CN103655631A - 抑制真菌生长的络新妇属蜘蛛有效部位的制备及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抑制真菌生长的络新妇属蜘蛛有效部位的制备及其用途。具体而言，该有效部位由粉碎或未粉碎的蜘蛛目络新妇科络新妇属（genus Nephila）虫体用盐溶液提取、酸沉淀、离心分离、再经透析方法方法纯化，并经冷冻干燥而得到络新妇属蜘蛛有效部位冻干粉；该有效部位具有显著抑制白色念珠菌生长的活性，可制备成水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂形式，用于制备防治真菌感染的药物制剂、医疗器械、日化用品、药用辅料、外伤敷料。

Description

抑制真菌生长的络新妇属蜘蛛有效部位的制备及其用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及从络新妇属蜘蛛中提取的抗真菌活性有效部位的制备及其防治真菌感染性疾病的医药用途。该有效部位由粉碎或未粉碎的蜘蛛目络新妇科络新妇属（genus Nephila）虫体用盐溶液提取、酸沉淀、离心分离、再经透析方法方法纯化；得到的有效部位经冷冻干燥而得。其具有显著抑制白色念珠菌生长的活性，可制备成水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂形式，用于制备防治真菌感染的药物制剂、医疗器械、日化用品、药用辅料、外伤敷料。

背景技术

随着医学科学的发展，各种新药物和新技术如广谱抗生素、激素、各种导管插管技术、化疗、移植等医疗手段的广泛使用，以及HIV感染和肿瘤，造成人类免疫系统被逐渐破坏的病例逐年增多，从而导致深部真菌病的发病率愈来愈高。而另一方面，随着人类滥用抗生素和临床抗真菌药物的广泛使用，导致传统抗生素不能有效对抗某些严重真菌感染和细菌感染，真菌的耐药现象日益严重。传统抗生素的作用已经遭遇显著瓶颈，大多数细菌、真菌对常见的抗生素产生了显著的抗药性；艾滋病患者、重症患者、烧伤患者等并发真菌性感染更使病患危在旦夕。因此，寻找广谱、高效、低毒的抗真菌新药已成为药物研究的热点；对耐药菌/顽固性真菌的研究迫在眉睫。

真菌病大体上可以分为以下四类：侵袭性真菌病与全身性真菌病（如曲霉病和念珠菌病等）、粘膜型真菌病（如“鹅口疮”等）、浅表型皮肤真菌病（如“香港脚”或“头皮癣”、“灰指甲”等）和过敏型真菌病（如哮喘与慢性炎症等）。在以上四类真菌病中，以第一类对人类危害最大，而后三类真菌病相应较轻一些。据来自国外的临床统计资料，在死于感染性疾病的人群中，有4%是死于全身性曲霉菌类真菌感染，大约2%的人死于全身性念珠菌感染。临床统计表明，病人一旦患上全身性曲霉病，其死亡率将高达85%，如患血液性念珠菌病则死亡率可达40%。利用现有抗真菌药物治疗全身性真菌病或血液感染型真菌病的效果至今仍无法令人满意。因此，药学界正在寻找可以抑制全身性感染的新型药物。

目前，国内外已开发上市的抗真菌药物主要有四大类，即多烯类（如两性霉素B）、三唑类（如氟康唑、咪康唑、益康唑、依曲康唑和酮康唑等）、烷基胺类（如特比萘芬）和新开发上市的棘白菌素（echinocandins）类（如卡帕芬净和米卡民等）。前三大类抗真菌药均为20世纪开发上市的老药，而棘白霉素类则是21世纪初开发上市的新药。但在上述药物中，只有少数几种能用于治疗全身性真菌感染症。三唑类抗真菌药物无论第一代还是第二代均对有丝真菌引起的全身性感染疗效不佳，而棘白霉素类抗真菌新药则对这类疾病有效。目前棘白霉素面临的最大问题是：尚无口服剂型，只限于注射（且仅限于医院使用），故病人使用颇为不便。其次，虽然棘白霉素对常见念珠菌病等真菌性感染疗效不错，但其价格昂贵，故而限制了它们在发达国家以外市场的销售量。如据报道，在我国市场上，每支卡帕芬净注射剂（剂量为50毫克）的零售价为3148元，而日本产的米卡民（50毫克剂量）价格稍低一些，但每支也要650元。我国医院临床目前最常用的全身性抗真菌药物仍为大扶康和特比萘芬。

