CN1044101A - 从一种蜘蛛毒液分离的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新颖的，相对分子量低的，由蜘蛛HololenaCur ta毒素分离并提纯出来的或合成制备出的，由36-38个氨基酸的多肽。它一般用作杀虫剂或治疗与药理学疾病有关的谷氨酸拮抗物或钙拮抗物。

Description

本申请是1988年12月23日提交的序号为289，175的部分继续申请。
近年来，科学家们致力于寻找分离和鉴定来自蜘蛛毒液的新的化学成份，以便用于医药和农业。H.Jackson和P.N.R.Usherwood发表的“蜘蛛毒素作为剖析显示兴奋的氨基酸转移元素的工具”一文（TINS，11，No        6，278-283，1988）综述了本领域中近年来的发展。此文报导蜘蛛Hololena        curta的毒素已被研究，这种活性的蜘蛛毒液的成份作为不可逆谷氨酸拮抗物存在于离析出的5000-10000Da的该毒液级份中。建议这种毒素“可以代表一类相对大量的不可逆谷氨酸拮抗物：（ID282）。
另外，Bowers等人发现（Proc        Natl.Acad，Sci.，USA        84，3506-3510（1987）），从H.Curta毒素离析出的级份包括Mr为7000及9000的两个亚单位，二者以二硫化物键联接，假想的由每个推定的亚单位之一组成的该毒素的Mr估计为16000，它是一种对于依赖电压的突触前的钙通道潜在和长期的抑制剂。
这种影响的神经肌肉介质的化合物具有研究兴趣并且用于治疗许多神经病学的疾病包括癫，缺氧-缺血神经元致死，享廷顿午蹈病（Jackson等：“蜘蛛毒液对于Avian        Cochlear        Nacleus中被Non-N-甲基-D-天冬氨酸受体传递的转移的影响“Excitatory        Amino        Acid        Transmission        51-54（1987）Alan        R.Liss，Inc.）及早老性痴呆以及用作天然杀虫剂。
本发明涉及从蜘蛛Hololena        curta的毒液中离析出来的或用合成方法制备的多肽，该多肽由约为4000Da的38个氨基酸序列组成，主要式子为：
N-Ter-Ala-Asp-Gys-Val-Gly-Asp-Gly-Gln-X-Cys
-Ala-Asp-Trp-Y-Gly-Pro-Tyr-Cys-Cys-Ser-Gly-
Tyr-Tyr-Cys-Ser-Gys-Arg-Ser-Met-Pro-Tyr-Cys-
Arg-Cys-Arg-Ser-Asp-Ser
（式Ⅰ）
其中X是Arg或Lys;Y是Ala或Phe，并且当x是Arg时Y必须是Ala，当X是Lys时，Y必须是phe，及式为：
N-Ter-Ser-Cys-Val-Gly-Gln-Tyr-Gly-Arg-Cys-Arg
-Ser-Ala-Tyr-Gln-Asp-Cys-Cys-Asp-Gly-Tyr-Tyr
-Cys-Asn-Cys-Ser-Gln-Pro-Pro-Tyr-Cys-Leu-Cys
-Arg-Asn-Asn-Asn
本发明还涉及它们的盐，多肽的使用以及用作杀虫剂的含该多肽的组合物，还涉及需要谷氨酸拮抗物活性及钙拮抗物活性的其它方面的一些应用，例如治疗许多神经病学疾病包括如癫，缺氧-缺血神经元致死，亨延顿午蹈病等的方法。
本说明书中使用的术语大部分是众所周知的并是本领域中通常使用的，现说明如下：
Ala：丙氨酸
Arg：精氨酸
Asn：天冬酰胺
ASp：天冬氨酸
Cys：半胱氨酸
Gln：谷氨酰胺
Gly：甘氨酸
Leu：亮氨酸
