CN110241094B

CN110241094B - 一种偶氮还原酶及其应用

Info

Publication number: CN110241094B
Application number: CN201910433456.XA
Authority: CN
Inventors: 王宜冰; 董浩; 王平; 郭钿媛; 张文学
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2039-05-23
Also published as: CN110241094A

Abstract

本发明提供一种偶氮还原酶AzoRed2及其应用，所述偶氮还原酶包含有：1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；或者，2)在1)中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的，具有1)中偶氮还原酶功能的酶。本发明提供一种新型偶氮还原酶，以及利用该偶氮还原酶的水解活性高效催化偶氮染料的降解。共表达偶氮还原酶和葡萄糖脱氢酶的全细胞催化剂可催化甲基红染料的降解，通过耦合葡萄糖脱氢酶实现辅酶再生过程，甲基红浓度为250μM时，2小时溶液的脱色率可达99％以上，且该全细胞催化剂重复使用三次后，2h溶液的脱色率仍可达97.91％，体现了该催化剂在偶氮染料降解中的潜力。

Description

一种偶氮还原酶及其应用

技术领域

本发明涉及功能酶筛选技术领域，尤其涉及一种偶氮还原酶AzoRed2及其应用。

背景技术

染料是指在有机介质或水溶液中，能够使纤维等物质着色的一种有机化合物。随着纺织业及印刷等产业的迅速发展，全球范围内对染料的需求逐年攀升。截止到2012年，全球共有约1万种纺织染料，且年产量超过了70万吨，在常用的染料中，偶氮类染料为产量最大的一种，约占染料总产量的70％。偶氮染料是指具有一个或多个偶氮键(-N＝N-)的染料，被广泛应用于纺织、化妆品、塑料、食品及医药等行业。但染料的使用过程中，不可避免地存在染料流失的现象，这与生产工艺及染料的种类等有关。流失的偶氮染料进入水体后，会严重影响水体的透光率，这不仅会影响水体中动植物的生长，破坏生态环境，而且偶氮染料通过食物链的积累，最终会影响人体的身体健康。因此，对废水中偶氮染料的处理至关重要。目前偶氮染料处理的方法包括三种，即物理法(吸附、膜分离、磁珠分离、沉淀、过滤等)、化学法(氧化法、电化学法、絮凝法等)和生物法(微生物降解、酶催化降解)，相对于物理法和化学法来说，生物法处理偶氮染料具有环境友好、成本低、操作简单及不会产生二次污染等优势，是一种值得进一步探索和发展的方法。

在微生物处理偶氮染料的脱色过程中，偶氮还原酶占据着重要的地位。偶氮还原酶是一种以辅酶作为电子供体，以偶氮染料作为电子受体，可催化偶氮染料中偶氮键断裂的一种氧化还原蛋白，其广泛存在于动植物及微生物中。根据偶氮还原酶结构中是否需要核黄素作为辅基，可以将偶氮还原酶分为两大类，一类是核黄素依赖型偶氮还原酶，一类是非核黄素依赖型偶氮还原酶。目前存在的偶氮还原酶仍存在着处理量小、稳定性差等问题，因此，开发新型的偶氮还原酶应用于废水中偶氮染料的降解，至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型偶氮还原酶，以及利用该偶氮还原酶的水解活性高效催化偶氮染料的降解，从而弥补现有技术的不足。

本发明的第一个目的在于，提供一种偶氮还原酶。

本发明的第二个目的在于，提供一种偶氮还原酶基因。

本发明的第三个目的在于，提供一种表达偶氮还原酶基因的重组质粒。

本发明的第四个目的在于，提供一种重组宿主微生物。

本发明的第五个目的在于，提供偶氮还原酶的应用。

为了实现本发明第一个目的，本发明提供了一种偶氮还原酶(AzoRed2)，其特征在于，所述的偶氮还原酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；或者，

2)在1)中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的，具有1)中偶氮还原酶功能的酶。

为了实现本发明第二个目的，本发明提供了一种偶氮还原酶基因(azored2)，其特征在于，所述的基因可编码上述偶氮还原酶。

作为一个优选方案，所述基因的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

为了实现本发明第三个目的，本发明提供了一种表达偶氮还原酶基因的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒表达上述偶氮还原酶基因。