老品种的康唑类如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等通过抑制真菌麦角甾醇生物合成中的羊毛甾醇14去甲基化酶而起效，此类老牌唑类抗真菌药物抗菌谱较窄而耐受性与日俱增，新品虽抗菌谱扩大但是代谢性质和理化特性不佳，水溶性低、生物利用度差。患者需要高脂饮食以利药物吸收，或服用高价的特种制剂形式方可起效。为增加水溶性而添加的环糊精等也给肾功能不全者带来较大威胁。

世界范围内，国际大型药业对抗真菌感染尤其是抗深度真菌感染的创新性药物的研发方兴未艾，而我国由于研发经费投入和对抗真菌感染药物的重视程度不够等原因，造成我国在真菌感染类治疗药物上落后跨国药企的事实，需要迎头赶上。

综上所述，尽快寻找新型、异于以往药物的抗真菌活性物质，是今后数十年药物工作者们需要抓紧研制的当务之急。

本研究团队以前从植物中发现许多对革兰氏阳性菌和/或阴性菌有效的植物提取部位和有效成分，更加增添了我们研发新的“绿色抗生素”、发现新的抗真菌天然药物的信心。[赵昱等，具抗病毒、抗炎、和/或抗菌作用的六棱菊属提取物及其用途，ZL200510077457.3]、[赵昱等，生姜中单萜苷类化合物及其抗菌用途和药物组合物，CN101012255]、[赵昱等，蒲公英中的两个黄酮苷及其抗格兰氏阳性菌的医药用途，ZL200710067180.5]、[赵昱等，蒲公英中的木质素及其抗菌活性和医药用途，ZL200710067458.9]、[赵昱等，黑紫橐吾中的含氯原子艾里莫芬烷及其抗菌和细胞毒活性，ZL200710067460.6]、[赵昱等，蒲公英中的倍半萜内酯及其抗格兰氏阳性菌的用途，ZL200710067776.5]、[赵昱等，黑紫橐吾素A及其抑制格兰氏阳性菌的医药用途，ZL200710068539.0]、[赵昱等，蒲公英木质素抑制格兰氏阳性菌的制药用途，ZL200810165728.4]。

本研究团队另外一个开发的重点是昆虫类抗菌肽资源。抗菌肽是自上世纪80年代以来兴起的新的抗菌药物开发领域。其是指从生物体内发现的宿主产生的一类能够抵御外界病原体感染的小分子多肽，由动物体内的分泌物、血液、淋巴组织等分离得到的大量抗菌肽与传统抗生素的作用机制不同，且其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都有不同的选择性。该研究方向引起了我们的兴趣，大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心的研发团队着力于从抗感染能力强的种群中发现绿色抗生素，诸如抗菌肽类物质和其他有成药可能的小分子物质基础。

络新妇蛛，Nephila,silk spider，属节肢动物门（Arthropoda）蛛型纲（Arachnida）络新妇科络新妇属昆虫，云贵高原广泛分布，结大型金黄色网，网的直径可达一公尺以上，以拉丝悬于树间。生活在温暖地区。约60种，云南省分布有3种；斑络新妇（Nephila pilipesFabricius）、棒络新妇（Nephila clavata L.Koch）、马拉近络新妇（Nephila malabarensisWalckenaer）。该属蛛体色艳丽，雌成蛛个体较大、雄蛛小数倍。

蜘蛛入药在我国早已有之。《唐本草》云：“主蛇毒，温疟，霍乱，止呕逆”；《日华子本草》云：“冷，无毒；斑蜘蛛治疟疾，疔肿”；《长沙药解》云：“炒枯存性研细用；破瘀消肿”；《本草纲目》云：“主口，脱肛，疔肿，胡臭”；《吉林中草药》云：“治瘰疬，疔疮，蜂、蝎蜇伤”；《中药大辞典》云：“祛风，消肿，解毒。治狐疝偏坠，中风口，小儿慢惊、口噤。疳积；疔肿，瘰疬，疮疡，蜈蚣、蜂、蝎蜇伤”。以上历史记录表明其体内必应具有某些特殊的物质和其特有的作用机制。在对云贵高原的药用昆虫抗菌活性系列研究过程中，我们对蛛型纲络新妇属进行了综合采集、种属鉴定和抑制真菌生长活性的药效学研究。

