CN106566837A - 一种海洋细菌来源ι‑卡拉胶酶基因及其应用 - Google Patents

一种海洋细菌来源ι‑卡拉胶酶基因及其应用 Download PDF

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CN106566837A CN201611031879.1A CN201611031879A CN106566837A CN 106566837 A CN106566837 A CN 106566837A CN 201611031879 A CN201611031879 A CN 201611031879A CN 106566837 A CN106566837 A CN 106566837A
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Abstract

本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体来讲涉及一种海洋细菌来源ι‑卡拉胶酶基因及其应用。本发明包括如下步骤：①PCR法获得来源于海洋细菌C.lytica M9编码ι‑卡拉胶酶的基因Cly‑ι‑car；②构建ι‑卡拉胶酶编码基因Cly‑ι‑car的重组工程菌株BL21‑Cly‑ι‑CAR；③ι‑卡拉胶酶编码基因Cly‑ι‑car的重组酶R‑BL21‑Cly‑ι‑CA的制备。本发明利用比较基因组学分析和同源克隆相结合的PCR方法，以海洋细菌为来源获得了一种全新的ι‑卡拉胶酶基因，并且将其应用于大肠杆菌工程菌株的构建，为实现工业化生产卡拉胶提供基础。

Description

一种海洋细菌来源ι-卡拉胶酶基因及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体来讲涉及一种海洋细菌来源ι-卡拉胶酶基因及其应用。
背景技术
卡拉胶是以1,4-α-D-吡喃半乳糖和1,3-β-D-吡喃半乳糖为骨架，交替连接成线性的硫酸多糖，常见的卡拉胶包括κ-卡拉胶、ι-卡拉胶及λ-卡拉胶三种。卡拉胶由于自身独特的化学结构具有广泛的应用。但由于卡拉胶具有分子量大、粘度大、溶解度低等缺点限制了其进一步应用。卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物，不但克服了上述卡拉胶的缺点，同时部分活性集团得到进一步暴露，具有新的活性。
目前，制备卡拉胶寡糖的方法主要包括物理降解法、化学降解法及酶解法。与前两者相比，酶解法以其反应条件温和、底物及产物具有特异性等优点成为较为理想的制备方式。但酶解法制备工艺中的瓶颈问题是高质量卡拉胶酶的来源。尽管很多产卡拉胶酶的菌株被发现，并对其产酶条件进行了优化，但酶的来源方面还存在以下方面问题：①产酶量和酶活力较低，无法达到规模化生产的要求；②野生菌株培养体系复杂，海洋来源需要大量的NaCl，为后续卡拉胶寡糖的纯化增加产本产酶条件不稳定；③容易出现菌种退化，无法实现连续生产等。因此采用分子生物学技术从编码卡拉胶酶的功能基因入手，通过基因克隆、序列分析、重组表达、表达特性及构效关系方面的研究是解决上述酶源问题的有效方法之一。而获得优良的编码卡拉胶酶的基因是进行上述工作的基础。
中国专利(CN 103773785)公开一种ι-卡拉胶降解酶基因及其制备方法和应用。将编码ι-卡拉胶降解酶的基因序列通过pET-32a(+)载体转化大肠杆菌，构建工程菌株。诱导工程菌株制备重组ι-卡拉胶酶，并应用于聚合度为2-10的卡拉胶寡糖的制备。
目前，多数研究者还是采用文库构建等传统方法获取卡拉胶酶基因。但文库构建工作费时费力，需要通过大量筛选获得阳性克隆，进而通过亚克隆等环节才能获得完整基因。伴随着高通量测序技术的发展，海量基因组被解析并释放基因组数据，如何借助这些基因组数据服务于卡拉胶酶基因的挖掘是亟待解决的问题。如果有一种方法能在比较基因组学分析的基础上，借助于传统同源克隆的原理而从基因组中通过一次PCR方法获得完整目的基因，则可以免除上述文库构建的繁琐工作，从而实现目的基因的高效获得。
发明内容
本发明的目的是：①提供来源于海洋细菌C.lytica M9编码ι-卡拉胶酶的基因Cly-ι-car；②提供来源于海洋细菌C.lytica M9编码ι-卡拉胶酶的基因Cly-ι-car的重组工程菌株BL21-Cly-ι-CAR的制备方法；③提供来源于海洋细菌C.lytica M9编码ι-卡拉胶酶的基因Cly-ι-car的重组酶R-BL21-Cly-ι-CA的制备方法。