作为一个优选方案，所述重组质粒的表达载体为pET28a(+)，pET32a(+)，pET21a(+)或pLLP-OmpA中的一种。

作为一个优选方案，所述重组质粒共表达葡萄糖脱氢酶基因。

所述重组质粒优选为pET28a-azored2或者pET28a-azored2-gdh。

为了实现本发明第四个目的，本发明提供了一种重组宿主微生物，其特征在于，所述重组宿主微生物转化或转染有上述的重组质粒。

作为一个优选方案，所述宿主微生物为BL21(DE3，BL21(DE3)plysS或Top10f’。

所述重组宿主微生物优选为BL21(DE3)-pET28a-azored2或者BL21(DE3)-pET28a-azored2-gdh。

为了实现本发明第五个目的，本发明提供了偶氮还原酶在偶氮染料降解中的应用。

本发明提供了所述重组宿主微生物在偶氮染料降解中的应用。

在利用共表达偶氮还原酶AzoRed2和葡萄糖脱氢酶GDH的全细胞(重组宿主微生物BL21(DE3)-pET28a-azored2-gdh)作催化剂进行偶氮染料的降解中，水解反应不外源添加辅酶NAD(P)⁺或NAD(P)H；水解反应添加葡萄糖作为氢供体，另外的，该全细胞催化剂可重复使用。

本发明的优点在于，本发明提供一种新型偶氮还原酶，以及利用该偶氮还原酶的水解活性高效催化偶氮染料的降解。共表达偶氮还原酶和葡萄糖脱氢酶的全细胞催化剂可催化甲基红染料的降解，通过耦合葡萄糖脱氢酶实现辅酶再生过程，甲基红浓度为250μM时，2小时溶液的脱色率(即甲基红的水解率)可达99％以上，且该全细胞催化剂重复使用三次后，2h溶液的脱色率仍可达97.91％，体现了该催化剂在偶氮染料降解中的潜力。

附图说明

图1：本发明的偶氮还原酶AzoRed2进化树及多重序列比对示意图。

图2：本发明的偶氮还原酶AzoRed2的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道1是表达后菌体破碎液上清，泳道2是表达后菌体破碎液沉淀，泳道3是纯化后的AzoRed2蛋白。

图3：本发明的偶氮还原酶AzoRed2辅基的验证。

图4：本发明的偶氮还原酶AzoRed2酶学性质研究。图a是AzoRed2最适温度及热稳定性，图b是AzoRed2最适pH，图c是AzoRed2的pH稳定性，图d是AzoRed2的底物谱。

图5：本发明的偶氮还原酶AzoRed2和葡萄糖脱氢酶GDH共表达的SDS-PAGE电泳图。泳道1是共表达后菌体破碎液上清，泳道2是共表达后菌体破碎液沉淀。

图6：本发明共表达AzoRed2和GDH的全细胞催化剂降解甲基红条件的优化。图a是NAD⁺添加量对脱色效率的影响，图b是全细胞催化剂添加量对脱色效率的影响，图c是葡萄糖添加量对脱色效率的影响，图d是甲基红浓度对脱色效率的影响。

图7：本发明共表达AzoRed2和GDH的全细胞催化剂批次化脱色效果。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

实施例1：偶氮还原酶AzoRed2基因序列分析

偶氮还原酶AzoRed2的家族分类，使用文献已报道的方法来进行，使用MEGA6.0软件构建AzoRed2与其他家族偶氮还原酶的进化树，Clustal X软件用于对偶氮还原酶间进行多序列比对，使用ESPript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)对比对序列进行输出。如图1a所示，AzoRed2属于偶氮还原酶中依赖FMN的NADH偏好型偶氮还原酶，且与同家族的偶氮还原酶序列相比，AzoRed2在FMN结合域位点具有高度的相似度，但在NAD(P)H结合位点处的相似度较低(图1b)。该酶与GenBank中已报道蛋白的氨基酸相似度最高仅为77.1％(Streptomyces sp.XY431)。

实施例2：新型偶氮还原酶AzoRed2的异源表达

根据基因组挖掘得到的偶氮还原酶基因azored2的基因序列，设计全长引物，并以Streptomyces sp.的基因组DNA为模板，进行目的片段PCR。得到的目的片段和表达载体pET28a(+)进行EcoRI和HindIII双酶切线性化后，进行连接。待重组质粒pET28a-azored2测序验证正确后，导入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组表达菌株37℃培养过夜后，接种到100mL含有Kan(终浓度50μg/mL)的LB液体培养基中，待OD600达到0.5-0.8时，添加终浓度为100μM的IPTG，并置于20℃摇床中180rpm下震荡培养20h。

