HU204283B

HU204283B - Process for isolating polypeptide from poison of spider hololena curta and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU204283B
Application number: HU896704A
Authority: HU
Inventors: Andrew G Stapleton
Original assignee: Merrell Dow Pharma
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1989-12-20
Publication date: 1991-12-30
Also published as: DK662089D0; NO895245L; CA2006087A1; PT92710A; HU896704D0; EP0374940A3; CN1044101A; DE68911498T2; JP2791957B2; ES2061919T3; KR900009695A; NO895245D0; EP0374940A2; CA2006087C; DE68911498D1; FI896136A0; JPH02221296A; HUT52782A; AU4730189A; IL92819A0

Description

A találmány tárgya polipeptidek izolálása a Hololena curta pókméregből és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

Az utóbbi években a kutatók vizsgálatokat folytattak a pókméreg kémiai komponensei szerkezetének meg- 5 határozására és gyógyszerészeiben, valamint mezőgazdaságban történő· felhasználására. A vizsgálatok eredményeit H. Jackson és Ρ. N. R. Usherwood „Pók toxíonok, mint az izgalmi aminosav-átviteli rendszer sebészeti eszközei”, TINS, 11, No. 6., 278-283 (1988) 10 összefoglaló közleménye tartalmazza. Ebben leírták, hogy a Hololena curta pók toxinját megvizsgálták és a pókméreg aktív alkotóeleme, amely irreverzibilis glutamát antagonista hatással rendelkezik a méreg egy izolált frakciójában található, amely 5000-10 000 Da 15 jellemzőjű. Feltételezték, hogy ez a toxin „valószínűleg az irreverzibilis glutamát antagonisták egy viszonylag nagy csoportjának képviselője” (ugyanott 282.

old.).

Ezen túlmenően Bowers és munkatársai, Proc. Natl. 20

Acad. Sci., USA, 84,3506-3510 (1987) közleményükben leírták, hogy a H. curta toxinból izolált frakció, amely két diszulfid hidakkal összekapcsolt, Mr 7000 és 9000 egységből áll. A toxin becsült Mr értéke 16 000, amely a két alegység molekulatömegének összege. A 25 toxin hatásos, valamint hosszú hatásidejű feszültségfüggőpresynapsisos kálciumvezeték inhibitor.

Az ilyen vegyületek, amelyek a neuromuszkuláris transzmittereket befolyásolják számos idegbetegség, mint például az epilepszia, az oxigénhiányos-vértelen idegi elhalás és a Huntington betegség [Jackson és munkatársai, „Pókmérgek hatása a nem N-metil-Daszaparát-receptorok által szabályozott átvitelre a madár csiga-nukleusban”, Izgalmi aminosav-átvitel, 5154, (1987)], Alán R. Liss, Inc., és Alzheimer-kór kezelésében, valamint természetes inszekticidként alkalmazhatók.

A találmány tárgya eljárás a Hololena curta pókméregből polipeptidek izolálására vagy szintetikus előállítására, amelyek 38 aminosavegységet tartalmaznak és Da értékük körülbelül 4000, valamint az alábbi (I) általános képlettel jellemezhetők:

N-Ter-Ala-Asp-Cys-Val-Gly-Asp-Gly-Gln-X-Cys-Ala-Asp-Trp-Y-Gly-Pro-Tyr-Cys-Cys-Ser-Gly-Tyr-Tvr-Cys-Ser-Cys-Arg-Ser-Met-Pro-Tyr-Cys-Arg-Cys-Arg-Ser-Asp-Ser, ahol

X jelentése Arg vagy Lys és

Y jelentése Alá vagy Phe, azzal a feltétellel, hogy amennyiben X jelentése Arg, akkor Y jelentése Alá és amennyiben X jelentése Lys, akkor Y jelentése Phe, valamint a (Π) képlettel leírható polipeptid izolálása, ill. előállítása.

N-Ter-Ser-Cys-Val-Gly-Gln-Tyr-Gly-Arg-Cys-Arg-Ser-Aía-Tyr-GIn-Asp-Cys-Cys-Asp-Gly-Tyr-Iyr-Cys-Asn-Cys-Ser-Gln-Pro-Pro-Tyr-Cys-Len-Cys-Arg-Asn-Asn-Asn

A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti vegyületek sóinak előállítására, valamint a polipeptidek és ezeket tartalmazó formált alakok inszekticidként való alkalmazására, valamint más olyan alkalmazására, amelyben a vegyületek glutamát-antagonista hatásossága vagy kálcium-antagonista hatása szükséges, mint például számos idegbetegség, például epilepszia, oxigénhiányos-vérhíányos idegelhalás és Huntington betegség kezelésében történő alkalmazására.

A találmány szerinti eljárás leírásában alkalmazott, a szakirodalomban jól ismert és általánosan használt rövidítések értelmezését az alábbiakban adjuk meg:

Ala-alanin

Arg-arginin

Asn-aszparagin

Asp - aszparaginsav

Cys-cisztein

Gln-glutamin

Gly-glicin

Leu-leucin

Lys - lizin

Met-metionin Phe-fenilalanin Pro-prolin Ser-szerin Tyr-tirozin Val-valin

N-Ter-N terminális aminosav-maradék.

