JPH02221296A - ホロレナ・クルタくも毒液から単離されたポリペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ホロレナ・クルタ（）Ｉｏｌｏｌｅｎａ　ｃ
＋＋ｒｔａ）くもの毒液から単離されるポリペプチド類
に関する。

〔従来の技術〕

近年、科学者たちは医学、ａ業向けに、くも毒液から新
しい化学成分を単離、確認しようとしていた。この分野
での最近の発展についての概観は、エッチ・ジャクソン
（Ｈ，Ｊａｃｋｓｏｎ）及びピー・エヌ・アール・アシ
ャーウッド（Ｐ、Ｎ、Ｒ，ｌｓｈｅｒｗｏｏｄ）、「興
奮性アミノ酸伝達因子の詳′ａ検射手段としてノくモ毒
素Ｊ　ＴｌＮ５ｍｌ１巻６号２７８−２８３頁（１９８
８年）によって刊行物中に提示されている。その中で、
ホロレナ・クルタくも毒素が検討され、このくも毒液の
、不可逆的なグルタメート拮抗剤として活性な成分が、
毒液の５，０００ないし！０，０００　Ｄａの単離され
たフラクションにあることが報告されている。

この毒素が「比較的大きな、不可逆的なグルタメート拮
抗剤の一部頚を代表しているかも知れない」という・示
唆がなされた（前掲２８２頁）。

更に、バワーズ（Ｂｏｗｅｒｓ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４を３５０６−３５ｍｌ０頁（１
９８７年）は、Ｈ、ｃ　ｕ　ｒ　ｔａ毒素から単離され
たフラクションがジスルフィド結合で結ばれたＭ、　７
０００と９０００の２つのサブユニットを含んでいて、
各々のり定サブユニットの一つからなると推定された毒
素の推定Ｍ１が１６．０００であって、このフラクショ
ンが電圧依存性のシナプス前のカルシウム通路の有力な
持続的抑制剤であることを明らかにしている。

神経筋伝達物質に影響するこのような（ヒ合物類は、て
んかん、低酸素−虚血性神経細胞死、及びハンチントン
病［ジャクソンら、「〜類鍋牛核における非Ｎ−メチル
ーＤ−アスバーテート受容体に媒介された伝達へのくも
毒液の彩奮」興奮性アミノ酸伝達５ｍｌ−５４頁（１９
８７年）アラン・Ｒ・リス社］及びアルツハイマー病を
含めた幾つかの神経系症状の研究と処置用、並ひに天然
殺虫剤用に興味ぶかいものがある。

〔課題を解決する手段〕

本発明は、本質的に式Ｉ Ｎ−Ｔｅｒ−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｖａ　Ｉ　
−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓｐ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｘ　−
Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｙ　−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−５ｅｒ−
Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ−Ａｒ３−Ｃｙｓ−
Ａｒ３−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−５ｅｒ　　　　　　　　（式
■）［式中ＸはＡｒｇ又はしｙｓであり、ＹはＡｌａ又
はＰｈｅであるが、億しＸがＡｒｇの時には、ＹはＡｌ
ａでなければならず、またＸがＬ　ｙ　ｓの時には、Ｙ
はＰｈｅでなければならない］ 及び式 ％式％ の、約４，０００　Ｄａの３８アミノ酸配列からなる、
ホロレナ・クルタ（Ｈｏｌｏｌｅｎａ　ｃｕｒｔａ）　
＜も毒１＆から単離されるか、又は合成的につくられる
ポリペプチド類に間する。

本発明はまた、それらの塩類に、またこのポリペプチド
類や、ポリペプチド類を含有する絹成物類の殺虫剤とし
ての使用に間しており、また例えばてんかん、低酸素−
虚血性神経！Ｉ胞死、及びハンチントン病を含めた幾つ
かの神経性症状の処置法におけるような、グルタメート
拮抗活性やカルシウム拮抗活性が望ましい場合のその他
の応用に間する。

〔課題を解決する手段〕

本明細書で使用される用語のほとんどは周知であり、こ
の技術で一船に使用されているもので、以下のものを説
明するために使用されている。

Ａｌａ−−アラニン Ａｒ８−　　フルギニン Ａｓｎ−−アスパラギン Ａｓｐ−−アスパラギン酸 Ｃｙｓ−−システィン Ｇｌｎ−−グルタミン ｃ＋ｙ−−グリシン Ｌｅｕ−一ロイシン Ｌｙｓ−−リシン Ｎｅｔ、−−メチオニン Ｐｈｅ−−フェニルアラニン Ｐｒｏ−−プロリン ５ｅｒ−−セリン Ｔｙｒ−−チコシン Ｖａｌ−−バリン Ｎ−Ｔｅｒ　−−Ｎ末端アミノ酸残基 本発明の範囲は配列の関連した３つのポリペプチド類を
包含し、各々ホロレナ・クルタくも毒液から単離される
か、又は合成的につくられたものである。式Ｉの各ポリ
ペプチドは３８アミノ酸配列からなり、アミノ酸配列は
９位置く式■のＸ）と１４４位置式■のＹ）でのみ２ポ
リペプチド間で異なっている。ＸがＡｒｇてＹがＡｌａ
の場合の化合物は、４１８８．９　Ｄａの分子量をもち
、ＸがＬｙｓて、ＹがＰｈｅの場合の化合物は、４２３
７．４０ａの分子量をもっている。これらの分子はＣｙ
ｓ（８）、５ｅｒ（５）、Ｔｙｒ（４）、Ａｒｇ／Ｌｙ
ｓ（４）のような塩基性残基、及びＡｓｐ（４）の高含
有量をもち、ヒスチジン、スレオニン、イソロイシン、
及びロイシンを欠いている。分子はまた、二つのジペプ
チド配列１８（ｙｓ−１９（ｙｓと２２７ｙ、−２３７
ｙ。