实施例3：偶氮还原酶AzoRed2的纯化

对偶氮还原酶AzoRed2进行诱导发酵，发酵结束后，离心收集菌体，并使用无菌的0.9％NaCl溶液清洗菌体。收集后的菌体重悬于pH 7.4的PBS缓冲液中，并置于冰浴下进行超声破碎。破碎后的溶液使用高速冷冻离心机进行固液分离，离心上清用于偶氮还原酶的纯化研究。纯化过程使用含不同浓度咪唑(20mM-500mM)的PBS缓冲液进行梯度洗脱，洗脱溶液分别进行收集，并使用超滤浓缩管(～3kDa)进行脱盐处理，脱盐浓缩后的蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳检测及偶氮还原酶活性检测。上述偶氮还原酶AzoRed2的蛋白凝胶电泳结果如图2所示，泳道1是菌体破碎液上清，泳道2是菌体破碎液沉淀，泳道3是纯化后的偶氮还原酶AzoRed2，可以看出偶氮还原酶基因使用pET28a(+)载体较好的进行可溶表达，并且经镍柱处理后，蛋白纯度较高。偶氮还原酶活性检测研究，确定AzoRed2对甲基红具有降解活性。

实施例4：偶氮还原酶AzoRed2酶学性质研究

经实施例3纯化后的偶氮还原酶AzoRed2，用作酶学性质研究。

初始酶反应体系(2mL)：甲基红25μM，NADH-Na₂ 250μM，FMN 5μM，pH 7.0磷酸钠缓冲液。上述反应体系置于37℃下孵育反应5min后，添加1％的SDS终止反应，根据溶液中甲基红的减少量来确定偶氮还原酶活性，1min内降解1μmol的甲基红所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。

(1)辅基依赖型的鉴定

将纯化后的AzoRed2作为对照组，1％SDS处理后的AzoRed2酶液为实验组，使用紫外分光光度计对其进行全波长扫描(300nm-550nm)，结果如图3所示。经过SDS处理后，最大吸收峰从463nm偏移到448nm，这与已报道的数据吻合，这是由于辅基FMN从蛋白结构中解离出来导致的，结合文献报道，确定AzoRed2为FMN依赖型偶氮还原酶。

(2)辅酶偏好性的测定

该过程在初始反应条件下，以辅酶作为唯一变量研究AzoRed2的辅酶偏好性，结果显示AzoRed2能利用NADH和NADPH作辅酶进行水解反应，且两者酶活无明显差异(结果未显示)，但进化树分析结果显示AzoRed2为依赖FMN的NADH偏好型偶氮还原酶，故猜测AzoRed2可能为偶氮还原酶分类中的一个新家族。

(3)最适温度和热稳定性研究

初始反应体系下，以温度作为唯一变量，研究不同温度(25-70℃)对AzoRed2催化活性的影响，图4a结果显示AzoRed2的最适反应温度为55℃。热稳定性研究是将AzoRed2酶液置于不同温度(25-70℃)下孵育1h后，检测剩余活性，图4a显示AzoRed2在25℃和30℃下孵育后，活性无变化，在温度高于50℃环境下孵育1h后，AzoRed2活性完全丧失。

(4)最适反应pH和pH稳定性研究

初始反应体系下，将pH作为唯一变量，研究pH对AzoRed2催化活性的影响，如图4b所示，AzoRed2在pH 5.0的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液中具有最高活性，pH 5.0为pH 5.0最适反应pH。

通过将AzoRed2置于不同pH(4.0-9.0)的缓冲液中进行孵育，定时取样检测剩余活性，研究AzoRed2的pH稳定性。结果如图4c所示，AzoRed2在pH 6.0-9.0的缓冲液中具有较好的稳定性，在pH 4.0和5.0的缓冲液中稳定性较差。

(5)底物特异性研究

初始反应条件下，以底物作为唯一变量，研究AzoRed2对不同底物(刚果红、甲基橙、台盼蓝、苏丹黑B、直接黑38、甲基红)的催化活性。如图4d所示，AzoRed2对甲基红的催化活性最高，对甲基橙的活性次之，AzoRed2对刚果红无催化活性。

(6)洗涤剂的影响

初始反应条件下，研究不同洗涤剂(Tween 20、Tween 80、Triton X-100、SDS)在不同浓度(0.5％和1.0％)下对酶催化活性的影响，结果显示研究的洗涤剂对AzoRed2的活性都有抑制效果，其中0.5％和1.0％的SDS使AzoRed2活性丧失。

^aND，无活性

(7)金属离子的影响

初始反应条件下，通过添加不同的浓度(1mM和10mM)的金属离子研究其对AzoRed2催化活性的影响，结果显示所研究的金属离子对AzoRed2的活性无明显的提高作用，Cu²⁺对AzoRed2活性的抑制效果最强，高浓度的Fe²⁺对AzoRed2的活性也有很高的抑制效果。