A találmány szerinti eljárás három szekvenciájában rokon polipeptidre vonatkozik, amelyeket a Hololena curta pókméregből izoláltak vagy szintetikusan állítottak elő. Valamennyi (Ί) általános képletű polipeptid 38 30 aminosavat tartalmazó szekvencia, amelyek csak a 9 [az (I) általános képletben X] és 14 [az (I) általános képletben Y] helyzetben található aminosavban térnek el egymástól A vegyület, amelyben X jelentése Arg és Y jelentése Alá 4188,9 Da moiekulasúlyú és a vegyü35 let, amelyben X jelentése Lys és Y jelentése Phe 4237,4 Da molekulasúlyú. Ezek a vegyületek magas Cys (8), Ser (5), Tyr (4), bázikus elem, mint Arg/Lys (4), Asp (4) tartalmúak és nem található bennük hisztidin, treonin, izoleucin és leucin. A molekulákban ^ISCys-^I9Cys és 40 ^yr-^Tyr dipeptid szekvencia található.

A (Π) képletű polipeptid 36 aminosavat tartalmaz és molekulasúlya 4103,0 Da. A vegyület magas Cys (8) és Tyr (5) tartalmú és nem található benne hisztidin, treonín és izoleucin. A molekulában ¹⁶Cys-¹⁷Cys és ²⁰Tyr45 ^2ITyr szekvencia található.

Atalálmány szerintipolipeptid-vegyületek (a továbbiakban „polipeptid” vagy, mint korábban „curtatoxin I, 2 és 3” néven nevezzük el őket) tiszta állapotban nyerhetők a H. curta méreg viszonylag kis molekulasú50 lyú frakcióiból izolálás és tisztítás után, A polipeptidek szintetizálhatok is rekombinációs DNA-eljárás és ehhez kapcsolt kémiai peptidszintézis alkalmazásával.

Az (0 és (D) képletűpolipeptidek izolálása és tisztítása a H. curta méreg viszonylag kis molekulasúlyú 55 frakcióiból kiindulva az alábbi eljárással történik. A H. curta mérget először reverz fázisú nagynyomású kromatográfia segítségével (HPLC) frakciókra választjuk szét. A 33. (X jelentése Arg és Y jelentése Als, amely curtatoxin I névvel leírt), a 37. (X jelentése Lys és Y 60 jelentése Phe, amely curtatoxin Π névvel jelölt) és a 27.

HU 204283 Β (amely curtatoxin III névvel jelölt) frakciók rendelkeznek jelentőséggel. Ezután minden egyes frakciót anioncserélő kromatográfia és gélszűrés segítségével tisztítunk. A végső tisztítást reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével végezzük és egyetlen szimmetrikus csúcsot tartalmazó frakciókat kapunk, amely azt jelzi, hogy azok homogén proteintartalmúak. Az izolálást és tisztítási eljárásokat a példákban részletesen ismertetjük.

A találmány szerinti vegyületek peptidszintézisét az alábbi általános eljárás szerint végezhetjük.

A találmány szerinti vegyületeket a szokásos peptidszintézis eljárással állíthatjuk elő. Lehetséges, hogy a találmány szerinti egyes vegyületek esetében részleges racemizálódás történik a szintézis során. Azonban a racemizáció mértéke olyan, amennyiben egyáltalán ez tapasztalható, hogy az a kapott vegyület aktivitását nem befolyásolja,

A találmány szerinti vegyületeket a klasszikus, oldatban végzett szintézissel állíthatjuk elő.

Az előállítás magában foglalja az egyes aminosavak vagy peptidfragmensek kapcsolását egyik partner karboxilcsoportjának és a másik partner aminocsoportjának reagáltatásával és amidkötés létrehozásával. Hogy a kapcsolást eredményesen végezhessük, előnyösen a funkciós csoportokat, amelyek közvetlenül nem vesznek részt a kapcsolási reakcióban, előzetesen védőcsoporttal látjuk el. Ezen túlmenően a reakcióban részt vevő karboxilcsoportot előnyösen aktív származékká alakítjuk, amely a jó kapcsolási reakciót biztosítja. Ez megköveteli a gondos reakciósorrend kiválasztását és a reakciókörülmények meghatározásást, valamint a megfelelő védőcsoportok alkalmazását. Valamennyi - a találmány szerinti vegyület előállításában alkalmazott - aminosav és választott védőcsoport és/vagy aktiváló csoport a szakirodalomban ismert.

A találmány szerinti vegyület szintézisének minden lépésében gondosan megválasztott védőcsoportokat alkalmazunk. Ez a védőcsoport-megválasztás biztosítja a szintézis optimális végrehajtását. Más védőcsoportkombinációk is alkalmazhatóak lennének a találmány szerinti vegyület előállítási eljárásában, de kevésbé eredményes szintézist biztosítanának. így például benziloxi-karbonil-csoport, t-butoxi-karbonil-csoport, tamiloxi-karbonil-csoport, p-metoxi-benzüoxi-karbonil-csoport, adamantiloxi-karbonil-csoport és izobomiloxi-karbonil-csoport védőcsoportokat alkalmazhatunk különféle kombinációkban aminocsoport védőcsoportként a találmány szerinti vegyület szintézisében. Ezen túlmenően a tirozilegységben a hidroxilcsoport védőcsoportjaként általában benzilcsoportot alkalmazunk (Bz), bár más védőcsoportok, mint például p-nitrobenzil-csoport (PNB), p-metoxi-benzil-csoport (PMB) és hasonló csoportok ugyancsak alkalmazhatók.

A találmány szerinti vegyület szintézisében alkalmazott karboxilcsoport védőcsoportok jellemzően a szokásos észterképző csoportok például etilcsoport, metilcsoport, benzücsoport, p-nitro-benzü-csoport, p-metoxi-benzil-csoport, 2,2,2-triklór-etü-csoport és hasonló csoportok.

