CN101233838B - 一种诱导蜘蛛产生抗菌活性物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种简便、高效的诱导蜘蛛产生抗菌活性物质的方法。其步骤为：a、紫外线照射诱导：将角类肥蛛放于培养皿中，于20W紫外灯下距离1米处照射0.5-3h，然后在正常条件下继续饲养；b、将诱导后1-120h的蜘蛛用组织匀浆法提取采集蜘蛛血淋巴，c、以支气管败血博氏菌为指示菌，用涂平板打孔法，测定血淋巴的抗菌活性。经紫外线照射诱导的蜘蛛提取的蜘蛛血淋巴抗菌活性最高，用该抗菌活性物质可以用于抗菌药物的开发。
Description
技术领域：
本发明涉及一种诱导蜘蛛产生抗菌活性物质的方法，属于生物医学领域。
技术背景：
抗生素的大量使用已使不少病原菌产生了抗药性，给一些疾病的治疗带来了困难。昆虫、蜘蛛、虾蟹等节肢动物体抗菌肽对革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌均有高效广谱的杀伤作用，可以杀死已产生耐药性的病原菌突变种，不会诱导抗药菌株的出现。抗菌肽不仅能作用于细菌、病毒以及其他一些原核生物，对肿瘤治疗也能起到一定的作用。抗菌肽极有可能成为抗菌素、抗病毒素以及抗肿瘤药的新来源。
昆虫、蜘蛛、虾蟹等节肢动物体体内的抗菌物质主要是通过各种体外诱导之后，昆虫、蜘蛛、虾蟹等节肢动物体内的一些组织(如脂肪体等)将合成抗菌物质并运输到血淋巴中，从而形成昆虫特有的防御系统。未经体外诱导的节肢动物体内的抗菌肽抗菌活性低、数量少。寻找高效简单的体外诱导及抗菌肽提取方法，使其能从昆虫体内提取更多、抗菌活性更高的抗菌物质，成为技术上亟待解决的问题。
蜘蛛是仅次于昆虫的一大类无脊椎动物，数量多，分布广，能在各种环境中生存，具有很强的抗逆能力。对蜘蛛抗菌物质的研究不仅具有重要的理论意义，而且具有广阔的应用前景。目前，国内外关于蜘蛛抗菌物质的研究报道很少，仅见Acanthoscurria gomesiana(一种捕鸟蛛)抗菌肽的分离、纯化及分子克隆等方面研究。
发明内容
本发明的目的时提出一种简便、高效的诱导蜘蛛产生抗菌活性物质的方法。
本发明是这样实现的，操作过程为：
1、紫外线照射诱导：将角类肥蛛放于培养皿中，于20w紫外灯下距离1米处照射0.5-3h，其中以1-1.5h为最好，然后在正常条件下继续饲养。
2、诱导后蜘蛛的饲养：将经紫外线照射的蜘蛛单头饲养于玻璃指管(长度×直径＝12cm×4cm)内，管底垫有吸足水的海绵供蜘蛛饮水，用棉花塞封口，然后将装有蜘蛛的玻璃指管置于25℃培养箱中，光照周期为12∶12(Light∶Dark)。每2天清洗玻璃指管，并喂以果蝇(Drosophila sp.)和摇蚊(Tendipes sp.)成虫。
3、蜘蛛血淋巴的提取：
采用组织匀浆法：将诱导后的蜘蛛用75％酒精消毒，然后置于冰浴中的1.5ml离心管中，加入预冷的无菌水匀浆(当外界温度较高时，还需加入一些巯基乙醇防止抗菌物质黑化)，匀浆液于4℃、12000rpm离心20分钟，去除上层脂肪，收集上清液置-20℃冰箱保存。
4、从紫外线照射后蜘蛛提取抗菌活性物质的时间
将经紫外线照射诱导的角类肥蛛分别于诱导后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h和120h时，用组织匀浆法采集血淋巴。以支气管败血博氏菌为指示菌，用涂平板打孔法，测定了各个时间角类肥蛛免疫血淋巴的抗菌活性。每处理设10次重复。
用紫外线照射诱导后，蜘蛛免疫血淋巴的抗菌活性上升很快，诱导后25-70h时抗菌活性可达70％，以诱导后60h时抗菌活性最高。随后抑菌活性随时间的增加开始缓慢下降，至120h时，仍然保持一定的抗菌活性。(见表1)