根据相关文献，在针对药物应用方面，“蜘蛛”多为复方中的一味，公开资料中没有蜘蛛作为单方应用于治疗与真菌感染相关疾病的报导。1995年王仁学公开的“一种速效口疮散”（申请号94103402.X），是由蜘蛛等5种药材构成，主治口腔性溃疡，兼治一般疥疮癣、丹毒等。2008年王秀成获得授权的专利“一种止痛止血止痒药散”（ZL200810016451.6），是由杨树花、蛇皮、蜘蛛等6种材料组成。2009年孙素芬等公开的“治疗脚气病的药物及其制备方法”（CN101411769A），由含蜘蛛在内的17种药物组成，且蜘蛛仅用于涂抹药膏配方中。显然，蜘蛛作为单味药单独使用于抑制真菌生长的医药用途在开发新的抗真菌物质基础方面仍是空白，故而本发明专门针对蛛型纲络新妇属进行抗真菌活性研发尚属首次且十分必要。

根据《中药大辞典》，其基元是指园网蛛科大腹园网蛛等全虫。动物分类学中，将此属归为圆蛛总科络新妇亚科络新妇属，是云南省优势资源。为明确云贵高原药源广泛分布的络新妇属蜘蛛是否具有抗真菌活性，及确定其抗真菌有效部位，指导进一步探明其中起主要药理作用的物质结构基础，从分子药理学基础上阐明络新妇属蜘蛛多种生物活性的作用机制，发明人对云南民间习用的络新妇属昆虫进行了综合采集和药效学活性研究。本发明使用不同浓度的盐溶剂系统对蛛形类虫体进行了提取，并由酸沉、离心、透析除盐等方法得到了富含多肽蛋白的有效部位，并测试了其抑制白色念珠菌的药理活性。试验结果发现：络新妇属蜘蛛抗真菌有效部位能显著抑制白色念珠菌生长。且具有较强的抑制活性，可以作为防治真菌感染类天然药物进一步深入开发，从而构成本发明。

发明内容

本发明的目的是提供了一种络新妇属蜘蛛具有抗真菌活性的有效部位及其制备方法；具体而言，该有效部位通过以下方法获得：由粉碎或未粉碎的蜘蛛目络新妇科络新妇属Nephila spp.虫体用盐溶液提取、酸沉淀、离心分离、再经透析方法纯化；得到的有效部位经冷冻干燥而得产品。

本发明的另一目的是提供了络新妇属蜘蛛抗真菌有效部位在制备防治真菌感染疾病的药物中的用途。

本发明的又一目的是提供了一种防治真菌感染的药物或药物组合物，其含有治疗有效量的络新妇属蜘蛛抗真菌有效部位和可药用辅料。其制剂形式包括水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、散剂、口服液、喷雾剂、冲剂、贴膜、注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、透皮吸收制剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂，及其控释或缓释剂型或纳米制剂。

本发明的另一目的是提供了将络新妇属蜘蛛抗真菌有效部位用于制备抗真菌感染的广谱抗菌药物、日化用品、医疗器械、药用辅料、外伤敷料或饲料添加剂的用途。

本发明中提供络新妇属蜘蛛抗真菌有效部位的动物药材可选用络新妇属蜘蛛虫体的任一部位，或它们的混合物。可以是干燥全虫，也可以是未经干燥的全虫或活体全虫。

本发明中所述及的经盐溶液提取再经透析方法纯化得到的络新妇属蜘蛛抗真菌有效部位可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有广谱抗真菌功效的水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂、泡沫凝胶，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。