A találmány szerinti vegyületek előállítása során a megfelelően N-védett aminosavegységet vagy peptidfragmenst úgy kapcsoljuk, hogy a másik aminosavvagy peptidfragmens szabad karboxilcsoportjának hidroxilcsoportját előzetesen a kapcsolási reakcióban aktív formára alakítjuk.

Ezt számos szakirodalomban ismert eljárással elvégezhetjük. Például egyik aktiválási eljárásban a karboxilcsoportot vegyes anhidriddé alakítjuk. A szabad karboxücsoportot más savval, jellemzően egy karbonsavszármazékkal, például savkloriddal reagáltatva aktiváljuk. A vegyes anhidridek képzésében alkalmazható savkloridok például az etil-klór-formiát, a fenil-klórformiát, a szek-butil-klór-formiát, az izobutil-klór-formiát, a pivaloil-klorid és hasonlók. Előnyösen alkalmazható az izobutü-klór-formiát.

A találmány szerinti vegyület szintézisében a kapcsolási reakció végrehajtásában alkalmazható más karboxilcsoport aktiválási eljárás, amelynek során aktív észterszármazékot alakítunk ki. Ilyen aktív észter lehet például 2,4,5-triklőr-fenil-észter, pentaklór-fenil-észter, p-nitro-fenil-észter és hasonló észter. Másik lehetséges kapcsolási eljárás a szakirodalomban jól ismert azidkapcsolási eljárás.

A találmány szerinti vegyület szintézisében alkalmazható előnyös kapcsolási eljárás során a karboxilcsoportot Ν,Ν’-diciklohexil-karbodümid segítségével (DCC) aktiváljuk és így biztosítjuk a kapcsolási reakció vegbemenetelét. Ezt az aktiválást egy mólekvivalens DCC alkalmazásával az aminosavra vagy peptidfragmensre vonatkoztatott ekvimoláris 1-hidroxi-benzotirazol (HOBt) jelenlétében végezzük. A HOBt jelenléte kiküszöböli a nem kívánt mellékreakciókat, a részleges racemizálódást is beleértve.

A találmány szerinti vegyület előállítási eljárásában bizonyos szintézisfázisokban a választott védőcsoportok szelektív eltávolítása szükséges. A közönséges peptidszintézisben jártas szakember könnyen ki tudja választani azokat a védőcsoportokat, amelyek megfelelnek a szelektív hasítás körülményeinek és így lehetővé teszik egy vagy több, de nem valamennyi védőcsoport eltávolítását az aminosavakból vagy peptidfragmensekből. Ez az eljárás a szakirodalomban jól ismert. A védőcsoportok szelektív eltávolítására vonatkozó részletes szakirodalom például Schröder és Lübke, The Peptides, I, Academic Press, New York (1965) könyve, különösen ennek 72-75. oldalán található táblázat.

A karboxilcsoport védőcsoportok eltávolítását alkálikus hidrolízissel végezhetjük. Viszonylag erős alkálikus körülményeket jellemzően alkálifém-hidroxidot, mint például nátrium-hidroxidot, kálium-hidroxidot, lítium-hidroxidofés hasonlókat kell alkalmazni, hogy a védett karboxilcsoport észtercsoport-származékát hidrolizáljuk. A hidrolízis reakciókörülményei a szakirodalomban ismertek. Számos karboxilcsoport védőcsoport katalitikus hidrogenolízissel is eltávolítható. Ilyen lehet például az aktív szénre felvitt palládium-katalizátor jelenlétében végzett katalitikus hidrogénezés.

Ezen túlmenően abban az esetben, amikor a karboxilcsoport védőcsoport p-nitro-benzil-csoport vagy

HU 204 283 Β

2,2,2-triklór-etil-csoport a védőcsoport eltávolítását cink és sósav jelenlétében végzett redukcióval végezhetjük.

Számos aminocsoport védőcsoportot úgy távolíthatunk el, hogy a védett aminosavat vagy peptidfragmenst savval, mint például hangyasavval, trifluor-ecetsavval (TFA), p-toluol-szulfonsavval (TSA) benzolszulfonsavval (BSA), naftolszulfonsawal és hasonló savval reagáltatjuk és a megfelelő savaddíciós sót állítjuk elő. Más védőcsoportok úgy távolíthatók el, ahogy a védett aminosavat vagy peptidfragmenst hidrogénbromid és ecetsav keverékével reagáltatjuk, és a megfelelő hidrogén-bromid savaddíciós sót állítjuk elő. Az alkalmazott reakció, illetve reagens kiválasztása a védőcsoport-eltávolítási reakcióban alkalmazott reagensek fizikai és kémiai jellemzőinek függvénye. A kapott savaddíciós sót jobb, gyógyszerészetileg elfogadható sóvá alakíthatjuk egy megfelelő ioncserélő gyanta, mint például DEAE Sephadex A25, Amberlyst A27 és hasonlók alkalmazásával·

A hidroxilcsoport védőcsoportokat a teljes peptidszintézis során megőrizhetjük és csak a legutolsó szintézislépésben az aminocsoport védőcsoporttal együtt távolíthatjuk el. Azonban a karboxilcsoport védőcsoport eltávolítására alkalmazott reakciókörülményektől függően a szintézis során korábbi lépésben is eltávolíthatők. Amennyiben a karboxilcsoport védőcsoportot hidrolízissel távolítjuk el, a hidroxilcsoport védőcsoport a vegyületen marad. Azonban amennyiben a karboxilcsoport védőcsoportot hidrogenolízis segítségével távolítjuk el, abban az esetben a hidroxilcsoport védőcsoport is lehasad. Ez utóbbi eset nem jelent komoly problémát, mert a találmány szerinti vegyületek nem védett tirozilegységek jelenlétében is szintetizálhatok.

