JP2002065262A - アゾ染料還元分解酵素、アゾ染料還元分解酵素をコードする遺伝子、組換えベクター、形質転換体、アゾ染料還元分解酵素の製造方法、アゾ染料含有排水の処理方法、及び捺染方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 難分解性のアゾ染料を分解できるアゾ染料還
元分解酵素（ＡＺＲ）と、該ＡＺＲをコードする遺伝子
と、該遺伝子を含んだ組換えベクターと、該組換えベク
ターを有する形質転換体と、該形質転換体を培養するこ
とによりＡＺＲを製造する方法と、ＡＺＲ又は形質転換
体を用いた排水処理方法の提供。 【解決手段】 ＢａｃｉｌｌｕｓＯＹ１−２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５２６１）に由来する特定なアミノ酸配列のＡ
ＺＲと、合成に由来する特定な核酸配列の該ＡＺＲをコ
ードする遺伝子と、該遺伝子を含む組換えベクターと、
該組換えベクターにより形質転換を行うことにより得ら
れ、効率的にＡＺＲを産生することができる菌株Ｅ．ｃ
ｏｌｉＧＩ６１８／ｐＡＺＲ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４
２）と、かかるＡＺＲを使用することにより、排水中の
難分解性のアゾ染料を分解する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、難分解性のアゾ染
料を分解することができるアゾ染料還元分解酵素（以
下、「ＡＺＲ」という。）と、該ＡＺＲをコードする遺
伝子と、該遺伝子を含んだ組換えベクターと、該組換え
ベクターを有する形質転換体と、該形質転換体を培養す
ることによりＡＺＲを製造する方法と、ＡＺＲ又は形質
転換体を用いた排水処理方法及び捺染方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アゾ染料は有機系の染色剤として非常に
構造的に種類に富んだ特徴を有している。このような合
成アゾ染料は、繊維、食品、化粧品分野等の幅広い各種
分野で染料として広く用いられており、現在、全世界で
年間７万トン以上生産されている。そして、従来より、
アゾ染料を含んだ排水は、繊維工業、食品工業、化粧品
工業や染料製造工業の工場等から環境中へ放出されてい
る。しかし、アゾ染料は比較的安定で、好気性の条件下
では容易に分解されないことから、汚水処理施設の流水
中よりしばしば化学的に変化していない状態で検出され
る。よって、アゾ染料は環境中では水質汚濁物質と考え
られている。

【０００３】このように排水中から難分解性のアゾ染料
を除去して、汚水処理システムにおいて排水からアゾ染
料による着色を除く方法として、従来より主に物理的又
は化学的方法が行われている。しかしながら、これらの
方法は設備等が高価であったり、また、処理コストが高
かったり、副産物の産生によりかえって処理が困難にな
ったり、更には処理のために集中的なエネルギーが必要
という問題点があった。そこで、従来の物理的、化学的
方法以外に、低コストで、環境に影響を与えることな
く、容易にアゾ染料を分解除去することができる方法が
求められていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記実情に鑑
みてなされたものであり、難分解性のアゾ染料を分解す
ることができるＡＺＲと、該ＡＺＲをコードする遺伝子
と、該遺伝子を含んだ組換えベクターと、該組換えベク
ターを有する形質転換体と、該形質転換体を培養するこ
とによりＡＺＲを製造する方法と、ＡＺＲ又は形質転換
体を用いた排水処理方法及び捺染方法を提供することを
目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】過去に本発明者らは、微
生物によるアゾ染料の脱色に着目し、染色廃液その他の
試料からアゾ系染料を脱色する微生物を見出すべく検索
を行った結果、バチルス属に属する菌株バチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）ＯＹ１−２（受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ
−５２６１号、以下、単に「菌株ＯＹ１−２」とい
う。）がアゾ染料を脱色することを見つけ出し、出願を
している（特許第２０８６０７６号公報）。また、菌株
ＯＹ１−２由来のＡＺＲについて、その一部のアミノ酸
配列について報告しているが、その全アミノ酸配列につ
いては不明であった（特開平８−１３３６０号公報）。

【０００６】そこで、本発明者らは、従来の物理的、化
学的処理に代わり、かかる微生物を用いたアゾ染料の生
物学的分解による排水処理を可能にするため、上記菌株
ＯＹ１−２及び菌株ＯＹ１−２由来のＡＺＲについて鋭
意検討した。その結果、上記菌株ＯＹ１−２由来のＡＺ
Ｒの全アミノ酸配列を決定すると共に、上記菌株ＯＹ１
−２からＡＺＲをコードする遺伝子を単離し、これをベ
クターに組み込むことにより得られる形質転換体が効率
的にＡＺＲを産生することを見出して、本発明を完成す
るに至った。

【０００７】本第１発明のＡＺＲは、（ａ）配列表の配
列番号１に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とす
る。本第１発明のＡＺＲにより分解される「アゾ染料」
は、ベンゼンアゾ系、ナフタレンアゾ系、複素環アゾ系
等、アゾ結合を有する染料の全てが含まれる。そして、
本第１発明のＡＺＲによれば、上記アゾ染料のアゾ結合
を非特異的に還元的に開裂分解して無色の芳香族アミン
に分解することができる。尚、本第１発明のＡＺＲによ
る還元分解は、完全に無色とするのが好ましいが、還元
分解の結果、完全に無色でなくても、元のアゾ染料より
も色調が薄まっていれば、還元分解に含まれる。

【０００８】また、本第１発明のＡＺＲは、通常は
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有す
るが、本第２発明に示すように、（ｂ）配列番号１に記
載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置
換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つアゾ染
料を還元分解することができるものであってもよい。こ
の場合、上記配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する
ＡＺＲとのアミノ酸の相同性は、通常は５０％以上、好
ましくは６０％以上、更に好ましくは８０％以上、最も
好ましくは９０％以上である。尚、本第１発明又は本第
２発明のＡＺＲは、上記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配
列を有していれば、菌体等から分離精製された天然由来
のものでもよく、また、人工的に合成されたり、あるい
は組換えＤＮＡにより他の宿主微生物、あるいは宿主細
胞等から得られる組換え体でもいい。

【０００９】本第１発明及び第２発明のＡＺＲは、下記
の実施例の記載した方法により培養、精製分離すること
により得られる。本第１発明及び第２発明のＡＺＲは、
以下のような性質を通常有する。 〔酵素の性質〕 （１）酸化還元反応に関係する酵素である。 （２）菌体内で生産される酵素である。 （３）酵素の生産時期は、定常期前期に産生される。 （４）アゾ基を２個のアミン基にまで還元する。 （５）この酵素による反応には補酵素として、ＮＡＤＰ
Ｈ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−リン
酸）、又はＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド−水素化物）が必要である。 （６）この酵素の至適ｐＨはｐＨ７．５で反応する。 （７）至適温度は５０℃である。２０〜７０℃は安定で
ある。通常３０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃、更
に好ましくは４０〜６０℃、最も好ましくは４０℃〜５
５℃である。 （８）ｐＨの安定性はｐＨ４〜１０で安定である。 （９）温度に対して７０℃まで安定であるから、耐熱性
を持っている。この温度において安定性を持つので、保
存、腐敗に強いものである。また、６５℃で殺菌が可能
である。 （１０）エタノール、アセトンに安定である。そして、
酵素をエタノール、アセトンで抽出することができるの
で、工業化には有利である。 （１１）菌体内酵素であるので、細胞膜を破壊して酵素
を溶出（抽出）するために超音波処理、リゾチーム処理
ができる。 （１２）公知のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定した分子
量が通常１５〜２５キロダルトン、好ましくは１８〜２
３キロダルトン、更に好ましくは１９〜２１キロダルト
ンである。 （１３）三量体を形成してアゾ染料の還元分解作用を奏
する場合がある。