本发明采用的技术方案为：
一种以海洋细菌为来源获取的ι-卡拉胶酶基因，其核苷酸序列为Seq ID.NO.1，该基因DNA序列全长1392bp，编码463个氨基酸。
一种以海洋细菌为来源获取的ι-卡拉胶酶基因的获取方法，包括如下步骤：
(1)根据海洋细菌C.lytica M9(菌种保藏号：CGMCC No：10829)中16s RNA序列构建系统进化树，找到与目的菌株最相近且具有全基因组数据的参考菌株(Cellulophagalytica DSM 7489,基因组数据信息NC_015167)；
(2)根据基因组注释信息找到参考菌株(C.lytica DSM 7489)基因组中编码ι-卡拉胶酶的基因序列(Celly_2571，编号gi|325284916:c2942676-2941285)，同时确定该参考菌株中编码ι-卡拉胶酶的相邻上游基因Celly_2570和下游基因Celly_2572及分别对应的核苷酸和氨基酸序列；
(3)根据相邻上下游基因(Celly_2570和Celly_2572)的氨基酸序列通过BlockMaker在线软件程序进行比对和寻找保守核心区域，其中Celly_2570的核心保守序列为NVLLNLDEK，Celly_2572的核心保守序列为RIPPQVGKY；
(4)根据Celly_2570基因的核心保守序列NVLLNLDEK，采用CODEHOP软件设计正向引物，正向引物序列为GTGGCGTTATGGCTTTGGAA，根据Celly_2572基因的核心保守序列RIPPQVGKY，采用CODEHOP软件设计反向引物，反向引物序列为TGCAAACACTAAACCCAGCG；
(5)以目的菌株C.lytica M9基因组为模板，利用步骤(4)中所述的引物经一步PCR方法获得一种全新的海洋细菌为来源，含有编码完整ι-卡拉胶酶基因的原始编码序列，其核苷酸序列为Seq ID.NO.1，该基因DNA序列全长1392bp，编码463个氨基酸。
一种以海洋细菌为来源获取的ι-卡拉胶酶基因的应用，包括如下步骤：
(1)海洋细菌C.lytica M9来源基因ι-卡拉胶酶基因的重组表达质粒和重组菌株的构建
①基于获得的ι-卡拉胶酶基因的全长序列，设计获取目的基因成熟肽部分的上下游引物：
上游引物Cly-ι-Car-F CATATGGATGATGACACCAATGAAAAAGAAG
下游引物Cly-ι-Car-R CTCGAGTTAGTTGCAATTACCTTCTTCAG)；
②采用含有ι-卡拉胶酶基因原始编码序列的质粒pMD-18T-原始编码序列模板，通过PCR方法获得目的基因成熟肽部分序列，采用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切PCR产物，胶回收酶切之后的片段，跟同样经过Nde I和Xho I双酶切的质粒pET-28a(+)连接，按照CaCl2转化法转化到大肠杆菌TOP10中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆；
③提取阳性克隆质粒，通过测序和Nde I和Xho I双酶切鉴定，获得目的基因的重组表达质粒pET-28a(+)-Cly-ι-car，将该质粒进一步转化到大肠杆菌BL21中，构建重组表达工程菌株BL21-Cly-ι-CAR；
(2)利用重组表达菌株BL21-Cly-ι-CAR表达重组ι-卡拉胶酶
①将活化好的重组表达菌株BL21-Cly-ι-CAR按照1:100的体积比转接到含有20pg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.8；
②将培养液温度降至18℃度左右，加入终浓度为0.l mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为18℃，转速100r/min，培养24h，离心收集菌体，将菌体重悬于海洋细菌C.lyticaM9发酵培养基中(C.lytica M9发酵培养基：每100ml陈海水中卡拉胶0.1％、蛋白胨0.5％、FeSO4.7H2O 0.002％)，在冰上进行超声波破碎处理，低温离心收集上清，SDS-PAGE检测上清中目的基因的表达量。
(3)重组R-BL21-Cly-ι-CAR酶的活性检测