Más eljárás ugyancsak lehetséges. Például egy külön előállított terminális tripeptidet, egy külön előállított C-terminális fenilalanin-származékot kapcsolunk, majd a bármely jelen levő védőcsoportot a megfelelő eljárásokkal eltávolítjuk. Más eljárás szerint lépésenként az egyes aminosavegységek egyenkénti sorrendben történő peptidlánchoz kapcsolásával állítjuk elő a kívánt vegyületet a C-terminális egységtől indulva. A fent leírt reakciók alkalmazhatók ebben és más előállítási eljárásokban is.

Ezen túlmenően a találmány szerinti vegyületek rekombinációs DNA-eljárással is előállíthatók.

A találmány szerinti vegyületek elsődleges szerkezete általában az alábbi eljárással határozható meg. A Curatoxin I, H és Hl vegyületek Friedman és munkatársai, J. Bioi. Chem. 245, 3868 (1970) módosított [D. Hawke és P. Yaum, Applied Biosystems Incorporated User Bulletin, No. 28, (1987)] eljárása szerint di-piridil-etilezzük. A di-piridil-etilezett toxinokat (PESTS) mikroborreverz fázisú HPLC segítségével sómentesítjük, majd körülbelül 40 percig végzett gradiens program szerinti elúció után standard automata Edmanlebontást hajtunk végre. A fenil-tio-hidantoin-származékká alakított aminosavakat minden egyes ciklusban on-line irányított PHT-analizátorral gázfázisú, szekvenciát meghatározó berendezéssel analizáljuk.

A peptideket gázfázisú hidrolízissel automintavevő csövekben hidrolizáljuk, amelyeket ezután aminomeghatározó analizátorba viszünk, hogy az elsőrendű és másodrendű aminosavakat meghatározzuk. Kezdet5 ben több nanomól természetes toxint analizáltunk és mindegyik esetben nagy hozamú ΡΗΤ-aminosavat kapunk, amely egyértelműen szolgáltatja a pepiid első 35-37 egységének szerkezetét. A ciszteineket a PESTfehérjék szekvencia-analízisével határozzuk meg. 10 Hogy a karboxil-terminális aminosavat meghatározzuk minden egyes pepiid PEST formáját CNBr-dal lebontjuk és így a 29 helyzetben található metionint hasítjuk. A karboxil-terminális fragmenst mikrobor C-18 reverz fázisú HPLC segítségével tisztítjuk és szekvenciáját 15 meghatározzuk. A hidrolizált pepiid aminosav összetétele megfelel az aminosav-szekvenciából számított értéknek és megerősíti a szerin, mint karboxil-terminális egység jelenlétét. A szerkezet megerősítését FAB-MS analízissel is elvégeztük. A Curtatoxin I és H MH* 20 molekulaion súlya 4188,7 Da, illetve 4237,4 Da, a számított érték ugyanakkor 4189,6 Da, illetve 4237,7 Da. A Curatoxin Hl mért molekulasúlya 4103,0 Da, amely megfelel a karboxiimidált polipeptid aminosav szekvenciájából számított értéknek. A találmány sze25 rinti vegyületek szerkezet-felderítési eljárásait a példákban részletesen bemutatjuk.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk.

A példákban bemutatjuk a találmány szerinti vegyü30 letek izolálásának és analízisének eljárásait.

»

1. példa

A Curtatoxin I, II és III tisztítási eljárása Hololena curta mérget fagyasztva tárolunk és fa35 gyasztva szárító kezdeti lépés nélkül kromatografálunk, például a mérget közvetlenül a HPLC-oszlopra injektálva.

A Curtatoxinok tisztításának ellenőrzésére alkalmazott bíoanalízis az Acheta domestica tücsök bénítási 40 vizsgálat volt A kromatográfía után az oszlopról kapott frakciókat éjjelen át Savant Speed-Vac berendezésben liofilizáljuk, majd a maradékot minimális mennyiségű (normál esetben 100-200 mikroliter) ionmentes vízben oldjuk. A tücsök garatüregébe 2 mikroliter injekciót 45 adunk, majd az állatot műanyag Petri-csészébe helyezzük. A paralitikus anyagot tartalmazó frakciók általában 5-10 percen belül paralizist okoztak, amely 2-3 órán belül teljessé vált. A tücsköket legalább a kővetkező 24 óra során (általában 48 óráig) megfigyeltük, hogy ellenőrizzük a hatás reverzibilitását.

Tisztítás: 1. lépés —

Pharmaci Pép RPC HR 16/10 oszlopot éjjelen át HPLC tisztaságú 0,05% trifluor-ecetsavat (TFA) tartal55 mazó vízzel egyensúlyi helyzetbe hozunk. Aroéreg teljes mennyiségét (0,5 ml) az oszlop ampullájába adagoljuk egy injekciós körön keresztül, amely 2,5 ml/perc adagolási sebességet biztosít. Az oszlopot a fenti áramlási sebességgel 40 ml fenti kiegyenlítő folyadékot alkalmazva 60 mossuk. A méreg alkotórészeit lineáris gradiens elúció

HU 204283 Β segítségével eluáljuk. A gradiens elúciót 60% acetonitriltartalomig végezzük [amely 0,05% trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmaz] és 100 percig 2,5mi/perc áramlási sebességet alkalmazunk. Egy frakciószedő segítségével 5 ml (2 perc) térfogatú frakciókat szedünk, amelyeket liofilizálunk, majd a fentiek szerint biológiai analízisnek vetünk alá. Gyors és gyakorlatilag teljes paralízis tapasztalható a 27., 33. és 37. frakció esetében. Ezeket a frakciókat további tisztítási lépésbe visszük.