表1经紫外线照射诱导后角类肥蛛血淋巴粗提液的抗菌活性随时间的变化趋势
蜘蛛血淋巴抑菌活性的测定：采用涂平板打孔法。将处于对数生长期的细菌配成106cfu/ml浓度的菌液，用L型玻璃棒均匀涂于平板上，然后在平板上用打孔器呈梅花状打孔，孔径为0.5cm。每孔加血淋巴粗提液15μl。将平板于4℃倒置2h后，于3℃培养16-18h，测量记录抗菌活性。抗菌活性的大小用抑菌圈直径来表示(抑菌圈直径＝总直径-孔的直径)。
采用三种方法(紫外线照射、大肠杆菌注射法和饥饿法)诱导角类肥蛛，然后以涂平板打孔法(Hultmark，1984)测定蜘蛛血淋巴对指示菌的抗菌活性，比较3种诱导方法的效果。
经过诱导的角类肥蛛血淋巴粗提液对支气管败血博氏菌和猪葡萄球菌两种菌的抗菌活性，均显著高于未经诱导的血淋巴粗提液的抗菌活性(表1)。其中，紫外线照射诱导的蜘蛛血淋巴粗提液对支气管败血博氏菌的抑菌效果显著高于注射诱导法，对猪葡萄球菌的效果也大于细菌注射法，但差异没有达到显著水平。在三种诱导方法中，对2种指示菌的抑菌效果均以紫外线照射诱导抑菌圈的直径最大，效果最好。
表1不同方法诱导角类肥蛛血淋巴粗提液的抑菌效果
| 供试细菌 | 诱导方法 | 抑菌圈直径(mm) |
| 支气管败血博氏菌Bordetellabronchiseptica | 紫外线照射细菌注射饥饿无诱导 | 9.01±0.14a8.03±0.19b4.60±0.26c- |
| 供试细菌 | 诱导方法 | 抑菌圈直径(mm) |
| 猪葡萄球菌Staphylococcus hyicus | 紫外线照射细菌注射饥饿无诱导 | 6.08±0.36a5.95±0.16a2.85±0.21b1.25±0.11c |
注：抑菌效果用抑菌圈的直径大小来表示。数据后的不同字母表示P＜0.05(n＝10)水平上有显著差异。“-”表示没有抑菌效果。
与细菌注射法及饥饿法相比，紫外线照射法诱导的免疫血淋巴具有最好的抑菌效果，且操作简单方便，适合大规模诱导，对一些个体较小、不宜进行注射的蜘蛛以及其他小型动物体特别有效，是一种较好的诱导蜘蛛产生抗菌物质的方法。
(细菌注射法：将供试蜘蛛于冰上麻醉后，在超净工作台上用微量进样器于其腹部腹面注射，每蛛注射1μl已制备好的大肠杆菌悬液(浓度为1×106cfu/ml)，后在正常条件下继续饲养。饥饿法：将角类肥蛛饥饿60h后，取血淋巴进行抗菌活性测定。)
紫外线诱导后蜘蛛免疫血淋巴抑菌活性谱的测定
将经紫外线诱导后60h的蜘蛛血淋巴，用涂平板打孔法测定其对支气管败血博氏菌等11种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌效果。每处理设10次重复。结果见表2。
从表2可以看出，蜘蛛经紫外线诱导后，其血淋巴对支气管败血博氏菌、猪葡萄球菌、猪链球菌I型、猪链球菌II型、鸡葡萄球菌、大肠杆菌O78、大肠杆菌O2、大肠杆菌K12、猪霍乱沙门氏菌、鸡沙门氏菌共10种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有明显的抗菌活性。其中，对支气管败血博氏菌、猪葡萄球菌及猪链球菌的抑菌活力最强，对大肠杆菌及其它供试细菌的抑菌活力次之。而末经诱导的蜘蛛血淋巴，没有抗菌活性或者其抗菌活性显著低于经紫外线诱导后的蜘蛛血淋巴。
表2紫外线诱导后角类肥蛛血淋巴粗提液的抗菌谱
| 供试细菌 | 革兰氏阳性细菌/阴细菌 | 经紫外线诱导血淋巴的抑菌圈直径(cm) | 未经紫外线诱导血淋巴的抑菌圈直径(cm) |