本发明的经盐溶液提取再经透析方法纯化得到的络新妇属蜘蛛抗真菌有效部位及其制剂或其可药用盐还可以与现已上市的治疗真菌感染相关病症的治疗药物及其原料药如多烯类（如两性霉素B）、三唑类（如氟康唑、咪康唑、益康唑、依曲康唑和酮康唑等）、烷基胺类（如特比萘芬）和新开发上市的棘白菌素（echinocandins）类品种联合使用，制备得到具有治疗真菌感染相关病症功效活性的组合物或复方制剂，可预期成为防治真菌感染疾病药品、保健品、日化用品和医疗器械。上述各类药物组合物或者药品、保健品、日化用品和医疗器械可以采用片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。

此外，本发明的经盐溶液提取再经透析方法纯化得到的络新妇属蜘蛛抗真菌有效部位及其制剂或其可药用盐还可以与文献中报道具有杀灭真菌疗效的中药（植物药、动物药、矿物药）合用，也可与杀灭真菌活性的纳米银制剂组成混合物或者联合使用。同样起到本发明所述之制备预防和治疗真菌感染引起的疾病的药物、外伤敷料中的应用，通过药物制剂、医疗器械、日化用品形式体现。上述各类药物组合物或者药品、保健品、日化用品和医疗器械可以采用片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。

经本发明人详细的文献查阅，查新结果显示：到目前为止，尚无由络新妇属蜘蛛制备出的有效部位用于制备抗真菌药物的报道。该有效部位对于真菌生长的强效抑制属于意想不到的发现，有着确切的原创性，且可以预期进一步开发成为防治真菌感染类疾病的药物或药物组合物。据此完成本发明。

本发明的有益之处在于：首次用不同浓度的盐溶剂系统提取结合蛋白组学实验方法制备出络新妇属蜘蛛有效部位，并首次发现了其在开发防治真菌感染类疾病的药物领域中的潜力，对于开发治疗真菌感染所致的病症，包括浅部真菌感染（表面感染真菌、皮肤癣真菌和皮下组织感染真菌）和深部真菌感染疾病所需的治疗药物提供了新的蛛形类动物药物之物质基础。本发明再一特点是：该属蜘蛛生长繁殖能力旺盛，在云贵高原广泛分布，便于养殖，每头雌蛛每年可以孵育600-800只子代，有利于成为稳定的生物药物资源，同时也有利于贫困山区农民养殖此类药源性动物达到脱贫目的。具有潜在的巨大社会效益和经济效益。该药物原料来源于天然养殖，制备步骤简便，成本低，污染小，利于大规模生产。

具体实施方案

为了更好地理解本发明的实质，下面分别用该类络新妇属蜘蛛经盐溶液提取再经透析方法纯化过程，以及制备得到的络新妇属蜘蛛抗真菌有效部位对2株白色念珠菌ATCC:10231和ATCC:90029抑制作用的药理实验结果，说明其在抗真菌研究领域中的新用途。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：斑络新妇抗真菌有效部位的制备

新鲜捕捉到的斑络新妇蜘蛛52头（采自思茅地区，活体标本由大理学院云南省药用昆虫及蛛形类资源利用开发工程实验室杨自忠教授鉴定为斑络新妇Nephila pilipesFabricius），将其（6.1克）直接冷冻，加入5倍体积的4℃预冷的磷酸盐缓冲液PBS溶液（0.2摩尔/升，pH=6.0），冰盐浴下组织匀浆机匀浆，在4℃条件下离心15分钟，转速2000转/分钟。取上清液缓慢加入饱和硫酸铵液，磁力搅拌混匀，使硫酸铵的终浓度达到30%。再重复上述步骤，使硫酸铵终浓度达到40%，50%，60%，70%，80%，于4℃下静置4小时后，再以6000转/分钟离心15分钟，取沉淀溶于PBS缓冲液中，4℃下以截留分子量为1000道尔顿（1KDa）的透析袋透析过夜，得到的去盐物冷冻干燥得斑络新妇抗真菌有效部位（BANLXF）50.3毫克。

