CN117535361B - κ-卡拉胶酶降解β/κ-卡拉胶和κ-卡拉胶制备单一寡糖的应用 - Google Patents
κ-卡拉胶酶降解β/κ-卡拉胶和κ-卡拉胶制备单一寡糖的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种κ‑卡拉胶酶降解β/κ‑卡拉胶和κ‑卡拉胶制备单一寡糖的应用，属于功能酶技术领域，所述κ‑卡拉胶酶CaKC16A能够降解κ‑卡拉胶获得高纯度κ‑新卡拉胶四糖，或降解β/κ‑卡拉胶获得高纯度β/κ‑新卡拉胶六糖，或者同时降解κ‑卡拉胶和β/κ‑卡拉胶获得κ‑新卡拉胶四糖和β/κ‑新卡拉胶六糖。本发明所述κ‑卡拉胶酶降解底物获得的产物具有高度单一性。
Description
技术领域
本发明属于功能酶技术领域，具体涉及一种κ-卡拉胶酶降解β/κ-卡拉胶和κ-卡拉胶制备单一寡糖的应用。
背景技术
卡拉胶多糖是来源于红藻细胞壁的一种天然线性硫酸多糖。由D-半乳糖（D-Gal,G）和3,6-脱水-D-半乳糖（D-AHG, DA/D）组成的重复二糖单元组成，分别通过β-1,4-和α-1,3-糖苷键交替连接。卡拉胶多糖根据硫酸盐基团的数量和种类，通常可被分为kappa（κ）-、iota（ι）-和lambda（λ）-卡拉胶。κ-、ι-和-λ卡拉胶的二糖单元分别含有1、2和3个硫酸基团，三者的二糖单体结构分别为G4S-DA、G4S-DA2S和G2S-D2,6-2S。除此之外，自然界中还存在混合结构的卡拉胶多糖。例如β/κ-卡拉胶的多糖链中含有两种不同结构的二糖单体G4S-DA和G-DA。
卡拉胶多糖由于其生物难溶性和大分子性导致了它无明显生理活性，甚至一些文献将其喂养后的小鼠进行炎症小鼠造模。而低分子的卡拉胶寡糖则具备良好的生物可溶性且易被机体吸收利用，表现出良好的生理活性。包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒等活性在食品和医药行业具有广泛的应用前景。因此开发卡拉胶寡糖的高效特异性制备技术是实现卡拉胶高值化利用的关键。
目前制备卡拉胶寡糖的方法有物理法、化学法和生物法等，其中最常见的是基于酸解的化学法和基于酶解的生物法。酸解具有反应迅速、处理底物浓度较大等优点，但是经酸解之后产物较杂，分离较为困难。酶解法相比于酸解法具有反应温和、产物单一、易于分离等优点。因此酶法是一种绿色的具有可持续应用前景的方法，挖掘卡拉胶酶用以制备卡拉胶寡糖具有重要意义。
κ-卡拉胶酶能够特异性水解κ-卡拉胶，产物为新κ-卡拉胶寡糖，属于糖苷水解酶16（glycoside hydrolase 16, GH16）家族。目前多数报道针对的是κ-卡拉胶酶催化κ-卡拉胶水解的应用研究，对于其对其他类型卡拉胶的水解应用。在之前的一项发明专利（专利号：ZL202210407215.X）中描述了一个可以同时水解κ-和β/κ-卡拉胶的β-卡拉胶酶OUC-FaGH16A，尽管其具备双功能水解活性，但是其水解产物组成较为复杂，还是难以通过其实现特定结构寡糖的定向制备。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种可以同时降解κ-和β/κ-卡拉胶的双功能κ-卡拉胶酶CaKC16A，产物特异性高，可以特异性制备κ-新卡拉胶四糖和β/κ-新卡拉胶六糖，对于破解特定结构卡拉胶寡糖的制备难题具有重要意义，应用前景广泛。
本发明是通过以下技术方案实现的：
κ-卡拉胶酶CaKC16A在降解κ-卡拉胶制备κ-新卡拉胶四糖中的应用。
κ-卡拉胶酶CaKC16A在降解β/κ-卡拉胶制备β/κ-新卡拉胶六糖中的应用。
κ-卡拉胶酶CaKC16A在同时降解κ-卡拉胶和β/κ-卡拉胶制备κ-新卡拉胶四糖和β/κ-新卡拉胶六糖中的应用。
κ-卡拉胶酶CaKC16A，其氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO:1所示。
卡拉胶酶CaKC16A的氨基酸序列（SEQ ID NO:1）：
