JP2791957B2 - ホロレナ・クルタくも毒液から単離されたポリペプチド類 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ホロレナ・クルタ（Hololena curta）くも
の毒液から単離されるポリペプチド類に関する。

〔従来の技術〕

近年、科学者たちは医学、農学向けに、くも毒液から
新しい化学成分を分離、確認しようとしていた。この分
野での最近の発展についての概観は、エッチ・ジャクソ
ン（H.Jackson）及びピー・エヌ・アール・アシャーウ
ッド（P.N.R.Usherwood）、「興奮性アミノ酸伝達因子
の詳細検討手段としてのくも毒素」TINS11巻６号278−2
83頁（1988年）によって刊行物に提示されている。その
中で、ホロレナ・クルタくも毒素が検討され、このくも
毒液の、不可逆的なグルタメート拮抗剤として活性な成
分が、毒液の5,000ないし10,000 Daの単離されたフラ
クションにあることが報告されている。この毒素が「比
較的大きな、不可逆的なグルタメート拮抗剤の一部類を
代表しているかも知れない」という示唆がなされた（前
掲282頁）。

更に、バワーズ（Bowers）ら、Proc.Natl.Acad.Sci,U
SA 84巻3506−3510頁（1987年）は、H.curta毒素から単
離されたフラクションがジスルフィド結合で結ばれたM_r
7000と9000の２つのサブユニットを含んでいて、各々の
想定サブユニットの一つからなると推定された毒素の推
定M_rが16,000であって、このフラクションが電圧依存性
のシナプス前のカルシウム通路の有力な持続的抑制剤で
あることを明らかにしている。

神経筋伝達物質に影響するこのような化合物類は、て
んかん、低酸素−虚血性神経細胞死、及びハンチントン
病［ジャクソンら、「鳥類蝸牛核における非Ｎ−メチル
−Ｄ−アスパーテート受容体に媒介された伝達へのくも
毒液の影響」興奮性アミノ酸伝達51−54頁（1987年）ア
ラン・Ｒ・リス社］及びアルツハイマー病を含めた幾つ
かの神経系症状の研究と処置用、並びに天然殺虫剤用に
興味ぶかいものがある。

〔課題を解決する手段〕

本発明は、本質的に式Ｉ ［式中ＸはArg又はLysであり、ＹはAla又はPheである
が、但しＸがArgの時には、ＹはAlaでなければならず、
またＸがLysの時には、ＹはPheでなければならない］ 及び式 の、約4,000 Daの38アミノ酸配列からなる、ホロレナ
・クルタ（Hololena curta）くも毒液から単離される
か、又は合成的につくられるポリペプチド類に関する。

本発明はまた、それらの塩類に、またこのポリペプチ
ド類や、ポリペプチド類を含有する組成物類の殺虫剤と
しての使用に関しており、また例えばてんかん、低酸素
−虚血性神経細胞死、及びハンチントン病を含めた幾つ
かの神経性症状の処置法におけるような、グルタメート
拮抗活性やカルシウム拮抗活性が望ましい場合のその他
の応用に関する。

〔課題を解決するための手段〕

本明細書で使用される用語のほとんどは周知であり、
この技術で一般に使用されているもので、以下のものを
説明するために使用されている。

Ala…アラニン Arg…アルギニン Asn…アスパラギン Asp…アスパラギン酸 Cys…システイン Gln…グルタミン Gly…グリシン Leu…ロイシン Lys…リシン Met…メチオニン Phe…フェニルアラニン Pro…プロリン Ser…セリン Tyr…チロシン Val…バリン Ｎ−Ter…Ｎ末端アミノ酸残基 本発明の範囲は配列の関連した３つのポリペプチド類
を包含し、各々ホレロナ・クルタくも毒液から単離され
るか、又は合成的につくられたものである。式Ｉの各ポ
リペプチドは38アミノ酸配列からなり、アミノ酸配列は
９位置（式ＩのＸ）と14位置（式ＩのＹ）でのみ２ポリ
ペプチド間で異なっている。ＸがArgでＹがAlaの場合の
化合物は、4188.9 Daの分子量をもち、ＸがLysで、Ｙ
がPheの場合の化合物は、4237.4 Daの分子量をもってい
る。これらの分子はCys（８）、Ser（５）、Tyr
（４）、Arg/Lys（４）のような塩基性残基、及びAsp
（４）の高含有量をもち、ヒスチジン、スレオニン、イ
ソロイシン、及びロイシンを欠いている。分子はまた、
二つのジペプチド配列¹⁸Cys−¹⁹Cysと²²Tyr−²³Tyrをも
っている。

式IIのポリペプチドは36アミノ酸配列からなり、410
3.0 Daの分子量をもっている。この分子はCys（８）とT
yr（５）の高含有量をもち、ヒスチジン、スレオニン及
びイソロイシンを欠いている。分子はまた、二つのジペ
プチド配列¹⁶Cys−¹⁷Cysと²⁰Tyr−²¹Tyrをもっている。

本発明のポリペプチド化合物類（以下に「ポリペプチ
ド類」と称されるか又は「クルタトキシン1,2及び３」
として説明されるもの）は、ホロレナ・クルタ毒液の比
較的低分子量の選抜されたフラクションの単離と精製に
よって実質的に純粋な形でつくられる。ポリペプチド類
の合成は、組換えDNAの手法を利用しても、更に化学的
ペプチド合成法によっても達成できる。