利用DNS(3,5—二硝基水杨酸)方法测定纯化的重组R-BL21-Cly-ι-CAR酶活性。具体操作：取1ml超声破碎后上清液即粗酶液，对照组酶液沸水浴5min灭活，对照组和实验组分别加入1ml浓度为0.2％(w/v)的ι-卡拉胶底物溶液，于45℃水浴反应30min，加入2mlDNS溶液，煮沸5min，迅速冷却后用紫外分光光度计于540nm下测定OD值，根据葡萄糖标准曲线求出反应液中的还原糖含量。
一种以海洋细菌为来源获取的ι-卡拉胶酶基因所编码的ι-卡拉胶酶，ι-卡拉胶酶的氨基酸序列为Seq ID.NO.2，属于糖苷水解酶GH82家族。
本发明的有益效果为：本发明通过一种新的、高效、准确的途径，以海洋细菌为来源获得了一种全新的ι-卡拉胶酶基因，并且将其应用与大肠杆菌工程菌株的构建，为实现工业化生产卡拉胶提供基础，通过本发明中的方法获得的以海洋细菌为来源的ι-卡拉胶酶基因，与已知ι-卡拉胶酶序列相似性最高为88％(NCBI:AGN70890.1,Cellulophagasp.QY3)，酶活达到40-60U/ml，可应用于工业生产。
附图说明
图1为重组ι-卡拉胶酶的SDS-PAGE电泳图，其中条带M为protein marker、条带2为对照组、条带3为表达整个目的基因实验组的重组ι-卡拉胶酶、条带4为仅表达目的基因成熟肽部分的重组ι-卡拉胶酶，箭头所指位置为目的条带；
图2为重组ι-卡拉胶酶的酶谱图，其中，条带M为protein marker、条带1为重组ι-卡拉胶酶。
具体实施方式
结合具体实施方式和说明书附图对本发明做进一步说明。
1.以海洋细菌为来源获取的ι-卡拉胶酶基因的获取
(1)根据海洋细菌C.lytica M9(菌种保藏号：CGMCC No：10829)中16s RNA序列构建系统进化树，找到与目的菌株最相近且具有全基因组数据的参考菌株(Cellulophagalytica DSM 7489,基因组数据信息NC_015167)；
(2)根据基因组注释信息找到参考菌株(C.lytica DSM 7489)基因组中编码ι-卡拉胶酶的基因序列(Celly_2571，编号gi|325284916:c2942676-2941285)，同时确定该参考菌株中编码ι-卡拉胶酶的相邻上游基因Celly_2570和下游基因Celly_2572及分别对应的核苷酸和氨基酸序列；
(3)根据相邻上下游基因(Celly_2570和Celly_2572)的氨基酸序列通过BlockMaker在线软件程序进行比对和寻找保守核心区域，其中Celly_2570的核心保守序列为NVLLNLDEK，Celly_2572的核心保守序列为RIPPQVGKY；
(4)根据Celly_2570基因的核心保守序列NVLLNLDEK，采用CODEHOP软件设计正向引物，正向引物序列为GTGGCGTTATGGCTTTGGAA，根据Celly_2572基因的核心保守序列RIPPQVGKY，采用CODEHOP软件设计反向引物，反向引物序列为TGCAAACACTAAACCCAGCG；
(5)以目的菌株C.lytica M9基因组为模板，利用步骤(4)中所述的引物经一步PCR方法获得卡拉胶酶基因的全长DNA序列，PCR采用TaKaRa公司的LA试剂盒，体系(总体积25μL)具体如下：10×LA Buffer II(Mg2+free)，2.5μL；MgCl2(25mM)，2.5μL；dNTPMixture(各2.5mM)，4μL；正向引物(10μM)，1μL；反向引物(10μM)，1μL；基因组模板(50ng/μL)，1μL；LA-Taq(5U/μL)，0.2μL；ddH2O，12.8μL。反应条件如下：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火58℃30s；35个循环；延伸72℃3min(1Kb/min)；延伸72℃10min；保温4℃。扩增结束后，1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，上样量为3μL。随后对目的片段进行胶回收，连接到克隆载体pMD-18T上，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，PCR进行阳性克隆筛选后测序，得到含有pMD-18T-原始编码序列的菌株。本发明得到海洋细菌C.lytica M9来源长度为3226bp的原始编码序列，其中包括一个完整的编码ι-卡拉胶酶基因的ORF(498-1889)。该基因DNA序列全长1392bp，编码463个氨基酸。