MNKRPIISSFMLVALAGCQSTGTEQAPIEKNNYIPPIHTPNGLVTKEKRLKLLEEFSDDFEQATLDESKWENAPKSLNVGAWTFAQPNAYVNDGQLVIEATQETHTRPFKDSCWDGKAGGSAKTVERTLYYKSGAVRSAKETVYGYYEAKMQGVKIFPGLCPSFWMYSDGHPFPDRNDKSKQYVDYSEIDIVELQQADWRAPGDEDDVYDMDLNLHARVEENGRIVWKRPKPNKATQFNHYRAPFDPSKGFHTYAVENRKDKITWYVDGVKVAEKPNTWWHRPMHVIFSMGLRRKFIKYNPACQRADPNPDYVVKEGYPEDARMRVDYVRGWEVLPSIWLDHSSKQLKSIKYTTSDTLSVKLHYHGGSNYHVASPITVSLVERTDDKIIQTIQTQQEPSVTSEDKRYGGELEVKLNLQAAKPLSRLANGHYYALQASFKSSNGETISLLGEPVRINVSK。
其核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO:2所示。
编码κ-卡拉胶酶CaKC16A的基因核苷酸序列（方向5’-3’）（SEQ ID NO:2）：
atgaacaagcgtcctattatctcatcatttatgttggtagccttggctggttgccaaagtacaggcacggaacaagcgccaattgaaaaaaataactatatcccacccattcatacgccaaacggtttagtcacaaaagaaaaacgtttaaaactattggaggaattttctgatgattttgaacaagcgactttagatgaatcaaaatgggagaacgcccccaagtctttaaatgttggagcatggacatttgctcagccgaatgcttatgtcaacgacggtcaattagtaatcgaagccactcaagaaacccacaccagaccatttaaagatagctgttgggacggcaaagctggcggctcagctaaaacagttgaacgcaccttatactataaatcgggtgcagtgcgctctgctaaagaaaccgtgtacggttattatgaagcgaaaatgcaaggcgtaaaaatatttccggggttgtgtccgtcattttggatgtacagcgatggccaccctttccctgatcgcaacgacaaatcaaaacaatatgtcgattacagtgaaatagacattgttgaattgcaacaagccgattggcgcgcaccaggcgatgaagatgatgtgtacgacatggaccttaacctgcatgctcgtgttgaagaaaatggccgtattgtgtggaagcggcctaaacccaacaaggcaacacagtttaaccactaccgcgcgccatttgatccatcaaagggctttcatacttatgcagttgaaaatcgcaaagataaaatcacatggtatgttgatggggtaaaagtagctgagaaacccaatacctggtggcaccgccctatgcatgtcattttctcaatgggtttacgccgtaagtttataaaatataacccagcatgccaacgcgcagatccaaaccctgattatgttgtcaaagaaggttatccagaagatgcacgaatgcgggtcgattatgtgcgtgggtgggaagtccttccatcaatttggttagatcactcaagcaaacaactcaagagtattaaatacaccacctctgatactttgtcagttaaattacattatcacggtggcagtaattaccatgtagcaagcccaataaccgtcagtttagttgaaagaactgacgacaaaattatacaaacaatccaaacacagcaagagccaagtgtaaccagcgaagataaacgctacggcggtgaacttgaagttaaacttaatttacaggccgcaaaaccgctaagtaggttagccaacggacattactatgcattgcaagcaagttttaaatcttccaacggcgaaaccattagcttgttaggggaacctgttcgcattaacgttagtaaataa。
进一步地，κ-卡拉胶酶CaKC16A的酶解条件为：底物浓度为5～10 g/L，加酶量为1～10 U/mL（1 U代表1分钟内释放1 μmol还原糖所需的酶量），优选为5 U/mL，酶解温度为35～80 ℃，优选50 ℃，pH值为3.0～10.0，优选8.0，酶解时间为10分钟以上，优选30分钟～1440分钟。