ホロレナ・クルタ毒液の比較的低分子量のフラクショ
ンからの式Ｉ及びIIポリペプチド類の単離精製は、一般
に以下の手順を用いて実施された。ホロレナ・クルタ原
毒液を初めに逆相高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）
によって分別し、フラクション33（ＸがArg、ＹがAla、
クルタトキシン１として確認されるもの）、37（ＸがLy
s、ＹがPhe、クルタトキシン２として確認されるも
の）、及び27（クルタトキシン３として確認されるも
の）を興味あるものとして確認した。次に、各フラクシ
ョンを陰イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過によ
って更に精製した。最終的な精製は逆相HPLCによって行
ない、均質なタンパク成分を示す各フラクション当たり
単一の対称的ピークを得た。化合物類の単離精製に特定
的な手順は、実施例中に提示されている。

本発明化合物類のペプチド合成は、一般に次の手順に
よって達成できる。

本発明化合物類は、ペプチド合成の定常的方法によっ
てつくられる。本発明化合物類のあるものの合成中に、
部分的ラセミ化が起こることがありうる。しかし、ラセ
ミ化が起こるとしても、その程度は本発明化合物の活性
を著しく変えるほどのものではない。

本発明化合物類は、古典的な液相合成によって合成で
きる。

調製は、アミド結合をつくるために一つのもののカル
ボキシル官能基をもう一つのもののアミノ官能基と反応
させることによって、アミノ酸又はペプチド断片を結合
させるものである。結合を効果的に達成させるために
は、第一に、反応に直接酸化しない反応性の全官能基
を、適当な封鎖基の使用によって不活性化すること、及
び第二に、結合しようとするカルボキシル官能基を適当
に活性化して、結合を進行できるようにすることが望ま
しい。このすべては、反応順序と反応条件の注意ぶかい
選択、並びに所望のペプチド生成物が実現されるように
特定封鎖基の使用を伴う。本発明化合物類をつくるため
に使用され、特定的に選択された保護基、及び／又は活
性化させる官能基をもったアミノ酸類の各々は、ペプチ
ド技術でよく認められた手法によってつくられる。

封鎖基の選ばれた組合わせが、本発明化合物類の全合
成の各時点で使用される。これらの特定的な組合わせ
は、最も順調に機能することがわかった。他の組合わせ
も本発明で化合物類の合成に作動するが、恐らくは成功
の程度が落ちる。従って、例えばベンジロキシカルボニ
ル、ｔ−ブチロキシカルボニル、ｔ−アミロキシカルボ
ニル、ｐ−メトキシベンジロキシカルボニル、アダマン
チロキシカルボニル、及びイソボルニロキシカルボニル
を本発明化合物類の合成にアミノ封鎖基として種々使用
できる。更に、ベンジル（Bzi）は、一般にチロシル残
基用のヒドロキシ保護基として使用されるが、ｐ−ニト
ロベンジル（PNB）、ｐ−メトキシベンジル（PMB）等の
その他のものも、十分に使用できる。

本発明化合物類の調製に使用されるカルボキシル封鎖
基は、例えばメチル、エチル、ベンジル、ｐ−ニトロベ
ンジル、ｐ−メトキシベンジル、2,2,2−トリクロロエ
チル等を含めた典型的なエステル形成基の任意のもので
ありうる。

本発明化合物類の調製で、適当に保護されたＮ−封鎖
アミノ酸又はペプチド断片と、適当に保護されたカルボ
キシ封鎖アミノ酸又はペプチド断片との結合は、アミノ
酸又はペプチド断片の遊離カルボキシル官能基を結合反
応に活性にすることからなる。これは、十分に認められ
た幾つかの手法の任意のものを用いて達成できる。一つ
のこのような活性化手法は、カルボキシル官能基を混合
無水物へ転化させるものである。遊離カルボキシル官能
基は別の酸との、典型的にはその酸の塩化物のようなカ
ルボン酸誘導体との反応によって活性化される。混合無
水物を形成させるのに使用される酸塩化物の例は、クロ
ロ蟻酸エチル、クロロ蟻酸フェニル、クロロ蟻酸第二ニ
ブチル、クロロ蟻酸イソブチル、塩化ピバロイル等であ
る。クロロ蟻酸イソブチルを使用するのが好ましい。

結合反応を実施する目的で、カルボキシル官能基を活
性化するもう一つの方法は、その活性エステル誘導体へ
の転化によるものである。このような活性エステル類
は、例えば2,4,5−トリクロロフェニルエステル、ペン
タクロロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステ
ル等を包含する。利用できるもう一つの結合法は広く認
められたアジド結合法である。

本発明化合物類の調製に好ましい結合法は、N,N′−
ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を用いて遊離
カルボキシル官能基を活性化し、それによって結合を進
めるものである。この活性化及び結合の手法は、アミノ
酸又はペプチド断片に対して同じモル量のDCCを使用し
て実施され、また同じモル量の１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール（HOBt）の存在下に行なわれる。HOBtの存在
は、ラセミ化の可能性を含めた、望ましくない副反応を
抑制する。