| 支气管败血博氏菌Bordetella bronchiseptica猪葡萄球菌Staphylococcus hyicus猪链球菌I型Streptococcus suis I猪链球菌II型Streptococcus suis II鸡葡萄球菌Staphylococcus gallinarum大肠杆菌Escherichia coli O<sub>78</sub>大肠杆菌Escherichia coli O<sub>2</sub>大肠杆菌Escherichia coli K<sub>12</sub>猪沙门氏菌Salmonella choleraesuis鸡沙门氏菌Salmonella gallinarum变形杆菌Proteus vuigaris | G<sup>-</sup>G<sup>+</sup>G<sup>+</sup>G<sup>+</sup>G<sup>+</sup>G<sup>-</sup>G<sup>-</sup>G<sup>-</sup>G<sup>-</sup>G<sup>-</sup>G<sup>-</sup> | 9.01±0.14a<sup>*</sup>6.08±0.36b<sup>*</sup>4.91+0.16c4.86±0.13c3.65±0.14d<sup>*</sup>3.57±0.09d<sup>*</sup>3.13±0.05d<sup>*</sup>3.11±0.18d<sup>*</sup>3.05±0.08de<sup>*</sup>2.33±0.10e<sup>*</sup>- | -1.25±0.11未作对照未作对照1.35±0.251.07±0.091.06±0.101.13±0.111.25±0.211.15±0.12- |
G+表示革兰氏阳性菌，G-表示革兰氏阴性菌。“+”表示有抑菌效果，“-”表示没有抑菌效果。数据后的小写字母不同表示蜘蛛血淋巴对不同细菌的抗菌活性在P＜0.05水平下差异显著，*表示免疫血淋巴与对照对同一细菌抑菌活性在p＜0.05水平下差异显著。
本发明的优点及前景：
本发明比较了紫外线照射、细菌注射法及饥饿法三种诱导蜘蛛产生免疫血淋巴的方法。饥饿法产生的诱导效果明显低于其他两种方法，而使用细菌注射法常常引起蜘蛛局部被微生物感染或体液倒流严重而造成蜘蛛死亡。同时，由于蜘蛛体型较小，采用细菌注射法诱导很麻烦、费时。同细菌注射诱导法比较，本发明诱导效果最好，免疫血淋巴对细菌的抑菌活性最高。同时，因其诱导方法简便、快速、省力，适于一次完成较大量免疫血淋巴的收集，在操作上比细菌注射法大为简化，适合大规模进行诱导，是一种极好的诱导抗菌物质生产方法。
具体实施方式：
实施例1：
1.采集角类肥蛛成蛛90头，分为两组，第一组80头做诱导，第二组10头做对照。将第一组的80头蜘蛛放于培养皿中，于20w紫外灯下距离1米处照射1h(一次可照射50头)，然后在正常条件下继续饲养。第二组的10头蜘蛛不照射，在正常条件下饲喂，作为对照。
2.将经紫外线照射后的80头蜘蛛以及未经诱导的10头蜘蛛单头饲养于玻璃指管(长度×直径＝12cm×4cm)内，管底垫有吸足水的海绵供蜘蛛饮水，用棉花塞封口，然后将装有蜘蛛的玻璃指管置于25℃培养箱中，光照周期为12∶12(Light∶Dark)。每2天清洗玻璃指管，并喂以果蝇(Drosophila sp.)和摇蚊(Tendipes sp.)成虫。
3.分别于诱导后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h和120h时取蜘蛛提取其血淋巴，每个时间取5头蜘蛛。0h的蜘蛛即为对照组蜘蛛。血淋巴的提取采用组织匀浆法：将蜘蛛用75％酒精消毒，然后置于冰浴中的1.5ml离心管中，加入预冷的无菌水匀浆(当外界温度较高时，还需加入一些巯基乙醇防止抗菌物质黑化)，匀浆液于4℃、12000rpm离心20分钟，去除上层脂肪，收集上清液，共收集3200μl，置-20℃冰箱保存，。
