CN109929859A - 一种κ-卡拉胶酶编码基因及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于海南土地杆菌(Pedobacter hainanensis Q‑13)的κ‑卡拉胶酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该κ‑卡拉胶酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的κ‑卡拉胶酶，能高效降解κ‑卡拉胶。本发明提供的κ‑卡拉胶酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药、化妆品及卡拉胶寡糖制备等领域。

Description

一种κ-卡拉胶酶编码基因及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种κ-卡拉胶酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该κ-卡拉胶酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本发明提供的κ-卡拉胶酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药、化妆品及寡糖制备等领域。

背景技术

卡拉胶(Carrageenan)，又称角叉菜胶、麒麟菜胶。是一种从红藻细胞壁中提取的含有D-半乳糖的多糖。卡拉胶属于亲水的线性硫酸化半乳糖家族，是由β-1,3-D-半乳糖和α-1,4-D-半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。这些聚糖以单糖的连接方式和基团的位置可分为6种基本形式：Kappa(κ-)，Iota(ι-)，Lambda(λ-)，Mu(μ-)，Nu(ν-)和Theta(θ-)卡拉胶。而商业化(即有经济效益)的卡拉胶主要有κ-型、ι-型和λ-型三种。κ-卡拉胶由3,6-内醚-α-D-半乳糖和4-O-硫酸-β-D-半乳糖单位重复组成；κ-卡拉胶主要提取自热带海藻卡帕藻属中的耳突卡帕藻。

天然卡拉胶因分子量大、粘度大、溶解度低、扩散困难，很难被机体吸收，而且毒性很大，因此严重制约了卡拉胶在食品、药品等领域上的应用。卡拉胶的降解产物称为卡拉胶寡糖，其分子量较小、溶解性较好、稳定性和安全性都有所改善，同时分子链上的活性基团充分暴露，使得其原有活性得到提高，甚至产生了新的活性。卡拉胶降解形成的寡糖片段经过人工修饰、改造后获得的衍生物具有多种新型生理和药理活性，如抗病毒、抗凝血、抗溃疡、抗肿瘤等。因此降解卡拉胶聚糖得到寡糖，并对寡糖进行一定的化学修饰，提高寡糖活性，已经成为海洋新药物开发的重要途径。

目前主要采用化学法降解卡拉胶制备卡拉胶寡糖。化学降解方法的弊端是反应条件不易控制、环境不友好且卡拉胶酸水解寡糖的得率较低，产物化学结构受到破坏，目的产物不易分离等。相比较而言，酶作为一种特殊的催化剂，可在常温常压和温和的缓冲体系下，高效地进行催化反应，并且酶对作用底物具有严格的专一性，酶催化过程易于控制，产物易分离，酶产物得率较高，不但可以得到分子量范围比较广的降解产物，而且对寡糖的化学结构不会产生影响。鉴于酶解方法的诸多优点，充分利用海洋微生物这一丰富的自然资源，酶解法制备寡糖已经成为获取低聚糖的主要手段。

卡拉胶降解酶(carrageenase)是一种多糖水解酶，可以断裂卡拉胶的β-1,4-糖苷键。根据其酶解底物的专一性，主要可分为κ-卡拉胶酶(EC 3.2.1.83)，ι-卡拉胶酶(EC3.2.1.157)和λ-卡拉胶酶(EC 3.2.1.162)等。目前关于卡拉胶酶的研究主要集中于κ-卡拉胶酶和ι-卡拉胶酶类型方面。卡拉胶酶主要来自海洋微生物，例如：交替假单胞菌属Pseudoalteromonas、假单胞菌属Pseudomonas、交替单胞菌属Alteromonas、希氏瓦菌属Shewanella、黄杆菌属Flavobacterium和周氏菌属Zobella。目前卡拉胶酶还没有应用到实际生产中，主要原因就在于野生菌产生的卡拉胶酶的酶活不高并且生产成本较高，没有达到实际生产的要求。所以，筛选获得产生具有高酶活性的卡拉胶酶野生菌株，并借助基因水平进行高量表达和表征是提高卡拉胶酶产量和活性的一种有效措施。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于海南土地杆菌(Pedobacterhainanensis Q-13)的κ-卡拉胶酶CgκP及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型κ-卡拉胶酶CgκP的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的κ-卡拉胶酶CgκP基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种新型κ-卡拉胶酶CgκP在卡拉胶降解中的应用。