(8)有机溶剂的影响

将AzoRed2母液置于不同浓度(10％和20％)的有机溶剂中，30℃下震荡孵育1h后测剩余活力，研究有机溶剂对AzoRed2活性的影响。结果显示10％浓度下正己烷对AzoRed2酶活性有轻微的提高作用，其他有机溶剂都有不同程度的抑制效果；20％浓度下，DMSO和甲醇对AzoRed2活性无影响，乙醇和异丙醇对AzoRed2酶活有轻微的促进作用，乙腈、正丁醇、异戊醇和氯仿在10％或20％浓度下都对AzoRed2活性有明显的抑制作用。

实施例5：偶氮还原酶AzoRed2氨基酸突变研究

在实施例1-4的基础上，研究氨基酸突变对AzoRed2活性的影响，选择Ser₁₀，Arg₂₆，Pro₄₈，Leu₉₃，His₁₆₉，Thr₂₁₄等氨基酸进行突变，将它们突变为Gly，通过诱导表达及纯化后，研究酶学性质的变化。结果显示突变后的AzoRed2依然具备偶氮还原酶活性，且酶学性质无明显变化。说明在AzoRed2氨基酸序列的基础上，突变某些氨基酸，并不能影响其偶氮还原酶活性。

实施例6：AzoRed2与GDH耦合催化重组质粒的构建

根据枯草芽孢杆菌中葡萄糖脱氢酶GDH的核酸序列设计全长引物，并以该菌基因组DNA为模板进行PCR反应，经双酶切后，连接到实施例2中构建好的pET28a-azored2重组质粒上。阳性克隆经测序验证正确后，按照实施例2中的方法进行诱导发酵，并进行SDS-PAGE分析。结果如图5所示，泳道1是菌体破碎液上清，泳道2是菌体破碎液沉淀，可以看出在理论分子量处有明显的蛋白条带，结合偶氮还原酶和葡萄糖脱氢酶活性验证(结果未显示)，确定AzoRed2和GDH顺利进行了共表达。

实施例7：全细胞催化甲基红降解条件优化

重新发酵菌液，离心后收集菌体用于全细胞催化降解甲基红，初始反应体系如下(2mL)：甲基红100μM，全细胞5mg，20mM葡萄糖，pH 6.0磷酸钠缓冲液。该体系置于30℃下80rpm震荡孵育，通过测剩余的甲基红含量，确定反应的脱色率。

(1)辅酶添加量对脱色效率的影响

在初始反应条件下，通过向体系中添加终浓度为0-0.6mM的NAD⁺来研究辅酶NAD⁺添加量对脱色效率的影响。结果如图6a所示，反应体系中添加NAD⁺后会显著提高体系的脱色效率，但考虑到添加NAD⁺会提高应用成本，后续考虑通过优化菌体添加量等因素在保证脱色效果的情况下，不使用辅酶NAD⁺。

(2)菌体添加量对脱色效率的影响

在初始反应条件下，通过向体系中添加2.5-15.0mg/mL的全细胞来研究全细胞催化剂的使用量对脱色效率的影响。结果如图6b所示，提高菌体添加量会显著提高体系的脱色效率，当菌体添加量达到12.5mg/mL时，20min溶液的脱色效率就可达97％以上，菌体添加量为5mg/mL时，120min内溶液的脱色效率可达99％左右，考虑到催化剂的节约使用及脱色效果，最终选择菌体的添加量为5mg/mL。

(3)葡萄糖添加量对脱色效率的影响

在初始反应条件下，通过向体系中添加5-50mM的葡萄糖研究葡萄糖添加量对脱色效率的影响。结果如图6c所示，提高葡萄糖的浓度会提高溶液的脱色效率，添加葡萄糖浓度为5mM时，120min内溶液的脱色率为97.46％，当葡萄糖浓度达到10mM时，120min内溶液的脱色率可达98％以上，综合考虑脱色效率及葡萄糖的节约使用，最终选择向体系中添加10mM的葡萄糖。

(4)底物浓度对脱色效率的影响

在上述研究的基础上，改变初始反应条件，向体系中添加5mg/mL的菌体，10mM的葡萄糖，来研究甲基红终浓度(100-250μM)对脱色效率的影响。结果如图6d所示，在该反应体系下，120min内溶液的脱色率都可达99％以上，也说明该全细胞催化剂具有较好的底物耐受性。

实施例8：全细胞催化甲基红降解批次反应

在实施例6研究的基础上，研究全细胞催化剂的批次反应效率，反应体系(2mL)为：甲基红250μM，全细胞10mg，10mM葡萄糖，pH 6.0磷酸钠缓冲液。批次反应结果如图7所示，该全细胞催化剂在反应3批次后，溶液的脱色率仍可达98％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 一种偶氮还原酶及其应用