Lényegében bármely preparatív reveiz fázisú (C-18) HPLC-oszlop hasonló, sőt esetenként azonos eredményt kell szolgáltasson. A Pharmacia-oszlop töltete 15 mikroliter porózus szilikagél C2/18 volt. Az első lépésben alkalmazott gradiens lassúbb volt, de az alkotóelemek kiváló elválasztását biztosította.

2. lépés: Curtatoxinl (a 3 3. frakcióból)

Bio-Rad mikroanalizátort MA7P + anioncserélő HPLC-oszlopot (4,6*30 cm) 20 mmólos Tris (pH 7,5) pufferrel 0,5 ml/perc áramlási sebesség alkalmazásával kiegyenlítünk. Ilyen izokratikus körülmények között a 33. frakció anyaga nem kötődik az oszlophoz, hanem a kifolyó térfogatban eluálódik. 220 nm-en végzett ellenőrző analízis mellett kézzel frakciókat szedünk. Az inaktív komponensek ebben az eljárásban kissé lassabban mozognak vagy az oszlopon megkötődnek és így jelentős tisztítást lehet elérni.

A mikroanalizátor kissé eltér más anioncserélőktől, mert gömb alakú, hártyaszerű (nem porózus), polimer töltetű (a legtöbb HPLC-oszlopban a mintaoszlop kölcsönhatás a töltőanyag pórusain belül történik). Emiatt a mikroanalizátor viszonylag kis kapacitású és így nagyobb áramlási sebességeket lehet alkalmazni. Az ajánlott áramlási sebesség erre az oszlopra 1,5 ml/perc, de kisebb sebességek is kiváló eredményt szolgáltatnak.

3. lépés: Curtatoxinl

Az előző tisztítási lépésben kapott aktív anyagot előzőleg 50 mmól Na₂SO4/20 mmól Na₂HPO4, pH 6,8 eleggyel kiegyenlített Bio-Rad Bio Sil TSK 250 gélpermeációs oszlopra (300*7,5 mm) visszük és 1,0 ml/perc áramlási sebességet alkalmazunk. 'Ilyen izokratikus körülmények mellett a paralitikus hatással rendelkező anyagot körülbelül 12 ml elúciós térfogatban (Ve) eluáljuk. Számos kisebb szennyezés távolítható el ebben a lépésben.

4. lépés: Curtatoxin I

A Curtatoxin I végső tisztítási lépése az 1. lépésben végzett reverz fázisú oszlopkromatográfia megismétlése. Ebben az esetben azonban az oszlopot 15% acetonitril-víz (0,05% TFA eleggyel 2,5 ml/perc áramlási sebesség) alkalmazásával hozzuk egyensúlyba. A toxin felvitele után az oszlopot a fenti áramlási sebesség alkalmazása mellett 12,5 ml kiegyenlítő folyadékkal mossuk. A Curtatoxin I-et gradiens elúció (35% acetonitril) alkalmazásával 85 percig 2,5 ml/perc áramlási sebességgel eluáljuk. Az elúciós pont körülbelül 26% acetonitril-tartalmú eluens értéknél található.

A tisztított toxint liofilizáljuk és fagyasztva tároljuk az aminosav szekvencia-analízis előtt.

5. lépés: CurtatoxinII(37. frakció azl. lépésből)

A 37. frakciót a 3. lépés eljárása szerint gélpermeábilis oszlopon tisztítjuk azzal az eltéréssel, hogy 0,5 ml/perc áramlási sebességet alkalmazunk. A toxikus komponens körülbelül 16 ml elúciós térfogatnál (Ve) eluálódik.

ő. lépés: Curtatoxin II

Az előző lépésben kapott aktív anyagot a 4. lépés eljárása szerint kromatografáljuk. Az aktív hatóanyag körülbelül 31% acetonitrilnek megfelelő helyzetnél eluálódik.

7. lépés: Curtatoxin III (az 1. lépés 27. frakciója)

A Curtatoxin IH tisztítását a 27. frakció (amelyet 100 mikroliter 0,1% TFA-tartalmú vízben újra oldunk) Aquapore RP-300 mikrobór reverz fázisú oszlopon (2,1*30 mm), egy Applied Biosystems Inc., 130 model protein-peptid elválasztó rendszert alkalmazva, újrakromatografálásával végezzük. Lineáris gradiens eluenst alkalmazunk 100% A puffertől (0,1% TFA vízben), 100% B pufféiig (0,85% TFA és 70% acetonitril vízben) haladva. Az áramlási sebesség 100 ml/perc és az elúciót 150 percig végezzük. A toxint redukció, majd 4-vinil-piridinnel végzett piridil-etilezés után mikrobor reverz fázisú HPLC segítségével is tisztítjuk,

2. példa ' '

Elsődleges szerkezet-meghatározás ηζ

A Curtatoxinokpiridil-etilezése és brómciános' lebontása '

A szekvencia-analízis előtt a tisztított curtatoxinökat

Friedman és munkatársai által kidolgozott (1970) és Hawke és Yuam által módosított (1987) eljárás szerint piridil-etilezzük. Ennek során az egyes curtatoxinok 10 mikrogrammját 44 mikroliter 6 mólos guanidin hidroklorid, 0,25 mólos trisz-HCl, pH 8,5, elegyében oldjuk, majd sorrendben 3 mikroliter 10%-os béta-merkaptoetanollal és 3 mikroliter 4-vinil-piridinnel reagáltatjuk 2 óra időtartamig szobahőmérsékleten. A piridil-etilezett toxinokat mikrobor reverz fázisú HPLC segítségével, Aquapore RP-300 oszlop (2,1*30 nm) alkalmazásával, Applied Biosystems Inc., 130 model proteinpeptid elválasztó rendszeren, sőmentesítjük. Gradiens elúciót alkalmazunk 100% A puffertől (0,1% trifluorecetsav vizes oldata) 100% B pufferig (0,085% trifluor-ecetsav és 70% acetonitril vizes oldata) haladva 150 percig 100 ml/perc elúciós sebességet alkalmazva. A piridil-etilezett póktoxinok körülbelül 40 perc értéknél eluálódnak a gradiens programban, 5-10 perccel előbb, mint a nem módosított fehérjék.