本发明所提供的κ-卡拉胶酶CgκP，来源于海南省陵水县麒麟菜晾晒处的土壤中分离纯化的海南土地杆菌Pedobacter hainanensis Q-13，从中扩增出的κ-卡拉胶酶CgκP编码基因(命名为CgκP)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有κ-卡拉胶酶活性的核苷酸序列。

本发明还提供了κ-卡拉胶酶CgκP的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：

1)序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-520位氨基酸残基序列，其中1-512位为具有κ-卡拉胶酶CgκP活性的氨基酸序列，512-519位为酶切位点及His-Tag的氨基酸序列；

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-520或1-512位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有κ-卡拉胶酶活性不变的氨基酸序列。

本发明的κ-卡拉胶酶CgκP的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的κ-卡拉胶酶CgκP的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶CgκP的方法，是将κ-卡拉胶酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的κ-卡拉胶酶。

上述κ-卡拉胶酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有κ-卡拉胶酶活性的核苷酸序列；

所述的重组表达κ-卡拉胶酶CgκP的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达κ-卡拉胶酶CgκP的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acidbacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

本发明的κ-卡拉胶酶CgκP的基因序列是通过PCR技术从海南土地杆菌(Pedobacter hainanensis Q-13)中克隆得到。该基因编码区长1566bp，属于糖苷水解酶GH(glycoside hydrolase)16家族。

本发明提供的κ-卡拉胶酶在降解卡拉胶中可以应用，包括以下应用中的一种或二种：

1)在断裂卡拉胶中β-1,4-糖苷键，获得卡拉胶寡糖中的应用；

2)在降解卡拉胶中糖苷键，仅获得三种产物为κ-4、κ-6、κ-8，便于分离的应用；

3)在对降解卡拉胶中酶活力为3000U/mg，具有高效降解能力的应用；

4)与其他卡拉胶酶混合后，在协同断裂卡拉胶中糖苷键方面的应用。

5)一种权利要求2所述的κ-卡拉胶酶在降解多种底物中特异性降解κ卡拉胶中的应用。

本发明从大肠杆菌重组表达获得的κ-卡拉胶酶CgκP，可以高效降解卡拉胶，以卡拉胶为底物时，在40℃、pH7.0的条件下具有最佳酶活性，酶活力为3000U/mg。解决了现有卡拉胶寡糖生产成本高的难题，具有重要的实用价值，可应用于大规模的工业化生产。

本发明的κ-卡拉胶酶CgκP可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药、化妆品及卡拉胶寡糖的制备等领域。