をもっている。

式■のポリペプチドは３６アミノ酸配列からなり、４１
０３、ＯＤａの分子量をもっている。この分子はＣｙｓ
（８）とＴｙｒ（５）の高含有量をもち、ヒスチジン、
スレオニン及びイソロイシンを欠いている。分子はまた
、二つのジペプチド配列１８（，５−１７（ｙｓと２０
７ｙ、−２１７ｙ、をもっている。

本発明のポリペプチド化合物１１　（以下に「ポリペプ
チド類」と称されるか又は「クルタトキシン１．２及び
３」として説明されるもの）は、ホロレナ・クルタ毒液
の比較的低分子量の選抜されたフラクションの単離と精
製によって実質的に純粋な形でつくられる。ポリペプチ
ド類の合成は、紐換えＤＮＡの手法を利用しても、更に
化学的ペプチド合成法によって一扁達成できる。

ホロレナ・クルタ毒液の比較的低分子量のフラクション
からの式ｌ及びロボリペブケト類の単離精製は、一般に
以下の手順を用いて実施された。

ホロレナ・クルタ原毒液を初めに逆相高性能液体クロマ
トグラフィ（ＨＰ　Ｌ　Ｉ’、　）によって分別し、フ
ラクシヨン３３　（Ｘ　ｂＩ　Ａｒｇ、　ＹがＡ　Ｉａ
、クルタトキシン１として確認されるもの）、３７（Ｘ
が１１％　ＹがＰｈｅ、クルタトキシン２として確認さ
れるもの）、及び２７（クルタトキシン３として確認さ
れるもの）を興味あるものとして確認した。次に、各フ
ラクションを陰イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾
過によって更に精製した。最終的な精製は逆相１１ＰＬ
Ｃによって行ない、均質なタンパク成分を示す各フラク
ション当たり単一の対称的ピークを得た。

化合物類の単離精製に特定的な手順は、実施例中に提示
されている。

本発明化合物類のペプチド合成は、一般に次の手順によ
って達成できる。

本発明化合物類は、ペプチド合成の定常的方法によって
つくられろ。本発明化合物類のあるものの合成中に、部
分的ラセミ化が起こることがありうる。しかし、ラセミ
化が起こるとしても、その程度は本発明化合物の活性を
著しく変えるほどのものではない。

本発明化合物類は、古典的な液相合成によって合成でき
る。

５ｌｌＩ！！は、アミド結合をつくるために一つのもの
のカルボキシル官能基をもう一つのもののアミノ官能基
と反応させることによって、アミノ酸又はペプチド断片
を結合させるものである。結合を効果的に達成させるた
めには、第一に、反応に直接酸化しない反応性の全官能
基を、適当な封鎖基の使用によって不活性化すること、
及び第二に、結合しようとするカルボキシル官能基を適
当に活性化して、結合を進行できろようにすることが望
ましい。このすべては、反応順序と反応条件の注意ぶか
い選択、並びに所望のペプチド生成物が実現されるよう
に特定封鎖基の使用を伴う。本発明化合物類をつくるた
めに使用され、特定的に選択された保護基、及び／又は
活性化させる官能基をもったアミノ酸類の各々は、ペプ
チド技術でよく認められた手法によってつくられろ。

封鎖基の選ばれた組合わせが、本発明化合物類の全合成
の各時点で使用される。これらの特定的な組合わせは、
最も順調に機能することがわがつた。他の組合わせも本
発明で化合物類の合成に作動するが、恐らくは成功の程
度が落ちる。従って、例λばベンジロキシカルボニル、
ｔ−ブチロキシカルボニル、ｔ−アミロキシカルボニル
、ｐ−メトキシベンジロキシカルボニル、アダマンチロ
キシカルボニル、及びイソボルニロキシ力ルボニルを本
発明化合物類の合成にアミノ封鎖基として種々使用でき
る。更に、ベンジル（Ｆｌｚｌ）は、一般にチロシル残
基用のヒドロキシ保護基として使用されるが、ｐ−ニト
ロベンジル（ＰＮＢ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＮＢ
）等のその他のものも、十分に使用できる。

本発明化合物類の調製に使用されるカルボキシル封鎖基
は、例えばメチル、エチル、ベンジル、ｐ−ニトロベン
ジル、ｐ−メトキシベンジル、２　、２　、２−トリク
ロロエチル等を含めた典型的なエステル形成基の任意の
ものでありうる。

本発明（ヒ合物類の調製で、適当に保護されたＮ−封鎖
アミノ酸又はペプチド断片と、適当に保護されたカルボ
キシ封鎖アミノ酸又はペプチド断片との結合は、アミノ
酸又はペプチド断片の遊離カルボキシル官能基を結合反
応に活性にすることからなる。これは、十分に認められ
た幾つかの手法の任意のものを用いて達成できろ。一つ
のこのような活性化手法は、カルボキシル官能基を混合
無水物へ転化させるものである。遊離カルボキシル官能
基は別の酸との、典型的にはその酸の塩化物のようなカ
ルボン酸誘導体との反応によって活性化される。混合無
水物を形成させるのに使用される酸塩化物の例は、クロ
ロ蟻酸エチル、クロロ蟻酸フェニル、クロａ９Ｒ＃第ニ
ブチル、クロロ蟻酸イソブチル、塩（ヒピバロイル等で
ある。クロロ蟻酸イソブチルを使用するのが好ましい。

結合反応を実施する目的で、カルボキシル官能基を活性
化するもう一つの方法は、その活性エステル誘導体への
転化によるものである。このような活性エステル類は、
例えば２，４．５−　）リフ１コロフエニルエステル、
ペンタクロロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエ
ステル等を包含する。利用できるもう一つの結合法は広
く認められたアジド結合法である。