A karboxil-terminális fragmensek előállítása minden egyes PEST I és H 10-10 mikrogrammját 330 mikroliter 70%-os hangyasavban oldjuk. A mintákhoz számos CNBr kristályt adunk, majd nitrogénnel átöblítjük és leforrasztjuk, majd 24 óráig szobahőmérsékleten, sötétben tároljuk. A mintákat centrifugával (Savant) szárítjuk, majd 50 mikroliter 0,1% TFA/H₂O oldószerben

HU 204283 Β újra oldjuk és mikrobór reverz fázisú HPLC segítségével tisztítjuk. Lineáris gradiens elúciót alkalmazunk 100% A pufféitól indulva (0,1% TEA vízben) 100% B pufferig haladva (0,085% TFA és 70% acetonitril vízben). Az elúciót 150 percig végezzük. A PEST IH 5 karboxil terminális fragmenseit 18 mikrogramm toxin tripszines feltárásával állítjuk elő, ahol az enzim:szubsztrát arány 1:50 és a feltárást 20 óráig szobahőmérsékleten végezzük 1% ammónium-hidrogén-karbonát, 9,0 pH-jú pufferben. A peptideket mikrobor re- 10 verz fázisú HPLC segítségével tisztítjuk a fent leírtaknak megfelelően.

Automatikus Edman-lebontást végzünk 470A model protein-peptid szekvencia-meghatározón (Applied Biosystems Inc.) a gyártó által leírt reagensekkel és stan- 15 dard programok alkalmazásával. A fenil-hidantoinszánnazékká alakított aminosavakat az egyes ciklusokban 120 PHT analizátoron (Applied Biosystems Inc.) analizáljuk, amely közvetlenül on-line kapcsolt a 470A gázfázisú szekvencia- meghatározóhoz. 20

Aminosav-analízis

Az aminosav-analízist egy termospré folyadék-kromatográf-tömegspektroszkőp rendszerrel (LC-MS) végeztük, amely egy Hewlett-Packard 5790 tőmegspekt- 25 roszkópiai detektort tartalmaz, amely egy Vestec 101 termospré átviteli egységre épített - ez utóbbi a termospré ionforrást és a kapcsolt vákuumrendszert is tartalmazza. A savasan hidrolizált termékeket fenilizotiocianáttal reagáltatjuk (PITC) és az LC-MS-analí- 30 zis előtt fenil-tiokarbamil (PTC)-aminosavakat képezünk. A kvantitatív eredményeket Hewlett-Packard Aminoquant analizátorral számítottuk, amely kétszeres származékképzést, o-ftálaldehid és 9-fluorenil-metil kémiai származékokat alkalmaz és ennek segítségével 35 határozza meg az első, illetve a másodrendű aminosavakat.

Aminosav szekvencia-analízis

Automata Edman-lebontást végeztünk 470A model 40 protein-peptid szekvencia-analizálón (Applied Biosystems Inc.) a gyártó által leírt reagensekkel és standard eljárások szerint Minden egyes ciklusban a fenil-tiohidantoin-szánnazékká alakított aminosavakat közvetlenül on-line a 470A gázfázisú rendszerhez kapcsolt 45 120 PHT model analizátorral (Applied Biosystems Inc.) analizáljuk.

FAB tömegspektroszkópiai vizsgálata

A molekulasúly-meghatározást ZAB2-SE kétszeres 50 fokuszálásé tömegspektroszkóp segítségével végeztük (VG Analytical Ltd.). A változatlan curtatoxinok EAB analízisét I mikrogramm minta alkalmazásával végeztük, ditío-tretíol, ditio-eritritol és tioglicerin (5:1:6 tömeg/tömeg) 1% TFA-tartalmú mátrixot alkalmaztunk. 55 Az ionizálást konstans mágneses térerő mellett a gyorsító feszültség lineáris pásztázásival idéztük elő. Az intervallumot úgy választottuk meg, hogy az két CsI referenciaiont tartalmazzon, amelyek tömegértékei (4030,0541 és 4289,8640) bezárják azt a tömegterüle- 60 tét, amelybe a curtatoxinok molekulatömege beleesik.

Az adatokat 1000 felbontással MCA adatrendszer üzemmódot alkalmazva nyertük. Az üzemmód során folyamatosan pásztázott adatokat gyűjt a rendszer, majd ezeket ugyanabba az adatbázisba integrálja. Ezt a rendszert alkalmazva a peptid 3 pásztázó mérését integráltuk 3 ezt követő CsI referencia-pásztázás adataival. A toxin tömegét lineáris interpolálással határoztuk meg.