附图说明

图1：κ-卡拉胶酶CgκP琼脂糖凝胶电泳检测。

图2：κ-卡拉胶酶CgκP表达及纯化的SDS-PAGE图。各泳道加入的样品分别是：泳道1-蛋白分子量标准；泳道2-纯化后的卡拉胶酶。

图3：pH值对κ-卡拉胶酶CgκP的影响曲线。

图4：温度对κ-卡拉胶酶CgκP的影响曲线。

图5：κ-卡拉胶酶CgκP对卡拉胶降解产物的ESI/MS图谱。

图6：为重组酶CgκP对κ-卡拉胶的活性图。

具体实施方式

序列表

SEQIDNo.1的信息

(a)序列特征

长度：1566核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.1

ATGAGCAAATTTATGTTTGTGTGCCTGATTATTAGCTGCTTTAACAGCCAGGCGCAGACCATTCCGGCGAGCGCGGTGCAGGGCCATGAACGCTGGCAGCTGGATATTAGCCTGAGCGATGAATTTAACGAAACCGTGAACTATAACGAAAAATGGAAAATTCAGCCGAACAACGTGGCGGCGTGGACCTATGATAACGTGAACAACATTAGCGTGGCGGGCGGCGTGGCGCAGATTCGCGCGGTGTATAACCCGCATATTCGCAACTATAGCGGCAGCCCGCGCAACTTTTATTTTAAAAGCGGCATGCTGACCACCCAGGCGACCAAAGTGTATGGCTATTTTGAAGCGAAAATTAAAGGCGCGAGCCTGTTTCCGGGCGTGTGCCCGGCGTTTTGGCTGTTTAGCGATTTTGATCGCAGCAGCACCCAGAACGGCCATATTATTTATTGCGAAATTGATGCGGTGGAACTGCAGCAGAACGATTGGTATCTGGGCCATCAGGATGATGTGCGCGATATGGATCTGAACCTGCATGCGGTGGTGCGCGAAAACGGCGTGGAAGCGTGGAAACGCCCGAAAGCGTTTCCGGATCAGCAGCTGAACAAATATCGCGCGCCGTGGGATCCGCGCACCGGCTTTCATACCTATGCGGTGGAAAACCGCCCGGATAGCGTGTTTTGGTATGTGGATGGCAACCTGATTGGCAAAAAAGAAAACCTGTATTGGCATCGCCCGATGAACGTGACCCTGAGCCTGGGCATGCGCAGCCCGTTTGTGAAATTTGAAAACAACGCGTTTGTGCCGCAGCAGCCGGATACCAACCAGATTAGCAACTTTCCGACCTTTATGAGCGCGGATTATGTGCGCACCTGGGATGTGCTGCCGAGCCTGTGGCTGAAAGATAAAGAACGCTATATTCAGCAGAGCTTTTATACCGGCACCGATATTGCGGTGGATTGCAGCTTTCATCCGGGCAGCGGCCATAAAGTGATGAGCGGCCAGTGGAACGGCATTACCGTGAAACTGATTGAAAAAAACCAGGCGGGCACCAACGTGAAAGAATATGTGGCGAGCAACCCGAGCATTATTAACAGCTTTGGCGGCAGCGCGAAAGTGGTGCTGAGCCTGAAAAACGTGACCCCGAGCAGCAAACTGCCGGCGGGCAACTATTATGTGCTGGTGCCGGTGTATAAAAGCAGCAAAAACGGCGGCACCGATGTGTTTCTGAACGAAGGCATTAGCCCGGTGAGCATTGTGGCGCAGGGCGAAACCAGCGGCCAGACCGGCAACAGCCTGGAAACCGATAGCATTCATCTGTATCCGGTGCCGGCGGAAGATTGCCTGAACATTGAACTGAAAAACTGGCCGATTGGCATTTATTATCTGAGCCTGACCGATATGAACGGCGTGGTGGTGCTGAAAACCCAGGTGAACAACCCGAAAACCCAGCTGAACGTGGCGGGCTTTAAAGGCACCTATGTGGTGCAGGTGACCAGCGGCGGCAAAAAAGTGCGCGAAAAAGTGGTGATTAACTAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

SEQIDNo.2的信息

(a)序列特征

长度：520氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

(b)分子类型：蛋白

序列描述：SEQ ID NO.2

MSKFMFVCLIISCFNSQAQTIPASAVQGHERWQLDISLSDEFNETVNYNEKWKIQPNNVAAWTYDNVNNISVAGGVAQIRAVYNPHIRNYSGSPRNFYFKSGMLTTQATKVYGYFEAKIKGASLFPGVCPAFWLFSDFDRSSTQNGHIIYCEIDAVELQQNDWYLGHQDDVRDMDLNLHAVVRENGVEAWKRPKAFPDQQLNKYRAPWDPRTGFHTYAVENRPDSVFWYVDGNLIGKKENLYWHRPMNVTLSLGMRSPFVKFENNAFVPQQPDTNQISNFPTFMSADYVRTWDVLPSLWLKDKERYIQQSFYTGTDIAVDCSFHPGSGHKVMSGQWNGITVKLIEKNQAGTNVKEYVASNPSIINSFGGSAKVVLSLKNVTPSSKLPAGNYYVLVPVYKSSKNGGTDVFLNEGISPVSIVAQGETSGQTGNSLETDSIHLYPVPAEDCLNIELKNWPIGIYYLSLTDMNGVVVLKTQVNNPKTQLNVAGFKGTYVVQVTSGGKKVREKVVINLEHHHHHH

实施例1κ-卡拉胶酶CgκP；全长基因克隆

参照基因组DNA纯化试剂盒(Thermo，LOT 00105781)操作步骤提取海南土地杆菌Q-13的基因组DNA。对The National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中κ-卡拉胶酶基因序列进行多序列比对分析后，设计简并引物CgκP-F:5’-AGCATATGATGAGCAAATTTATGTTTGTG-3’；CgκP-R:5’-GCCTCGAGGTTAATCACCACTTTTTCG-3’，以提取的海南土地杆菌Q-13的基因组DNA为模板，扩增编码κ-卡拉胶酶成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。PCR反应条件为：94℃3min，1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃5min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的基因进行切胶回收，经双酶切的方法连接到原核表达载体pET21a上后测序。

实施例2κ-卡拉胶酶基因序列分析

测序结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，DNAMAN软件进行多序列比对，VectorNTI分析序列信息。

获得的κ-卡拉胶酶基因(命名为CgκP)编码区长1566bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示。CgκP编码512个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质理论分子量为58.83kDa，预测等电点为7.6。CgκP编码的氨基酸包含GH16家族中的κ-卡拉胶酶结构域以及Pro分泌系统C端分选结构域。。

