CN101759778A - 一种蜘蛛活性多肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从蜘蛛毒液中分离得到的新的活性多肽和其制备方法，以及该活性多肽在治疗抗缺血性脑损伤中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种从蜘蛛毒液中分离得到的新的活性多肽及其制备方法和应用。
背景技术
蜘蛛又名网虫、盘丝仙，属节肢动物门蛛形纲蜘蛛目，种类很多，全世界有4万余种，我国有4000多种。蜘蛛具有极高的药用价值，性味甘、微苦、微寒、有大毒，具有消炎、消毒、消肿瘤等功能。用蜘蛛入药，具有解毒消炎之功效，主治疔疮、疮疡、毒虫咬伤、口噤、中风口斜、小儿惊风、阳痿早泄等症。用活蜘蛛泡酒，可用来驱湿消炎、解毒、治疗中风、牙痛、风湿骨痛、肾虚等病症。
其中蜘蛛毒素的药用价值尤其受到人们的重视，蜘蛛毒素成分复杂，其中主要成分是多肽和蛋白质，包括多肽神经毒素、细胞毒素、酶、激肽类似物、凝集活性肽和抗菌肽等。此外蜘蛛毒液中还含有多胺类以及A TP、核苷酸、单胺类等低分子质量物质和无机盐等。据报道，蜘蛛毒素对治疗脑溢血等疾病的效果是目前世界上任何一种药物所无法比拟的，可治疗和预防癫痛、老年性痴呆、脑动脉硬化、脑供血不足、中风后遗症等。我国抗衰老研究中心用蜘蛛毒液研制成“脑力再生丸”、“增微一号丸”，用于治疗脑血管和肿瘤等疾病，取得良好效果。蜘蛛毒素在医疗上的其它用途还有：从蜘蛛毒液中可分离出镇痛肽；有些蜘蛛的粗毒中存在对枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及大肠杆菌有明显抑制作用的抗菌活性肽等。因此，蜘蛛毒素含有大量的活性多肽，这是新药发现的一个重要来源。
发明人将本发明的蜘蛛活性多肽全序列结构经蛋白数据库进行搜索比较，未发现有任何相同的多肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从蜘蛛毒液中分离得到的新的活性多肽和其制备方法，以及该活性多肽在治疗抗缺血性脑损伤中的应用。
该蜘蛛活性多肽是一种单链多肽，分子量1862.5，等电点9.82，多肽全序列为：天冬氨酸-亮氨酸-苏氨酸-脯氨酸-苏氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(DLTPTPRGINSRFKPF)。
该蜘蛛活性多肽制备方法为：
a.蜘蛛毒液15000r/min离心8min-12min，取上清液冰冻干燥；
b.DEAE Sephadex A-50离子交换：上述冻干粉溶解于0.05M Tris-HCl，含10mM EDTA，pH 7.3的缓冲液，装于10kDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时，DEAE Sephadex A-50(Pharmacia公司产品)阴离子交换柱(500mm长，26mm直径)经于0.05M Tris-HCl，含10mMEDTA，pH 7.3的缓冲液平衡，已透析好的样品上柱，同样缓冲液洗脱，收集活性成分峰。
c.Sephadex G-75凝胶过滤：上述活性峰冻干，溶解于pH 7.8，0.05mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，含10mmol/L的EDTA缓冲液，上样于Sephadex G-75(Pharmacia公司产品)凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，用同样缓冲液洗脱，收集活性成分峰。
多肽分子量测定采用快原子轰击质谱法：以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流1μA，发射电压25Kv。
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法测定多肽等电点(韦和平等，生物化学实验与指导，250-253，中国医药科技出版社，2003)。
氨基酸序列测定：将样品置于水解管中，加入6mol/L的盐酸溶液，真空封口。在110℃下水解24h，冷却后过滤和蒸干，再加入0.02mol/L的盐酸溶液在空气中放置30min。采用835-50氨基酸自动分析仪(日本Hitachi公司)测定氨基酸序列。
该多肽用于治疗抗缺血性脑损伤的用途通过减轻PC12细胞缺血缺氧损伤作用和对大鼠局灶性缺血再灌注损伤保护作用的实验例加以说明。
试验例一：蜘蛛活性多肽对PC12细胞损伤的保护作用
1.实验方法
1.1PC细胞培养和传代
细胞用含10％的小牛血清的DMEM培养液配置成每毫升含106个细胞的细胞悬液，接种于培养瓶中，置CO2培养箱，37℃，5％CO2下培养。待细胞铺满单层后，弃去培养基，用少许PBS缓冲液荡洗两次，加入2mL-3mL用PBS液配成0.125％胰酶，消化1min-2min，待细胞变圆后，立即加入足量新鲜培养液终止消化，并反复吹打，显微镜下观察，待单层细胞松动浮起呈单个分散时，用培养液稀释至每毫升含5×105个细胞，接种于96孔培养板中，37℃，5％CO2培养箱中孵育24h后即可用于实验。
1.2蜘蛛活性多肽对正常PC细胞的影响
设给予等量PBS液空白对照组，蜘蛛活性多肽终浓度分别为10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L的高、中、低三个剂量组，终浓度为10-6mol/L尼莫地平组，每组6孔，给药后，继续培养24h，每孔加20μL的5g/L的溴化四氮唑蓝(MTT)溶液。37℃培育4h，收集上清液，每孔加入DMSO 200μL，轻轻振荡2-3分钟，在酶标仪上测570nm处吸光度(A值)。
同前方法，24孔培养板，每组6孔，加入药物24h后，收集培养液，测定其中乳酸脱氢酶(LDH)的含量。
