至反应体系为50μL，扩增程序为：94℃5min；94℃30s,55℃30s,72℃45s,35cycles，72℃5min；从而扩增得到PoPE1基因序列，将片段回收后，根据原核表达载体pET-28a(+)多克隆位点，选取酶切位点为NcoI(CCATGG)和XhoI(CTCGAG)，采用双酶切的方式，利用内切酶NcoI和XhoI进行酶切，将PoPE1编码序列连接到载体上。连接方法为采用T4连接酶，反应体系为20μL，片段与载体各2μL，反应温度25℃，反应时间20min。之后将连接的重组质粒转化大肠杆菌TransT1(全式金，北京)，具体方法为，取1μL的重组质粒与大肠杆菌感受态细胞在冰上共同孵育30min，之后将其于42℃处理1min，冰浴2min，在超净工作台下，加入无菌的LB培养基500μL，摇床37℃，200r/min培养1h后进行卡那霉素抗性平板涂布进行培养。并将长出的菌落进行测序，经测序正确的大肠杆菌进行大量培养并提取连接正确的质粒，并转化大肠杆菌DE3(全式金，北京)进行后续蛋白表达。

2、蛋白表达

将验证正确的蛋白表达菌株过夜活化，取1mL菌液接种至10mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，摇床37℃培养至OD600为0.6-0.8。

同时将含有pET-28a(+)的空质粒的表菌株为阴性对照，分别取1mL的菌液计入到含有50μg/mL的卡那霉素的200mL的LB培养基中，37℃，220r/min，震荡培养3-4h至OD600为0.6-0.8。加入诱导剂IPTG(终浓度为2mmol/L)，16℃诱导蛋白表达12h。菌体收集，高速离心(6000r/min)收集菌体，弃上清液，加入缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,pH 7.0)涡旋振荡，经超声波破碎，功率200w，间隔时间5s，超声震荡5s，共计30min。超声破碎后，将全部的液体加入50mL的离心管中，低温高速离心(8000r/min，4℃离心30min)收集上清液，上清液即为蛋白PoPE1表达液。

3、蛋白纯化

将获得的蛋白表达液通过无菌的10mL注射器过0.45μm滤膜，之后将过完滤膜的蛋白表达液进行Ni-柱(5mL)亲和层析采用重力柱的方式，对蛋白进行吸附，并重复上样3次，从而最大可能地将目的蛋白吸附到Ni-柱上。之后用5倍上样体积的缓冲液(50mmol/LTris-HCl,pH 7.0)冲洗Ni柱，在出口处用10μL的移液枪吸取5μL进行蛋白检测，参照brandford蛋白检测，直至缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,pH 7.0)将不能吸附到柱上的蛋白全部冲洗出来。然后用1倍上样量体积的洗脱缓冲液洗脱蛋白，并收集洗脱液，并利用10kDa超滤管(上海生工)进行浓缩除盐(5000r/min，4℃离心30min)。除盐后，加入无盐的Tris缓冲液至溶液体积1mL。

4、蛋白电泳检测

取10μL蛋白浓缩液至1.5mL的离心管中，加入2μL 6×Protein loading buffer混匀，沸水浴10min，取10μL进行SDS-PAGE检测，电泳为恒压垂直胶电泳，电泳步骤为，80V，15min，此步骤目的为是蛋白在浓缩胶中压到一条线，方面后续蛋白的分子量的分析，之后转换电压160V，50min至蛋白移动至胶的底部。电泳结束后，考马斯亮蓝R250染色，观察蛋白表达情况。

经过SDS-PAGE检测，获得分子量约为34kDa的包含His(组氨酸)的融合表达蛋白，且从图1SDS-PAGE胶图中可以看出，该蛋白的纯度较高，杂带较少，可用于后续的生测实验。