实施例3CgκP基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化

为了便于基因的重组表达，在设计的上下游引物中分别引入NdeI和XhoI酶切位点。将PCR清洁产物CgκP和表达载体pET21a分别用NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经清洁回收后，用T₄DNA连接酶连接(连接体系：(5μLT₄DNA Ligase 0.5μL，10×T₄DNA LigaseBuffer 0.5μL，pET21a 2μL，PCR产物2μL)，连接条件：室温过夜连接。)。取5μL连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的固体Luria-Bertani培养基上，37℃培养12-16h。挑取单克隆，使用简并引物进行菌落PCR验证，将扩增正确的单克隆接入含有100μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；使用内切酶NdeI和XhoI对提取的质粒进行双酶切，结果正确的重组质粒送华大基因测序。测序结果表明，在pET21a的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO 1所示的CgκP基因，且插入方向正确，证明重组质粒构建成功，将该重组质粒命名为pET21a-CgκP。

将pET21a-CgκP转化E.coliBL21(DE3)，对其进行诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测κ-卡拉胶酶CgκP的表达及纯化情况，结果如图2所示，纯化后的κ-卡拉胶酶CgκP在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例4κ-卡拉胶酶CgκP的活性测定及酶学性质分析

(1)κ-卡拉胶酶CgκP的活力测定

以450μL 0.5％(w/v)的卡拉胶为底物，加入50μL重组酶CgκP，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol还原糖(以半乳糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。蛋白浓度使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

(2)pH对重组酶CgκP的影响

在25℃的条件下，分别以450μL 0.5％(w/v)，pH3.0-10.0(pH3.0Gly-HCl，pH4.0-5.0HAc-NaAc，pH6.0-7.0Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH8.0Tris-HCl，pH9.0-10.0Gly-NaOH)的卡拉胶为底物，加入50μL重组酶CgκP，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。以灭活的酶作为对照，以活性最高的值为100％，测定在各个反应pH下酶的相对活性。根据酶在不同pH下的相对活性绘制曲线，确定酶的最适反应pH。结果如图3所示，CgκP的最适反应pH为7.0，随着pH的升高或降低，CgκP的活性均降低。

(3)温度对重组酶CgκP的影响

在pH7.0的条件下，以450μL0.5％(w/v)卡拉胶为底物，分别在25-85℃下加入50μL重组酶CgκP，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。以灭活的酶为对照，以反应最高酶活力为100％计算相对酶活，根据酶在不同温度下的相对活性绘制曲线。结果如图4所示，CgκP的最适反应温度为40℃。

在最适温度和最适pH条件下，按标准方法测得CgκP的酶活力为3000U/mg。

(4)重组酶CgκP的底物特异性

选取κ-卡拉胶，ι-卡拉胶，λ-卡拉胶，琼脂糖，几丁质5种底物考察重组酶CgκP的底物特异性。将50μL重组酶CgκP分别加入到450μL 0.5％(w/v)的不同底物中，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组酶CgκP对各底物的降解活性，酶活力单位定义为：1μmol还原糖(以半乳糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。结果如下图6所示，重组酶CgκP对κ-卡拉胶表现出最高的活性，未检测到对其他四种底物活性。

实施例5重组酶CgκP降解κ-卡拉胶产物分析

将0.5％(w/v)κ-卡拉胶与重组酶CgκP按9:1(体积比)的比例混合后，在25℃条件下反应2h，通过Sevage法除蛋白后，对其产物进行电喷雾离子化质谱(ESI/MS)分析。如图5所示，CgκP对κ-卡拉胶的降解可以生成多种聚合度的低聚糖，DP＝4-8,寡糖类型见表1。因此，CgκP可用于卡拉胶寡糖的制备以及与卡拉胶降解相关方面的研究，包括农业、食品、饲料添加、医药、化妆品及卡拉胶低聚糖制备等领域。

表1寡糖类型

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种κ-卡拉胶酶编码基因及其制备与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1566

<212> DNA

<213> 海南土地杆菌(Pedobacter hainanensis )