Lys：赖氨酸
Met：蛋氨酸
Phe：苯丙氨酸
Pro：脯氨酸
Ser：丝氨酸
Tyr：酪氨酸
Val：缬氨酸
N-Ter-N端氨基酸残基
本发明的范围包括三个有关序列的多肽，每个都是从蜘蛛Holodena Curta的毒液中分离出来的或者是合成的。式Ⅰ的每个多肽由38个氨基酸序列组成，两个多肽之间氨基酸序列的差别仅在于位置9（在式Ⅰ中是X）和14（在式Ⅰ中是Y）。其中X是Arg且Y是Ala的化合物的分子量为4188.9Da;其中X是Lys且Y是Phe的化合物的分子量为4237.4Da。这些分子有较高含量的Cys（8），Ser（5），Tyr（4），碱性残基如Arg/Lys（4），Asp（4），分子中没有组氨酸，苏氨酸，异亮氨酸和亮氨酸。分子中还有两个二肽序列18Cys-19Cys及22Tyr-23Tyr。
式Ⅱ的多肽由36个氨基酸序列组成，其分子量为4103.0Da。该分子有较高含量的Cys（8）及Tyr（5），没有组氨酸，苏氨酸和异亮氨酸，该分子也有两个二肽序列16Cys-17Cys和20Tyr-21Tyr。
本发明的多肽化合物（以下有时称为“多肽”或如下述提出的“Curta毒素1，2及3”）能通过分离并提纯选择性的相对低分子量的H.Curta毒液的级份方式实质上以纯的形式得到。使用重组体DNA技术或者用化学肽合成方法也能完成这种多肽的合成。
从相对低分子量的H.Curta毒液级份中式Ⅰ和式Ⅱ的多肽分离和提纯通常是用下述方法实现的。首先将全部H.Curta毒液用反相高压液相色谱（HPLC）初步分级，其中级份33（X是Arg且Y是Ala，称为Curta毒素1），级份37（X是Lys且Y是Phe，称为Curta毒素2）及级份27（称为Curta毒素3）被认为是有兴趣的。每个级份再通过阴离子交换色谱及凝胶过滤进一步提纯，最后再用反相-HPLC提纯，对每个级份得到一个对称单峰，说明是单一的蛋白质组份。分离和提纯该化合物的特殊方法在实施例中给出。
本发明化合物的肽合成法通常采用以下方法。
本发明的化合物采用肽合成法中的常规方法制备。在合成本发明的某些化合物期间，可能发生部分外消旋化。虽然如些，但外消旋化的程度不足以较大地改变本发明化合物的活性。
本发明的化合物能采用经典的溶液合成法合成。
制备方法包括通过羧基官能基和氨基官能基彼此反应将氨基酸或肽片断偶联起来得到酰胺键。为了有效地达到偶联，首先需要将不直接参加反应的所有反应性官能团用适当的保护基钝化，其次要将需被偶联的羧基官能团适当活化以使偶联能进行。所有这些包括精心地选择反应顺序和反应条件以及使用特殊的保护基，以便能得到所需的肽产品。用来制备本发明化合物，及有特别选定的保护基和/或活化官能团的每一氨基酸，均可用肽技术领域中已知的技术来制备。
本发明化合物全部合成过程中的每一步都要选择性地结合保护基。这种特殊的结合被发现能作用最平稳。但是尽管大概成功率较低，在合成本发明的化合物中也采用其它方式的结合。因之，例如苄氧羧基，叔-丁氧羰基，叔-戊氧羰基，对-甲氧苄氧羰基，金刚烷氧羰基，冰片氧羰基在合成本发明化合物中能被广泛用作氨基保护基。而且，苄基（BZ丨）一般用作对于酪氨酰残基的羟基保护基，尽管也可以使用如对-硝基苄基（PNB），对-甲氧基苄基（PMB）等。
制备本发明化合物所用的羧基保护基，可以是任何能形成典型的酯的基团，例如包括甲基、乙基、苄基、对硝基苄基、对甲氧苄基、2，2，2-三氟乙基等。
在制备本发明化合物时，使适当保护的N-保护氨基酸或肽片断和适当保护了羧基-保护的氨基酸或肽片断偶联，反映出氨基酸的自由羧基官能团或肽片断活性所组成以形成偶联反应。这一点可以采用已知技术中的任何一种来完成。这种活化技术之一包括将羧基官能转化成混合酸酐，自由羧基官能可通过和其它酸，一般是碳酸衍生物如其酰氯反应被活化。形成混合酐，所用的酰氯的例子是氯甲酸乙酯，氯甲酸苯酯，氯甲酸仲丁酯，氯甲酸丁酯，新戊酰氯等，最好用氯甲酸异丁酯。