实施例2 PoPE1蛋白诱导植物过敏反应

1、诱导植物过敏性坏死反应

将上述纯化后PoPE1蛋白通过调整蛋白浓度约500nM，在选取一月龄左右的烟草、油菜和辣椒的中部叶片，通过1mL的无菌注射器从叶片的背面注射50μL的PoPE1蛋白溶液，重复三次，6h后观察叶片坏死情况。

从图2中可以得知，蛋白PoPE1在500nM时能引起烟草叶片的坏死反应，而在此浓度下对油菜和辣椒却没有叶片坏死情况出现，无法引起油菜和辣椒叶片的坏死反应。

2、诱导烟草过敏性坏死反应(Hypersensitive Response，HR)的浓度筛选

经测定PoPE1蛋白浓度后，调整蛋白浓度为1μM，10μM，100nM，200nM和300nM，以缓冲液buffer(50mmol/L Tris-HCl,pH 7.0)为对照，选取一月龄左右3—4叶期的三生烟草植株的中部叶片，通过1mL无菌注射器(不带针头)从叶片背面注射50μL的重组蛋白，每一浓度下共同处理同一植株叶片一次，并设置三次重复，6h后观察叶片典型的坏死斑情况并拍照，并确定最小的引起烟草叶片坏死的蛋白浓度。

通过图2诱导烟草HR反应结果图中各组实验组结果分析可知，引起烟草过敏性反应的蛋白浓度为200nM，低于此浓度基本上不能引起烟草的过敏性反应，蛋白的浓度越高，诱导的过敏反应越剧烈。

3、激活烟草过氧化氢的积累

再将上述叶片剪下，并用蒸馏水冲洗干静，放入含有1％的DAB(Diaminobezidin3,3-二氨基联苯胺)染色液的培养皿中，低温避光下采用冷冻干燥机真空处理2h后用无水乙醇进行处理，待叶片叶绿素完全脱色后进行拍照，以蛋白缓冲液为对照，每个处理步骤重复三次。

通过图3氧爆发的DAB染色结果图中各组实验组结果分析可知，叶片经过蛋白处理后，可以在注射部位观察到有明显的褐色物质出现。说明该蛋白PoPE1可以激活叶片中活性氧的产生。

实施例3重组蛋白PoPE1诱导抗性基因表达水平检测

采用荧光定量PCR的方法，对烟草抗病性相关基因转录水平进行分析。选取经注射重组蛋白PoPE1溶液的烟草叶片以及用buffer(50mmol/L Tris-HCl,pH 7.0)处理的烟草叶片分别用液氮研磨成粉，利用植物RNA提取试剂盒(全式金)提取烟草叶片RNA，方法步骤参照试剂盒说明书，将提取后的RNA放置于-80℃保存。对提取的烟草叶片RNA进行反转录，采用全式金公司的反转录试剂盒(Transcript Two step RT-PCR kit)，取1μg RNA进行cDNA反转录，反应体系为20μL(基因前后引物各1μL(PoPE1-F：CCATGGGCGCCAACTGCGACCAC，SEQID NO.6；PoPE1-R：CTCGAGAAACTTCAGAGTCTGA，SEQ ID NO.7)，模板1μL，mix 10μL，双蒸水7μL)，取1μL cDNA为模板，以actin为内参基因，对基因PR1(病程相关蛋白1；Pathogenrelated 1)，PR5(病程相关蛋白5；Pathogen related 5)，PAL(苯丙氨酸解氨酶)以及HSR203j(植物诱导抗性Marker gene)进行抗性基因的特异性扩增，采用全式金公司qPCR2步法检测，使用ABI7500仪器程序如下，94℃30S；94℃5S，60℃30s采集信号，重复循环40次，检测在激发蛋白注射后抗性相关基因的表达量。

抗病相关基因的特异性引物如下表1所示：

表1

名称	序列	SEQ ID NO.
			Actin F	ATGCCTATGTGGGTGACGAAG	8
Actin R	TCTGTTGGCCTTAGGGTTGAG	9
			PR1 F	CGTTGAGATGTGGGTCGATG	10
PR1 R	CCTAGCACATCCAACACGAA	11
			PR5 F	CTCATGCTGCCACTTTTGAC	12
PR5 R	CTCCAAGATTGGCCTGAGTC	13
			PAL F	GTTATGCTCTTAGAACGTCGCCC	14
PAL R	CCGTGTAATGCCTTGTTTCTTGA	15
			HSR203j F	TGCCGTCAAAGATGTAGTCG	16
HSR203j R	CAGCATGGCTGACACAAAAG	17

荧光定量PCR扩增条件：

94℃预变性30s、94℃变性5s、60℃30s，并采集信号，循环40次。

对照组中相关基因的表达均默认为1，图4柱状图显示处理组中的表达量变化，经对比分析可知，经过荧光定量PCR结果分析后可见PoPE1处理(即注射激发蛋白PoPE1)烟草叶片6h后，提高抗性基因(如基因PR1，PR5，PAL和HSR203j)的表达，即检测显示上调。说明PoP1蛋白可以诱导增强植物抗病性，从而有效抵抗病原物的侵染和危害，预测其在生物类蛋白农药的开发中具有重要应用前景，其具体配制及工艺有待做进一步的研究。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东省科学院生物工程研究所

<120> 一种PoPE1基因和蛋白的新应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggctccta ctaagtggtt caccgcggcg ctggcaagct gcctcgccgg agcagtcttg 60

gct 63

<210> 2

<211> 915

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gcgccaactg cgaccaccga taccctgatc gtcaagcgtg ccaacatcaa cgatgcggca 60

acaggtttcg caagccagaa tggcggcacc accggcggcg ccggcgggac caccaccacc 120

gtctcatcct acgcagcttt tacgcaggca gtccagggcg atgcaaagaa ggtggtcatt 180

gtgtcaggaa ccatcaccca gactgcggat caagcccgag ttggcagcaa taccagcatc 240

atcggcaagg atgccaatgc caagctggtg aactttggcg ttcttatcaa gggcgcctcg 300

aatgtcatca ttcgtaacct gggcatctcc aaagttctgg ctgccaacgg agatgccatt 360

ggcattcaga agtccaagaa tgtctgggtg gatcactgcg atgtctcttc cgatatgaac 420

cacgacaagg actactacga tggtctcatt gacatcaccc acgcttcgga ctacgtcacc 480

gtgtccaaca cttatatcca cgaccactgg aaggcttctc tgatcggcca ctccgacaac 540

aacggcgccg aggataaggg tcatctccat gtcacccaga acaacaatta ctggaagaac 600

atccactcgc gcactccctc gatccgcttc ggcacaggcc acatctacaa cagctacttt 660

gaggttgacg acggtatcaa cacccgcgat ggcgcccagg tcctggtgga atcgaacgtg 720

tttgtcggtt ccaacaaacc cctctattcg accgatgccg gctacgccgt cgccaaggac 780

aacgactttg gttccggtgc caacaaggcc tccgctggta cactcacttc tgtcccgtat 840

tcgtactcgc tgctgggttc caagaatgtc aagagcgctg ttgtcggtag cgcgggtcag 900

actctgaagt tttga 915

<210> 3

<211> 325

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Ala Pro Thr Lys Trp Phe Thr Ala Ala Leu Ala Ser Cys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Val Leu Ala Ala Pro Thr Ala Thr Thr Asp Thr Leu Ile Val

20 25 30

Lys Arg Ala Asn Ile Asn Asp Ala Ala Thr Gly Phe Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Gly Gly Thr Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Thr Thr Val Ser Ser