一种重组表达载体在降解κ-卡拉胶酶和/或β/κ-卡拉胶中的应用，所述载体携带有编码κ-卡拉胶酶CaKC16A的基因。
一种重组工程菌在降解κ-卡拉胶酶和/或β/κ-卡拉胶中的应用，所述重组工程菌携带有编码κ-卡拉胶酶CaKC16A的基因。
本发明还提供κ-卡拉胶酶CaKC16A在制备降解κ-卡拉胶酶和/或β/κ-卡拉胶酶制剂中应用。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明通过实验研究发现，κ-卡拉胶酶CaKC16A并不是只对κ-卡拉胶具有水解能力，而是对κ-和β/κ-卡拉胶都有高的降解活性，且产物具有高度单一性，同时不表现出对ι-卡拉胶的降解活性。这说明κ-卡拉胶酶CaKC16A的双功能水解活性，可以同时特异性制备两种结构不同的卡拉胶寡糖，为研究卡拉胶寡糖的构效关系提供了有力工具，有着广阔的应用前景。
本发明通过实验研究发现，κ-卡拉胶酶CaKC16A在50 ℃和pH值为8.0的条件下，可以同时作用于κ-和β/κ-卡拉胶，且产物具有高度单一性，可特异性制备得到κ-新卡拉胶四糖和β/κ-新卡拉胶六糖。本发明构建了含κ-卡拉胶酶基因的表达载体，实现了在大肠杆菌中的异源表达，为该酶的工业化大规模生产提供了良好的基础。κ-卡拉胶酶CaKC16A的最适反应温度为50 ℃，在该温度下作为底物的卡拉胶多糖可以保持溶液状态，可以更好地实现该κ-卡拉胶酶的大规模应用。
附图说明
图1：本发明的κ-卡拉胶酶CaKC16A纯化的SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker，CE道为粗酶，PE道为纯酶；
图2：温度变化对κ-卡拉胶水解酶活的影响；
图3：pH变化对κ-卡拉胶水解酶活的影响；
图4：本发明的κ-卡拉胶酶水解不同卡拉胶的相对酶活；
图5：本发明的κ-卡拉胶酶水解κ-卡拉胶产物的HPLC图；
图6：本发明的κ-卡拉胶酶水解β/κ-卡拉胶产物的HPLC图；
图7：本发明的κ-卡拉胶酶水解β/κ-卡拉胶产物的MS图；
图8：本发明的κ-卡拉胶酶水解β/κ-卡拉胶产物经D-AHG糖苷酶水解后的HPLC图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。下面通过具体实例对本发明的方法做进一步的说明。
实施例1 κ-卡拉胶酶基因CaKC16A的克隆
本申请的发明人从NCBI数据库中挖掘得到海洋细菌Catenovulum agarivoransDS2来源的κ-卡拉胶酶片段（GenBank: WP_051479691.1），根据进化树和多序列比较分析，发现该基因片段所表达的κ-卡拉胶酶属于糖苷水解酶16家族的17亚家族分支。目前无该κ-卡拉胶酶水解活性的相关验证和报道，需要进一步的实验探究证实。该基因包含有1380个碱基，序列见SEQ ID NO.2，编码的蛋白具有459个氨基酸，序列见SEQ ID NO.1。发明人根据宿主大肠杆菌的密码子偏好性对该基因片段的DNA序列进行了密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.3（不含N端51 bp的信号肽编码序列）所示。
人工合成的κ-卡拉胶酶CaKC16A编码基因的核苷酸序列如下所示（方向5’-3’）（如SEQ ID NO.3所示）：
tgtcagtcaactggaacagaacaagctcccatcgagaaaaacaactacattccgccgattcacactccgaacggtttggtcaccaaagagaagcgcctgaagttgctggaagagttcagcgacgacttcgagcaggcgacgttggacgagtcgaaatgggagaacgcaccgaagtcactcaacgtgggtgcgtggacctttgcccagccgaacgcgtatgtaaatgatggccagctggttattgaggcaacccaagaaacgcatacccgtccgttcaaagatagctgttgggatggtaaagccggtggcagtgcgaagaccgtggagcgcaccctgtattacaaatctggtgcggtgcgtagcgctaaagaaactgtctatggctactacgaagcgaagatgcagggcgtgaaaatcttcccgggcctttgcccgtcattttggatgtatagcgacggtcacccgttcccagaccgtaatgacaagtccaagcagtatgttgactactctgagatcgacatcgtggaactgcaacaggctgattggcgcgcgccaggtgatgaagacgatgtttatgatatggatctgaacctgcacgcgcgcgtggaggaaaacgggagaatcgtttggaaacgccctaaaccgaacaaagcgacccagtttaatcattaccgtgcgccattcgatccgtcgaagggttttcacacatacgcagttgagaaccgtaaggacaagatcacctggtatgtcgatggtgtgaaggttgccgaaaagccgaatacctggtggcatcgtccgatgcatgtgatttttagcatgggtctgcgtcgtaaattcatcaaatataatccggcatgccagcgtgcggacccgaatccggattacgtggtgaaagagggctacccagaagatgcacgtatgcgtgttgattatgttcgcggttgggaagttctaccgtccatctggctggaccacagctccaagcagctgaaatctattaaatacaccaccagcgacaccctgtctgtgaaactccactatcatggcggctccaactaccacgttgcgtcgccgatcacggtgagcctggtcgagagaaccgatgacaagattatccaaaccattcaaacgcaacaagaaccgtccgttacctccgaagacaaacgttacggcggtgagttggaggtgaaattgaatctgcaagcggcaaagccgctgagccgtcttgctaatggccactactacgctctgcaggccagctttaagagcagcaacggtgaaacgattagcttactgggcgaaccggttcgcattaacgtaagcaagtaa。
人工合成SEQ ID NO.3所示的基因片段。以人工合成的基因片段为模板，进行PCR扩增。PCR所用的特异性引物如下所示：
正向引物：5’- gagctcggtaccctcgagtgtcagtcaactggaacag -3’，如SEQ ID NO.4所示，
反向引物：5’- cttagtggtggtggtggtggtgcttgcttacgttaatgcgaac -3’，如SEQ IDNO.5所示。
实施例2 携带κ-卡拉胶酶基因CaKC16A表达载体的构建
将实施例1扩增得到目的片段，与线性化的pColdⅡ载体采用无缝拼接试剂盒在50℃反应5分钟后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB固体抗性平板上。37 ℃培养箱过夜培养后挑取单克隆进行阳性克隆验证，将条带大小正确的单克隆送至测序公司测序待测序比对完全正确，得到重组质粒，命名为pCold-CaKC16A，保存在-20 ℃冰箱备用。
实施例3 含κ-卡拉胶酶基因的工程菌构建
将实施例2中得到的携带卡拉胶酶基因的重组质粒转化至大肠杆菌RTS BL21(DE3)Chaprone感受态中，采用42 ℃热激转化法进行转化，涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB固体抗性平板上。37 ℃培养箱过夜培养后挑取单克隆进行阳性克隆验证，将条带大小正确的单克隆于液体LB培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素）中培养过夜。保藏菌液于10%甘油中，于-80 ℃长期保存备用。
实施例4 κ-卡拉胶酶CaKC16A的制备和纯化
将实施例3中保存的菌液于LB液体培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素和25 μg/mL氯霉素）中37 ℃过夜培养活化后转接至100 mL LB三角瓶（含100 μg/mL氨苄青霉素，25 μg/mL氯霉素和0.5 mg/ml L-阿拉伯糖）中37 ℃，200 rpm培养至OD600约为0.3左右加入终浓度2 ng/ml四环素（诱导chaprone伴侣蛋白表达），继续于37℃培养至OD600为0.6左右加入终浓度为0.1 mM的IPTG，转至15 ℃培养16小时，表达κ-卡拉胶酶。