【００１０】本第３発明の遺伝子は、請求項１又は２に
記載のアゾ染料還元分解酵素をコードすることを特徴と
する。尚、本明細書において「遺伝子」には、ハイブリ
ダイゼーション用プローブや、あるいはＰＣＲ用プライ
マーのように、直接翻訳されてＡＺＲを産生する用途以
外の用途に使用するものも含む。

【００１１】本第３発明の遺伝子は、（ａ）配列番号１
に記載のアミノ酸配列を有するＡＺＲ、又は（ｂ）上記
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１以上のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有
し、且つアゾ染料を還元分解することができる酵素をコ
ードするものであれば、その核酸配列には限定はない。
通常は、本第４発明に示すように、配列表の配列番号２
に記載の核酸配列を有しているが、その他、配列表の配
列番号２に記載の核酸配列と５０％以上、好ましくは６
０％以上、更に好ましくは８０％以上、最も好ましくは
９０％以上の相同性を有し、且つアゾ染料を還元分解す
ることができる酵素をコードするものでもよい。

【００１２】本第３発明及び第４発明の遺伝子は、微生
物等から得られる天然起源のものを分離精製したものの
他、本第３発明及び第４発明の遺伝子の核酸配列とハイ
ブリダイズするプローブを調製し、これを用いてポリメ
ラーゼ連鎖反応法（以下、「ＰＣＲ法」という。）によ
り調製する等の方法により、人工的に合成したものでも
よい。通常は、本第５発明に示すようにバチルス属起源
であり、その中でも、本第６発明に示すように、バチル
ス属に属する菌株である菌株ＯＹ１−２（受託番号；Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−５２６１号）起源のものが好ましい。

【００１３】本第７発明の組換えベクターは、上記第３
発明乃至第６発明のいずれかに記載の遺伝子を含むこと
を特徴とする。本第７発明において組換えベクターを調
製するために用いることができるベクターには特に限定
はなく、プラスミドベクター、バクテリオファージベク
ター等が挙げられるが、通常は本第８発明に示すよう
に、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＴｒｘ−Ｆｕｓ等
のプラスミドベクターが用いられ、特に、本第９発明に
示す組換えベクターｐＴｒｘ−ＡＺＲを得るために導入
されるプラスミドベクターであるｐＴｒｘ−Ｆｕｓ等が
挙げられる。本第７発明乃至第９発明の組換えベクター
は、上記ベクターＤＮＡに制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ
やＮｄｅＩ、ＸｂａＩ等を作用させて消化し、得られた
ＤＮＡ断片に上記第３発明乃至第６発明のいずれかに記
載のＤＮＡを組み込んで、Ｔ４リガーゼ等の公知の方法
で連結することにより得ることができる。

【００１４】本第１０発明の形質転換体は、上記第７発
明乃至第９発明のいずれかに記載の組換えベクターを導
入して形質転換したものであることを特徴とする。本第
１０発明において、宿主については特に限定はないが、
通常は本第１１発明に示すように、微生物を宿主として
形質転換を行う。このような微生物としては、例えば、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）等が挙げられる。このようにして得られた形質転換
体としては、本第１２発明に示すように、組換えベクタ
ーｐＴｒｘ−ＡＺＲ等の組換えベクターを大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＧＩ６１８に公知の方法により導入して形質
転換を行い得られた形質転換微生物である大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＧＩ６１８／ｐＡＺＲ（受託番号；ＦＥＲＭ
ＢＰ−７１４２号、以下、単に「ＧＩ６１８／ｐＡＺ
Ｒ」という。）は、ＡＺＲ産生能力に優れているので好
ましい。

【００１５】本第１３発明のアゾ染料還元分解酵素の製
造方法は、本第１０発明乃至第１２発明のうちのいずれ
かに記載の形質転換微生物を培地で培養し、培養物より
アゾ染料還元分解酵素を採取することを特徴とする。本
第１３発明の方法により製造されるＡＺＲは、アゾ染料
還元分解作用を有し、通常は、（ａ）配列表の配列番号
１に記載のアミノ酸配列を有しているが、その他、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１以上
のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配
列を有し、且つアゾ染料を還元分解することができる酵
素も含まれる。この場合、本第１３発明に示すように、
上記（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１
以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列と、上記（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
を有するＡＺＲとのアミノ酸の相同性は、通常５０％以
上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以
上、最も好ましくは９０％以上である。

【００１６】本第１３発明のＡＺＲの製造方法における
条件については、ＡＺＲを製造することができる限り、
特に限定はなく、種々の条件により行うことができる
が、通常は次のような方法により行われる。即ち、上記
形質転換微生物ＧＩ６１８／ｐＡＺＲを、ＩＤ培地（１
リットルあたり「カザアミノ酸」〔Ｄｉｆｃｏ社製〕；
０．４ｇ、グルコース；５ｇ、ＭｇＣｌ₂；１ｍＭ、Ｎ
ａ₂ＨＰＯ₄；６ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄；３ｇ、ＮａＣｌ；０．
５ｇ含む）２００ｍｌに接種して、３０℃、５時間培養
し、次いで、終濃度が０．１ｇ／ｌとなるようにトリプ
トファンを添加した上記ＩＤ培地で３０℃、４時間培養
する。これに２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）を２０ｍｌ添加した後、集菌して菌体懸濁液を
調製し、これを−８０℃での凍結し、３７℃で融解した
後、超音波処理（１サイクル３．５Ｗ、１５秒、１０サ
イクル繰り返す）を行って菌体を破砕する。そして、破
砕後の菌体懸濁液を４℃、９０００ｇで３０分間遠心分
離し、その上清を「ＲｅｄセファロースＣＬ−６Ｂ」
（アマーシャム・ファルマシア社製、カラムサイズ；直
径１．０ｃｍ×長さ２．０ｃｍ）に添加し、次いで２０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍｌを
添加して、上記「ＲｅｄセファロースＣＬ−６Ｂ」の洗
浄を行い、その後、溶離液である１０ｍＭのＮＡＤＨを
１０ｍｌ添加することにより、組換えＡＺＲをカラムか
ら流出させることにより得られる。

【００１７】上記ＡＺＲは、アゾ染料を還元分解するこ
とができるので、アゾ染料の分解が必要とされる様々な
分野に適用することができる。例えば、第１４発明に示
すように、上記第１発明又は第２発明に記載のＡＺＲ
や、本第１６発明に示すように、上記第１３発明に記載
のＡＺＲの製造方法により得られたＡＺＲをアゾ染料含
有排水に添加したり、第１５発明に示すように、上記第
１０発明乃至第１２発明のいずれかに記載の形質転換体
を適用することにより、アゾ染料含有排水の処理を行う
ことができる。