本発明化合物類の調製に好ましい結合法は、Ｎ。

Ｎ′−ジシクロへキシルカルボジイミド（［）ＣＣ）を
用いて遊離カルボキシル官能基を活性化し、それによっ
て結合を進めるものである。この活性化及び結合の手法
は、アミノ酸又はペプチド断片に対して同しモル量のＯ
ＣＣを使用して実施され、また同じモル量の１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（ＨＯＢ　ｔ＞の存在下に行な
われる。　ＨＯＢｔの存在は、ラセミ化の可能性を含め
た、望ましくない副反応を抑制する。

選ばれた封鎖基の開裂が、本発明化合物類の調製に使用
される合成順序の特定時点で必要となる。

ペプチド合成技術で通常の熟練をもつ化学者は、生成物
の選択的開裂がアミノ酸又はペプチド断片上に存在する
（呆護基の一つ以１であるが全部よりは少ない基を除く
ように実施できるという点て適合性のある基を、代表的
な保護基から容易に選択できる。これらの手法は、ペプ
チド技術において十分に認められている。選択的開裂に
利用できる手法についてのより完全な！！議は、シュロ
ーダー（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ）及びルーブク（Ｌｕｈｋｅ
）の文献「ペプチド類」春夏、アカデミツクブレス社、
ニューヨーク州（１９６５年）、特にその７２−７５頁
に示された表中に提示されている。

カルボキシル（呆護基の開裂は、アルカリ鹸化によって
達成できる。典型的には水酸１ヒナトリウム、水酸化カ
リウム、水酸化リチウム等のようなアルカリ金属水酸化
物を使用する比較的強いアルカリ条件が、（ｌｉ！謹カ
ルボキシルの脱エステル化に一般に使用される。鹸化を
達成するための反応条件は、この技術で十分に認められ
ている。カルボキシル封鎖基の多くは、例えは炭素玉の
パラジウムのような触媒の存在下におけろ水添分解を含
めた接触水添分解によっても除去できる。更に、カルボ
キシル封鎖基がｐ−ニトロヘンシル又は２，２．２−　
トリクロロエチルの場合には、脱到鎖は亜鉛と塩酸の存
在下の還元によって達成できろ。

アミノ封鎖基の多くは、それぞれの酸付加塩生成物を形
成させるために渫謹アミノ酸又はペプチドを蟻酸、トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ｐ−トルエンスルホンＭ　（
ＴＳＡ）、ヘンセンスルホン酸（Ｒ５Ａ）、ナフタリン
スルホン酸等のような酸で処理することによって開裂す
る。その他のものの開裂は、深謹アミノ酸又はペプチド
をｔ１８ｒと酢酸の混合物で処理し、対応パイトロブロ
マイド酸付加塩をつくることによって達成できる。使用
される適当な方法又は試薬は、特定の脱封鎖反応に関与
する材料の化学的又は物理的性質に依存しよう。生ずる
酸付加塩は、ＤＥＡＥセファデックスＡ２５、アンバー
ライ１−Ａ２７等のような適当なイオン交換樹脂での処
理によって、製薬学的により受入れられろ形に転化でき
る。

ヒドロキシ１采護基は、ペプチド調製の進行中にペプチ
ド上に保持しておき、最終合成段階中にアミノ封鎖基の
開裂と連係して除去されるようにてきる。しかし、カル
ボキシル封鎖基の除去に使用される条件によっては、調
製順序の半間に除くこともできる。カルボキシル基をア
ルカリ鹸化によって開裂する時は、ヒドロキシ保護基は
保持される。しかし、カルボキシル保護基の除去に接触
水添分解を用いる時は、ヒドロキシ保護基も開裂されろ
。後者の状況は重大問題をもたらすことはない。という
のは、本発明化合物類の調製は保護されないチロシル残
基の存在下に達成できるためである。

当然ながら、他のＩｌｌ　字も利用可能である。一つの
方法は、別個に調製されたＮ−末端トリペプチドを別個
に調製されたＣ−末端フェニルアラニン誘導体と結合さ
せ、続いて任意の残った封鎖部分を適当に脱封鎖するも
のである。使用できるもう一つの解決法は、ペプチド鎖
の構築にＣ−末端部分から始めて、１個ずつの７ミノ＃
を段階的に１１１６序だてて付加することである。上記
のような反応手法は本調製順序でも、その池の考慮され
た任意の調製にも使用されろ。