選ばれた封鎖基の開裂が、本発明化合物類の調製に使
用される合成順序の特定時点で必要となる。ペプチド合
成技術で通常の熟練をもつ化学者は、生成物の選択的開
裂がアミノ酸又はペプチド断片上に存在する保護基の一
つ以上であるが全部よりは少ない基を除くように実施で
きるという点で適合性のある基を、代表的な保護基から
容易に選択できる。これらの手法は、ペプチド技術にお
いて十分に認められている。選択的開裂に利用できる手
法についてのより完全な議論は、シュローダー（Schrod
er）及びルーブク（Lubke）の文献「ペプチド類」巻
Ｉ、アカデミックプレス社、ニューヨーク州（1965
年）、特にその72−75頁に示された表中に提示されてい
る。

カルボキシル保護基の開裂は、アルカリ鹸化によって
達成できる。典型的には水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、水酸化リチウム等のようなアルカリ金属水酸化物
を使用する比較的強いアルカリ条件が、保護カルボキシ
ルの脱エステル化に一般に使用される。鹸化を達成する
ための反応条件は、この技術で十分に認められている。
カルボキシル封鎖基の多くは、例えば炭素上のパラジウ
ムのような触媒の存在下における水添分解を含めた接触
水添分解によっても除去できる。更に、カルボキシル封
鎖基がｐ−ニトロベンジル又は2,2,2−トリクロロエチ
ルの場合には、脱封鎖は亜鉛と塩酸の存在下の還元によ
って達成できる。

アミノ封鎖基の多くは、それぞれの酸付加塩生成物を
形成させるために保護アミノ酸又はペプチドを蟻酸、ト
リフルオロ酢酸（TFA）、ｐ−トルエンスルホン酸（TS
A）、ベンゼンスルホン酸（BSA）、ナフタリンスルホン
酸等のような酸で処理することによって開裂する。その
他のものの開裂は、保護アミノ酸又はペプチドをHBrと
酢酸の混合物で処理し、対応ハイドロブロマイド酸付加
塩をつくることによって達成できる。使用される適当な
方法又は試薬は、特定の脱封鎖反応に関与する材料の化
学的又は物理的性質に依存しよう。生ずる酸付加塩は、
DEAEセファデックスA25、アンバーライトA27等のような
適当なイオン交換樹脂での処理によって、製薬学的によ
り受入れられる形に転化できる。

ヒドロキシ保護基は、ペプチド調製の進行中にペプチ
ド上に保持しておき、最終合成段階中にアミノ封鎖基の
開裂と連係して除去されるようにできる。しかし、カル
ボキシル封鎖基の除去に使用される条件によっては、調
製順序の早期に除くこともできる。カルボキシル基をア
ルカリ鹸化によって開裂する時は、ヒドロキシ保護基は
保持される。しかし、カルボキシル保護基の除去に接触
水添分解を用いる時は、ヒドロキシ保護基も開裂され
る。後者の状況は重大問題をもたらすことはない。とい
うのは、本発明化合物類の調製は保護されないチロシル
残基の存在下に達成できるためである。

当然ながら、他の順序も利用可能である。一つの方法
は、別個に調製されたＮ−末端トリペプチドを別個に調
製されたＣ−末端フェニルアラニン誘導体と結合させ、
続いて任意の残った封鎖部分を適当に脱封鎖するもので
ある。使用できるもう一つの解決法は、ペプチド鎖の構
築にＣ−末端部分から初めて、１個ずつのアミノ酸を段
階的に順序だてて付加することである。上記のような反
応手法は本調製順序でも、その他の考慮された任意の調
製にも使用される。

更に、本発明化合物類は組換えDNA合成によってつく
ることができる。

一般的に、本発明化合物類の完全な一次構造は、以下
の手順によって決定された。ファイアドマン（Firedma
n）ら、J.Biol.Chem.,245巻3868頁（1970年）の手順
を、ディー・ホーク（D.Hawke）及びピー・ヨーム（P.Y
aum）がApplied Biosystems In corporated User Bulle
tin 28号（1987年）で変更した手順に従って、クルタト
キシンＩ、II及びIIIをピリジルエチル化した。次に、
ピリジルエチル化した毒素（PESTS）をマイクロボア逆
相HPLCによって脱塩し、勾配プログラムへ約40分溶離
後、標準的自動化エドマン解体を行った。フェニルチオ
ヒダントイン誘導体化アミノ酸を各サイクルに気相配列
決定装置と直接オラインさせたPHT分析装置で分析し
た。ペプチドをオートサンプラ管内で気相加水分解によ
って加水分解し、次に一次及び二次アミノ酸の検出のた
め、管をアミノクォント分析装置に移した。初期に天然
毒素の数ナノモルを分析し、各々が高率のPTH−アミノ
酸を与え、最初の35−37残基に対する明確な指定をもた
らした。システインはPESTタンパクの配列分析によって
決定された。カルボキシ末端配列を立証するために、各
ペプチドのPEST型をCNBrで解体させると、29位置でメチ
オニンが開裂した。カルボキシ末端断片はマイクロボア
Ｃ−18逆相HPLCで精製され配列決定された。加水分解さ
れたペプチドのアミノ酸組成は、断片のアミノ酸配列か
ら計算された組成と一致しており、カルボキシ末端セリ
ン残基を確認した。構造の確認はFAB−MS分析で得られ
た。クルタトキシンＩとIIのMH⁺イオン分子量は4188.7
Daと4237.4 Daであり、これに対し計算値は4189.6 Daと
4237.7 Daであった。クルタトキシンIIIの分子量は410
3.0 Daであり、これはカルボキシアミド化ポリペプチド
のアミノ酸配列の分子量から計算されたものと一致して
いた。本発明化合物類の一次構造を決定する特定手順
は、下の実施例に提示されている。