A karboxil-terminális csoportot tartalmazó peptidfragmensek tömegspektrumát konvencionális mágneses pásztázással határoztuk meg. A tömegfelbontás 2000 volt, ami lehetővé tette, hogy az egyes peptidek izotópjait elválasszuk. Az analízis előtt CsI referencia segítségével kalibrálási mérést végeztünk. Ezt követően az analízist 1:1 glicerin/tioglicerin (tömeg/tömeg) -1% TFA mátrixban 17 KeV céziumion-áramot alkalmazva végeztük.

A találmány szerinti vegyületek inszekticidként alkalmazhatók. Általában a polipeptideket legalább 3 mikrogramm/g testtömeg dózisban alkalmazzuk, hogy valamilyen inszekticid hatást fejtsenek ki. Előnyösen legalább körülbelül 9 mikrogiamm/g testtömeg dózist alkalmazunk. A találmány szerinti vegyületek inszekticid hatását ismert és standard eljárásokkal könnyen meghatározhatjuk. Az alábbi eljárásban bemutatjuk a polipeptidek inszekticid hatásának kimutatását.

Acheta domestica fajhoz tartozó tücsköket vagy a teljes pókméreggel vagy annak tisztított frakciójával oltjuk be. Akontrolltücsköket desztillált vízzel oltjuk be. A teljes Hololena curta mérget (50 mg/mg a Bradford/Coomassile Blue próba szerint) ionmentes vízzel keverjük, majd 0,5 mikroliter elegyet (25 mikrogramm protein) injektálunk *a tücsök toroküregébe. Azonnali és irreverzibilis paralízis következik be. Körülbelül 880 mikrogramm curtatoxin Il-ot (37. frakció) oldunk 150 mikroliter ionmentes vízben. 5 tücsök esetében (átlagsúlyuk 0,384 g) 5,86 mikrogramm/mikroliter hígítású elegyet adagoltunk úgy, hogy minden egyes tücsök 2,93 mikrogramm polipeptid injekciót kapjon. Normális mozgásválaszmegszűnést és paralízist észleltünk és mind az öt tücsök az injekció beadásától számítva, 48 órán belül elpusztult, miközben mind az öt kontrollállat életben maradt. Egy másik 1,95 mikrogramm/mikroliter oldatot készítünk és a fentihez hasonló módon 0,98 mikrogramm polipeptidet injektálunk öt tücsökbe (átlagsúlyuk 0,314 g). Az öt tücsökből az injekció beadásától számított 48 órán belül kettő elpusztult, míg az öt kontrollállat normális állapotú maradt. További hígított oldatokat is megvizsgáltunk, de ezek nem okoztak elhalást.

A fenti eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti vegyület(ek) inszekticid hatással rendelkeznek.

A találmány szerinti vegyületek glutamátreceptor és káíciumvezeték antagonista hatással is rendelkeznek és idegi rendellenességek, például görcs, Alzheimer- és Huntington-kór, post celebrális ischaemia (amely agyvérzés után következik be) és hasonlók kezelésére alkalmasak.

HU 204283 Β

A találmány szerinti vegyületek antagonista hatását jól ismert eljárásokkal, mint például L. Vyklicky és munkatársai, Neuroscience Letters, 68, 227-231 (1986) és C. W. Bowers és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 3506-3510 (1987) közleményében leírt eljárásokkal könnyen meghatározhatjuk.

Jellemző esetben a találmány szerinti vegyületeket a kezelést igénylő emlősnek, például embernek olyan hatásos dózisban adagoljuk, amely glutamátreceptor vagy kálciumvezeték antagonista választ vált ki és így alkalmas a fent leírt betegségek kezelésére.

A találmány szerinti polipeptid-vegyületeket szabad sav vagy só formában alkalmazhatjuk. A gyógyszerészetileg elfogadható só kifejezés alatt az (I) általános képletű vegyület szerves vagy szervetlen addíciós sóit értjük, amelyek a betegnek adagolva nem toxikusak és ártalmatlanok, azaz a só jelenléte miatti mellékhatás nem befolyásolja az (I) általános képletú polipeptid előnyös hatását. Ezeket a sókat is beleértjük a találmány tárgykörébe. Ilyen sók lehetnek például ammóniumsók, alkálifémsók, például nátrium- és káliumsók; alkáliföldfémsók, például kalcium- és magnéziumsók; szerves bázisokkal képzett sók, például diciklohexilamin-só, N-metil-D-glükamin-só és aminosavakkal képzett sók, mint például argininnel és lizinnel képzett sók és hasonló sók. Képezhetünk továbbá szervetlen és szerves savakkal sókat, így például előállíthatunk sókat az alábbi savakkal: sósav, hidrogén-bromid, kénsav, salétromsav, kénessav, foszforsav, aszkorbinsav, matánszulfonsav, ecetsav, propionsav, borkősav, citromsav, tejsav, mandulasav, almasav, fahéjsav, palmitinsav, itakonsav, fumársav, benzolszulfonsav és toluolszulfonsav. A nem toxikus fiziológiailag elfogadható sók előnyösek, de más sók előnyösen alkalmazhatók, például izolálás és tisztítás során. .

A sókat a szokásosan alkalmazott eljárásokkal állíthatjuk elő. Például a tennék szabad ionos formáját egy vagy több ekvivalens alkalmas bázissal reagáltatjuk olyan oldószerben, amelyben a só oldhatatlan. A sóképzést végezhetjük olyan oldószerben, például vízben, amely vákuumdesztillációval vagy fagyasztva szárítással eltávolítható. A sóképzést végezhetjük ioncserélő gyanta segítségével, amelynek során egy előállított só kationját más kationra cseréljük.