更に、本発明化合物類は紺喚えＤＮＡ合成によってつく
ることができる。

一般的に、本発明化合物類の完全な一次構造は、以下の
手順によって決定された。ファイアトマン（Ｆｉｒｅｄ
ｓａｎ）ら、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２４
５巻３８６８頁（１９７０年）の手順を、デイ−・ホー
ク（Ｄ、　Ｈａｗｋｅ）及びビー伽ヨーム（Ｐ、　Ｖａ
ｕｍ）がＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎ
ｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ　ｌノｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
　２８号（１９８７年）で変更した手順に従って、クル
タトキシン■、口及び■をピリジルエチル化した。次に
、ピリジルエチル化した毒素（ＰＥ５ＴＳ）をマイクロ
ポア逆相）ＩＰＬｃによって脱塩し、勾配プログラムへ
約４０分溶離後、標準的自動化エドマン解体を（テなっ
た。フェニルチオヒダントイン誘導体化アミノ酸を各サ
イクルに気相配列決定装置と直接オンラインさせたＰＩ
（Ｔ分析装置で分析した。ペプチドをオートサンプラ管
内で気相加水分解によって加水分解し、次に一次及び二
次アミノ酸の検出のため、管を７ミノフォント分析装萱
に移した。初期に天然毒素の数ナノモルを分析し、各々
が高率のＰＴＨ−アミノ酸を与え、最初の３５−３７残
基に対する明確な指定をもたらした。システィンはＰＥ
５Ｔタンパクの配列分析によって決定された。カルボキ
シ末端配列を立証するために、各ペプチドのＰＥ５Ｔ型
をＣＮＢｒで解体させると、２９位置でメチオニンが開
裂した。カルボキシ末端断片はマイクロポアＣ−１８逆
相１１　Ｐ　Ｌ　Ｃて精製され配列決定された。加水分
解されたペプチドのアミノ酸紹成は、断片のアミノ酸配
列から計算された組成と一致しており、カルボキシ末端
セリン残基を確認した。構造の確認はＦＡＢ−ＭＳ分析
で得られた。クルタトキシン■と■のＭＨ＋イオン分子
量は４１８８．７Ｄａと４２３７．４　Ｄａてあり、こ
れに対し計算値は４１８９゜６０ａと４２３７．７０ａ
であった。クルタトキシン■の分子量は４１０３．ＯＤ
ａであり、これはカルボキシアミド１ヒボリペブチトの
アミノ酸配列の分子量から計算されたものと一致してい
た。本発明化合物類の一次構造を決定する特定手順は、
下の実施例に提示されている。

〔実り’ｔＥ例〕

以下の特定的な実施例は本発明化合物類を渭得し特性化
する方法を例示するためにｔに示されているが、これら
はいかなる彩においても本発明の範囲を限定するものと
考えられてはならない。

実施例１　クルタトキシンＩ、■及びｌ■の精製手１ｌ
１１ ホロレナ・クルタ毒液を冷凍保存し、初期の凍結乾燥段
階なしに、すなわちＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラムへ毒液を直
接に注入してクロマトグラフィ処理した。

クルタトキシン類の精製を監視するために用いられた生
物検定は、コオロギ（Ａｃｈｅｔａ　ｄｏｓ＋ｅｓｔｉ
ｃａ）のまひであった。クロマトグラフィに続いて、カ
ラムフラクションは５ａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ
を使用して一夜凍結乾燥させ、残留物を最少量の蒸留／
脱イオン水（通常１００−２００７ｚ　ｌ）に溶解した
。コオロギの胸郭に２１ｔｌの注入を行ない、その後コ
オロギをプラスチック製ペトリ皿内に入れた。まひ性材
料を含有するフラクションは、通常５分ないし１０分以
内にまひをもたらし、２−３時間で完了した。原状ＩＭ
帰について検査するために、少なくとも２４時間（通常
４８時間）の間、コオロギを監視した。

ＷＵ：段階ｌ　ファーマシアＰｅｐ　ＲＰＣＨＲ１６／
１０カラムを、０．０５％ＴＦＡ（）リフルオロ酢酸）
含有の１（ＰＬＣ等級の水で一夜平衡化した。原毒液０
．５ｍｌをカラムバイアルの注入ループに毎分２．５ｍ
ｌの流量で適用した。カラムを上の流量の平衡化溶媒４
０１て洗った。毎分２．５　ｍｌの流量で１００分にね
たり（３０＄アセトニトリル（０，０５Ｘ　ＴＦＡを含
有）まで線状勾配操作をして、毒ｉ夜成分を選択的に溶
離した。５ｍｌ（２分）フラクションを集めるのにフラ
クション回収Ｐ装置を使用し、フラクションを凍結乾燥
し、上記のように生物検定した。急速な、本質的に即時
のまひが、フラクション２７．３３及び３７から見られ
た。これらのフラクションをその後のＭ製段階に通した
。

木質的にとんな分離用逆相（臼）１）ＩＩＰＩｃカラム
でも、同一でなくとも類似の分離を与えるはずである。

ファーマシ７カラムを多孔性シリカ（−２／□８（１５
７１１）で充填し・た。この第一段階に使用された勾配
は緩やかであったが、毒液成分の優れた分離を生じた。

段階２：　クルタトキシン■　（フラクション３３莢ｊ
） バイオラドマイクロアナライザーＭＡ７Ｐ＋陰イオン交
換ＨＰＬＣカラム（４，（’１ｖ３０　ｍｍ）を毎分０
．５　ｍｌの１−２９の２０ｍＭ）リス（ｐｌ＋　７．
Ｆｉ）で平衡化した。このようなイソクラチック条件下
に、フラクション３３からのまひ性毒素はカラムに結合
せず、空隙容積中に溶離した。２２０　ｎｍでの吸収を
監視しながら、フラクションを手で集めた。不活性成分
はこの手順でやや遅れるか、又はカラムに結合されて、
有意の精製をもたらした。

マイクロアナライザーは、これが球状で薄皮の（非多孔
性）重合体からなる点で、他の陰イオン交換体とやや異
なろくほとんどのＩＩＰＬｃカラムでは、試料−カラム
の相互作用が充填材料の多孔内部で起こる〉。このよう
に、マイクロアナライザーは比較的低容積をもち、この
ため収率が高く、より高い流量を使用できる。この方ラ
ムに勧められる流量は毎分１．５　ｍｌであるが、それ
より低い流量も優れた結果を与えた。

段階３：　クルタトキシンＩ 先行段階からの活性材料を、５０　ｍＭ　Ｎａ２Ｓθ４
／２０ｍＭ　Ｎａ２１１ＰＯ４（Ｉｌｌｌ　６．８）で
予め平衡化したバイオラドＢｉｏＳｉｌ　ＴＳに２５０
ゲル透過カラム（３００Ｘ７．５　ｍｍ）に毎分１．０
１の流量で適用した。これらのイソクラチック条件下に
、まひ性活性分は約１２　ｎｉｌのｉ’ｆ７　Ｉｆｔ容
量（Ｖｅ）で溶離した。幾分の汚染物質はこの方法で除
去された。