〔実施例〕

以下の特定な実施例は本発明化合物類を獲得し特性化
する方法を例示するために提示されているが、これらは
いかなる形においても本発明の範囲を限定するものと考
えられてはならない。

実施例１ クルタトキシンＩ、II及びIIIの精製手順 ホロレナ・クルタ毒液を冷凍保存し、初期の凍結乾燥
段階なしに、すなわちHPLCカラムへ毒液を直接に注入し
てクロマトグラフィ処理した。

クルタトキシン類の精製を監視するために用いられた
生物検定は、コオロギ（Acheta domestica）のまひであ
った。クロマトグラフィに続いて、カラムフラクション
はSavant Speed−Vacを使用して一夜凍結乾燥させ、残
留物を最少量の蒸留／脱イオン水（通常100−200μｌ）
に溶解した。コオロギの胸郭に２μｌの注入を行ない、
その後コオロギをプラスチック製ペトリ皿内に入れた。
まひ性材料を含有するフラクションは、通常５分ないし
10分以内にまひをもたらし、２−３時間で完了した。原
状復帰について検査するために、少なくとも24時間（通
常48時間）の間、コオロギを監視した。

精製：段階１ ファーマシアPep RPC HR 16/10カラム
を、0.05％TFA（トリフルオロ酢酸）含有のHPLC等級の
水で一夜平衡化した。原毒液0.5mlをカラムバイアルの
注入ループに毎分2.5mlの流量で適用した。カラムを上
の流量の平衡化溶媒40mlで洗った。毎分2.5mlの流量で1
00分にわたり60％アセトニトリル（0.05％TFAを含有）
まで線状勾配操作をして、毒液成分を選択的に溶離し
た。5ml（２分）フラクションを集めるのにフラクショ
ン回収装置を使用し、フラクションを凍結乾燥し、上記
のように生物検定した。急速な、本質的に即時のまひ
が、フラクション27、33及び37から見られた。これらの
フラクションをその後の精製段階に通した。

本質的にどんな分離用逆相（C18）HPLCカラムでも、
同一でなくとも類似の分離を与えるはずである。ファー
マシアカラムを多孔性シリカＣ_2/18（15μｌ）で充填し
た。この第一段階に使用された勾配は緩やかであった
が、毒液成分の優れた分離を生じた。

段階2: タルクトキシンＩ（フラクション33から） バイオラドマイクロアナライザーMA7P⁺陰イオン交換H
PLCカラム（4.6×30mm）を毎分0.5mlの流量の20mMトリ
ス（pH7.5）で平衡化した。このようなイソクラチック
条件下に、フラクション33からのまひ性毒素はカラムに
結合せず、空隙容積中に溶離した。220nmでの吸収を監
視しながら、フラクションを手で集めた。不活性成分は
この手順でやや遅れるか、又はカラムに結合されて、有
意の精製をもたらした。

マイクロアナライザーは、これが球状で薄皮の（非多
孔性）重合体からなる点で、他の陰イオン交換体とやや
異なる（ほとんどのHPLCカラムでは、試料−カラムの相
互作用が充填材料の多孔内部で起こる）。このように、
マイクロアナライザーは比較的低容積をもち、このため
収率が高く、より高い流量を使用できる。このカラムに
勧められる流量は毎分1.5mlであるが、それより低い流
量も優れた結果を与えられた。

段階3: クルタトキシンＩ 先行段階からの活性材料を、50mM Na₂SO₄/20mM Na₂HP
O₄（pH6.8）で予め平衡化したバイオラドBioSil TSK 25
0ゲル透過カラム（300×7.5mm）に毎分1.0mlの流量で適
用した。これらのイソクラチック条件下に、まひ性活性
分は約12mlの溶離容量（Ve）で溶離した。幾分の汚染物
質はこの方法で除去された。

段階4: クルタトキシンＩ クルタトキシンＩの精製の最終段階は、段階１と同じ
カラムで行なわれる別の逆相段階であった。しかし、カ
ラムを毎分2.5mlの流量の水/0.05％TFA中の15％アセト
ニトリルで平衡化した。毒素の適用に続いて、カラムを
上の流量の平衡化溶媒12.5mlで洗った。毎分2.5mlで85
分にわたり35％アセトニトリルまで勾配操作を行なっ
て、クルタトキシンＩを溶離した。溶離位置はほぼ26％
アセトニトリルであった。