为完成偶联反应另一个活化羧基官能基的方法，是转化为它的活性酯衍生物。这种活性酯包括例如2，4，5-三氯苯酯，五氯苯酯，对-硝基苯酯等。另一种易得到应用的偶联方法是已知的叠氮化物偶联法。
在制备本发明的化合物时较好的偶联方法是使用N，N′-二环已基碳化二亚胺（DCC）来活化自由羧基以使偶联反应进行。这种活化和偶联技术使用对于氨基酸或肽片断等摩尔量的DCC并在等摩尔量的1-羟基苯并三唑（HOBt）存在下完成。HOBt的存在排除了不需要的付反应，包括排除外消旋化的可能性。
在制备本发明化合物用的合成路线的某个特定步骤中必须脱掉选择的保护基。肽合成领域中具有普通技术的化学工作者能很容易地从有代表性的保护基中选择出这种保护基，这样做的意义是产品选择性地脱掉保护基，即允许脱一个或几个保护基，而不是脱掉存在于氨基酸或肽片断上的所有保护基。这种技术在肽技术领域中是熟知的。Schroder和Lubke在文献中（The        Peptides        I，Academic        Press，New        York        1965，特别是其中72-75页的表格）提供了易获得的选择性脱掉保护基的这方面技术的更为完整的论述。
用碱性皂化法可以脱掉羧基保护基，相对强的碱性条件，一般使用碱金属氢氧化物如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化锂等一般使用将保护的羧基进行脱酯。完成皂化的反应条件是本技术领域中熟知的。很多羧基保护基也可用催化氢解方法来脱掉，例如用载于碳上的钯作催化剂进行氢解。况且，当羧基保护基是对硝基苄基或2，2，2-三氯乙基情况时，可以在锌和盐酸存在下通过还原反应来脱掉保护基。
用酸处理保护的氨基酸或肽可以脱掉许多氨基保护基，形成相应的酸加成盐。所用的酸如甲酸，三氟乙酸（TFA），对甲苯磺酸（TSA），苯磺酸（BSA），萘磺酸等。另一脱掉氨基保护基的方法是用HBr和乙酸的混合物处理被保护的氨基酸或肽，产生相应的氢溴酸加成盐。所使用的特殊的方法或试剂将取决于在特定的脱除保护反应中所用材料的化学及物理性质。所得到的酸加成盐通过用适当的离子交换树脂如DEAE        Sephadex        A25，Amberlyst        A27等处理可转化成药学上更易接受的形式。
羟基保护基在整个制备过程中可一直保留在肽上，在合成的最后一步期间和脱掉氨基保护基一起被脱除。但是，根据脱掉羧基保护基时所采用的条件，它也可以在合成步骤中较早地被脱掉。当用碱性皂化的方法脱掉羧基保护基时，羟基保护基被保留着，但当用催化氢解脱掉羧基保护基时，羟基保护基也就一起被脱掉了。后面一种情况将不会有严重问题，因为可以在未保护的酪氨酰残基存在下完成制备本发明的化合物。
当然，另一些步骤也是适用的。其一是将单独制备的N-端基三肽和单独制备的C-端基苯丙氨酸衍生物进行偶联，随后再适当脱去任何残留的保护基部分。所用的另一溶液方法是分步，连续加入单氨基酸以便形成从带有C-端基部分开始的肽链。如上述的反应技术也被用于此处及任何其它经过仔细考虑的制备步骤中。
此外，本发明的化合物也可用重组DNA合成技术来制备。