4.将处于对数生长期的支气管败血博氏菌配成106cfu/ml浓度的菌液，用L型玻璃棒均匀涂于平板上，然后在平板上用打孔器呈梅花状打孔，孔径为0.5cm。取步骤3中已提取的血淋巴粗提液加样，每孔加15μl。设10次重复。将平板于4℃倒置2h后，于37℃培养16-18h。
5.测量记录抗菌活性。抗菌活性的大小用抑菌圈直径来表示(抑菌圈直径＝总直径-孔的直径)。不同时间提取的血淋巴粗提液的抗菌活性如表3所示，未经诱导的蜘蛛血淋巴粗提液没有抗菌活性，用紫外线照射诱导后，蜘蛛免疫血淋巴的抗菌活性上升很快，以诱导后60h时抗菌活性最高，抑菌圈直径为9.01mm。随后抑菌活性随时间的增加开始缓慢下降，至120h时，仍然保持一定的抗菌活性。因此，蜘蛛血淋巴的提取以诱导后60h为最佳。
表3.经紫外线照射诱导后角类肥蛛血淋巴粗提液不同时间的抗菌活性(抑菌圈直径，mm)
| 时间 | 0h | 2h | 4h | 6h | 8h | 10h | 12h | 24h | 36h | 48h | 60h | 72h | 84h | 96h | 108h | 120h |
| 抑菌圈直径 | 0 | 1.07 | 3.35 | 3.46 | 4.04 | 5.2 | 6.25 | 7.01 | 7.57 | 8.7 | 9.01 | 7.83 | 4.77 | 2.82 | 2.54 | 2.26 |
实施例2：
1.采集大腹园蛛40头，放于培养皿中，于20w紫外灯下距离1米处照射1h。
2.将经紫外线照射后的40头蜘蛛单头饲养于玻璃指管(长度×直径＝12cm×4cm)内，管底垫有吸足水的海绵供蜘蛛饮水，用棉花塞封口，然后将装有蜘蛛的玻璃指管置于25℃培养箱中，光照周期为12∶12(Light∶Dark)。每2天清洗玻璃指管，并喂以果蝇(Drosophilasp.)和摇蚊(Tendipes sp.)成虫。
3.饲养经紫外线照射后的蜘蛛60h后，取蜘蛛提取血淋巴。将蜘蛛用75％酒精消毒，然后置于冰浴中的1.5ml离心管中，加入预冷的无菌水匀浆(当外界温度较高时，还需加入一些巯基乙醇防止抗菌物质黑化)，匀浆液于4℃、12000rpm离心20分钟，去除上层脂肪，收集上清液，共收集2000μl，置-20℃冰箱保存。
4.将处于对数生长期的支气管败血博氏菌、猪葡萄球菌、猪链球菌I型、猪链球菌II型、鸡葡萄球菌、大肠杆菌O78、大肠杆菌O2、大肠杆菌K12、猪霍乱沙门氏菌、鸡沙门氏菌、变形杆菌共11种细菌分别配成106cfu/ml浓度的菌液，用L型玻璃棒分别均匀涂于平板上，然后在平板上用打孔器呈梅花状打孔，孔径为0.5cm。取步骤3已提取的血淋巴粗提液加样，每孔加15μl。设10次重复。将平板于4℃倒置2h后，于37℃培养16-18h。
5.测量记录抗菌活性。抗菌活性的大小用抑菌圈直径来表示(抑菌圈直径＝总直径-孔的直径)。如表2所示，蜘蛛经紫外线诱导后，其血淋巴对支气管败血博氏菌、猪葡萄球菌、猪链球菌I型、猪链球菌II型、鸡葡萄球菌、大肠杆菌O78、大肠杆菌O2、大肠杆菌K12、猪霍乱沙门氏菌、鸡沙门氏菌共10种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有明显的抗菌活性，提示其具有较广的抗菌活性。其中，对支气管败血博氏菌、猪葡萄球菌及猪链球菌的抑菌活力最强，对大肠杆菌及其它供试细菌的抑菌活力次之。而末经诱导的蜘蛛血淋巴，没有抗菌活性或者其抗菌活性显著低于经紫外线诱导后的蜘蛛血淋巴。
实施例3：
1.采集角类肥蛛40头，分为四组，每组10头。前三组分别采用紫外线照射法诱导、细菌注射法诱导、饥饿法诱导，第四组不诱导，做为对照组。