经福林酚法检查，该有效部位中蛋白多肽含量为60.5%。

实施例2：棒络新妇抗真菌有效部位的制备

将捕捉到的棒络新妇蜘蛛66头（采自大理地区，活体标本由大理学院云南省药用昆虫及蛛形类资源利用开发工程实验室杨自忠教授鉴定为棒络新妇Nephila clavata L.Koch）（称重为8.3克）直接冷冻，加入5倍体积的4℃预冷的磷酸盐缓冲液PBS溶液（0.2摩尔/升，pH=6.0），冰盐浴下组织匀浆机匀浆，在4℃条件下离心15分钟，转速2000转/分钟。取上清液缓慢加入饱和硫酸铵液，磁力搅拌混匀，使硫酸铵的终浓度达到30%。再重复上述步骤，使硫酸铵终浓度达到40%，50%，60%，70%，80%，于4℃下静置4小时后，再以6000转/分钟离心15分钟，取沉淀溶于PBS缓冲液中，4℃下以截留分子量为1KDa的透析袋透析过夜，得到的去盐物冷冻干燥得棒络新妇抗真菌有效部位（BANGLXF）56.8毫克。

经福林酚法检查，该有效部位中蛋白多肽含量为52.5%。

实施例3：斑络新妇抗真菌有效部位抑制真菌活性检测

参照美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）提出的标准化抗真菌敏感性试验方法，测试实施例1制备得到的斑络新妇抗真菌有效部位（BANLXF）的体外抗真菌活性。

3.1真菌标准株：

白色念珠菌ATCC:10231：重庆市疾病预防控制中心提供。

白色念珠菌ATCC:90029（5-FC耐药菌株）：北京医院卫生部临床检验中心。

3.2试剂：

3.2.1沙氏琼脂培养基（sabouraud dextrose agar）：广东凯微生物科技有限公司产品。

3.2.2酵母抽提物（yeast extract）：海生工生物工程技术服务有限公司分装。

3.2.3三氮吗啡啉丙磺酸（3-N-morpholinopropanesulfonicacid，MOPS)

3.2.4标准抗真菌药物干粉及注射液：氟康唑（Fluconazole，FCZ)，扬子江药业集团公司；两性霉素B（AmphotericinB，AmB)、5-氟胞嘧啶（Fluorocytosine，5-FC)、酮康唑（Ketoconazle，KETO），中国药品生物制品检定所产品；配置成不同浓度梯度的倍比稀释液。

3.2.5二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）及二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF)：上海生工生物工程技术服务有限公司分装产品。

3.3仪器：

3.3.1电子天平JA1203N（AB204-5，METTLER TOLEDO）：上海精密科学仪器公司产品。

3.3.2SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司产品。

3.3.3隔水式恒温培养箱（GSP-9160MBE）：上海一恒科学仪器有限公司产品。

3.3.4电热恒温培养箱（HZQ-F160A）：上海一恒科学仪器有限公司产品。

3.3.5美菱电冰箱（BCD-221CHC）：合肥美菱股份有限公司产品。

3.3.6微量移液器（Proline Pipette，DragonMed Pipette）：芬兰雷勃公司产品。

3.3.7细胞计数板（96well cell culture cluster）：上海求精仪器公司产品。

3.3.8普通光学显微镜（Olympus）：日本奥林巴斯光学仪器株式会社产品。

3.3.9干烤箱（101A-2）：上海崇明实验仪器公司产品。

3.3.10立式高压蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50SⅡ）：上海博讯实业有限公司产品。

3.3.11磁力加热搅拌器（ARE）：意大利VELP公司产品。

3.3.12滤膜、滤器（0.22μm，SARTORIUS）：德国赛多利斯公司产品。

3.3.13酸度计（PHSJ-4A）：上海精科雷磁公司产品。

3.3.14试管振荡器（MS2）：广州仪科实验室技术公司产品。

3.3.15恒温振荡培养箱（THZ-18AB）：上海一恒科学仪器公司产品。

3.3.16低温冰箱（-20℃，科龙BCD-219WAK）：广东科龙电器有限责任公司产品。

3.3.1796孔平底微量培养板：美国Corning Incorporated产品。

3.4实验方法：

3.4.1实验步骤：

3.4.1.1RPMI-1640液的配制：取10.4克RPMI-1640粉（含L谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，GIBCO）溶于900毫升无菌水中，加入34.53克三氮吗啡啉丙磺酸（MOPS）至其终点浓度为0.165摩尔/升，室温下用磁力搅拌器混匀2-3小时，使其充分溶解，用氢氧化钠（1摩尔/升）调节pH值至7.0（25℃），用灭菌水定容至1升，滤过除菌，分装后-20℃保存备用。