一般而言，本发明化合物的完整的一级结构用下述方法测定。Curta毒素Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ按照Firedman等人提出的（J.Biol，CHem，245，3868（1970））D、Hawke及P.Yaum改进的（Applied        Biosystems        Incorporated        User        Bulletin，No        28（1987））方法进行吡啶乙基化。吡啶乙基化的毒素（PESTS）用微孔反相HPLC脱盐，洗脱约40分钟后进入梯度程序，再进行标准的自动Edman降解。用和气相序列发生器直接联机PHT分析仪上，在每次循环中对苯基硫代海因衍生的氨基酸进行分析。在自动样品管中通过气相水解将肽进行水解，然后转入到氨基定量分析仪中以便测定伯氨基酸和仲氨基酸。首先将几毫微摩尔的天然毒素进行分析，并且每个都给出高产量的PTH氨基酸，对第一个35-37残基获得了清楚的测定。半胱氨酸通过PEST蛋白质的序列分析来测定。为了证明羧端基序列，每个肽的PEST形式均用CNBr降解，以便在位置29脱掉蛋氨酸。羧端基片断用微孔C-18反相HPLC提纯并进行序列分析。水解肽的氨基酸组份和从该片断的氨基酸序列计算出的组份一致，证实了羧端基丝氨酸残基。该结构还从FAB-MS分析中得到证实。Curta毒素Ⅰ和Ⅱ相应的离子分子量MH+分别为4188.7Da、4237.4Da，而计算值分别是4189.6Da和4237.7Da。Curta毒素Ⅲ的分子量为4103.0Da，这和从羧酰胺化多肽的氨基酸序列的分子量计算出来的数值一致。测定本发明化合物一级结构的个别方法在下述实施例中说明。
下述实施例用以说明了解和鉴定本发明化合物的方法，但它们不以任何方式构成对本发明的范围的限制。
实施例1
纯化Curta毒素Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ的原始记录
将Hololena        Curta毒液冷冻储藏，不经最初的冻干步骤即进行色谱提纯，即直接把毒液注入到HPLC柱中。
用监测器Curta毒液纯度的生物测定实验是观察蟋蟀Aoheta        domestica的麻痹情况，接着进行色谱提纯后，柱级份用Savant        Speed-Vac冻干过夜，残留物溶于最低量的蒸馏水/去离子水中（通常100-200μl）将其2μl注入到蟋蟀的胸腔中，随后将其装在塑料的陪替氏培养皿中。含麻痹物质的级份通常在5-10分钟内产生麻痹作用，完全麻痹需2-3小时。蟋蟀至少要被监测24小时（通常48小时）观其复复苏。
提纯：步骤1：Pharmacia        Rep        RPC        HR        16/10柱用含0.05%IFA（三氟乙酸）的HPLC-级别的水平衡过夜。全部毒液（0.5ml）通过注射环以2.5ml/min的流速被注入到柱子中。以上述流速用40ml平衡溶剂洗涤柱子。通过线性梯度洗脱将毒液组份选择性地洗至60%的乙腈止。（含0.05%TFA），流速为2.5ml/min，需用约100分钟。用级份收集器收集5ml（2分钟）级份，将其冻干并进行上述生物测定，对于级份27，33和37基本上会见到迅速的立即的麻痹作用。将这些级份接着参与下一步的提纯。
假如不进行同样的分离的话，基本上任何制备反相（C18）HPLC柱都给出类似的结果。Pharmacia柱子用15μl孔度硅石C2/18填充。在此第一步中所用的梯度洗脱是较慢的，但它能使毒液组份得到极好的离析。
第2步，Curta毒素Ⅰ（级份33）：将Bio-Rad MicroAnalyzer MA7P+阴离子交换HPLC柱（4.6×30mm）以0.5ml/min的流速用20mM（Tris）（PH7.5）平衡。在这种isocratic条件下，从级份33得到的起麻痹作用的毒素将不粘在柱子上而以空体积洗脱。当监测吸收度为220nm时，用手操收集级份。不活泼的组份通过原始记录此时稍稍滞后或粘于柱子上而获得较好的提纯。