精製毒素を凍結乾燥し、その後の配列分析にかける前
に冷凍保存した。

段階5: クルタトキシンII（段階１からのフラクション
37） 段階３について記述されたとおりに、フラクション37
をゲル透過カラムに通したが、但し流量は毎分0.5mlで
あった。毒素成分は約16mlの溶離容量（Ve）で溶離し
た。

段階6: クルタトキシンII 先行段階からの活性材料を、段階４についてまさに記
述されたとおりにクロマトグラフィ処理した。活性材料
は約31％アセトニトリルに相当する位置に溶離した。

段階7: クルタトキシンIII（段階ｑからのフラクショ
ン27） クルタトキシンIIIの精製は、アプライド・バイオシ
ステムズ社のモデル130タンパク−ペプチド分離システ
ムを使用して、アクアポアRP−300マイクロボア逆相カ
ラム（2.1×30mm）上でフラクション27（水中0.1％TFA1
00μｌ中でもどしたもの）の再クロマトグラフィ処理に
よって達成された。勾配は、毎分100μｌの流量で150分
にわたり100％緩衝液Ａ（水中0.1％TFA）から100％緩衝
液Ｂ（水中0.85％TFA及び70％アセトニトリル）まで、
線状であった。毒素は、還元及び４−ビニルピリジンで
のピリジルエチル化後、マイクロボア逆相HPLCによって
も精製された。

実施例２ 一次構造の決定 クルタトキシン類のピリジルエチル化と臭化シアンに
よる解体。配列分析に先立って、ホーク及びユアム（19
87年）によって少量のタンパク用に変更されたフリード
マンら（1970年）の手順に従って、精製クルタトキシン
類をピリジルエチル化した。要約すると、各クルタトキ
シン10μｇを6Mグアニジン−HCl、025Mトリス−HCl（pH
8.5）44μｌ中に溶解し、順次10％β−メルカプトエタ
ノール３μｌ及び４−ビニルピリジン３μｌと室温で２
時間反応させた。次に、ピリジルメチル化された毒素
を、アプライド・バイオシステムズ社のモデル130タン
パク−ペプチド分離システムで、アクアポアRP−300カ
ラム（2.1×30mm）を使用するマイクロボア逆相HPLCに
よって脱塩した。勾配は、毎分100μｌの流量で150分に
わたり100％緩衝液Ａ（水中0.1％トリフルオロ酢酸）か
ら100％緩衝液Ｂ（水中0.085％トリフルオロ酢酸及び70
％アセトニトリル）まで、線状であった。ピリジルエチ
ル化されたくも毒素（PESTS）は、約40分で勾配プログ
ラムに溶離し、未変更タンパクより５−10分早かった。

カルボキシ末端断片をつくるために、各PEST IとII10
μｇを70％蟻酸330μｌに溶解した。CNBrの結晶数個を
試料に加え、次にこれを窒素でフラッシュし、密封して
暗所に室温で24時間置いた。試料をスピードバック遠心
分離器（サバント）で乾燥し、0.1％TFA/H₂O50μｌに再
溶解し、マイクロボア逆相HPLCによって再精製した。勾
配は線状であり、150分にわたり100％緩衝液Ａ（水中0.
1％TFA）から100％緩衝液Ｂ（水中0.085％ TFA及び70
％アセトニトリル）までの範囲にあった。PEST IIIのカ
ルボキシ末端は、1:50の酵素／基質重量比で毒素18μｇ
のトリプシン消化によって発生させた。１％重炭酸アン
モニウム（pH9.0）中で、室温で20時間消化を行なっ
た。ペプチドを上記のように、マイクロボア逆相HPLCで
精製した。

モデル470Aタンパク−ペプチド配列決定装置（アプラ
イド・バイオシステムズ社）で自動化エドマン解体を行
なった。試薬、指示及び標準プログラムはメーカーの提
供によった。470A気相配列決定装置と直接オンラインに
なっているモデル120PTH−分析装置（アプライド・バイ
オシステムス社）で各サイクルにフェニルチオヒダント
イン誘導体化アミノ酸を分析した。

アミノ酸分析−アミノ酸分析による確認は、サーモスプ
レー・イオン源と関連の真空システムからなるヴェステ
ック101サーモスプレー・インターフェースに据え付け
られたヒューレット・パッカード5790質量選択検出器か
らなる専用サーモスプレー液体クロマトグラフィ−質量
スペクトル分析（LC−MS）システムによって行なわれ
た。LC−MS分析に先立って、酸加水分解物をフェニルイ
ソチオシアネート（PITC）と反応させると、フェニルチ
オカルバミル（PTC）アミノ酸が形成された。一次及び
二次アミノ酸の決定のため、ｏ−フタルアルデヒドと９
−フルオレニルメチルクロロフォルメートの二重の誘導
体化化学を使用するヒューレット・バンカード・アミノ
クォント・アナライザーで定量的な結果が得られた。

アミノ酸配列分析−モデル470Aタンパク−ペプチド配列
決定装置（アプライド・バイオシステムズ社）で自動化
エンドマン解体を行なった。試薬、指示及び標準プログ
ラムはメーカーの提供によった。470A気相配列決定装置
と直接オンラインになっているモデル120PTH−アナライ
ザー（アプライド・バイオシステムズ社）で各サイクル
にフェニルチオヒダントイン誘導体化アミノ酸を分析し
た。