3.4.1.2储备液的制备：储备液浓度应为应用液的10倍，5-FC（5-氟尿嘧啶）和FCZ（氟康唑）为1,280微克/毫升，AmB（两性霉素B）和KETO（酮康唑）为320微克/毫升，用电子天平分别称取5-FC、FCZ、KETO和AmB各10毫克，5-FC用1毫升双蒸水溶解，FCZ用1毫升二甲基甲酰胺（DMF）溶解，AmB和KETO分别用二甲亚砜（DMSO)溶解，之后用RPMI-1640稀释至储存液浓度，分装后-70℃保存备用。

3.4.1.3应用液的制备：用RPMI-1640液将储备液作1:10稀释后再作倍比稀，FCZ、5-FC和AmB为128微克/毫升-0.25微克/毫升作10个系列的浓度，KETO为32微克/毫升-0.06微克/毫升10个系列浓度，均为2倍终浓度。

3.4.1.4微量药敏培养板的制备：使用一次性的96孔板，第1-10列分别加入10个浓度梯度的测试药物的应用液，从高浓度到低浓度。第11列加入RPMI-1640，每孔100微升，第12列作为空白对照，放入-20℃冰箱备用，使用时经-4℃、4℃和室温各1小时。

3.4.1.5念珠菌的激活与稀释：将待测的菌株在YPD琼脂培养基（1%酵母抽提物，1%蛋白胨，2%葡萄糖）上激活两次后，取直径大于1毫米的菌落少许于3毫升无菌生理盐水中混匀制成菌悬液，取少许，用血细胞技术板计数四个大方格中的菌细胞数，取平均值X，此时菌细胞数为X×10⁴CFU/毫升，用RPMI-1640液调整浓度为3×10⁴CFU/毫升（两倍终浓度）。

3.4.1.6测试样品：称取实施例1中得到的斑络新妇抗真菌有效部位（BANLXF）1.0毫克作为测试样品。

3.4.1.7加样：在上述制备好的含有测试药物的培养板上加入念珠菌悬液，每孔100微升空白对照不加，震荡混匀后放入湿盒（防止微量板中的液体挥发而影响药物的浓度）35℃孵育24-48小时后观察结果。

3.4.2数据统计分析方法

肉眼判断结果，以生长对照空为依据。AmB为完全抑制即MIC100作为观察终点，液体清亮；其余药物以80%抑制（即MIC₈₀）为观察终点，菌种生长明显减少，液体轻微混浊；阳性对照中菌种生长良好；空白对照清凉，无细菌生长。质控菌株MIC值在美国临床微生物实验室标准CLSI M27-A2方案规定的范围内，显示实验结果是有效的。

3.5实验结果：

3.5.1质控株对抗真菌药物的敏感性：四种阳性药物对质控菌株ATCC:90029和ATCC:10231标准株药敏结果符合CLSI M27-A2方案对于质控株标准株的要求。即：重复3次以上进行AmB、5-FC、FCZ和KETO的MIC值变化不超过2个浓度梯度。

3.5.2斑络新妇抗真菌有效部位（BANLXF）及阳性对照的抗真菌活性结果见表1。

表1斑络新妇抗真菌有效部位（BANLXF）对白色念珠菌的抑制作用

（注：*指采用MIC₁₀₀值，其余为MIC₈₀值）

3.6实验结论：

通过采用“微量液基稀释法”研究斑络新妇抗真菌有效部位对2株白色念珠真菌的体外抗真菌活性。结果表明：斑络新妇抗真菌有效部位对2株念珠菌菌株均具有显著的抗真菌活性。说明其为极有发展潜力的抑制真菌生长活性有效部位，具有进一步开发成为新一代抗真菌药物的价值。

实施例4：棒络新妇抗真菌有效部位样品抑制真菌活性检测

参照美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）提出的标准化抗真菌敏感性试验方法，测试实施例1制备得到的斑络新妇抗真菌有效部位（BANLXF）的体外抗真菌活性。