段階４：　クルタトキシンｌ クルタトキシン「の精製のＰ！終段階は、段階ｌと同じ
カラムで行なわれろ別の逆相段階であった。

しかし、カラムを毎分２．５　ＩＩｔの流量の水１０．
０５！ＴＦＡ中の１５χアセトニトリルで平衡化し・た
。毒素の適用に続いて、カラムを上の流量の平衡化溶媒
１２．５−１で洗った。ＩＮ分２．５ｍｌで８５分にわ
たり３５Ｘアセトニトリルまで勾配操作を１テなって、
クルタトキシンｌを溶離した。溶離１ａ置はほぼ２６１
アセトニトリルであった。

精製毒素を凍結乾燥し、その後の配＋１１分析にかける
前に冷凍保存した。

段階３について記述されたとおりに、フラクション３７
をゲル透過カラムに通したが、但し流量は毎分０．５ｍ
ｌであった。毒素成分は約１６１の溶離容量（Ｖｅ）で
溶離した。

段ＰＩ６：　　クルタトキシン■ 先行段階からの活性材料を、段階４についてまさに記述
されたとおりにクロマトグラフィ処理した。活性材料は
約３１Ｘアセトニトリルに相当する位置に溶離した。

クルタトキシン■の精製は、アプライド・バイオシステ
ムズ社のモデル１３０タンパク−ペプチド分離システム
を使用して、アクアボアＲＰ−３００マイクロポア逆相
方ラム（２，ｌＸ３０　ｍｍ）上でフラクション２７（
水中０．ｌ％ＴＦＡ　１ｏ０１１１中でもとしたも））
ノ再クロマトグラフィ処理によって達成された。勾配は
、毎分１００Ｉｚｌの流量で１５０分にわたり１０ｏｚ
緩南ｉｎ　、Ａ　（水中０．ｌＸ　ＴＦＡ）　カラ１０
０２０　ｉｔｊ　ｉｆｆ　Ｂ　（水中０．８５＄　ＴＦ
Ａ及び７（１＄ア七トニトリル）まで、線状であった。

毒素は、還元及び４−ビニルピリジンてのピリジルエチ
ル化後、マイクロポア逆相）ＩＰｔ、ｃによっても精製
された。

実施例２−次構造の決定 クルタトキシン類のピリジルエチル化と臭化シアンによ
る解体。配列分析に先立って、ホーク及びユアム（１９
８７年）によって少量のタンパク用に変更されたフリー
トマンら（１９７０年）の手１１１Ｑに従って、精製ク
ルタトキシン類をピリジルエチル化した。

要約すると、各クルタトキシンＩＯ７ｔｇを６Ｍグアニ
ジン−ＨＣｌ、０．２５Ｍ　トリス−１１ｃＩ（ｐＨ８
，５）４４７１１中に溶解し、順次１０ｚβ−メルカプ
トエタノール３７ｚｌ及び４−ビニルピリジン：３７Ｌ
ｌと室温で２時間反応させた。

次に、ピリジルメチル化された毒素を、アプライド・バ
イオシステムズ社のモデル１３０タンパク−ペプチド分
離システムで、アクアボアＲＰ−３００カラム（２，１
χ３０　ｙａ醜）を使用するマイクロポア逆相ＨＰＬＣ
によって脱塩した。勾配は、毎分１００μｍの流量で１
５０分にわたり１００工緩所液Ａ（水中０．１１リフル
オロ酢酸）　カラ１００１１１ｉＷｅ　Ｂ　（水中０．
０８５Ｘ　）　ｌ／　フルオロ酢酸及び７０Ｘアセトニ
トリル）まで、線状であった。ピリジルエチル化された
くも毒素（Ｐ　ＥＳＴＳ）は、約４０分で勾配プログラ
ムにｉＢ＃１し、未変更タンパクより５−１０分手かっ
た。

カルボキシ末端断片をつくろために、各ＰＥ５Ｔ　１と
ｒ１１０７ｔｇを７０％蟻酸３：（Ｏｌｌｌに溶解した
＊　ＣＮ８ｒの結晶数個を試料に加え、次にこれを窒素
でフラッシュし、蜜月して暗所に室温で２４時間装いた
。試料をスピードバック遠心分離器（サバント）で乾燥
し、Ｏ，ＩＸ、ＴＦＡ／Ｈ２０５０μｍに再溶解し、マ
イクロポア逆相ＨＰＬＣによって再精製した。勾配は線
状であり、１５０分にわたり＋００羞緩衝ｉαノ入（水
中０．１てＴＦＡ）カラ１００１緩衝ｔ（ＲＢ＜水中０
．０８５＄　ＴＦＡ及び７０％７セトニトリル）までの
範囲にあった。　ＰＥＳＴｍのカルボキシ末端は、Ｉ：
５０の酵素ｌ基質重量比で毒素１８μｇのトリプシン消
１ヒによって発生させた。１χ重炭酸アンモニウム（ｐ
Ｈ９，０）中で、室温で２０時間消１ヒを行なった。ペ
プチドを上記のように、マイクロポア逆相）ＩＰＬＣで
精製した。

モデル４７０Ａタンパク−ペプチド配列決定装置（アプ
ライド・バイオシステムズ社）で自動化エドマン解体を
行なった。試薬、指示及び標準プログラムはメーカーの
提供によった。　４７０Ａ気相配列決定装置と直接オン
ラインになっているモデル１２０ＰＴＨ−分析装置ｉＥ
（アプライド・バイオシステムズ社）で各サイクルにフ
ェニルチオヒダントイン誘導体化アミノ酸を分析した。