<400> 1

atgagcaaat ttatgtttgt gtgcctgatt attagctgct ttaacagcca ggcgcagacc 60

attccggcga gcgcggtgca gggccatgaa cgctggcagc tggatattag cctgagcgat 120

gaatttaacg aaaccgtgaa ctataacgaa aaatggaaaa ttcagccgaa caacgtggcg 180

gcgtggacct atgataacgt gaacaacatt agcgtggcgg gcggcgtggc gcagattcgc 240

gcggtgtata acccgcatat tcgcaactat agcggcagcc cgcgcaactt ttattttaaa 300

agcggcatgc tgaccaccca ggcgaccaaa gtgtatggct attttgaagc gaaaattaaa 360

ggcgcgagcc tgtttccggg cgtgtgcccg gcgttttggc tgtttagcga ttttgatcgc 420

agcagcaccc agaacggcca tattatttat tgcgaaattg atgcggtgga actgcagcag 480

aacgattggt atctgggcca tcaggatgat gtgcgcgata tggatctgaa cctgcatgcg 540

gtggtgcgcg aaaacggcgt ggaagcgtgg aaacgcccga aagcgtttcc ggatcagcag 600

ctgaacaaat atcgcgcgcc gtgggatccg cgcaccggct ttcataccta tgcggtggaa 660

aaccgcccgg atagcgtgtt ttggtatgtg gatggcaacc tgattggcaa aaaagaaaac 720

ctgtattggc atcgcccgat gaacgtgacc ctgagcctgg gcatgcgcag cccgtttgtg 780

aaatttgaaa acaacgcgtt tgtgccgcag cagccggata ccaaccagat tagcaacttt 840

ccgaccttta tgagcgcgga ttatgtgcgc acctgggatg tgctgccgag cctgtggctg 900

aaagataaag aacgctatat tcagcagagc ttttataccg gcaccgatat tgcggtggat 960

tgcagctttc atccgggcag cggccataaa gtgatgagcg gccagtggaa cggcattacc 1020

gtgaaactga ttgaaaaaaa ccaggcgggc accaacgtga aagaatatgt ggcgagcaac 1080

ccgagcatta ttaacagctt tggcggcagc gcgaaagtgg tgctgagcct gaaaaacgtg 1140

accccgagca gcaaactgcc ggcgggcaac tattatgtgc tggtgccggt gtataaaagc 1200

agcaaaaacg gcggcaccga tgtgtttctg aacgaaggca ttagcccggt gagcattgtg 1260

gcgcagggcg aaaccagcgg ccagaccggc aacagcctgg aaaccgatag cattcatctg 1320

tatccggtgc cggcggaaga ttgcctgaac attgaactga aaaactggcc gattggcatt 1380

tattatctga gcctgaccga tatgaacggc gtggtggtgc tgaaaaccca ggtgaacaac 1440

ccgaaaaccc agctgaacgt ggcgggcttt aaaggcacct atgtggtgca ggtgaccagc 1500

ggcggcaaaa aagtgcgcga aaaagtggtg attaactaac tcgagcacca ccaccaccac 1560

cactga 1566

Claims (7)

1.一种κ-卡拉胶酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有κ-卡拉胶酶活性的核苷酸序列；

4)与SEQIDNO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解卡拉胶的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

2.一种权利要求1所述的κ-卡拉胶酶基因编码的κ-卡拉胶酶，其特征在于：其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：

1)序列表中SEQIDNO.2从氨基端开始的第1-518位氨基酸残基序列；

2)对序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有κ-卡拉胶酶活性的氨基酸序列。

3.一种权利要求2所述的κ-卡拉胶酶的制备方法，其特征在于：将κ-卡拉胶酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的κ-卡拉胶酶；

上述κ-卡拉胶酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQIDNO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQIDNO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有κ-卡拉胶酶活性的核苷酸序列；

4)所述的重组表达κ-卡拉胶酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞，即用于重组表达κ-卡拉胶酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞(如EscherichiacoliBL21、EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillussubtilis R25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如LacticacidbacteriaCOCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaeaeucalypti等)，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)中的一种。

5.一种权利要求2所述的κ-卡拉胶酶在降解κ-卡拉胶中的应用。

6.一种权利要求2所述的κ-卡拉胶酶在降解多种底物中特异性降解κ卡拉胶中的应用。

7.按照权利要求5所述的应用，其特征在于：包括以下应用中的一种或二种：

1)在断裂卡拉胶中β-1,4-糖苷键，获得卡拉胶寡糖中的应用；

2)在降解卡拉胶中糖苷键，仅获得三种产物为κ-4、κ-6、κ-8，便于产物分离的应用；

3)在对降解κ-卡拉胶中的酶活力维持在较高的水平，活力可达3000U/mg以上，具有高效降解κ-卡拉胶能力的应用；

4)与其他卡拉胶酶混合后，在协同断裂卡拉胶中糖苷键方面的应用。