4.1真菌标准株：

白色念珠菌ATCC:10231：重庆市疾病预防控制中心提供。

白色念珠菌ATCC:90029（5-FC耐药菌株）：北京医院卫生部临床检验中心。

4.2试剂：

4.2.1沙氏琼脂培养基（sabouraud dextrose agar）：广东凯微生物科技有限公司产品。

4.2.2酵母抽提物（yeast extract）：海生工生物工程技术服务有限公司分装。

4.2.3三氮吗啡啉丙磺酸（3-N-morpholinopropanesulfonicacid，MOPS)

4.2.4标准抗真菌药物干粉及注射液：氟康唑（Fluconazole，FCZ)，扬子江药业集团公司；两性霉素B（AmphotericinB，AmB)、5-氟胞嘧啶（Fluorocytosine，5-FC)、酮康唑（Ketoconazle，KETO），中国药品生物制品检定所产品；配置成不同浓度梯度的倍比稀释液。

4.2.5二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）及二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF)：上海生工生物工程技术服务有限公司分装产品。

4.3仪器：

4.3.1电子天平JA1203N（AB204-5，METTLER TOLEDO）：上海精密科学仪器公司产品。

4.3.2SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司产品。

4.3.3隔水式恒温培养箱（GSP-9160MBE）：上海一恒科学仪器有限公司产品。

4.3.4电热恒温培养箱（HZQ-F160A）：上海一恒科学仪器有限公司产品。

4.3.5美菱电冰箱（BCD-221CHC）：合肥美菱股份有限公司产品。

4.3.6微量移液器（Proline Pipette，DragonMed Pipette）：芬兰雷勃公司产品。

4.3.7细胞计数板（96well cell culture cluster）：上海求精仪器公司产品。

4.3.8普通光学显微镜（Olympus）：日本奥林巴斯光学仪器株式会社产品。

4.3.9干烤箱（101A-2）：上海崇明实验仪器公司产品。

4.3.10立式高压蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50SⅡ）：上海博讯实业有限公司产品。

4.3.11磁力加热搅拌器（ARE）：意大利VELP公司产品。

4.3.12滤膜、滤器（0.22μm，SARTORIUS）：德国赛多利斯公司产品。

4.3.13酸度计（PHSJ-4A）：上海精科雷磁公司产品。

4.3.14试管振荡器（MS2）：广州仪科实验室技术公司产品。

4.3.15恒温振荡培养箱（THZ-18AB）：上海一恒科学仪器公司产品。

4.3.16低温冰箱（-20℃，科龙BCD-219WAK）：广东科龙电器有限责任公司产品。

4.3.1796孔平底微量培养板：美国Corning Incorporated产品。

4.4实验方法：

4.4.1实验步骤：

4.4.1.1RPMI-1640液的配制：取10.4克RPMI-1640粉（含L谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，GIBCO）溶于900毫升无菌水中，加入34.53克三氮吗啡啉丙磺酸（MOPS）至其终点浓度为0.165摩尔/升，室温下用磁力搅拌器混匀2-3小时，使其充分溶解，用氢氧化钠（1摩尔/升）调节pH值至7.0（25℃），用灭菌水定容至1升，滤过除菌，分装后-20℃保存备用。

4.4.1.2储备液的制备：储备液浓度应为应用液的10倍，5-FC（5-氟尿嘧啶）和FCZ（氟康唑）为1,280微克/毫升，AmB（两性霉素B）和KETO（酮康唑）为320微克/毫升，用电子天平分别称取5-FC、FCZ、KETO和AmB各10毫克，5-FC用1毫升双蒸水溶解，FCZ用1毫升二甲基甲酰胺（DMF）溶解，AmB和KETO分别用二甲亚砜（DMSO)溶解，之后用RPMI-1640稀释至储存液浓度，分装后-70℃保存备用。

4.4.1.3应用液的制备：用RPMI-1640液将储备液作1:10稀释后再作倍比稀，FCZ、5-FC和AmB为128微克/毫升-0.25微克/毫升作10个系列的浓度，KETO为32微克/毫升-0.06微克/毫升10个系列浓度，均为2倍终浓度。