2.海洋细菌C.lytica M9来源基因ι-卡拉胶酶基因的重组表达质粒和重组菌株的构建
①基于获得的ι-卡拉胶酶基因的全长序列，设计获取目的基因成熟肽部分的上下游引物：
上游引物Cly-ι-Car-F CATATGGATGATGACACCAATGAAAAAGAAG
下游引物Cly-ι-Car-R CTCGAGTTAGTTGCAATTACCTTCTTCAG)；
②采用含有ι-卡拉胶酶基因原始编码序列的质粒pMD-18T-原始编码序列模板，通过PCR方法获得目的基因成熟肽部分序列，采用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切PCR产物，胶回收酶切之后的片段，跟同样经过Nde I和Xho I双酶切的质粒pET-28a(+)连接，按照CaCl2转化法转化到大肠杆菌TOP10中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆；
③提取阳性克隆质粒，通过测序和Nde I和Xho I双酶切鉴定，获得目的基因的重组表达质粒pET-28a(+)-Cly-ι-car，将该质粒进一步转化到大肠杆菌BL21中，构建重组表达工程菌株BL21-Cly-ι-CAR；
3.利用重组表达菌株BL21-Cly-ι-CAR表达重组ι-卡拉胶酶
①将活化好的重组表达菌株BL21-Cly-ι-CAR按照1:100的体积比转接到含有20pg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.8；
②将培养液温度降至18℃度左右，加入终浓度为0.l mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为18℃，转速100r/min，培养24h，离心收集菌体，将菌体重悬于海洋细菌C.lyticaM9发酵培养基中(C.lytica M9发酵培养基：每100ml陈海水中卡拉胶0.1％、蛋白胨0.5％、FeSO4.7H2O 0.002％)，在冰上进行超声波破碎处理，低温离心收集上清，SDS-PAGE检测上清中目的基因的表达量。
4.重组R-BL21-Cly-ι-CAR酶的活性检测
利用DNS(3,5—二硝基水杨酸)方法测定纯化的重组R-BL21-Cly-ι-CAR酶活性。具体操作：取1ml超声破碎后上清液即粗酶液，对照组酶液沸水浴5min灭活，对照组和实验组分别加入1ml浓度为0.2％(w/v)的ι-卡拉胶底物溶液，于45℃水浴反应30min，加入2ml DNS溶液，煮沸5min，迅速冷却后用紫外分光光度计于540nm下测定OD值，根据葡萄糖标准曲线求出反应液中的还原糖含量。测得的卡拉胶酶活性为55.23U/ml。配制含0.2％的ι-卡拉胶的SDS-PAGE电泳胶，进行正常的不连续SDS-PAGE电泳，电泳完毕，将凝胶取下先用预冷的蒸馏水漂洗，洗去电泳缓冲液，然后加入适量2.5％TritonX-100，摇床复性1h，倒掉之后，加入TritonX-100洗脱液洗脱30min，重复两次。倒掉洗脱液后加入适量孵育液，40℃孵育过夜后取出，预冷蒸馏水漂洗后，Alcian blue染色后蒸馏水脱色，直至出现清晰降解亮带。结果表明这个重组表达的Cly-ι-CAR酶是具有ι-卡拉胶降解活性的，为后续的研究和应用提供了良好材料。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，按照本领域的普通技术知识和通用方法，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连大学
<120> 一种海洋细菌来源ι-卡拉胶酶基因及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> Cellulpphaga lytica M9
<400> 1
atgaagaaaa acaattttaa gtcaattatt tttatattat tagcaattaa cataataaca 60
tcatgctcta ataaggatga tgacaccaat gaaaaagaag acccaatatc aaataacgat 120