MicroAnalyzer是稍不同于其它阴离子交换器的，它由球形的，薄膜的（非孔的）聚合物组成。（在大多数HPLC柱中，样品和柱之间的相互作用出现在填充材料的孔中间）。因之MicroAnalyzer有相对低的容量，这又意味着可使用收率高并且较高的流速。虽然对此种柱所推荐的流速是1.5ml/min但较慢的流速能得到极好的结果。
步骤3：Curta毒素Ⅰ：将从上一步得到的活化物质施加到Bio-Rad Biosil TSK 250凝胶渗透柱（300×7.5mm）中，该柱预先以1.0ml/min的流速用50mM Na2SO4/20mM Na2HPO4（PH6.8）平衡。在这种isocartic条件下麻痹活性物在约12ml洗脱体积（Ve）时被洗脱，几种次要的污染物用此方法除去。
步骤4Curta毒素Ⅰ：提纯Curta毒素Ⅰ的最后一步，是如步骤1相同柱子所进行的另外反相步骤。而且柱子以2.5ml/min的流速用15%乙腈的水溶液/0.05%TFA平衡。接着加入毒素，柱子用12.5ml平衡溶剂以上述流速洗涤。Curta毒素Ⅰ的洗脱以2.5ml/min的流速，85分钟后梯度至35%的乙腈时完成。洗脱位置接近26%乙腈。
将提纯过的毒素冻干并冷冻储藏，再进行下一步的序列分析。
步骤5：Curta毒素Ⅱ（从第一步得到的级份37）-：将级份37加到凝胶渗透柱中，如步骤3所述，但流动速度变为0.5ml/min，毒性组份在洗脱体积约16ml（Ve）处被洗脱。
步骤6：Curta毒素Ⅱ将从上一步得到的活性物进行色谱提纯，方法和步骤4完全一样，活性物质在相当于约31%乙腈的位置被洗脱。
步骤7：Curta毒素Ⅲ（从步骤9得到的级份27）-Curta毒素Ⅲ的提纯是将级份27再进行一次色谱提纯（用100μl含0.1%TFA的水重新平衡），采用Aquapore        RP-300微孔反相柱（2.1×30mm），并使用Applied        Biosystem        Inc.的Madel        130蛋白质-肽分离系统。梯度洗脱是从100%缓冲液A（含0.1%TFA的水）线性至100%缓冲液B（含0.85%TFA和70%乙腈的水），流速为100μl/min。洗脱时间约150分钟，毒素被还原并用4-乙烯基吡啶进行吡啶乙基化以后，再用微孔反相HPLC提纯。
实施例2
一级结构的测定
Curta毒素的吡啶乙基化及溴化氰降解。在进行序列分析前，按照Friedman等人提出的（1970）后来被Hawke和Yuam（1987）用少量蛋白质而改进的方法将已经提纯过的Curta毒素进行吡啶乙基化。简言之，将10μg每种Curta毒素溶于44μl6M的胍-HCl，0.25M        Tris-HCl（PH8.5）中，随后使其和3μl10%β-巯基乙醇及3μl        4-乙烯基吡啶于室温反应2小时。吡啶乙基化的毒素然后用微孔反相HPLC脱盐，使用Aquapore        RP-300柱（2.1×30mM）在Applied        Biosystems        Inc的model        130蛋白质-肽分离系统上。梯度是线性的，范围从100%缓冲液A（含0.1%三氟乙酸的水）到100%缓冲液B（含0.085%三氟乙酸和70%乙腈的水），洗脱时间为150分钟，流速为100μl/min。被吡啶乙基化的蜘蛛毒素（PESTS）洗脱在接近40分钟中进入梯度程序，比未经改性的蛋白质早5-10分钟。