アミノ酸分析　−アミノ酸分析による確認は、サーモス
プレー・イオン源と関連の真空システムからなるヴエス
テツクｌ旧サーモスプレー・インターフェースζこ据え
ｆ寸けられたヒューレ・ソト番パッカード５７９０質量
選択検出器からなる専用サーモスプレー液体クロマトグ
ラフィー質量スペクトル分析（ＬＣ−ＭＳ）システムに
よって行なわれた。　ＬＣ−ＭＳ分析に先立って、酸加
水分解物をフェニルイソチオシアネー）（ＰＩＴＣ）と
反応させると、フェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）アミ
ノ酸が形成された。−次及び二次アミノ酸の決定のため
、Ｏ−フタルアルデヒドとＳトフルオレニルメチルクロ
ロフオルメートの二重の誘導体１ヒ化学を使用するヒユ
ーレット・バラカート・アミノフォント・アナライザー
で定量的な結果が得られた。

ペプチド配列決定装置（アプライド・バイオシステムズ
社）で自動化エドマン解体を行なった。試薬、指示及び
標準プログラムはメーカーの提供によった。４７０Ａ気
相配列決定装置と直接オンラインになっているモデル１
２０ＰＴ）Ｉ−アナライザー（アプライド・バイオシス
テムズ社）で各サイクルにフェニルチオヒダントイン誘
導体化アミノ酸を分析した。

ＦＡ）ｌｌｊ　量スペクトル分析　−ＺＡＢ２−ＳＥ二
重焦点質量スペクトル分析計（〜Ｇアナリテイカル社）
を使用して、分子量測定を行なった。損われていないク
ルタトキシン類のＦＡＢ分析は、１％　ＴＦＡを加えた
ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、及びチオ
グリセロール（５：ｌ：６重置比）からなる基剤中の適
当な毒素１７ｚｇを使用して達成された。

定磁界強度で加速度ポテンシャルの線走査を用いてイオ
ン化が得られた。２Ｃｓｌ標準イオンを含むように間隔
が選定され、これらのイオンの質Ｉｋｌｌ！！（４０３
０，０５４１及び４２８９．８６４０）はクルタトキシ
ン類の分子量領域を包括していた。データシステムのＭ
ＣＡモートを使用して、１０００のＮ量分解能でデータ
を（４た。このモートは連続データの累積走査を裏め、
それを同しデータファイルに統合する。この方法を用い
て、ペプチドからの３走査をＣｓｌ標準からの３後続走
査と統合した。次に、毒素の質量を直線補間によって決
定した。

カルボキシ末端含有ペプチドについて得られた質量スペ
クトルは、慣用のマグネット電流走査を用いて得られた
。ペプチドの個々の同位体が分解できるように、２００
０のｎ量分解能を使用した。分析に先立って、（：５ｍ
ｌを基準として使用し、質量較正を得た。その後の分析
は、Ｉ％ＴＦＡを加えたグリセロール／チオグリセロー
ルＩ：Ｉ（ｗ／ｗ）からなる基剤中で、＋７　ＫｅＶセ
シウムイオンビームを用いて行なわれた。

本発明１ヒ合物類は殺虫剤として有用である。典型的に
は、ポリペプチド類が何らかの殺虫活性を生ずるために
は、体重８当たり少なくとも約３１１ｇの量で投与でき
る。体重ｇ当たり少なくとも約９μｇの量を使用するの
が好ましい。本発明１ヒ合物類の殺虫性状は、標準的な
１＠知の手１１１ａによって容易に決定できる。以下の
手１１１αはポリペプチド類の殺虫活性を例証している
。

Ａｃｈｅｔａ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ属／種のコオロギに
くも原毒液又はくも毒液の精製フラクションを注射し、
対照コオロギには蒸留水のみを注射した。ホロレナ・ク
ルタ毒液（プラトフォード／ダマシーブルー検定で測定
されるとおり、５０　ｍｇ／ｍｌ）を脱イオン水と混合
し、０．５μｍ（２５μｇタンパク）をコオロギの胸郭
に注射すると、直ちに不可逆的なまひが生した。クルタ
トキシン■（フラクション３７）約８８０μを脱イオン
水＋５０７１１に溶解した。５．８６μｇ／７ｚｌの希
釈物を１群５匹のコオロギ（平均重量＝　０．３８４　
ｇ）に使用し、ポリペプチド２．９３μｇを各コオロギ
に注射した。復元応答の欠如とまひが観察され、注射後
４８時間に５匹全部が死んだが、対照の５匹はすべて生
きていた。１．９５７１ｇ／μｍの第二の溶液を調製し
、ポリペプチド０．９８μｇを同じくコオロギ５匹（平
均重量＝　０．３１４　ｇ）に注射した。５匹のうち２
匹は４８時間後に死んだが、対照の５匹全部は正常であ
った。史に、希釈溶液を試験したが、：ｙ１死性を生じ
なかった。

との結果は、本発明化合物類により、有力な殺虫活性が
得られたことを例証している。

本発明化合物類は、けいれん、アルツハイマー病、ハン
チントン病、心臓発作を伴う後大脳虚血等を含めた神経
性疾患の処置に有効なグルタメート受容体及びカルシウ
ム通路拮抗剤としても有用である。

これら化合物類の拮抗性状は、エル・ヴイクリッキー（
Ｌ、　Ｖｙｋｌｉｃｋｙ）ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ　ｌ、ｅｔｔｅｒｓ６８巻２２７−２３１頁（１９８
６年）繞ひシー・ダブ）Ｉニー・バウアー（Ｃ，Ｗ、　
Ｂｏｗｅｒｓ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、１．Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、。