待发酵结束后，8000 rpm离心5分钟收集菌体，加入一定量的无菌水洗涤菌体，再次8000 rpm离心5分钟收集菌体。pH 8.0的Tris-HCl缓冲液复溶菌体后于冰浴条件下超声破碎（320 W，开3秒，停3秒持续破碎30分钟），破碎完全后8000 rpm，4 ℃条件下离心15分钟收集上清即为粗酶。所表达的目的基因含有His纯化标签，因此我们采用Ni-NTA亲和层析进行纯化。采用不同浓度梯度（10、20、50、80、120、200和500 mM）咪唑进行目的蛋白的洗脱，连接Akta纯化仪进行纯化，SDS-PAGE结果显示250 mM咪唑可以得到较为单一的目的蛋白条带（图1），结果显示所得蛋白分子量大小约为54 kDa，符合预测结果。纯化后酶液蛋白浓度经R250考马斯亮蓝法测定为0.15 g/L。用30 kDa超滤管置换浓缩，采用超纯水为置换溶剂，将酶液浓缩至蛋白浓度为1 g/L，得到纯酶，用于酶学特性的测定。
实施例5 测定κ-卡拉胶酶CaKC16A的最适反应条件
将实施例4中得到的CaKC16A纯酶在不同温度（30、40、50、60、65、70和80 ℃）条件下测定温度对其水解酶活的影响，反应底物为3 g/L κ-卡拉胶，pH值为7.0反应30分钟后终止反应。反应释放的还原糖采用DNS法进行测定，即反应液200 μL终止反应后加入300 μLDNS后煮沸5分钟显色，冷却至室温后取200 μL于540 nm处测定吸光值，根据标准曲线（此处以D-半乳糖为标准物质绘制标准曲线）计算还原糖的产生量。根据测定结果，可知CaKC16A在50 ℃温度条件下显示出最大的水解活力（图2）。进一步在pH 3～10条件下测定CaKC16A的最适pH，如图3所示其最适反应pH为8.0。
实施例6 测定κ-卡拉胶酶CaKC16A的比酶活
酶活测定方法为：反应体系为200 μL，包含pH 8.0, 50 mM Tris-HCl缓冲液、3 g/L κ-卡拉胶、1.5 mg纯酶（实施例4制备），在50 ℃条件下反应10分钟后终止反应，反应释放的还原糖采用DNS法（见实施例5）进行测定。
酶活定义为：在最适反应条件下，1分钟转化生成1 μmol还原糖所需酶量，经测定，CaKC16A水解κ-卡拉胶的比酶活为30.82 U/mg。
实施例7 κ-卡拉胶酶CaKC16A水解不同卡拉胶相对酶活的比较
以不同类型卡拉胶多糖（κ-、ι-、β/κ-和λ-卡拉胶）为底物测定CaKC16A的底物特异性。反应体系为200 μL，包含pH 8.0, 50 mM Tris-HCl缓冲液、3 g/L 不同类型卡拉胶、1.5mg纯酶（实施例4制备），在50 ℃条件下反应30分钟后终止反应，反应释放的还原糖采用DNS法（见实施例5）进行测定。绘制相对酶活柱状图，如图4所示，其对κ-卡拉胶酶表现出最高的水解活性，同时能够水解β/κ-和λ-卡拉胶，几乎不表现出对ι-卡拉胶的水解活性。
实施例8 测定CaKC16A水解κ-卡拉胶的水解产物
将实施例4中得到的CaKC16A纯酶与3 g/L的κ-卡拉胶在50 ℃，pH 8.0条件下反应24小时后采用HPLC测定其水解产物。如图5所示，与标准品对照，其主要水解产物为κ-新卡拉胶四糖。
实施例9 测定CaKC16A水解β/κ-卡拉胶的水解产物
将实施例4中得到的CaKC16A纯酶与3 g/L的β/κ-卡拉胶在50 ℃，pH 8.0条件下反应24小时后采用HPLC测定其水解产物。如图6所示，与标准品对照，可知其主要产物为单一的β/κ-新卡拉胶六糖，进一步利用MS检测了该水解产物，如图7所示，该β/κ-新卡拉胶六糖仅脱除了一个硫酸基团，但是脱硫位点未知。为了进一步判断具体结构，借助一个D-AHG糖苷酶ZuGH129A（GenBank: WP_076457038.1、氨基酸序列见SEQ ID NO.6）去水解CaKC16A的β/κ-卡拉胶降解产物，在35 ℃，pH 8.0条件下反应1小时后采用HPLC测定产物组成。如图8所示，与原始底物相比，产物出峰时间后移，那说明ZuGH129A能够作用该底物切下其非还原端的D-AHG单元，由此说明该β/κ-新卡拉胶六糖的非还原端不含硫酸基团，为β-新卡拉胶二糖单元。由此可知CaKC16A水解β/κ-卡拉胶的产物为β/κ-新卡拉胶六糖，结果组成为DA-G-(DA-G4S)2。
D-AHG糖苷酶ZuGH129A，其氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO:6所示。