A beteg, amelyet idegi rendellenesség miatt kezelünk emlős, az embert is beleértve, amely egy adott betegség, rendellenesség vagy sérülés miatt ezt a kezelést igényli. Az aktív hatóanyag, azaz az (I) vagy (H) általános képletú polipeptid betegnek kezelés céljából adagolt dózisa széles határok között változhat, például a kezelés időtartama, a kezelt beteg kora és neme, a kezelt betegség súlyossága, az alkalmazott polipeptid fajtája, más kiegészítő gyógyszeres kezeléssel együttes alkalmazás és hasonlók függvényében.

A találmány szerinti vegyületeket a kezelést igénylő betegnek a megfelelő hatás kiváltásához megfelelő formált alakban adagoljuk. A találmány tárgykörébe tartozik a formált alak előállítása, amely gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot és az (I) általános képletú vegyület hatásos mennyiségét tartalmazza. Gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyag bármely nem toxikus és betegre ártalmatlan hordozóanyag lehet, amely az aktív hatóanyag hatásosságát nem befolyásolja. A vegyület gyógyszerészetileg hatásos mennyisége, amely a kezelt betegséggel szemben eredményes hatást fejt ki. Az (I) és (Π) általános képletú vegyületek gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal alkalmazhatók szokásos egységdózis-formában orális vagy parenterális úton.

A találmány szerinti vegyület előnyös dózisát az orvos határozza meg. A választott dózis a fent leírt körülményektől függően változó, de általában körülbelül 0,01 - körülbelül 10 mg/kg.

A találmány tárgya továbbá eljárás polipeptidet és inért hordozót tartalmazó formált alak előállítása. Ezen formált alakok diagnosztikai célra vagy analitikai referenciaként vagy standardként, valamint inszekticidként alkalmazhatók. A találmány tárgya eljárás formált alak előállítására, amely a találmány szerinti polipeptidet vagy sóját és inért hordozóanyagot tartalmaz. Inért hordozóanyag lehet bármely anyag, amely nem reagál az aktív hatóanyaggal és amely annak tömeget, hordozóközeget biztosít. A vegyület hatásos mennyisége az a mennyiség, amely a fenti felhasználásokban hatásos eredményt ad.

Claims

SZABADALMIIGÉNYPONTOK

1. Eljárás a Hololena curta teljes pókméige 27. frakciójának izolálására, azzal jellemezve, hogy a teljes méreg 0,5 ml-ét Pharmacia Pép RPC HR16/10 HPLC-oszlopra visszük, és 2,5 ml/perc áramlási sebességés 0,05% trifluor-ecetsavat tartalmazó 60% acetonitrilig haladó lineáris gradiens elúció alkalmazásával 100 perc időtartamig 5 ml térfogatú, 2 perces, frakciókat szedve az oszlopról eluálódó 27. frakciót izoláljuk. (Elsőbbsége: 1989.11.29.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az

N-Ter-Ser-Cys-Val-Gly-Gln-Tyr-Gly-Arg-Cys-Arg-Ser-Ala-Tyr-Gln-Asp-Cys-Cys-Asp-Gly-iyr-Tyr-Cys-Asn-Cys-Ser-Gln-Pro-Pro-Tyr-Cys-Leu-Cys-Arg-Asn-Asn-Asn képletú polipeptidet és sóit (Curtatoxin Hl) izoláljuk. (Elsőbbsége: 1989.11.29.)
3. Eljárás a Hololena curta teljes pókmérge 33. frakciójának izolálására, azzal jellemezve, hogy a teljes méreg 0,5 ml-ét Pharmacia Pép RPC HR 16/10 HPLC-oszlopra visszük és 2,5 ml/perc áramlási sebesség és 0,05% trifluor-ecetsavat tartalmazó 60% acetonitrilig haladó lineáris gradiens elúció alkalmazásával, 100 perc időtartamig 5 ml térfogatú, 2 perces, frakciókat szedve az oszlopról eluálódó 33. frakciót izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988.12.23.)
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az

N-Ter-Ala-Asp-Cys-Val-Gly-Asp-Gly-Gln-Arg-Cys-Ala-Asp-Trp-Ala-Gly-Pro-Tyr-Cys-Cys-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Cys-Aig-Ser-Met-Pro-Tyr-Cys-Arg-Cys-Arg-Ser-Asp-Ser

HU 204283 Β képletű polipeptidet és sóit (Curtatoxin I) izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988.12.23.)
5. Eljárás a Hololena curta teljes pókmérge 37. frakciójának izolálására, azzal jellemezve, hogy a teljes méreg 0,5 ml-ét Pharmacia Pép RPC HR 16/10 HPLC-oszIopra visszük, és 2fi ml/perc áramlási sebesség és 0,05% trifluor-ecetsav-tartalmú 60% acetonitrilig haladó lineáris gradiens elúció alkalmazásával 100 perc időtartamig 5 ml térfogatú, 2 perces, frakciókat szedve az oszlopról eluálódó 37. frakciót izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988.12.23.)
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az

N-Ter-Ala-Asp-Cys-Val-Gly-Asp-GIy-Gln-Lys-Cys-Ala-Asp-Trp-Phe-Gly-Pro-Tyr-Cys-Cys-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Cys-Arg-Ser-Met-Pro-Tyr-Cys-Arg-Cys-Arg-Ser-Asp-Ser képletű polipeptidet és sóit (Curtatoxin H) izoláljuk. (Elsőbbsége: 1988.12.23.)
7. Eljárás gyógyszerészeti formált alak előállítására, azzal jellemezve, hogy az (I), (II) vagy (ΠΙ) képletű aktív hatóanyagot gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal elegyítjük. (Elsőbbsége: 1988.12.23.)