cctcttgttt acgtaggcca aactacaaat gatagattaa cagataacga agaacgtttt 180
tataaagata aaattccaaa taaagaactt gtagcaacct taaatggtaa ttgcaatcca 240
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ttaaaaatag atcctgaagc tataatagag cccgatttaa gcggaaacat taaaaacaaa 420
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acgctaacag acagcttctc taagttttca aatattgttt taaacctacc tgctagttca 660
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ggtgaaggcg gtattacaat gagagtagaa actggtgctg caaaaacaaa tatgttaaac 840
gaaaaaactg tagacgatat tgttgttaga gatattaccg taaaaaatgg cgatgccgct 900
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gctgttagaa ataatgctag ctctaatgct gattgcgcta atggtagtga tggaggttgc 1260
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tttacttatc caagtagtga aataaaaggc tgtcctaaag ttaaaaaacc tgaagaaggt 1380
aattgcaact aa 1392
<210> 2
<211> 463
<212> protein
<213> Cellulpphaga lytica M9
<400> 2
MKKNNFKSII FILLAINIIT SCSNKDDDTN EKEDPISNND PLVYVGQTTN DRLTDNEERF 60
YKDKIPNKEL VATLNGNCNP LDSGILNNEI ESLSNDGGGV IRIPKGNYCL RDIILRSKYH 120
LKIDPEAIIE PDLSGNIKNK NITIFVVGED FYLENVSITN LDEDNTDRST WFLSNIPNGE 180
YGGVKLVEFG NVKNFKLSGI TLTDSFSKFS NIVLNLPASS KTNEVSTKGV IKNVFMTNMH 240
VGYGVIQMQT GRSILCKNIS GEGGITMRVE TGAAKTNMLN EKTVDDIVVR DITVKNGDAA 300
MNFSPHRVDQ GRVDVERVIA TNSTHAVQIA AGFLDNNTNG VNNLGTFDSK SYIGDVTVTG 360
GYGAQIKGKD YKYFSCDKRK ELIEKCYNPD DESVTGTSIS AVRNNASSNA DCANGSDGGC 420
YEIIIGRITK TNEDFELNDF FTYPSSEIKG CPKVKKPEEG NCN 463

Claims (4)

1.一种以海洋细菌为来源获取的ι-卡拉胶酶基因，其特征在于，核苷酸序列为SeqID.NO.1，该基因DNA序列全长1392bp，编码463个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的一种以海洋细菌为来源获取的ι-卡拉胶酶基因的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据海洋细菌C.lytica M9中16s RNA序列构建系统进化树，找到与目的菌株最相近且具有全基因组数据的参考菌株；
(2)根据基因组注释信息找到参考菌株C.lytica DSM 7489基因组中编码ι-卡拉胶酶的基因序列(Celly_2571，编号gi|325284916:c2942676-2941285)，同时确定该参考菌株中编码ι-卡拉胶酶的相邻上游基因Celly_2570和下游基因Celly_2572及分别对应的核苷酸和氨基酸序列；