<130> /

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 233

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Val Pro Arg Leu Leu His Leu Asp Ser Ser Ala Arg Thr Asp Ser Phe

1 5 10 15

Thr Arg Arg Leu Gly Ala Ala Phe Val Arg Ala Trp Arg Leu Asn Gly

20 25 30

Gly Gly Glu Val Thr His Arg Asp Leu Ala Ile Asp Pro Pro Pro Pro

35 40 45

Ile Ser Glu Gly Trp Thr Ser Leu Cys Asp Thr Leu Leu Arg Glu Gly

50 55 60

Ile Thr Glu Ala Ala Thr Asp His Tyr Ala Gln Ala Val Arg Thr Glu

65 70 75 80

Ala Glu Arg Arg Ala Trp Ala Val Thr Glu Pro Leu Leu Ala Glu Leu

85 90 95

Leu Ala Ala Asp Val Val Leu Ile Gly Ala Pro Met Tyr Asn Phe Gly

100 105 110

Val Pro Ala Ala Leu Lys Ala Trp Ile Asp Gln Val Thr Phe Pro Lys

115 120 125

Met Val Leu Ala Pro Arg Arg Phe Val Val Leu Ser Ala Arg Gly Gly

130 135 140

Ala Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Arg Glu Pro Phe Asp His Gln Gly Arg

145 150 155 160

Tyr Leu Leu Asp Phe Phe His Gly His Tyr Gly Val Glu Asp Ala Glu

165 170 175

Val Ile Ser Ala Glu Leu Val Asn Ser Leu Ser Asp Pro Gly Leu Ala

180 185 190

Gly Arg Leu Pro Gln His Leu Asp Ser Ala Ala Ala Ala Leu Ala Arg

195 200 205

Ala Val Glu Leu Gly Thr Glu Leu Ala Thr Val Pro Ala Thr Thr Ser

210 215 220

Ala Asp Arg Thr Leu Ala Lys Glu Gly

225 230

<210> 2

<211> 702

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gtgcctcgac tcctgcacct cgacagcagc gcccgcaccg actccttcac ccgccgcctc 60

ggcgccgcct tcgtccgggc ctggcggctg aacggcggcg gcgaggtcac gcaccgcgac 120

ctcgccatcg acccgccccc gccgatctcg gagggctgga ccagcctctg cgacaccctc 180

ctgcgcgagg gcatcaccga ggccgccacc gaccactacg cgcaggccgt ccggaccgag 240

gccgaacgcc gcgcctgggc ggtcaccgaa cccctgctcg ccgagctgct cgccgcagac 300

gtggtgttga tcggcgcgcc gatgtacaac ttcggcgtcc cggcggccct caaggcctgg 360

atcgaccagg tgaccttccc gaagatggtg ctcgccccgc gccgcttcgt ggtcctctcg 420

gcgcgcggcg gcgcgtacgg gcccggcact ccccgcgagc ccttcgacca ccaaggccgg 480

tacctgctcg acttcttcca cggccactac ggcgtcgagg acgccgaggt gatcagcgcc 540

gaactggtca actccctcag cgaccccggc ctcgccggcc gcctgccgca gcacctcgac 600

tccgccgccg cagccctcgc ccgggccgtg gaactcggca cggagctcgc caccgtgccc 660

gccacgacct cggccgaccg cacgctggcg aaggagggtt aa 702

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

cccaagctta aggagatata catatgtatc cggatttaaa aggaaaa 47

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

ccgctcgagt taaccgcggc ctgcctggaa t 31

Claims

1.一种偶氮还原酶，其特征在于，所述偶氮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种偶氮还原酶基因，其特征在于，所述的基因可编码权利要求1中所述的偶氮还原酶。

3.如权利要求2所述的偶氮还原酶基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQID NO:2。

4.一种表达偶氮还原酶基因的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒表达权利要求2或3所述的偶氮还原酶基因。

5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达载体为pET28a(+)，pET32a(+)，pET21a(+)或pLLP-OmpA中的一种。

6.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒共表达葡萄糖脱氢酶基因。

7.一种重组宿主微生物，其特征在于，所述重组宿主微生物转化或转染有权利要求4—6任一所述的重组质粒。

8.根据权利要求7所述一种重组宿主微生物，其特征在于，所述宿主微生物为BL21(DE3)，BL21(DE3)plysS或Top10f’。

9.权利要求1所述偶氮还原酶在偶氮染料降解中的应用。

10.权利要求7所述重组宿主微生物在偶氮染料降解中的应用。