FAB質量スペクトル分析−ZAB2−SE二重焦点質量スペク
トル分析計（VGアナリティカル社）を使用して、分子量
測定を行なった。損われていないクルタトキシン類のFA
B分析は、１％TFAを加えたジチオスレイトール、ジチオ
エリスリトール、及びチオグリセロール（5:1:6重量
比）からなる基剤中の適当な毒素１μｇを使用して達成
された。一定磁界強度で加速度ポテンシャルの線走査を
用いてイオン化が得られた。2Csl標準イオンを含むよう
に間隔が選定され、これらのイオンの質量値（4030.054
1及び4289.8640）はクルタトキシン類の分子量領域を包
括していた。データシステムのMCAモードを使用して、1
000の質量分解能でデータを得た。このモードは連続デ
ータの累積走査を集め、それを同じデータファイルに統
合する。この方法を用いて、ペプチドからの３走査をCs
l標準からの３後続走査と統合した。次に、毒素の質量
を直線補間によって決定した。

カルボキシ末端含有ペプチドについて得られた質量ス
ペクトルは、慣用のマグネット電流走査を用いて得られ
た。ペプチドの個々の同位体が分解できるように、2000
の質量分解能を使用した。分析に先立って、Cslを基準
として使用し、質量較正を得た。その後の分析は、１％
TFAを加えたグリセロール／チオグリセロール1:1（w/
w）からなる基剤中で、17KeVセシウムイオンビームを用
いて行なわれた。

本発明化合物類は殺虫剤として有用である。典型的に
は、ポリペプチド類が何らかの殺虫活性を生ずるために
は、体重ｇ当たり少なくとも約３μｇの量で投与でき
る。体重ｇ当たり少なくとも約９μｇの量を使用するの
が好ましい。本発明化合物類の殺虫性状は、標準的な周
知の手順によって容易に決定できる。以下の手順はポリ
ペプチド類の殺虫活性を例証している。

Acheta domestica属／種のコオロギにくも原毒液又は
くも毒液の精製フラクションを注射し、対照コオロギに
は蒸留水のみを注射した。ホロレナ・クルタ毒液（ブラ
ドフォード／クマシーブルー検定で測定されるとおり、
50mg/ml）を脱イオン水とし、0.5μｌ（25μｇタンパ
ク）をコオロギの胸郭に注射すると、直ちに不可逆的な
まひが生じた。クルタトキシンII（フラクション37）約
880μｌを脱イオン水150μｌに溶解した。5.86μg/μｌ
の希釈物を１群５匹のコオロギ（平均重量＝0.384g）に
使用し、ポリペプチド2.93μｇを各コオロギに注射し
た。復元応答の欠如とまひが観察され、注射後48時間に
５匹全部が死んだが、対照の５匹はすべて生きていた。
1.95μg/μｌの第二の溶液を調製し、ポリペプチド0.98
μｇを同じくコオロギ５匹（平均重量＝0.314g）に注射
した。５匹のうち２匹は48時間後に死んだが、対照の５
匹全部は正常であった。更に、希釈溶液を試験したが、
致死性を生じなかった。

上の結果は、本発明化合物類により、有力な殺虫活性
が得られたことを例証している。

本発明化合物類は、けいれん、アルツハイマー病、ハ
ンチントン病、心臓発作を伴う後大脳虚血等を含めた神
経性疾患の処置に有効なグルタメート受容体及びカルシ
ウム通路拮抗剤としても有用である。

これら化合物類の拮抗性状は、エル・ヴィクリッキー
（L.Vyklicky）ら、Neuroscience Letters68巻227−231
頁（1986年）及びシー・ダブリュー・バウアー（C.W.Bo
wers）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 84巻3506−3510頁
（1987年）に記述されたものなど、標準的な周知の手順
によって容易に決定できる。

典型的には、本発明化合物類は治療の必要な哺乳類、
例えばヒトの患者に対して、ゲレタメート受容体及びカ
ルシウム通路の拮抗応答を生ずる有効量で投与される
と、それによって上記症状の治療がもたらされる。

本発明のポリペプチド化合物類は遊離酸型又は塩類と
して使用できる。「製薬学的に受け入れられる塩」とい
う表現は、塩に起因する副作用が式Ｉポリペプチド類の
有益な効果を損わないように、有効活性に矛盾しない濃
度において患者に比較的無毒無害であるような、式Ｉ化
合物類の任意の有機又は無機酸付加塩を意味する。これ
らの塩類は本発明の範囲に包含される。このような塩類
は、アンモニウム塩；ナトリウムとカリウム塩のような
アルカリ金属塩；カルシウムとマグネシウム塩のような
アルカリ土類金属塩；例えばジシクロヘキシルアミン
塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンのような有機塩基との
塩類、及びアルギニンとリシンのようなアミン酸類との
塩を包含する。また例えば、次の酸類：塩酸、臭化水素
酸、硫酸、燐酸、硝酸、アスコルビン酸、メタンスルホ
ン酸、酢酸、ブロピオン酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、
リンゴ酸、マンデリン酸、桂皮酸、パルミチン酸、イタ
コン酸、フマール酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエ
ンスルホン酸のような有機及び無機酸類との塩も調製で
きる。製薬学的に受け入れられる無毒性の塩類が好まし
いが、生成物の単離精製用にその他の塩類も有用であ
る。