【ノＳＡ　８４巻：１５０ｆｌ−３５ｍｌ０頁（＋！１
８７年）に記述されたものなと、標準的な周知の手順に
よって容易に決定できろ。

典型的には、本発明化合物類は治療の必要な吐乳類、例
えばヒトのだ１者に対して、グルタメート受容体及びカ
ルシウム通路の拮抗応答を生ずる有効量で投与されると
、それによって上記症状の治療がもたらされる。

本発明のポリペプチド化合物類は遊離酸型又は塩類とし
て使用できる。「製薬学的に受け入れられる塩」という
表現は、塩に起因する副作用が式Ｉポリペプチド類の有
益な効果を損わないように、有効活性に矛盾しない濃度
において患者に比較的無毒無害であるような、式Ｉ化合
物類の任意の有機又は無機酸付加塩を意味する。これら
の塩類は本発明の範囲に包含される。このような塩類は
、アンモニウム塩；ナトリウムとカリウム塩のようなア
ルカリ金属塩；カルシウムとマグネシウム塩のようなア
ルカリ＋：、類金属塩；例えはジシクロヘキシルアミン
塩、Ｎ−メチル−１トグルカミンのような有機塩基との
塩類、及びアルキニンとりシンのようなアミノ酸類との
塩を包含する。また例えは、次の酸類：塩酸、臭化水素
酸、硫酸、燐酸、硝酸、アスコルビン酸、メタンスルホ
ン酸、酢酸、プロピオン酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、
リンゴ酸、マンゾリン酸、桂皮酸、バルミチン酸、イタ
コン酸、フマール酸、ヘンゼンスルホン酸、及びトルエ
ンスルホン酸のような有機及び無機ｖｉ類との塩も調製
できろ。製薬学的に受け入れられる無毒性の塩類が好ま
しいが、生成物の単離Ｍ装用にその他の塩類も有用であ
る。

塩にとって不溶性の溶媒又は媒体中で、又は真空中ない
し凍結乾燥で除去できる水のような溶媒中で、遊離酸型
の生成物を１当量以上の適当な塩基と反応させるか、又
は既存塩の陽イオンと別の陽イオンとを適当なイオン交
換杓脂玉て交ＩＩ２！することによって、慣用手段によ
って塩を形成ずろことができる。

神経系疾患の治療のためには、患者とは、特定症状、損
傷、又は疾病のため治療を必要とするヒトを含めた吐乳
類である。神紗系疾患の治療のために患者に投与される
活性成分（すなわち式■又はＨのポリペプチド）の量は
、使用の特定適量単位、処置間開、処置を受ける患者の
年齢性別、及び処置されろ症状の程度、使用ポリペプチ
ド、他薬剤での同時処置を利用するかどうか等の考慮に
従って広く変わりつる。

本発明のポリペプチド類は、適当に処方された製剤組成
物の形で必要な患者へ投与することによって、所望の薬
理学的効果を達成するために利用できる。従って、本発
明は製薬学的に受け入れられる担体と、製薬学的有効量
の式■化合物とを含めてなる製＾り組成物を包含する。

製薬学的に受け入れられる担体は、担体に起因する副作
用が活性成分の有益な効果を損わないように、有効活性
に矛盾しない濃度において患者に。比較的無毒無害であ
るような任言の担体てある。化合物の製薬学的有効量は
、処置される特定症状に対して結果をもたらすか、或い
は影響を現わすような量である。

式Ｉ及び式■化合物類は、経口又は非経口投与用に慣用
の適量単位形式を用いて、製薬学的に受け入れられる１
ｆ１１本と一緒に投与できる。

医師は最も適した本発明化合物類の特定ａｍを決定しよ
う。選はれた適量は、上に述べた要因によって変わるで
あろうが、典型的には約０．Ｏｌないし約１０　ｍｇ／
Ｊの範囲にあろう。

本発明はまた、ポリペプチドと不活性担体を含有ずろ組
成物類を包括する。このような組成物類は診断用途に、
又は分析標準又は基準として、並びに殺虫用途に使用で
きる。従って、本発明は不活性担体と、本発明のポリペ
プチド又はその塩とを含めてなる組成物類を包含する。

不活性担体は、運搬される化合物と相互に作用せず、運
搬化合物に支持、運搬手段、かさ、ＩＩｌ跡材料を与え
るようなｌｆ意の材料である。化合物の有効量は、記述
された用途のために望ましい方法で大晦てさ、結果を与
えるか、又は特定実施手１１１１ｉに影響を与えろよう
な量である。