为了获得羧基端片断，将10μg的每种PESTⅠ和Ⅱ溶于330μl70%的甲酸中，往样品中加一些CNBr的晶体，然后用氮气冲洗，封闭并于室温于暗处放置24小时，将样品在Speedvac离心机（Savant）上干燥。再重新溶解于50μ10.1%TFA/H2O中，并用微机反相HPLC再提纯。梯度是线性的，范围从100%缓冲液A（含0.1%TFA的水）到100%缓冲液B（含0.085%TFA和70%乙腈的水），时间为150分钟。18μg的毒素通过胰蛋白酶消化作用产生PEST111的羧端基片断，酶和底物重量比为1∶50，消化作用在1%碳酸氢铵（PH9.0）中于室温进行20小时。肽用如上述微孔反相HPLC提纯。
自动Edman降解在model        470A蛋白质-肽序列分析仪（Appllied        Biosystems        Inc.）上进行，试剂，操作规程及标准程序均是制造商提供的。苯基硫代海因衍生的氨基酸用Model        120        PTH-分析仪（Applied        Bio        Systems，Inc）在每次循环时进行分析，上述仪器直接和470A相序列分析仪相连。
氨基酸分析、氨基酸分析鉴定用专用的热喷啉液体色谱-质谱（LC-MS）系统进行，该系统由安装在Vestec        101热喷啉界面上的Hewlett        Packard        5790质谱选择检定器组成，热喷淋界面由热喷淋离子源和相联的真空体系组成。在LC-MS分析前，使酸性的水解物和异硫氰酸苯酯（PITC）反应形成苯基硫代氨基甲酰（PCT）氨基酸。定量结果在Hewlett        Packard氨基定量分析仪上得到，它使用双重衍生物化学，邻苯二醛和9-氟烯炔甲基氯代甲酸酯，以分别测定伯，仲氨基酸。
氨基酸序列分析-自动Edman降解在Model        470A蛋白质-肽序列分析仪上进行（Applied        Biosystems，Inc.），试剂，操作规程及标准程序均是由制造商提供的。苯基硫代海因衍生的氨基酸在每一循环中用和470A气相序列仪直接相连的model        120PTH分析仪上进行分析（Applied        Biosystems，Inc.）。
FAB质谱分析：分子量测定使用ZAB2-SE双焦距质谱仪（VG        Analytical，Ltd）。完整的Curta毒素的FAB分析使用1μg适当的毒素在由二硫苏糖醇，二硫赤藓糖醇和硫甘油（重量比5∶1∶6）组成的基质中和1%TFA进行。离子化作用使用在恒定磁场强度下加速电压的线性扫描来获得。被选择的间隔包括2C5I参照离子，它们的质量值（4030.0541和4289.8640）把Curta毒素的分子量范围进行分类。使用数据系统的MCA模型在质量解析1000处得到数据，这种模型收集了连续数据的相邻的扫描并把它们汇积成相同的数据图。用这种图，肽的3个扫描同作为参照的CSI的3个连续的扫描一起被积分，然后毒素质量通过线性内插法被测定。
对于含肽片断羧端基所获得的质谱，可使用普通的磁流扫描被得到，使用质量解析2000以保证肽的个别同位素被解析。分析之前，使用CsI作参照获得质量校准，其后的分析使用17KeV铯离子束在由1∶1甘油/硫代甘油（W/W）与1%TFA组成的基质中进行。
本发明的化合物用作杀虫剂，一般而言，该多肽的用量至少为每克体重量3微克重以产生某些杀虫效力。用量至少大约为每克体重9微克较好。本发明化合物的杀虫性能用标准的及已知的方法很容易地被测定，下述方法说明多肽的杀虫活性。