D-AHG糖苷酶ZuGH129A的氨基酸序列（SEQ ID NO:6）：
MKNNSTLAKNTLVLLVITCLTAFKGLAFDSVSPDPIVLENEKLNISVDSKTGCFSVTEKISGHLWKSDPWDHAAGLLTLSDPKGKKQTVNISKSKKIEVSKTGKNTVSLKFIDPVFADGSVAKGVSIATELRLDPNNTQLDVEVMEHRSGNFTLFDLRYPARAFSLKTDEDKGAAVIPQKQGVICPSYIFPMNGGRFCKWDDATYNNKSQGSLELFNNGTGLTMPWWGTYNEKSAVIGIVDVSARPHMQYNINNNGQYLFNAKGVMSPYQRIVFLDPIWKLDQEKGKMRMSYHFIPGGDYVDMAKVYQKEAKARGHFVSLQEKLKRNPNVNKLPGAIYFGIYGGYPHYVNMPGMAFTFDELKNIIKTIHDDLKVDKAFVHAWGTFSNFVPHNYPISEALGGPEKLKAAVDLAKSYGYLYSSYHAYSPMLENDPNFTTDLMQRDAEGKLMNTGSRWARVDPKFQKGLAQKNIEKEISYLGLEADITDITFAAYRENGKEGRIELAKYIDSFNLVNGTEHGQEQWIPYFDMFEGMTYLEDRPLSVISHPAPLFNLVYHEAIANFGKIQDPDNEVTANGDFRIKALRSMLFGRGTTIFFSPYEFEGMRPMIEMARDLVAPVHKETFFSELQSHEYLSADYKVQRSRFSSGTEVIANLGPVAQKIEGGITIPGYGYRIKMKDGSLKTGHFQVSLHMDE。
实施例10 CaKC16A同时水解κ-和β/κ-卡拉胶制备寡糖
将实施例4中得到的重组CaKC16A纯酶与κ-和β/κ-卡拉胶（浓度均为1.5 g/L）在50℃，pH 8.0条件下反应24小时后，煮沸离心后透析除盐，冻干成粉末即为含有κ-新卡拉胶四糖和β/κ-新卡拉胶六糖的粗寡糖。
Claims (8)
1.κ-卡拉胶酶CaKC16A在降解κ-卡拉胶制备κ-新卡拉胶四糖中的应用，其特征在于，所述κ-卡拉胶酶CaKC16A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.κ-卡拉胶酶CaKC16A在降解β/κ-卡拉胶制备β/κ-新卡拉胶六糖中的应用，其特征在于，所述κ-卡拉胶酶CaKC16A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.κ-卡拉胶酶CaKC16A在同时降解κ-卡拉胶和β/κ-卡拉胶制备κ-新卡拉胶四糖和β/κ-新卡拉胶六糖中的应用，其特征在于，所述κ-卡拉胶酶CaKC16A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1-3任何一项所述应用，其特征在于，κ-卡拉胶酶CaKC16A的酶解条件为：底物浓度为5～10g/L，加酶量为1～10U/mL，酶解温度为35～80℃，pH值为3.0～10.0，酶解时间为10分钟以上。
5.根据权利要求1-3任何一项所述应用，其特征在于，κ-卡拉胶酶CaKC16A的酶解条件为：底物浓度为5～10g/L，加酶量为5U/mL，酶解温度为50℃，pH值为8.0，酶解时间30分钟～1440分钟。
6.一种重组表达载体在降解κ-卡拉胶酶和/或β/κ-卡拉胶中的应用，其特征在于，所述载体携带有编码权利要求1所述κ-卡拉胶酶CaKC16A的基因。
7.一种重组工程菌在降解κ-卡拉胶酶和/或β/κ-卡拉胶中的应用，其特征在于，所述重组工程菌携带有编码权利要求1所述κ-卡拉胶酶CaKC16A的基因。
8.一种κ-卡拉胶酶CaKC16A的应用，其特征在于，所述应用为κ-卡拉胶酶CaKC16A用于制备降解κ-卡拉胶酶和/或β/κ-卡拉胶酶制剂，所述κ-卡拉胶酶CaKC16A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "κ-卡拉胶寡糖的酶解制备及其体外抗病毒活性";马悦欣 等;《中山大学学报(自然科学版)》;20091130;第48卷(第6期);第105-108、137页 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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