塩にとって不溶性の溶媒又は媒体中で、又は真空中な
いし凍結乾燥で除去できる水のような溶媒中で、遊離酸
型の生成物を１当量以上の適当な塩基と反応させるか、
又は既存塩の陽イオンと別の陽イオンとを適当なイオン
交換樹脂上で交換することによって、慣用手段によって
塩を形成することができる。

神経系疾患の治療のためには、患者とは、特定症状、
損傷、又は疾病のため治療を必要とするヒトを含めた哺
乳類である。神経系疾患の治療のために患者に投与され
る活性成分（すなわち式Ｉ又はIIのポリペプチド）の量
は、使用の特定適量単位、処置期間、処置を受ける患者
の年齢性別、及び処置される症状の程度、使用ポリペプ
チド、他薬剤での同時処置を利用するかどうか等の考慮
に従って広く変わりうる。

本発明のポリペプチド類は、適当に処方された製剤組
成物の形で必要な患者へ投与することによって、所望の
薬理学的効果を達成するために利用できる。従って、本
発明は製薬学的に受け入れられる担体と、製薬学的有効
量の式Ｉ化合物とを含めてなる製剤組成物を包含する。
製薬学的に受け入れられる担体は、担体に起因する副作
用が活性成分の有益な効果を損わないように、有効活性
に矛盾しない濃度において患者に比較的無毒無害である
ような任意の担体である。化合物の製薬学的有効量は、
処置される特定症状に対して結果をもたらすか、或いは
影響を現わすような量である。式Ｉ及び式II化合物類
は、経口又は非経口投与用に慣用の適量単位形式を用い
て、製薬学的に受け入れられる担体と一緒に投与でき
る。

医師は最も適した本発明化合物類の特定適量を決定し
よう。選ばれた適量は、上に述べた要因によって変わる
であろうが、典型的には約0.01ないし約10mg/kgの範囲
にあろう。

本発明はまた、ポリペプチドと不活性担体を含有する
組成物類を包括する。このような組成物類は診断用途
に、又は分析標準又は基準として、並びに殺虫用途に使
用できる。従って、本発明は不活性担体と、本発明のポ
リペプチド又はその塩とを含めてなる組成物類を包含す
る。不活性担体は、運搬される化合物と相互に作用せ
ず、運搬化合物に指示、運搬手段、かさ、追跡材料を与
えるような任意の材料である。化合物の有効量は、記述
された用途のために望ましい方法で実施でき、結果を与
えるか、又は特定実施手順に影響を与えるような量であ
る。