4.4.1.4微量药敏培养板的制备：使用一次性的96孔板，第1-10列分别加入10个浓度梯度的测试药物的应用液，从高浓度到低浓度。第11列加入RPMI-1640，每孔100微升，第12列作为空白对照，放入-20℃冰箱备用，使用时经-4℃、4℃和室温各1小时。

4.4.1.5念珠菌的激活与稀释：将待测的菌株在YPD琼脂培养基（1%酵母抽提物，1%蛋白胨，2%葡萄糖）上激活两次后，取直径大于1毫米的菌落少许于3毫升无菌生理盐水中混匀制成菌悬液，取少许，用血细胞技术板计数四个大方格中的菌细胞数，取平均值X，此时菌细胞数为X×10⁴CFU/毫升，用RPMI-1640液调整浓度为3×10⁴CFU/毫升（两倍终浓度）。

4.4.1.6测试样品：称取实施例2中得到的棒络新妇抗真菌有效部位（BANGLXF）1.0毫克作为测试样品。

4.4.1.7加样：在上述制备好的含有测试药物的培养板上加入念珠菌悬液，每孔100微升空白对照不加，震荡混匀后放入湿盒（防止微量板中的液体挥发而影响药物的浓度）35℃孵育24-48小时后观察结果。

4.4.2数据统计分析方法

肉眼判断结果，以生长对照空为依据。AmB为完全抑制即MIC100作为观察终点，液体清亮；其余药物以80%抑制（即MIC₈₀）为观察终点，菌种生长明显减少，液体轻微混浊；阳性对照中菌种生长良好；空白对照清凉，无细菌生长。质控菌株MIC值在美国临床微生物实验室标准CLSI M27-A2方案规定的范围内，显示实验结果是有效的。

4.5实验结果：

4.5.1质控株对抗真菌药物的敏感性：四种阳性药物对质控菌株ATCC:90029和ATCC:10231标准株药敏结果符合CLSI M27-A2方案对于质控株标准株的要求。即：重复3次以上进行AmB、5-FC、FCZ和KETO的MIC值变化不超过2个浓度梯度。

3.5.2棒络新妇抗真菌有效部位（BANGLXF）及阳性对照的抗真菌活性结果见表1。

表2棒络新妇抗真菌有效部位（BANGLXF）对白色念珠菌的抑制作用

（注：*指采用MIC₁₀₀值，其余为MIC₈₀值）

4.6实验结论：

通过采用“微量液基稀释法”研究棒络新妇抗真菌有效部位对2株白色念珠真菌的体外抗菌活性。结果表明：棒络新妇抗真菌有效部位对2株念珠菌均具有显著的抗真菌活性。说明该属蜘蛛的有效提取部位为极有发展潜力的抑制真菌生长活性有效部位，具有进一步开发成为新一代抗真菌药物的价值。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims (5)

1.一种从络新妇属蜘蛛中提取的抗真菌有效部位，其特征是：所述抗真菌有效部位是络新妇属蜘蛛经由盐提蛋白法提取并由透析得来的富含蛋白多肽的部位，该抗真菌有效部位中蛋白和多肽的含量在50%或以上。

2.一种制备权利要求1所述的抗真菌有效部位的方法，其特征是：粉碎或未粉碎的蜘蛛目络新妇科络新妇属虫体干品或鲜品，用盐溶液提取、酸沉淀、离心分离、再经透析方法纯化，得到的有效部位经冷冻干燥而得产品；其中透析法纯化时采用的是截留分子量为1千道尔顿的透析膜。

3.根据权利要求1所述的从络新妇属蜘蛛中提取的抗真菌有效部位用于制备防治真菌感染性疾病的药物用途。

4.根据权利要求3的药物用途，其特征是：所述抗真菌感染药物用途通过药物制剂、医疗器械、日化用品形式体现，所述药物制剂、医疗器械、日化产品的形式是水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂。

5.一种具有预防和治疗真菌感染的药物组合物，其特征是：该药物组合物是由含有治疗有效量的权利要求1的从络新妇属蜘蛛中提取的抗真菌有效部位及其与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成药物组合物，在制备预防和治疗真菌感染引起的疾病的药物、外伤敷料中的应用。