本明春書に説明されたとおりの本発明の精神又は範囲か
ら逸脱せずに、本発明に対して変化と変更をなしうろこ
とは、当業者に認められよう。

出願人　メレル　ダウ　フ７−マスーティカルズインコ
ーボレーテット

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 I 【遺伝子配列があります】 ［式中ＸはＡｒｇ又はＬｙｓであり、ＹはＡｌａ又はＰ
   ｈｅであるが、但しＸがＡｒｇの時には、ＹはＡｌａで
   なければならず、またＸがＬｙｓの時には、ＹはＰｈｅ
   でなければならないことを条件とする］のポリペプチド
   又はその塩類。 ２、式 【遺伝子配列があります】（クルタトキシン I ）の特
   許請求の範囲第１項によるポリペプチド。 ３、式 【遺伝子配列があります】（クルタトキシンII）の特許
   請求の範囲第１項によるポリペプチド。 ４、特許請求の範囲第１項のポリペプチドの殺虫量に昆
   虫を接触させることを含めてなる、昆虫防除法。 ５、ポリペプチドが特許請求の範囲第２項又は第３項の
   とおりである、特許請求の範囲第４項の方法。 ６、不活性担体と組合わせた特許請求の範囲第１項のポ
   リペプチドの有効量を含めてなる組成物。 ７、特許請求の範囲第１項のポリペプチドのグルタメー
   ト拮抗有効量を患者に投与することを含めてなる、神経
   系疾患の処置法。 ８、特許請求の範囲第１項のポリペプチドのカルシウム
   通路拮抗有効量を患者に投与することを含めてなる、神
   経系疾患の処置法。 ９、製薬学的に受け入れられる担体と組合わせた特許請
   求の範囲第１項のポリペプチドの製薬学的有効量を含め
   てなる製剤組成物。 １０、式 【遺伝子配列があります】 のポリペプチド、及びその塩類。 １１、特許請求の範囲第１０項のポリペプチドの殺虫量
   に昆虫を接触させることを含めてなる、昆虫防除法。 １２、不活性担体と組合わせた特許請求の範囲第１０項
   のポリペプチドの有効量を含めてなる組成物。 １３、特許請求の範囲第１０項のポリペプチドのグルタ
   メート拮抗有効量を患者に投与することを含めてなる、
   神経系疾患の処置法。 １４、特許請求の範囲第１０項のポリペプチドのカルシ
   ウム通路拮抗有効量を患者に投与することを含めてなる
   、神経系疾患の処置法。 １５、製薬学的に受け入れられる担体と組合わせた特許
   請求の範囲第１０項のポリペプチドの製薬学的有効量を
   含めてなる製剤組成物。 １６、ホロレナ・クルタ（Ｈｏｌｏｌｅｎａｃｕｒｔａ
   ）くもの原毒液０．５ｍｌを毎分２．５ｍｌの流量でフ
   ァーマシアＰｅｐＲＰＣＨＲ１６／１０ＨＰＬＣカラム
   に適用し、毎分２．５ｍｌの流量で１００分間にわたり
   、０．０５％ＴＦＡを含有する６０％アセトニトリルま
   で線形勾配で流すことによって選択的に溶離し、カラム
   から溶離する２７番目のフラクションとして５ｍｌ２分
   間のフラクションを集める時に、フラクション２７とし
   て回収されるホロレナ・クルタくもの原毒液の一成分。 １７、ホロレナ・クルタくもの原毒液０．５ｍｌを毎分
   ２．５ｍｌの流量でファーマシアＰｅｐＲＰＣＨＲ１６
   ／１０ＨＰＬＣカラムに適用し、毎分２．５ｍｌの流量
   で１００分間にわたり、０．０５％ＴＦＡを含有する６
   ０％アセトニトリルまで線形勾配で流すことによって選
   択的に溶離し、カラムから溶離する３３番目のフラクシ
   ョンとして５ｍｌ２分間のフラクションを集める時に、
   フラクション３３として回収されるホロレナ・クルタく
   もの原毒液の一成分。 １８、ホロレナ・クルタくもの原毒液０．５ｍｌを毎分
   ２．５ｍｌの流量でファーマシアＰｅｐＲＰＣＨＲ１６
   ／１０ＨＰＬＣカラムに適用し、毎分２．５ｍｌの流量
   で１００分間にわたり、０．０５％ＴＦＡを含有する６
   ０％アセトニトリルまで線形勾配で流すことによって選
   択的に溶離し、カラムから溶離する３７番目のフラクシ
   ョンとして５ｍｌ２分間のフラクションを集める時に、
   フラクション３７として回収されるホロレナ・クルタく
   もの原毒液の一成分。 １９、原毒液０．５ｍｌを毎分２．５ｍｌの流量でファ
   ーマシアＰｅｐＲＰＣＨＲ１６／１０ＨＰＬＣカラムに
   適用し、毎分２．５ｍｌの流量で１００分間にわたり、
   ０．０５％ＴＦＡを含有する６０％アセトニトリルまで
   線形勾配操作をし、５ｍｌ２分間のフラクションを集め
   、カラムから溶離する２７番目のフラクションを選択的
   に単離することを含めてなる、ホロレナ・クルタくもの
   原毒液のフラクション２７を単離する方法。 ２０、式 【遺伝子配列があります】（クルタトキシンIII）のポ
   リペプチド、及びその塩類を単離するための、特許請求
   の範囲第１９項による方法。 ２１、原毒液０．５ｍｌを毎分２．５ｍｌの流量でファ
   ーマシアＰｅｐＲＰＣＨＲ１６／１０ＨＰＬＣカラムに
   適用し、毎分２．５ｍｌの流量で１００分間にわたり、
   ０．０５％ＴＦＡを含有する６０％アセトニトリルまで
   線形勾配操作をし、５ｍｌ２分間のフラクションを集め
   、カラムから溶離する３３番目のフラクションを選択的
   に単離することを含めてなる、ホロレナ・クルタくもの
   原毒液のフラクション３３を単離する方法。 ２２、式 【遺伝子配列があります】（クルタトキシン I ）のポ
   リペプチドを単離するための、特許請求の範囲第２１項
   による方法。 ２３、原毒液０．５ｍｌを毎分２．５ｍｌの流量でファ
   ーマシアＰｅｐＲＰＣＨＲ１６／１０ＨＰＬＣカラムに
   適用し、毎分２．５ｍｌの流量で１００分間にわたり、
   ０．０５％ＴＦＡを含有する６０％アセトニトリルまで
   線形勾配操作をし、５ｍｌ２分間のフラクションを集め
   、カラムから溶離する３７番目のフラクションを選択的
   に単離することを含めてなる、ホロレナ・クルタくもの
   原毒液のフラクション３７を単離する方法。 ２４、式 【遺伝子配列があります】（クルタトキシンII）のポリ
   ペプチドを単離するための、特許請求の範囲第２３項に
   よる方法。