紫外线照射诱导：将10头供试蜘蛛放于培养皿中，于20w紫外灯下距离1米处照射1h，然后在正常条件下继续饲养。
细菌注射法：将10头供试蜘蛛于冰上麻醉后，在超净工作台上用微量进样器于其腹部腹面注射，每蛛注射1μl已制备好的大肠杆菌悬液(浓度为1×106cfu/ml)，后在正常条件下继续饲养。
饥饿法：将10头供试蜘蛛饥饿60h后，取血淋巴进行抗菌活性测定。
2.将经紫外线照射诱导，细菌注射诱导、未经诱导的对照组蜘蛛单头饲养于玻璃指管(长度×直径＝12cm×4cm)内，管底垫有吸足水的海绵供蜘蛛饮水，用棉花塞封口，然后将装有蜘蛛的玻璃指管置于25℃培养箱中，光照周期为12∶12(Light∶Dark)。每2天清洗玻璃指管，并喂以果蝇(Drosophila sp.)和摇蚊(Tendipes sp.)成虫。饥饿法诱导的蜘蛛不喂果蝇和摇蚊，其他条件同前边三组。
3.将诱导后的蜘蛛用75％酒精消毒，然后置于冰浴中的1.5ml离心管中，加入预冷的无菌水匀浆(当外界温度较高时，还需加入一些巯基乙醇防止抗菌物质黑化)，匀浆液于4℃、12000rpm离心20分钟，去除上层脂肪，收集上清液，共收集400μl，置-20℃冰箱保存。
4.将处于对数生长期的支气管败血博氏菌及猪葡萄球菌分别配成106cfu/ml浓度的菌液，用L型玻璃棒均匀涂于平板上，然后在平板上用打孔器呈梅花状打孔，孔径为0.5cm。取已提取的血淋巴粗提液加样，每孔加15μl。设10次重复。将平板于4℃倒置2h后，于37℃培养16-18h。
5.测量记录抗菌活性。抗菌活性的大小用抑菌圈直径来表示(抑菌圈直径＝总直径-孔的直径)。结果如表1所示，经过诱导的角类肥蛛血淋巴粗提液对支气管败血博氏菌和猪葡萄球菌两种菌的抗菌活性，均显著高于未经诱导的血淋巴粗提液的抗菌活性(表1)。其中，紫外线照射诱导的蜘蛛血淋巴粗提液对支气管败血博氏菌的抑菌效果显著高于注射诱导法，对猪葡萄球菌的效果也大于细菌注射法，但差异没有达到显著水平。在三种诱导方法中，对2种指示菌的抑菌效果均以紫外线照射诱导抑菌圈的直径最大，效果最好。
与细菌注射法及饥饿法相比，紫外线照射法诱导的免疫血淋巴具有最好的抑菌效果，且操作简单方便，适合大规模诱导，对一些个体较小、不宜进行注射的蜘蛛如角类肥蛛、卡氏毛园蛛以及其他小型动物体特别有效，是一种很好的抗菌物质诱导方法。
Claims (2)
1.一种诱导蜘蛛产生抗菌活性物质的方法，其特征在于步骤为：
a、紫外线照射诱导：将角类肥蛛放于培养皿中，于20w紫外灯下距离1米处照射0.5-1.5h，然后在正常条件下继续饲养；
b、诱导后蜘蛛的饲养：将经紫外线照射的蜘蛛单头饲养于φ4×12cm玻璃指管内，管底垫有吸足水的海绵供蜘蛛饮水，用棉花塞封口，然后将装有蜘蛛的玻璃指管置于25℃培养箱中，光照周期为12∶12(Light∶Dark)，每2天清洗玻璃指管，并喂以果蝇(Drosophila sp.)和摇蚊(Tendipes sp.)成虫；
c、采用组织匀浆法提取采集蜘蛛血淋巴：
将诱导后1-120h的蜘蛛用75％酒精消毒，然后置于冰浴中的1.5ml离心管中，加入预冷的无菌水匀浆，当外界温度较高时，还需加入1-5％的防止抗菌物质黑化的巯基乙醇，匀浆液于4℃、12000rpm离心20分钟，去除上层脂肪，收集上清液置-20℃冰箱保存；
d、以支气管败血博氏菌为指示菌，用涂平板打孔法，测定血淋巴的抗菌活性。
2.根据权利要求1所述的一种诱导蜘蛛产生抗菌活性物质的方法，其特征在于所述的用组织匀浆法采集蜘蛛血淋巴是将经紫外线照射诱导后25-70h的蜘蛛进行采集。
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