1.3蜘蛛活性多肽对NaCN致PC12细胞缺血损伤的影响
设给予等量PBS液的空白对照组，给予等量PBS液的模型组，蜘蛛活性多肽终浓度分别为10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L的高、中、低三个剂量组，终浓度为10-6mol/L的尼莫地平组，每组6孔。PC12细胞培养24h后用D-Hank’s液洗两次，加入2mL无糖Earle’s液，各组分别加入药物或试剂后温孵24h，然后加入终浓度为20mmol/L的NaCN，作用10min后弃去培养基，用D-Hank’s液洗两次，加入2mL低糖DMEM培养基继续培养24h。其余方法同上，测定570nm处吸光度(A值)和LDH的含量。
1.4蜘蛛活性多肽对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的影响
分组同NaCN致缺血实验相同，每组6孔，加入药物24h后再加终浓度为0.5mmol/L的H2O2，刺激细胞4h后，即为氧化损伤模型。其余方法同上，测定570nm处吸光度(A值)和LDH的含量，同样方法重复两次。
1.5统计学处理
所有数据均以均值±标准差
采用单因素方差分析进行组间显著性比较，两组间样本均数比较采用t检验。
2.实验结果
2.1蜘蛛活性多肽对正常培养细胞的影响
由表1可见，各药物对正常条件培养的细胞活性以及LDH含量均无影响，与空白对照组相比，差异均没有统计学意义(P＞0.05)。
表1蜘蛛活性多肽对正常培养细胞的影响(
n＝6)
2.2蜘蛛活性多肽对NaCN致PC12细胞缺血模型的影响
由表2可见，PC12细胞经缺糖处理后，A值显著下降，LDH的含量显著增多，与空白对照组相比差异有非常显著意义(P＜0.01)，表示细胞活力显著下降，细胞损伤程度严重。蜘蛛活性多肽终浓度分别为10-7mol/L，10-8mol/L高、中剂量组能明显改善NaCN对PC12细胞造成的缺血损伤，细胞摄取MTT的能力明显增强，与模型组比较，差异有非常显著意义(P＜0.01)；蜘蛛活性多肽终浓度为10-9mol/L低剂量组与模型组比较，差异有显著意义(P＜0.05)。同时，蜘蛛活性多肽终浓度分别为10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L的高、中、低三个剂量组，均能显著减少细胞LDH的释放量，与模型组相比，差异有非常显著意义(P＜0.05)。蜘蛛活性多肽的3个剂量组随着浓度增加作用增强。
表2蜘蛛活性多肽对NaCN致PC12细胞缺血模型的影响(
n＝6)
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
2.3蜘蛛活性多肽对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的影响
表3可见，与空白对照组比较，模型组经H2O2处理后A值显著下降且LDH含量显著增多(P＜0.01)，表明细胞活力显著下降，细胞损伤程度严重。蜘蛛活性多肽终浓度分别为10-7mol/L，10-8mol/L高、中剂量组能明显抑制H2O2对PC12细胞造成的缺氧损伤，细胞活力明显增强，与模型组比较，差异有非常显著意义(P＜0.01)；蜘蛛活性多肽低剂量组(10-9mol/L)与模型组比较，差异有显著意义(P＜0.05)。同时，蜘蛛活性多肽终浓度分别为10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L的高、中、低三个剂量组均能显著减少细胞LDH的释放量，与模型组相比，差异有非常显著意义(P＜0.05)蜘蛛活性多肽三个剂量组随着浓度增加作用增强。
表3蜘蛛活性多肽对H2O2诱导PC12细胞氧化损伤的影响(
n＝6)
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
试验例二：蜘蛛活性多肽对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用
1.实验方法
取SD大鼠70只，雄性，体重250g-350g，按体重随机分为7组，分别为假手术组，均给以等量生理盐水的模型组，溶媒组，0.5mg/kg的尼莫地平组，蜘蛛活性多肽40μg/kg，20μg/kg，10μg/kg组。以上各组给药容量均为0.5mL/100g。每天尾静脉注射给药一次，连续4天，第4天最后一次于缺血前30min给药。参考Longa等人的方法，采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。大鼠用10％水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后仰卧恒温手术台上。从颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支：枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用，然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将长5cm，直径0.28mm的尼龙线经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进18mm左右时感到阻力，即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了大脑中动脉的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。1h后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端。缝合皮肤，完成MCAO导致局灶性脑缺血-再灌注模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞大脑中动脉。