Achetadomestica属/种的蟋蟀或者用全部蜘蛛毒液注射或者用提纯的蜘蛛毒液级份来注射，而对照用蟋蟀仅用蒸馏水注射，而将Hololena        Curta毒液（50mg/ml用Bradford/coomassia        Blue试验测定）和去离子水混合，将其0.5μl（25μg蛋白质）注射到蟋蟀的胸腔内，引起即刻的及不可逆的麻痹。约880μgCurta毒素Ⅱ（级份37）被溶于150μl去离子水中，5.86μg/μl的稀释液被用于5个蟋蟀的一个实验组（平均重量＝0.384克），带有2.93μg多肽被注射到每个蟋蟀体内。观察到无恢复平稳反应及麻痹作用，注射后48小时全部5个蟋蟀均死亡，而对照的5个蟋蟀仍活着。准备好1.95μg/μl的另一种溶液，0.98μg的多肽同样被注射到5个蟋蟀体内（平均重0.314克），48小时后5个中的2个死亡，而5个对照用的蟋蟀均正常，进一步将溶液稀释进行实验，但未发现致死现象。
以上结果说明本发明的化合物具有强有力的杀虫活性。
本发明的化合物还能用作谷氨酸受体及钙通道拮抗物，在治疗神经病学疾病方面是有效的，这些疾病包括惊厥，早老性痴呆和享廷顿午蹈病，大脑局部缺血，随后发作等。
本发明化合物的拮抗作用性质能很容易地用标准和已知方法来测定，这种方法是L.VyKlicky等人（Neuroscience        Letlers        68        227-231        1986）及C.W.Bowers等人（Proc、Natl、Acad        Sci，USA        84        3506-3510        1987）提出的。
一般来说，本发明化合物可用于哺乳动物例如需治疗的病人，其用量为能有效地产生谷氨酸受体或钙通道拮抗物反应。因之能治疗上述的各种疾病。
本发明的多肽化合物可以以游离酸形式或者盐形式被使用。“药学上可接受的盐”一词是指式Ⅰ化合物的任何有机或无机加成盐，它们在和有效活性相一致的浓度上对病人是相对无毒无害的，即这种盐所引起的付作用不会损害式Ⅰ多肽的有效性。这些盐也属于本发明的范围。这种盐包括铵盐，碱金属盐如钠盐及钾盐，碱土金属盐如钙盐及镁盐，和有机碱如二环己基胺，N-甲基-D-葡糖胺形成的盐，以及和氨基酸如精氨酸及赖氨酸形成的盐等。还可制备和有机及无机酸形成的盐，如和下列酸形成的盐：盐酸，氢溴酸，磺酸，硫酸，磷酸，硝酸，抗坏血酸，甲磺酸，乙酸，丙酸，酒石酸，柠檬酸，乳酸，苹果酸，扁桃酸，肉桂酸，棕榈酸，衣康酸，富马酸，苯磺酸和甲苯磺酸。尽管也可使用其它盐，但非毒性的生理上可接受的盐是优先选用的例如分离或纯化过的产物。
用普通的方法即能制备这种盐，例如将该产品的游离酸形式和一个或一个以上当量适当的碱在其盐不能溶解在其中的溶剂或介质中进行反应。或者使用如水这样的溶剂，随后它能真空除掉或用冻干，或者用在适当的离子交换树脂上，将存在的盐可交换的阳离子交换成另一种阳离子。
为治疗神经病学疾病的患者是哺乳动物，包括需治疗特殊病症，损伤或疾病的病人。对于患有神经病学疾病的病人所给用的有效成分（即式Ⅰ和Ⅱ的多肽）的数量能在很宽的范围内改变，这要根据所用的特定剂量单位，治疗周期，被治疗的病人的年令和性别，被治疗病人发病程度所用的多肽，是否使用了其它药物等来考虑。
本发明的多肽能以适当配方的药物组合形式被使用，以便当对需要治疗的病人给药后能达到所希望的医理学效果。因之，本发明包括含有药学上，可接受的载体和药学上有效量的式Ⅰ化合物的药学组合物。药学上可接受的载体是对病人来说相对无毒和无害的，并在和有效成份的有效活性相匹配的浓度中的任何载体，以致由载体引起的任何付作用都不会损害有效成份有效性。化合物的药物有效量是指其数量能对被治疗的特殊病症产生结果或给出影响。式Ⅰ和式Ⅱ的化合物能和药学上可接受的载体一起，使用普通的剂量单位形式通过口服或非肠道给药来使用。
医生能确定最合适的本发明化合物特定剂量。所选择的剂量将根据上述因素而变化，但一般范围是约0.01-10mg/kg。