50 55 60

Tyr Ala Ala Phe Thr Gln Ala Val Gln Gly Asp Ala Lys Lys Val Val

65 70 75 80

Ile Val Ser Gly Thr Ile Thr Gln Thr Ala Asp Gln Ala Arg Val Gly

85 90 95

Ser Asn Thr Ser Ile Ile Gly Lys Asp Ala Asn Ala Lys Leu Val Asn

100 105 110

Phe Gly Val Leu Ile Lys Gly Ala Ser Asn Val Ile Ile Arg Asn Leu

115 120 125

Gly Ile Ser Lys Val Leu Ala Ala Asn Gly Asp Ala Ile Gly Ile Gln

130 135 140

Lys Ser Lys Asn Val Trp Val Asp His Cys Asp Val Ser Ser Asp Met

145 150 155 160

Asn His Asp Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Ile Asp Ile Thr His Ala

165 170 175

Ser Asp Tyr Val Thr Val Ser Asn Thr Tyr Ile His Asp His Trp Lys

180 185 190

Ala Ser Leu Ile Gly His Ser Asp Asn Asn Gly Ala Glu Asp Lys Gly

195 200 205

His Leu His Val Thr Gln Asn Asn Asn Tyr Trp Lys Asn Ile His Ser

210 215 220

Arg Thr Pro Ser Ile Arg Phe Gly Thr Gly His Ile Tyr Asn Ser Tyr

225 230 235 240

Phe Glu Val Asp Asp Gly Ile Asn Thr Arg Asp Gly Ala Gln Val Leu

245 250 255

Val Glu Ser Asn Val Phe Val Gly Ser Asn Lys Pro Leu Tyr Ser Thr

260 265 270

Asp Ala Gly Tyr Ala Val Ala Lys Asp Asn Asp Phe Gly Ser Gly Ala

275 280 285

Asn Lys Ala Ser Ala Gly Thr Leu Thr Ser Val Pro Tyr Ser Tyr Ser

290 295 300

Leu Leu Gly Ser Lys Asn Val Lys Ser Ala Val Val Gly Ser Ala Gly

305 310 315 320

Gln Thr Leu Lys Phe

325

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ccatgggcgc caactgcgac cac 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctcgagaaac ttcagagtct ga 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ccatgggcgc caactgcgac cac 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ctcgagaaac ttcagagtct ga 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

atgcctatgt gggtgacgaa g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tctgttggcc ttagggttga g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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cgttgagatg tgggtcgatg 20

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<400> 11

cctagcacat ccaacacgaa 20

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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ctcatgctgc cacttttgac 20

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<213> Artificial Sequence

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ctccaagatt ggcctgagtc 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gttatgctct tagaacgtcg ccc 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ccgtgtaatg ccttgtttct tga 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

tgccgtcaaa gatgtagtcg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

cagcatggct gacacaaaag 20

Claims (8)

1.一种PoPE1基因在诱导烟草抗性基因表达的应用，所述PoPE1基因由信号肽序列和非信号肽序列组成，其中，所述信号肽核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，非信号肽序列如SEQID NO.2所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的核酸序列，所述抗性基因为PR1、PR5、PAL和HSR203j中的至少一种。

2.一种PoPE1蛋白在诱导烟草抗性基因表达的应用，所述PoPE1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述抗性基因为PR1、PR5、PAL和HSR203j中的至少一种。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的应用，所述PoPE1基因及蛋白来源于溶磷草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)P8，保藏号CGMCC No.2272。

4.一种PoPE1的基因重组表达载体在烟草中诱导抗性基因表达的应用，其特征在于，所述重组表达载体上插入有如权利要求1所述的PoPE1基因，所述抗性基因为PR1、PR5、PAL和HSR203j中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pET-28a(+)。

6.一种诱导烟草抗性基因表达的方法，其特征在于，该方法包括注射PoPE1蛋白溶液，所述抗性基因为PR1、PR5、PAL和HSR203j中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PoPE1蛋白溶液引起烟草过敏性反应的最低注射浓度为1-300nM。

8.根据权利要求6-7任一项所述的方法，其特征在于，所述PoPE1蛋白溶液注射部位为烟草叶片。

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