术后24h按Bederson的方法对动物的行为缺陷进行分级评分，标准如下：
0级：未观察到神经症状；
1级：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁；
2级：将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低；
3级：动物自由行走时向手术对侧环转或转圈；
4级：软瘫，肢体无自发活动。
MCAO24h后，断头处死大鼠，取出大脑，称湿重。在视交叉及其前后各2mm处，做冠状切片5片，于1％氯化三苯基四氮唑(TTC)中避光37℃孵育30min，其中每隔7-8分钟翻动一次，再分离苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)，计算梗塞百分比如下：
梗死百分比(％)＝苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100％
将染色后的脑组织置于110℃烘箱烘干，计算脑含水量如下：
脑组织含水量(％)＝(1-脑组织干重/脑组织湿重)×100％
2.实验结果：
由表1可见：模型组的MCAO大鼠脑卒中评分明显增加，梗死百分比和脑含水量也明显增大(P＜0.01与假手术组比较)，说明造模成功。溶媒对MCAO大鼠的脑卒中评分、梗死百分比和脑含水量没有明显作用(P＞0.05与模型组比较)。蜘蛛活性多肽40μg/kg，20μg/kg，10μg/kg组能显著降低MCAO大鼠的脑卒中评分，并能够明显减少局灶性脑缺血大鼠脑的梗死百分比和降低脑含水量(P＜0.01，P＜0.05)。三个剂量是随着浓度增大作用增强。尼莫地平0.5mg/kg也能显著改善MCAO大鼠的脑卒中评分，减少梗死百分比和降低脑含水量(P＜0.01)。
表1蜘蛛活性多肽对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用(n＝10)
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01
具体实施方式
实施例1：
该蜘蛛活性多肽制备方法为：
a.蜘蛛毒液15000r/min离心8min-12min，取上清液冰冻干燥；
b.DEAE Sephadex A-50离子交换：上述冻干粉溶解于0.05M Tris-HCl，含10mM EDTA，pH 7.3的缓冲液，装于10kDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时，DEAE Sephadex A-50(Pharmacia公司产品)阴离子交换柱(500mm长，26mm直径)经于0.05M Tris-HCl，含10mMEDTA，pH 7.3的缓冲液平衡，已透析好的样品上柱，同样缓冲液洗脱，收集活性成分峰。
c.Sephadex G-75凝胶过滤：上述活性峰冻干，溶解于pH 7.8，0.05mol/L Tris-HCl，0.1mol/L的NaCl，含10mmol/L的EDTA缓冲液，上样于Sephadex G-75(Pharmacia公司产品)凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，用同样缓冲液洗脱，收集活性成分峰。
多肽分子量测定采用快原子轰击质谱法：以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流1μA，发射电压25Kv。
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦法测定多肽等电点(韦和平等，生物化学实验与指导，250-253，中国医药科技出版社，2003)
氨基酸序列测定：将样品置于水解管中，加入6mol/L的盐酸溶液，真空封口。在110℃下水解24h，冷却后过滤和蒸干，再加入0.02mol/L的盐酸溶液在空气中放置30min。采用835-50氨基酸自动分析仪(日本Hitachi公司)测定氨基酸序列。
通过上述方法得到的蜘蛛活性多肽是一种单链多肽，分子量1862.5，等电点9.82，多肽全序列为：天冬氨酸-亮氨酸-苏氨酸-脯氨酸-苏氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(DLTPTPRGINSRFKPF)。
Claims (4)
1.一种从蜘蛛毒液中分离得到的一种多肽，其特征在于该多肽全序列为：天冬氨酸-亮氨酸-苏氨酸-脯氨酸-苏氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(DLTPTPRGINSRFKPF)。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于该多肽的分子量1862.5，等电点9.82。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于该多肽的提取方法为，
a.蜘蛛毒液15000r/min离心8min-12min，取上清液，0.50μm滤膜过滤；
b.将滤液上样于蛋白液相色谱仪上，采用反相色柱进行分离；
c.凝胶过滤：上述活性峰冻干，溶解于pH 7.8，0.05mol/L的Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，含10mmol/L的EDTA缓冲液，上样于凝胶过滤柱，用同样缓冲液洗脱，收集活性成分峰。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于该多肽用于治疗抗缺血性脑损伤。
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