【００１８】本第１４発明乃至第１６発明の各アゾ染料
含有排水の処理方法によれば、従来の物理的、化学的方
法と比較して、低コストで、環境に影響を与えることな
く、排水中から難分解性のアゾ染料を容易に分解除去す
ることができる。本第１４発明乃至第１６発明におい
て、アゾ染料含有排水を処理するために、上記形質転換
体又はＡＺＲを排水に適用する方法については特に限定
はなく、上記形質転換体又はＡＺＲを適当な担体に固定
したバイオリアクターに排水を通したり、あるいは、上
記形質転換体又はＡＺＲを排水に直接添加することによ
り適用することができる。また、本第１４発明乃至第１
６発明の各アゾ染料含有排水の処理方法における排水処
理条件についても、排水中のアゾ染料を還元分解するこ
とができる限り、特に限定はない。

【００１９】その他、本第１７発明乃至本第１９発明に
示すように、染色基材上に、アゾ系染料と、上記第１発
明又は第２発明に記載のアゾ染料還元分解酵素や、上記
第１３発明に記載のアゾ染料還元分解酵素の製造方法に
より得られたアゾ染料還元分解酵素のうちの少なくとも
該酵素を含む液若しくは糊剤、又は上記第１０発明乃至
第１２発明のうちのいずれかに記載の形質転換体を含む
液若しくは糊剤を所望形状に塗布し、その後、該酵素を
作用させて上記アゾ系染料による着色を消失若しくは低
減させて捺染を行うこともできる。

【００２０】本第１７発明乃至本第１９発明の各捺染方
法によれば、脱色に還元剤又はアルカリ等の化学剤を使
用する必要がないので、染料の制約が少なく、基材の痛
みも少ない上、色境界部分のにじみが少ないため細かく
て複雑な模様の作成が可能で、鮮やかな色を有する着色
抜染が可能で、更にぼかし模様も容易に作成できる。
尚、本第１７発明乃至本第１９発明の各捺染方法の捺染
条件については、アゾ染料を還元分解できる限り特に限
定はなく、温度、ｐＨ及び処理時間等を種々選択するこ
とにより、完全に抜染するだけでなく、ぼかし模様（色
違い模様）とすることができるし、この両者を組み合わ
せることにより、更に複雑且つ美観に優れた模様を作成
することもできる。

【００２１】本第１７発明乃至第１９発明の各捺染方法
としては、例えば、アゾ系染料により染色された染色基
材上に、アゾ系染料及び上記ＡＺＲ又は形質転換体を作
用させることにより行われる。その他、アゾ系染料及び
非アゾ系染料により染色された複合染色基材上に、アゾ
系染料及び上記ＡＺＲ又は形質転換体を作用させたり、
あるいは、染色されていない基材若しくは非アゾ系染料
により染色された染色基材上に、アゾ系染料及び上記Ａ
ＺＲや形質転換体を作用させて行うこともできる。尚、
染色基材上に適用される上記「アゾ系染料」には、非ア
ゾ系染料を含んでいてもよい。また、本第１７発明乃至
第１９発明において「捺染」とは、直接捺染（白地或い
は地染の生地に模様をプリントするもの）、抜染［地染
の生地に模様をつけるもの（白色抜染、着色抜染及び半
抜染を含む。）］及び防染（染色を阻害するもので模様
を書き、染めるもの）を含む。

【００２２】また、本第１７発明乃至第１９発明におけ
る上記「基材」は、アゾ系染料等にて染色可能のもので
あれば良く、通常は、織布（繊維材料種、織り方等は問
わない。）等であるが、これに限らず、不織布、紙、樹
脂シート等であってもよい。更に、本第１７発明乃至第
１９発明において、所定の酵素を含む液（染料の含有の
有無は問わない。染料を含む場合は着色液となる。）、
所定の酵素及び糊成分を含む糊剤（染料の含有の有無は
問わないし、液状、ペースト状等の形態も問わない。染
料を含む場合は色糊剤となる。）を所定の基材上に塗布
する方法は、特に限定されず、例えば、型紙印捺方式、
インクジェット方式、手書き方式、ローラー印捺方式、
スクリーン印捺方式等の所望の塗布方法とすることがで
きる。この糊剤は、通常、直接捺染に用いられ、これに
含まれる上記糊成分としては、でんぷん類（小麦でんぷ
ん等）、化工でんぷん（ブリティッシュガム等）、化工
天然ガム（ローカストビーンガム等）、アルギン酸ナト
リウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、合成
糊料（ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル等）等を
用いることができる。

【００２３】

【発明の実施の形態】以下、本発明について、実施例及
び比較例を挙げて具体的に説明する。 （１）菌株ＯＹ１−２由来の天然ＡＺＲの調製及びＮ末
端のアミノ酸配列の決定 ５００ｍｌの坂口フラスコに、乾燥（普通）ブイヨン
（日水製薬製）２００ｍｌ及びアゾ系染料（商品名「Ｒ
ｏｃｃｅｌｌｉｎｅ ＮＳ ｃｏｎｃ．１２０％」 住
友化学株式会社製）０．０２％を添加し、次いで菌株Ｏ
Ｙ１−２（受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−５２６１号）を
接種して３８℃で４８時間振盪培養し、その培養液を遠
心分離（３０００ｇ、２０分間）して菌体を集めた。そ
して、該菌体を０．１Ｎリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、
１．０ｍＭ ジチオトレイトール）で洗浄後、遠心分離
（５０００ｇ、１０分間）して菌体の懸濁液を調製し
た。

【００２４】次に、上記菌体の懸濁液に、超音波破砕装
置により２００Ｗ、１５分間（３０秒間隔）下にて超音
波を照射して、酵素のリゾチームにより細胞膜を破壊
し、その後、該菌体の懸濁液を遠心分離（１２０００
ｇ、６０分間）にかけて、上清液であるＡＺＲを含む酵
素液を得た。更に、該酵素液に硫酸アンモニウム液（硫
酸アンモニウム濃度４０％）を加えて懸濁液とし、透析
液を、以下の、、及びのクロマトグラフィー処
理を順次行って、菌株ＯＹ１−２由来の天然ＡＺＲを精
製した。 ＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ−６Ｂ クロマトグラ
フィー（溶離液；０〜０．５Ｎ ＮａＣｌ）（アマーシ
ャム・ファルマシア社製） ブルーセルロファイン アフィニティークロマトグラ
フィー（溶離液；１０ｍＭ ＮＡＤＨ）（第一製薬株式
会社製） レッドセファロース ＣＬ−６Ｂ アフィニティーク
ロマトグラフィー（溶離液；１０ｍＭ ＮＡＤＨ）（ア
マーシャム・ファルマシア社製） ゲルクロマトグラフィー（Ｈｉｌｏａｄ１６／６０
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ）（溶離液；０．０２Ｍ
リン酸緩衝液 ｐＨ７．０〔０．１Ｍ ＮａＣｌ〕）
（アマーシャム・ファルマシア社製）

【００２５】上記菌株ＯＹ１−２由来の天然ＡＺＲのＮ
末端のアミノ酸配列は、上記分離・精製後、２フッ化ポ
リビニリデンメンブラン（ＰＶＤＦ；商品名「Ｓｅｑｕ
ｉ−Ｂｌｏｔ−ＰＶＤＦメンブレン」 Ｂｉｏ−Ｒａｄ
社製）へブロッティングし、次いで「プロテインシーク
エンサー４７０／１２０Ａ」（ＰＥ アプライドバイオ
システムズ社製）により決定した。