本发明也包括含该多肽及惰性载体的组合物。这种组合物可用于诊断或用作分析参照物或标准物以及用于杀虫剂。因之本发明包括含有惰性载性及本发明多肽或其盐的组合物。惰性载体是和被载的化合物不相互反应的任何材料，并且是起支撑作用的，方便运输的，松散的可获得的材料，还要能和被载的化合物匹配。有效量的化合物是指，其数量对上述使用来说以所需的方式被使用，并能对所采用的特定方法产生效果或给出影响。
很明显，对本域的技术人员来说，在不脱离本发明精神和范围的情况下如本说明书所提出的。可对本发明作出改进。

Claims (6)

1、一种从蜘蛛Hololena        Curta的全部毒液中分离出级份27的方法，该方法包括以2.5ml/min的流速将0.5ml全部毒液加到Pharmica    Pep    RPC    HR    16/10    HPLC柱子中，以2.5ml/min的流速在100分钟后进行线性梯度洗脱至含0.05%TFA的60%的乙腈止，收集2分钟的级份5ml，从该柱子上洗脱，选择分离第27个级份。
2、按照权利要求1的方法分离下式的多肽
N-Ter-Ser-Cys-Val-Gly-Gln-Tyr-Gly-Arg-Cys-
Arg-Ser-Ala-Tyr-Gln-Asp-Cys-Cys-Asp-Gly-
Tyr-Tyr-Cys-Asn-Cys-Ser-Gln-Pro-Pro-Tyr-Cys-
Leu-Cys-Arg-Asn-Asn-Asn
（Curta毒素Ⅲ）
及其盐。
3、一种从蜘蛛Hololena        Curta的全部毒液中分离级份33的方法，该方法包括以2.5ml/min流速将0.5ml全部毒液加到Pharmica        Pep/RPC        HR16/10        HPLC柱子上，以2.5ml/min流速在100分钟后进行线性梯度洗脱，至含0.05%TFA的60%乙腈止，收集2分钟的级份5ml，从柱子上洗脱选择分离出第33组份。
4、按照权利要求3的方法分离下式的多肽
N-Ter-Ala-Asp-Cys-Val-Gly-Asp-Gly-Gln-Arg-
Cys-Ala-Asp-Trp-Ala-Gly-Pro-Tyr-Cys-Cys-Ser-
Gly-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Cys-Arg-Ser-Met-Pro-Tyr-
Cys-Arg-Cys-Arg-Ser-Asp-Ser（Curta毒素Ⅰ）
5、一种从蜘蛛Holoena        Curta的全部毒液中分离级份37的方法，该方法包括以2.5ml/min的流速将0.5ml的全部毒液加到Pharmica        Pep        RPC        HR        16/10        HPLC柱子上，以2.5ml/min的流速在100分钟后进行线性梯度洗脱至含0.05%TFA的60%乙腈止，收集2分钟的级份5ml，从该柱上洗脱选择分离出第37级份。
6、按照权利要求5的方法分离下式的多肽：
N-Ter-Ala-Asp-Cys-Val-Gly-Asp-Gly-Gln-Lys-
Cys-Ala-Asp-Trp-Phe-Gly-Pro-Tyr-Cys-Cys-Ser
-Gly-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Cys-Arg-Ser-Met-Pro-
Tyr-Cys-Arg-Cys-Arg-Ser-Asp-Ser-（Curta毒素        Ⅱ）
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