本明細書に説明されたとおりの本発明の精神又は範囲
から逸脱せずに、本発明に対して変化と変更をなしうる
ことは、当業者に認められよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/435,1/14 A01N 63/00 A61K 37/02,35/64 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式 Ｎ−Ter−A₁−Cys−Val−Gly−A₂
   −Gly−A₃−Cys−A₄−Cys−Cys−A₅−Gly−Tyr−Tyr−C
   ys−A₆−Cys−A₇−Pro−Tyr−Cys−A₈−Cys−Arg−A₉ 〔式中、A₁は−Ala−Asp−であり、A₂は−Asp−であ
   り、A₃は−Gln−Ｘ−（ＸはArg又はLysである）であ
   り、A₄は−Ala−Asp−Trp−Ｙ−Gly−Pro−Tyr−（Ｙは
   Ala又はPheである）であり、A₅は−Ser−であり、A₆は
   −Ser−であり、A₇は−Arg−Ser−Met−であり、A₈は−
   Arg−であり、A₉は−Ser−Asp−Serであって、但しＸが
   Argの時には、ＹはAlaでなければならず、またＸがLys
   の時には、ＹはPheでなければならないことを条件とす
   るか、又は、 A₁は−Ser−であり、A₂は−Gln−Tyr−であり、A₃は−A
   rg−であり、A₄は−Arg−Ser−Ala−Tyr−Gln−Asp−で
   あり、A₅は−Asp−であり、A₆は−Asn−であり、A₇は−
   Ser−Gln−Pro−であり、A₈は−Leu−であり、A₉は−As
   n−Asn−Asn−である。〕の化合物又はその塩類。
2. 【請求項２】式Ｉ Ｎ−Ter−Ala−Asp−Cys−Val−Gly−Asp−Gly−Gln−
   Ｘ−Cys−Ala−Asp−Trp−Ｙ−Gly−Pro−Tyr−Cys−Cy
   s−Ser−Gly−Tyr−Tyr−Cys−Ser−Cys−Arg−Ser−Me
   t−Pro−Tyr−Cys−Arg−Cys−Arg−Ser−Asp−Ser ［式中ＸはArg又はLysであり、ＹはAla又はPheである
   が、但しＸがArgの時には、ＹはAlaでなければならず、
   またＸがLysの時には、ＹはPheでなければならないこと
   を条件とする］のポリペプチド又はその塩類である請求
   項１に記載の化合物。
3. 【請求項３】式 Ｎ−Ter−Ala−Asp−Cys−Val−Gly−Asp−Gly−Gln−A
   rg−Cys−Ala−Asp−Trp−Ala−Gly−Pro−Tyr−Cys−C
   ys−Ser−Gly−Tyr−Tyr−Cys−Ser−Cys−Arg−Ser−M
   et−Pro−Tyr−Cys−Arg−Cys−Arg−Ser−Asp−Ser
   （タルクトキシンＩ）の特許請求の範囲第２項によるポ
   リペプチド。
4. 【請求項４】式 Ｎ−Ter−Ala−Asp−Cys−Val−Gly−Asp−Gly−Gln−L
   ys−Cys−Ala−Asp−Trp−Phe−Gly−Pro−Tyr−Cys−C
   ys−Ser−Gly−Tyr−Tyr−Cys−Ser−Cys−Arg−Ser−M
   et−Pro−Tyr−Cys−Arg−Cys−Arg−Ser−Asp−Ser
   （クルタトキシンII）の特許請求の範囲第２項によるポ
   リペプチド。
5. 【請求項５】特許請求の範囲第２項のポリペプチドの殺
   虫量に昆虫を接触させることを含めてなる、昆虫防除
   法。
6. 【請求項６】ポリペプチドが特許請求の範囲第３項又は
   第４項のとおりである、特許請求の範囲第５項の方法。
7. 【請求項７】不活性担体と組合わせた特許請求の範囲第
   ２項のポリペプチドの有効量を含めてなる昆虫防除組成
   物。
8. 【請求項８】式 Ｎ−Ter−Ser−Cys−Val−Gly−Gln−
   Tyr−Gly−Arg−Cys−Arg−Ser−Ala−Tyr−Gln−Asp−
   Cys−Cys−Asp−Gly−Tyr−Tyr−Cys−Asn−Cys−Ser−
   Gln−Pro−Pro−Tyr−Cys−Leu−Cys−Arg−Asn−Asn−
   Asnのポリペプチド、及びその塩類である請求項１に記
   載の化合物。
9. 【請求項９】特許請求の範囲第８項のポリペプチドの殺
   虫量に昆虫を接触させることを含めてなる、昆虫防除
   法。
10. 【請求項１０】不活性担体と組合わせた特許請求の範囲
    第８項のポリペプチドの有効量を含めてなる昆虫防除組
    成物。
11. 【請求項１１】ホロレナ・クルタくもの原毒液0.5mlを
    毎分2.5mlの流量でファーマシアPep RPC HR 16/10 HPLC
    カラムに適用し、毎分2.5mlの流量で100分間にわたり、
    0.05％TFAを含有する60％アセトニトリルまで線形勾配
    操作をし、5ml2分間のフラクションを集め、カラムから
    溶離する27番目のフラクションを選択的に単離すること
    を含めてなる、式 Ｎ−Ter−Ser−Cys−Val−Gly−Gln
    −Tyr−Gly−Arg−Cys−Arg−Ser−Ala−Tyr−Gln−Asp
    −Cys−Cys−Asp−Gly−Tyr−Tyr−Cys−Asn−Cys−Ser
    −Gln−Pro−Pro−Tyr−Cys−Leu−Cys−Arg−Asn−Asn
    −Asn（クルタトキシンIII）のポリペプチド、及びその
    塩類を単離する方法。
12. 【請求項１２】ホロレナ・クルタくもの原毒液0.5mlを
    毎分2.5mlの流量でファーマシアPep RPC HR 16/10 HPLC
    カラムに適用し、毎分2.5mlの流量で100分間にわたり、
    0.05％TFAを含有する60％アセトニトリルまで線形勾配
    操作をし、5ml2分間のフラクションを集め、カラムから
    溶離する33番目のフラクションを選択的に単離すること
    を含めてなる、式 Ｎ−Ter−Ala−Asp−Cys−Val−Gly
    −Asp−Gly−Gln−Arg−Cys−Ala−Asp−Trp−Ala−Gly
    −Pro−Tyr−Cys−Cys−Ser−Gly−Tyr−Tyr−Cys−Ser
    −Cys−Arg−Ser−Met−Pro−Tyr−Cys−Arg−Cys−Arg
    −Ser−Asp−Ser（クルタトキシンＩ）のポリペプチド
    を単離する方法。
13. 【請求項１３】ホロレナ・クルタくもの原毒液0.5mlを
    毎分2.5mlの流量でファーマシアPep RPC HR 16/10 HPLC
    カラムに適用し、毎分2.5mlの流量で100分間にわたり、
    0.05％TFAを含有する60％アセトニトリルまで線形勾配
    操作をし、5ml2分間のフラクションを集め、カラムから
    溶離する37番目のフラクションを選択的に単離すること
    を含めてなる、式 Ｎ−Ter−Ala−Asp−Cys−Val−Gly
    −Asp−Gly−Gln−Lys−Cys−Ala−Asp−Trp−Phe−Gly
    −Pro−Tyr−Cys−Cys−Ser−Gly−Tyr−Tyr−Cys−Ser
    −Cys−Arg−Ser−Met−Pro−Tyr−Cys−Arg−Cys−Arg
    −Ser−Asp−Ser（クルタトキシンII）のポリペプチド
    を単離する方法。