【００２６】（２）菌株ＯＹ１−２の遺伝子ＤＮＡの調
製 菌株ＯＹ１−２を乾燥（普通）ブイヨン（日水製薬製）
２００ｍｌで３７℃、２４時間、好気性の条件下で振と
う培養した。その後、該液体培地５ｍｌに、分解緩衝液
（トリス塩酸〔ｐＨ８．０〕；０．３Ｍ、ＮａＣｌ；
０．１Ｍ、ＥＤＴＡ；６ｍＭ）０．５ｍｌを添加して菌
体懸濁液を調製した。そして、０．１Ｎ塩酸で洗浄した
直径０．１７ｍｍの滅菌ガラスビーズを１／４程度充填
した２ｍｌのスクリューキャップ遠心管に上記菌体懸濁
液を移し、次いで、クロロホルムを０．５ｍｌ添加し、
「ミニ−ヴィードヴィーターセル粉砕機」（バイオスペ
ックプロダクト社製）で５分間強く振ることにより、菌
体ＯＹ１−２を粉砕した。その後、上記菌体懸濁液を４
℃、９０００ｇで５分間遠心分離して菌体ＯＹ１−２の
遺伝子ＤＮＡを含む上層を分離し、該上層にフェノール
−クロロホルム抽出液を０．５ｍｌ添加して再抽出を行
うことにより更に精製した。次いで、３Ｍの酢酸ナトリ
ウム溶液５０μｌと１ｍｌの９９．５％エタノールを添
加して攪拌し、４℃、９０００ｇで５分間遠心分離する
ことにより、菌体ＯＹ１−２の遺伝子ＤＮＡを濃縮し
た。該遺伝子ＤＮＡは、ＴＥ緩衝液（トリス塩酸〔ｐＨ
８．０〕；１０ｍＭ、ＥＤＴＡ；１ｍＭ）３００μｌに
溶解した。

【００２７】（３）スクリーニングのためのジゴキシゲ
ニン標識プローブの調製 プローブ調製用の鋳型ＤＮＡの調製 プローブ調製用の鋳型ＤＮＡを以下の方法により調製し
た。ＰＣＲ法により調製する際に使用するプライマーと
して、上記〔００２５〕の方法により決定されたアミノ
酸配列に対応するヌクレオチドであるＡＺＲ−１（配列
番号３）及びＡＺＲ−２（配列番号４）を用いてＰＣＲ
用の反応混合液（５０μｌ）を調製した。配列番号３及
び４のＡＺＲ−１及びＡＺＲ−２の塩基配列中、Ｉはイ
ノシンを示す。また、ＡＺＲ−１の６番目の塩基は、Ａ
（アデニン）とＧ（グアニン）がＡ：Ｇ＝１：１の割合
で含まれており、７番目の塩基は、Ｃ（シトシン）とＴ
（チミン）がＣ：Ｔ＝１：１の割合で含まれている。ま
た、１８番目の塩基は、Ａ、Ｃ及びＴがＡ：Ｃ：Ｔ＝
１：１：１の割合で含まれており、２１番目の塩基は、
ＣとＴがＣ：Ｔ＝１：１の割合で含まれている。ＡＺＲ
−１はこれらの２４種類のヌクレオチド配列の混合物で
ある。同様に、ＡＺＲ−２の２番目、１４番目及び２０
番目の塩基は、ＡとＧがＡ：Ｇ＝１：１の割合で含まれ
ており、４番目、１１番目及び１７番目の塩基は、Ｃ
（シトシン）とＴ（チミン）がＣ：Ｔ＝１：１の割合で
含まれている。ＡＺＲ−２はこれらの６４種類のヌクレ
オチド配列の混合物である。

【００２８】ＰＣＲ用の反応混合液（５０μｌ）は、Ｌ
Ａ−ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｍｇ²⁺フリー）に、ＭｇＣｌ₂
を２．５ｍＭ、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐを各２５０μＭ、上記段落番号〔００２６〕の（２）
で調製した菌株ＯＹ１−２由来のＤＮＡを１０ｎｇ、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ（商品名「Ｔａｋａｒａ ＬＡ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ」、宝酒造株式会社製）を
１．２５単位、プライマーである上記ＡＺＲ−１及びＡ
ＺＲ−２を各２μＭ含んでいる。そして、上記ＰＣＲ用
の反応混合液を使用し、商品名「タカラサーマルサイク
ラーパーソナル」（宝酒造株式会社製）を用いて、９
４℃、３０秒間の条件でのＤＮＡ鎖の解離、５５℃、
３０秒間の条件でのプライマーとＤＮＡのアニーリン
グ、７２℃、１分間の条件での伸長反応、を１サイク
ルとして、これを３０サイクル行うことによりＰＣＲ法
を行った。その後、得られたＰＣＲ産物であるプローブ
調製用の鋳型ＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動によ
り分離後、ゲルから抽出し、次いで、「タカラライゲー
ションキットＶｅｒ．２」（宝酒造株式会社製）を使用
して、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ社製）に直接サブクローニングした。サブクローンの
塩基配列は、「モデル３１０ジェネティックアナライザ
ー」（ＰＥ アプライドバイオケミカルズ社）を用いて
ジデオキシチェーンターミネーター法により決定され
た。

【００２９】ジゴキシゲニン標識プローブの調製 ハイブリダイゼーション用のジゴキシゲニン標識プロー
ブは、ＰＣＲ−ＤＩＧラベリングキット（ロッシュモレ
キュラーバイオケミカルス社製）を用いてＰＣＲ法によ
り調製した。このＰＣＲ法で用いられた反応混合液（５
０μｌ）は、トリス塩酸（ｐＨ８．３）を１０ｍＭ、Ｋ
Ｃｌを５０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂を１．５ｍＭ、ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを各２００μＭ、ジゴ
キシゲニン−１１−ｄＵＴＰを７０μＭ、上記キットに
付属している耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１．２５単
位、「プライマーＭ１３Ｍ１」及び「Ｍ１３ＲＶ」（両
者とも宝酒造株式会社製）を２μＭ、及び上記段落番号
〔００２７〕の（３）の方法により調製されたプロー
ブ調製用の鋳型ＤＮＡを含むｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）Ｔベ
クターを１０ｎｇ含んでいる。

【００３０】ＰＣＲ法は上記段落番号〔００２８〕に記
載されたのと同じ条件及び方法で行われた。そして、得
られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動により
分離後、ゲルから抽出して、スクリーニングのためのジ
ゴキシゲニン標識プローブとした。