(3)根据相邻上下游基因(Celly_2570和Celly_2572)的氨基酸序列通过Block Maker在线软件程序进行比对和寻找保守核心区域，其中Celly_2570的核心保守序列为NVLLNLDEK，Celly_2572的核心保守序列为RIPPQVGKY；
(4)根据Celly_2570基因的核心保守序列NVLLNLDEK，采用CODEHOP软件设计正向引物，正向引物序列为GTGGCGTTATGGCTTTGGAA，根据Celly_2572基因的核心保守序列RIPPQVGKY，采用CODEHOP软件设计反向引物，反向引物序列为TGCAAACACTAAACCCAGCG；
(5)以目的菌株C.lytica M9基因组为模板，利用步骤(4)中所述的引物经一步PCR方法获得一种全新的海洋细菌为来源，含有编码完整ι-卡拉胶酶基因的原始编码序列，其核苷酸序列为Seq ID.NO.1，该基因DNA序列全长1392bp，编码463个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的一种以海洋细菌为来源获取的ι-卡拉胶酶基因的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)海洋细菌C.lytica M9来源基因ι-卡拉胶酶基因的重组表达质粒和重组菌株的构建①基于获得的ι-卡拉胶酶基因的全长序列，设计获取目的基因成熟肽部分的上下游引物：
上游引物Cly-ι-Car-F CATATGGATGATGACACCAATGAAAAAGAAG
下游引物Cly-ι-Car-R CTCGAGTTAGTTGCAATTACCTTCTTCAG)；
②采用含有ι-卡拉胶酶基因原始编码序列的质粒pMD-18T-原始编码序列模板，通过PCR方法获得目的基因成熟肽部分序列，采用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切PCR产物，胶回收酶切之后的片段，跟同样经过Nde I和Xho I双酶切的质粒pET-28a(+)连接，按照CaCl2转化法转化到大肠杆菌TOP10中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆；
③提取阳性克隆质粒，通过测序和Nde I和Xho I双酶切鉴定，获得目的基因的重组表达质粒pET-28a(+)-Cly-ι-car，将该质粒进一步转化到大肠杆菌BL21中，构建重组表达工程菌株BL21-Cly-ι-CAR；
(2)利用重组表达菌株BL21-Cly-ι-CAR表达重组ι-卡拉胶酶
①将活化好的重组表达菌株BL21-Cly-ι-CAR按照1:100的体积比转接到含有20pg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养至OD600达到0.6-0.8；
②将培养液温度降至18℃度左右，加入终浓度为0.l mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为18℃，转速100r/min，培养24h，离心收集菌体，将菌体重悬于海洋细菌C.lytica M9发酵培养基中(C.lytica M9发酵培养基：每100ml陈海水中卡拉胶0.1％、蛋白胨0.5％、FeSO4.7H2O 0.002％)，在冰上进行超声波破碎处理，低温离心收集上清，SDS-PAGE检测上清中目的基因的表达量；
(3)重组R-BL21-Cly-ι-CAR酶的活性检测
利用DNS(3,5—二硝基水杨酸)方法测定纯化的重组R-BL21-Cly-ι-CAR酶活性，具体操作：取1ml超声破碎后上清液即粗酶液，对照组酶液沸水浴5min灭活，对照组和实验组分别加入1ml浓度为0.2％(w/v)的ι-卡拉胶底物溶液，于45℃水浴反应30min，加入2ml DNS溶液，煮沸5min，迅速冷却后用紫外分光光度计于540nm下测定OD值，根据葡萄糖标准曲线求出反应液中的还原糖含量。
4.根据权利要求1所述的一种以海洋细菌为来源获取的ι-卡拉胶酶基因所编码的ι-卡拉胶酶，其特征在于，ι-卡拉胶酶的氨基酸序列为Seq ID.NO.2，属于糖苷水解酶GH82家族。
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