【００３１】（４）菌株ＯＹ１−２の遺伝子ライブラリ
ーの調製 上記段落番号〔００２６〕の（２）の方法により精製さ
れた菌株ＯＹ１−２由来のＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ処理して完全に分解して断片化した。同様に、ファー
ジベクターλｇｔ１０についても制限酵素ＥｃｏＲＩ処
理を行った。そして、得られた菌株ＯＹ１−２由来のＤ
ＮＡ断片２μｇと、１μｇのファージベクターλｇｔ１
０のＥｃｏＲＩ消化物とを、「ＤＮＡライゲーションキ
ットＶｅｒ．１」（宝酒造株式会社製）を用い、当該キ
ットのプロトコールに基づいて連結した。そして、「ギ
ガパックインビトロパッケージングキット」（ストラタ
ジーン社製）を用いてパッケージングを行い、その後、
大腸菌ｐ２３９２（λｇｔ１０と共に東洋紡より入手）
に感染させた。次いで、感染させた該大腸菌ｐ２３９２
をＬＢ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に接種し、３７℃で
１２時間培養することにより、約１×１０⁶個のプラー
クを有する菌株ＯＹ１−２の遺伝子ライブラリーを調製
した。

【００３２】（５）ＡＺＲ遺伝子のクローニングと核酸
配列の決定 ＬＢ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に、上記遺伝子ライブ
ラリーと大腸菌Ｃ６００ｈｆｌとを共に接種し、３７℃
で６時間培養した。そして、得られたプラーク上にナイ
ロンフィルター（「ナイトラン４５」 Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製 ９ｃｍ×１２ｃｍ）を重
層し、上記ナイロンフィルター上にプラークを転写し
た。

【００３３】上記ナイロンフィルターについて、試薬
「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（クローンテク社製）３ｍｌ中、
６８℃で３０分間の条件でプレハイブリダイゼーション
を行った。そして、上記試薬を一度捨てた後、終濃度が
１０ｎｇ／ｍｌになるように、上記〔００２７〕の
（３）の方法により調製されたジゴキシゲニン標識プロ
ーブを添加した試薬「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（クローンテ
ク社製）１．５ｍｌを再度添加して、６０℃で１時間の
条件でハイブリダイゼーションを行った。その後、上記
ナイロンフィルターを、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳと
を含む洗浄液により室温で５分間洗浄を行い、更に、
０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとを含む洗浄液により
６０℃で１５分間洗浄を行った。

【００３４】そして洗浄液を捨てた後、２％上記ナイロ
ンフィルターを１：５０００に希釈されたアルカリフォ
スファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体（Ｆａｂ；ロッ
シュモレキュラーバイオケミカルズ社製）と共に室温で
３０分間インキュベートし、次いで、緩衝液３（トリス
塩酸〔ｐＨ９．５〕：１００ｍＭ、ＭｇＣｌ₂：５０ｍ
Ｍ）１０ｍｌに、１０％ニトロブルーテトラゾリウム塩
（ＮＢＴ）４５μｌ／５％５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）３５μｌを含む
発色液（和光純薬工業株式会社）を４ｍｌ添加して、ア
ルカリフォスファターゼにより触媒される色素反応を行
うことにより、ハイブリダイズしたプローブを検出し
た。そして、検出されたポジティブクローンに挿入され
ているＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理し、得られたＤＮＡ断片
をプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位へ挿入してサ
ブクローンを行い、組換えプラスミドｐＴ７Ｂ−ＡＺＲ
５−８を得た。そして、得られたｐＴ７Ｂ−ＡＺＲ５−
８の塩基配列は、「モデル３１０ジェネティックアナラ
イザー」（ＰＥ アプライドバイオケミカルズ社製）を
用いてジデオキシチェーンターミネーター法により決定
した。

【００３５】（６）サザンプロットハイブリダイゼーシ
ョン 上記段落番号〔００３４〕において検出されたポジティ
ブクローンに挿入されているＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理
し、得られたＤＮＡ断片を鋳型として、上記段落番号
〔００２７〕の（３）に記載されたジゴキシゲニン標識
プローブの調製と同じ方法により、ジゴキシゲニン標識
ＤＮＡ断片を調製した。このジゴキシゲニン標識ＤＮＡ
断片は、ジゴキシゲニンでラベルされた、ＡＺＲをコー
ドする領域全体を含む１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片であ
る。

【００３６】そして、上記〔００２６〕の（２）の方法
により得られた菌株ＯＹ１−２由来のＤＮＡ１μｇに制
限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐｓ
ｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ及びＸｂａＩを添加して完全
に消化し、消化物を０．７％アガロースゲルで分離後、
ナイロンフィルター「ナイトラン４５」（５．５ｃｍ×
６．５ｃｍ）へ真空転写した。上記ナイロンフィルター
は試薬「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（クローンテク社製）２ｍ
ｌ中、６８℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを
行った。続いて、上記試薬を一度捨てた後、終濃度が１
０ｎｇ／ｍｌになるように、上記ジゴキシゲニン標識Ｄ
ＮＡ断片を添加した試薬「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（クロー
ンテク社製）１ｍｌを再度加え、６８℃、３０分間の条
件でハイブリダイゼーションを行った。

【００３７】そして、ハイブリダイゼーション後、洗浄
液として２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを２５０ｍｌ用
い、室温で５分間、上記ナイロンフィルターを洗浄し、
続いて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを２５０ｍｌ用
い、６８℃で１５分間、上記ナイロンフィルターを２回
洗浄した。そして洗浄液を捨てた後、上記ナイロンフィ
ルター上でハイブリダイズした上記ジゴキシゲニン標識
プローブは、１：５０００に希釈されたアルカリフォス
ファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体（Ｆａｂ；ロッシ
ュモレキュラーバイオケミカルズ社製）と共に室温で３
０分間インキュベートし、続いて、緩衝液３（トリス塩
酸〔ｐＨ９．５〕：１００ｍＭ、ＭｇＣｌ ₂：５０ｍ
Ｍ）中、ＮＢＴ／ＢＣＩＰシステム（和光純薬工業株式
会社）を４ｍｌ添加して、アルカリフォスファターゼに
より触媒される色素反応を行うことにより検出した。

【００３８】（７）形質転換体の調製及び形質転換体に
よるＡＺＲの産生 ＡＺＲをコードするＤＮＡの転写解読枠全体を、以下に
示すＰＣＲにより増幅した。この過程で用いられた反応
混合液（５０μｌ）は、ＬＡ−ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｍｇ
²⁺フリー）に、ＭｇＣｌ₂を２．５ｍＭ、ｄＡＴＰ，ｄ
ＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを各２５０μＭ、上記段落
番号〔００３４〕で調製したプラスミドｐＴ７Ｂ−ＡＺ
Ｒ５−８を１０ｎｇ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（商品
名「Ｔａｋａｒａ ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ」、
宝酒造株式会社製）を１．２５単位、そして、プライマ
ーであるＡＺＲ−ｒｅｃ−Ｓ−Ｎｄｅ（配列番号５）と
ＡＺＲ−ｒｅｃ−Ｅ−Ｘｂａ（配列番号６）を各２μＭ
含んでいる。

【００３９】そして、上記反応混合液を使用し、商品名
「タカラサーマルサイクラーパーソナル」（宝酒造株式
会社製）を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法は、９
４℃、３０秒間の条件でのＤＮＡ鎖の解離、５５℃、
３０秒間の条件でのアニーリング、７２℃、１分間の
条件での伸長反応、を１サイクルとして、３０サイクル
行った。その後、得られたＰＣＲ産物を１％アガロース
ゲル電気泳動により分離後、ゲルから抽出し、そしてヌ
クレオチド配列形成のため、直ちにｐＴ７Ｂｌｕｅ
（Ｒ）Ｔ（ノバゲン社製）へサブクローンし、次いで、
制限酵素ＮｄｅＩとＸｂａＩにより断片化後、発現ベク
ターであるｐＴｒｘ−Ｆｕｓ（インビトロジェン社製）
へ導入して組換えベクターｐＴｒｘ−ＡＺＲを得た（図
１参照）。そして、上記組換えベクターｐＴｒｘ−ＡＺ
ＲをＨａｎａｈａｎの方法により宿主微生物である大腸
菌ＧＩ６１８へ導入して形質転換体である大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）ＧＩ６１８／ｐＡＺＲ（受託番号；ＦＥＲＭ
ＢＰ−７１４２号）を得た。

【００４０】（８）組換えＡＺＲの精製 上記ＧＩ６１８／ｐＡＺＲを、ＩＤ培地（１リットルあ
たり「カザアミノ酸」〔Ｄｉｆｃｏ社製〕；０．４ｇ、
グルコース；５ｇ、ＭｇＣｌ₂；１ｍＭ、Ｎａ₂ＨＰ
Ｏ₄；６ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄；３ｇ、ＮａＣｌ；０．５ｇ含
む）２００ｍｌに接種して、３０℃、５時間培養し、次
いで、終濃度が０．１ｇ／ｌとなるようにトリプトファ
ンを添加した上記ＩＤ培地で３０℃、４時間培養する。
これに２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
を２０ｍｌ添加した後、集菌して菌体懸濁液を調製し、
これを−８０℃での凍結し、３７℃で融解した後、超音
波処理（１サイクル３．５Ｗ、１５秒、１０サイクル繰
り返す）を行って菌体を破砕する。そして、破砕後の菌
体懸濁液を４℃、９０００ｇで３０分間遠心分離し、そ
の上清を「ＲｅｄセファロースＣＬ−６Ｂ」（アマーシ
ャム・ファルマシア社製、カラムサイズ；直径１．０ｃ
ｍ×長さ２．０ｃｍ）に添加し、次いで２０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍｌを添加して、
上記「ＲｅｄセファロースＣＬ−６Ｂ」の洗浄を行い、
その後、溶離液である１０ｍＭのＮＡＤＨを１０ｍｌ添
加することにより、組換えＡＺＲをカラムから流出させ
た。この過程における各流出分画でのタンパク質濃度
（ｍｇ／ｍｌ）を、２８０ｎｍにおける光学密度の減少
を測定することにより求め、各流出分画とタンパク質濃
度との関係を図２に、精製した組換えＡＺＲをＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析した結果を図３に示す。尚、図３中、１
は精製前の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＩ６１８／ｐＡＺ
Ｒ由来のタンパク質を示し、２は精製後の組換えＡＺＲ
を示し、３は菌株ＯＹ１−２由来のＡＺＲを示す。そし
て、組換えＡＺＲを含む流出液をセルロース製透析チュ
ーブに入れて、これを流出液の１０００倍量の２０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に入れて攪拌
することによりＮＡＤＨを流出液から除く工程を２回行
って、組換えＡＺＲの精製を行った。

【００４１】（９）ＡＺＲのアゾ染料還元分解活性の評
価 ＡＺＲのアゾ染料還元分解は、以下の方法により測定し
て評価した。ＧＩ６１８／ｐＡＺＲから得られた組換え
ＡＺＲ１μｇを反応溶液（アゾ染料「Ｒｏｃｃｅｌｌｉ
ｎ ＮＳ２００」〔住友化学株式会社製〕；２０μＭ、
リン酸ナトリウム緩衝液〔ｐＨ７．５〕；２０ｍＭ）
１．０ｍｌに添加した。そして、ＡＺＲ添加後の上記反
応溶液を２０℃〜９０℃の各温度で５分間プレインキュ
ベートし、次いで、この反応溶液に１０ｍＭのＮＡＤＰ
Ｈを２５μｌ添加して、２０℃〜９０℃の各温度の下、
アゾ染料の還元分解反応を行った。そして、アゾ染料の
吸収極大（５１０ｎｍ）における光学密度の減少を測定
して、酵素の相対活性（％）を求めた。この結果を図４
に示す。

【００４２】また、上記組換えＡＺＲに代えて、菌株Ｏ
Ｙ１−２とＧＩ６１８／ｐＡＺＲを各１μｇ用い、アゾ
染料として「Ｒｏｃｃｅｌｌｉｎ ＮＳ２００」、「Ｓ
ｏｌａｒ Ｏｒａｎｇｅ」、及び「Ｂｌａｃｋ Ｂ」
〔いずれも住友化学株式会社製〕を使用して、上記と同
じ方法によりアゾ染料の還元分解反応を行い（反応温度
３７℃）、各時間におけるアゾ染料の吸収極大における
光学密度の減少を測定することにより、アゾ染料還元分
解活性を調べた。その結果を図５に示す。尚、吸収極大
は、「Ｂｌａｃｋ Ｂ」で６００ｎｍ（図５Ａ）、「Ｒ
ｏｃｃｅｌｌｉｎＮＳ２００」で５１０ｎｍ（図５
Ｂ）、「Ｓｏｌａｒ Ｏｒａｎｇｅ」で４８５ｎｍ（図
５Ｃ）である。

【００４３】（１０）実施例の効果 上記段落番号〔００３１〕の（４）において調製された
菌株ＯＹ１−２の遺伝子ライブラリーから、上記段落番
号〔００３５〕の（６）に示すハイブリダイゼーション
により、ＡＺＲをコードするＤＮＡのクローンを行った
結果、配列番号２に示す単一の転写解読枠を有する１．
２ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片を含むＤＮＡ断片が分離され
た。配列番号２のＤＮＡ断片から導き出されるアミノ酸
配列は、配列番号１に示す精製された天然ＡＺＲから決
定されたアミノ酸配列とよい同一性を示した。しかも、
上記配列番号２のＤＮＡ断片から翻訳されるＡＺＲの分
子量を計算すると１９４２３ダルトンであり、これは、
精製された天然ＡＺＲの分子量である２００００ダルト
ンとよく一致していた。

【００４４】上記組換えベクターであるプラスミドｐＴ
ｒｘ−ＡＺＲにより形質転換して得られた形質転換体で
あるＧＩ６１８／ｐＡＺＲを培養することにより得られ
た組換えＡＺＲを公知のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析
した結果、分子量が約２００００ダルトンであることが
判る。また、このタンパク質をＰＶＤＦメンブラン上へ
転写してアミノ酸配列を調べた結果、アミノ酸配列はＭ
ＫＬＶＶＩＮＧＴＰＲＫＦＧＲＶＶを示し、配列番号１
に示す天然のＡＺＲのアミノ酸配列とよい同一性を示し
た。更に、図３より、ＧＩ６１８／ｐＡＺＲを培養する
ことにより得られた組換えＡＺＲのバンドが菌株ＯＹ１
−２由来のＡＺＲとほぼ同じ箇所に現れていることが判
る。これらの結果より、本実施例において、形質転換体
であるＧＩ６１８／ｐＡＺＲを培養することにより得ら
れた組換えＡＺＲは、菌株ＯＹ１−２から得られた天然
のＡＺＲと同じであることを示している。

【００４５】形質転換体ＧＩ６１８／ｐＡＺＲを培養す
ることにより得られた組換えＡＺＲは、図２に示すよう
に、１０ｍＭのＮＡＤＨを添加することにより、「Ｒｅ
ｄセファロースＣＬ−６Ｂ」より溶出した。また、菌株
ＯＹ１−２から純粋な天然ＡＺＲを得るためには、特開
平８−１３３６０号公報や上記段落番号〔００２６〕の
（２）に示すように、４ステップのカラムクロマトグラ
フィーが必須だったのに対し、上記形質転換体ＧＩ６１
８／ｐＡＺＲを培養することにより得られた組換えＡＺ
Ｒについて、上記段落番号〔００４０〕の（８）に示す
条件で精製を行った結果、図３に示すように、１ステッ
プでほぼ純粋な組換えＡＺＲが得られることが判る。即
ち、形質転換体ＧＩ６１８／ｐＡＺＲを培養することに
よりＡＺＲを製造すると、菌株ＯＹ１−２と比べて、不
純物が少ない状態でＡＺＲが得られることから、より効
率的にＡＺＲを得ることができることが判る。

【００４６】また、アゾ染料「Ｒｏｃｃｅｌｉｎ ＮＳ
２００」を基質として、形質転換体ＧＩ６１８／ｐＡＺ
Ｒを培養することにより得られた組換えＡＺＲの種々の
反応温度でのアゾ染料還元活性を調べたところ、図４に
示すように、５０℃で最大となることが判る。更に、図
５Ａ〜Ｃより、菌株ＯＹ１−２とＧＩ６１８／ｐＡＺＲ
を同量用いた場合のアゾ染料還元分解活性を比較した結
果、ＧＩ６１８／ｐＡＺＲの方が菌株ＯＹ１−２よりも
１０倍以上高いことが判る。この結果より、本実施例の
形質転換微生物ＧＩ６１８／ｐＡＺＲを培養すると、不
純物が少なく、純度が高いＡＺＲを効率的に得ることが
できることが判る。

【００４７】尚、本発明においては、前記具体的実施例
に示すものに限られず、目的、用途に応じて本発明の範
囲内で種々変更した実施例とすることができる。

【００４８】

【発明の効果】本第１発明及び第２発明により得られた
ＡＺＲは、アゾ染料を生物学的に分解することができる
ので、アゾ染料含有排水の処理や、染色基材上に適用す
ることにより、捺染、白抜抜染を行う等、アゾ系染料の
還元分解が要求される幅広い分野において利用すること
ができる。また、本第３発明乃至第６発明の遺伝子によ
れば、アゾ染料の脱色や排水処理等に好適に使用するこ
とができるＡＺＲを効率的に産生できる他、ＡＺＲを生
物学的に産生するために、ＡＺＲ産生能を有する形質転
換微生物を得るのに好適に使用することができる。ま
た、本第７発明乃至第９発明の組換えベクターによれ
ば、本第３発明乃至本第６発明の遺伝子を宿主に導入す
ることにより、ＡＺＲ産生能を有する形質転換体を得る
ことができる。

【００４９】本第１０発明乃至第１２発明の形質転換体
によれば、ＡＺＲ産生能のない微生物であっても、形質
転換によりＡＺＲ産生能を持たせることができる。これ
により、本第１３発明のＡＺＲの製造方法に示すよう
に、かかる形質転換体を培養することにより、アゾ染料
還元分解活性の高いＡＺＲを効率的に得ることができ
る。そして、本第１４発明乃至第１６発明に示すよう
に、上記形質転換体やＡＺＲをアゾ染料含有排水に適用
することにより、アゾ染料含有排水を好適に処理するこ
とができる。また、本第１７発明乃至第１９発明に示す
ように、上記形質転換体やＡＺＲを用いて、アゾ系染料
による着色を消失若しくは低減させて捺染を行うことが
できる。

【００５０】

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Osaka Prefecture; Yushiro Chemical Industry co.,Ltd. <120> Azoreductase, Genes Encoding Azoreductase, Recombinant vector, Tra nsformation, Process for producing Azoreductase, Method of waste water t reatment and method for printing <130> P1758 <160> 6 <210> 1 <211> 178 <212> PRT <213> Bacillus sp.OY1-2 <400> １ Met Lys Leu Val Val Ile Asn Gly Thr Pro Arg Lys Phe Gly Arg Thr 1 5 10 15 Arg Val Val Ala Lys Tyr Ile Ala Asp Gln Phe Glu Gly Glu Leu Tyr 20 25 30 Asp Leu Ala Ile Glu Glu Leu Pro Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Ser Gln 35 40 45 Arg Asp Leu Glu Ala Val Lys Lys Leu Lys Thr Leu Val Lys Ala Ala 50 55 60 Asp Gly Val Val Leu Cys Thr Pro Glu Tyr His Asn Ala Met Ser Gly 65 70 75 80 Ala Leu Lys Asn Ser Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Ser Glu Phe Ile His 85 90 95 Lys Pro Val Ala Leu Leu Ala Val Ala Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile 100 105 110 Asn Ala Leu Asn Ser Met His Ala Ser Leu Ala Gly Val Tyr Ala Asn 115 120 125 Ala Ile Pro Lys Gln Val Val Leu Asp Gly Leu His Val Gln Asp Gly 130 135 140 Glu Leu Gly Glu Asp Ala Lys Pro Leu Ile His Asp Val Val Lys Glu 145 150 155 160 Leu Lys Ala Tyr Met Ser Val Tyr Lys Glu Val Lys Lys Gln Leu Gly 165 170 175 Val Glu <210> 2 <211> 537 <212> DNA <213> Bacillus sp.OY1-2 <400> 2 atg aaa cta gtc gtt att aac ggt aca cca aga aaa ttt ggt aga act 48 Met Lys Leu Val Val Ile Asn Gly Thr Pro Arg Lys Phe Gly Arg Thr 1 5 10 15 cgc gtg gtg gca aaa tat att gcg gat caa ttt gaa ggg gaa tta tat 96 Arg Val Val Ala Lys Tyr Ile Ala Asp Gln Phe Glu Gly Glu Leu Tyr 20 25 30 gat tta gca att gag gag tta cct tta tac aat gga gaa gag tcg caa 144 Asp Leu Ala Ile Glu Glu Leu Pro Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Ser Gln 35 40 45 cgt gat tta gag gca gta aaa aaa tta aaa acg tta gtg aaa gct gcg 192 Arg Asp Leu Glu Ala Val Lys Lys Leu Lys Thr Leu Val Lys Ala Ala 50 55 60 gat ggg gtt gta tta tgt aca cca gaa tat cat aat gcg atg agc ggt 240 Asp Gly Val Val Leu Cys Thr Pro Glu Tyr His Asn Ala Met Ser Gly 65 70 75 80 gcg ctg aaa aac tct tta gat tac tta agt agt agt gaa ttt att cat 288 Ala Leu Lys Asn Ser Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Ser Glu Phe Ile His 85 90 95 aaa cca gtt gca ttg tta gcg gtt gct ggt ggc ggt aaa ggt gga ata 336 Lys Pro Val Ala Leu Leu Ala Val Ala Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile 100 105 110 aat gca tta aac agc atg cac gcg tcg cta gca ggt gtt tat gca aat 384 Asn Ala Leu Asn Ser Met His Ala Ser Leu Ala Gly Val Tyr Ala Asn 115 120 125 gca att cca aaa caa gtt gtg ctt gat gga tta cat gtg caa gat ggt 432 Ala Ile Pro Lys Gln Val Val Leu Asp Gly Leu His Val Gln Asp Gly 130 135 140 gaa ctt ggg gaa gat gca aaa cca tta att cat gat gta gtt aaa gaa 480 Glu Leu Gly Glu Asp Ala Lys Pro Leu Ile His Asp Val Val Lys Glu 145 150 155 160 ttg aaa gca tat atg agc gta tat aaa gag gtg aaa aaa caa cta gga 528 Leu Lys Ala Tyr Met Ser Val Tyr Lys Glu Val Lys Lys Gln Leu Gly 165 170 175 gtg gag tga 537 Val Glu <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer using for generation of probe for screening <400> 3 atgaarytig tigtiathaa ygg <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer using for generation of probe for screening <400> 4 arcytciccc ytcraaytgr tc <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer using for amplification of the entire open reading frame of AZR by PCR <400> 5 catatgaaac tagtcgttat taac <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer using for amplification of the entire open reading frame of AZR by PCR <400> 6 tctagagcag atagactatt ggctcc

【００５１】

【配列表フリーテキスト】

【００５２】

【配列番号３】スクリーニング用プローブの調製に使用
するプライマーとして設計したオリゴヌクレオチド。

【００５３】

【配列番号４】スクリーニング用プローブの調製に使用
するプライマーとして設計したオリゴヌクレオチド。

【００５４】

【配列番号５】ＰＣＲ法によるＡＺＲの転写解読枠の増
幅に使用するプライマーとして設計したオリゴヌクレオ
チド。

【００５５】

【配列番号６】ＰＣＲ法によるＡＺＲの転写解読枠の増
幅に使用するプライマーとして設計したオリゴヌクレオ
チド。

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えベクターｐＴｒｘ−ＡＺＲを得る実験の
説明図である。

【図２】組換えＡＺＲのカラムクロマトグラフィーにお
ける流出分画とＡＺＲ濃度との関係を示したグラフであ
る。

【図３】精製した組換えＡＺＲをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
析した結果を示す写真である。

【図４】組換えＡＺＲの各温度における相対活性のグラ
フである。

【図５】菌株ＯＹ１−２とＧＩ６１８／ｐＡＺＲを用い
て行ったアゾ染料還元分解活性と時間との関係を表した
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/02 9/02 Ｄ０６Ｐ 5/00 １２０Ｂ Ｄ０６Ｐ 5/00 １２０ １２１ １２１ 5/12 １０１ 5/12 １０１ 5/13 Ａ 5/13 Ｃ１２Ｒ 1:07） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｆ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 鈴木 定彦 大阪府大阪市東成区中道１−３−69 大阪 府立公衆衛生研究所内 (72)発明者 淵上 正晴 神奈川県高座郡寒川町田端1580番地 ユシ ロ化学工業株式会社内 (72)発明者 横山 正 神奈川県高座郡寒川町田端1580番地 ユシ ロ化学工業株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA17 BA08 DA06 EA04 GA11 GA19 HA12 4B050 CC01 CC03 DD02 FF04E FF05E FF09E FF11E FF14E LL10 4B065 AA16Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA28 CA56 CA60 4D050 AA13 AB03 AB17 BC04 4H057 AA02 BA24 CA04 CB03 CC03 DA01 GA04

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミ
   ノ酸配列を有することを特徴とするアゾ染料還元分解酵
   素。
2. 【請求項２】 （ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
   において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加さ
   れたアミノ酸配列を有し、且つアゾ染料を還元分解する
   ことができることを特徴とするアゾ染料還元分解酵素。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のアゾ染料還元分
   解酵素をコードすることを特徴とする遺伝子。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２に記載の核酸配列を
   有する請求項３記載の遺伝子。
5. 【請求項５】 上記遺伝子がバチルス属起源である請求
   項３又は４記載の遺伝子。
6. 【請求項６】 上記バチルス属がバチルス（Ｂａｃｉｌ
   ｌｕｓ）ＯＹ１−２（受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−５２
   ６１号）である請求項５記載の遺伝子。
7. 【請求項７】 上記請求項３乃至６のいずれかに記載の
   遺伝子を含むことを特徴とする組換えベクター。
8. 【請求項８】 上記組換えベクターが組換えプラスミド
   ベクターである請求項７記載の組換えベクター。
9. 【請求項９】 上記組換えプラスミドベクターがプラス
   ミドベクターｐＴｒｘ−ＡＺＲである請求項８記載の組
   換えベクター。
10. 【請求項１０】 宿主に上記請求項７乃至９のいずれか
    に記載の組換えベクターを導入して形質転換したことを
    特徴とする形質転換体。
11. 【請求項１１】 上記宿主が微生物である請求項１０記
    載の形質転換体。
12. 【請求項１２】 上記形質転換体が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
    ｉ）ＧＩ６１８／ｐＡＺＲ（受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ
    −７１４２号）である請求項１１記載の形質転換体。
13. 【請求項１３】 上記請求項１０乃至１２のいずれかに
    記載の形質転換体を培地で培養し、培養物よりアゾ染料
    還元分解酵素を採取することを特徴とするアゾ染料還元
    分解酵素の製造方法。
14. 【請求項１４】 アゾ染料含有排水に上記請求項１又は
    ２に記載のアゾ染料還元分解酵素を添加することを特徴
    とするアゾ染料含有排水の処理方法。
15. 【請求項１５】 アゾ染料含有排水に上記請求項１０乃
    至１２のうちのいずれかに記載の形質転換体を適用する
    ことを特徴とするアゾ染料含有排水の処理方法。
16. 【請求項１６】 アゾ染料含有排水に上記請求項１３に
    記載のアゾ染料還元分解酵素の製造方法により得られた
    アゾ染料還元分解酵素を添加することを特徴とするアゾ
    染料含有排水の処理方法。
17. 【請求項１７】 染色基材上に、アゾ系染料及び上記請
    求項１又は２に記載のアゾ染料還元分解酵素のうちの少
    なくとも該酵素を含む液若しくは糊剤を所望形状に塗布
    し、その後、該酵素を作用させて上記アゾ系染料による
    着色を消失若しくは低減させて捺染を行うことを特徴と
    する捺染方法。
18. 【請求項１８】 染色基材上に、アゾ系染料及び上記請
    求項１０乃至１２のうちのいずれかに記載の形質転換体
    を含む液若しくは糊剤を所望形状に塗布し、その後、上
    記アゾ系染料による着色を消失若しくは低減させて捺染
    を行うことを特徴とする捺染方法。
19. 【請求項１９】 染色基材上に、アゾ系染料及び上記請
    求項１３に記載のアゾ染料還元分解酵素の製造方法によ
    り得られたアゾ染料還元分解酵素のうちの少なくとも該
    酵素を含む液若しくは糊剤を所望形状に塗布し、その
    後、該酵素を作用させて上記アゾ系染料による着色を消
    失若しくは低減させて捺染を行うことを特徴とする捺染
    方法。