CN104894078B - 一种定点突变改造的基因工程酪氨酸酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过基因工程改造获得的链霉菌酪氨酸酶。本发明所述的一种定点突变改造的基因工程酪氨酸酶，其特征在于所述定点突变的基因工程链霉菌酪氨酸酶氨基酸序列相对于天然的链霉菌酪氨酸酶氨基酸序列的第7位谷氨酰胺突变为赖氨酸，第234位甘氨酸突变为脯氨酸。本发明所述的基因工程链霉菌酪氨酸酶最适温度相对于天然的链霉菌酪氨酸酶提高了10℃，在60℃下的半衰期提高了3倍，为其高效合成黑色素奠定了基础。

Description

一种定点突变改造的基因工程酪氨酸酶
技术领域
本发明涉及一种热稳定性及最适作用温度提高的酪氨酸酶突变体，属于基因工程技术领域。
技术背景
酪氨酸酶(Tyrosinase,EC 1.14.18.1)是一种含有双铜离子的金属酶。酪氨酸酶是多功能酶，在氧气的参与下可以催化单酚生成二元酚(一元酚酶活性)；催化二元酚生成相应的醌(二元酚酶活性)。而醌在经过一系列酶催化及非酶催化的氧化还原反应后最终生成黑色素。酪氨酸酶广泛的存在于动植物及微生物中。一般认为人类的毛发、眼睛、皮肤上的颜色都是由酪氨酸酶决定的，因而大多数化妆品行业通过研究酪氨酸酶酶抑制剂来开发美白产品。人体内如果酪氨酸酶代谢异常将会导致一系列疾病的发生，例如白癜风和白化病等。同时禽类的羽毛，及昆虫甲壳的颜色也酪氨酸酶相关，它的产物黑色素可以与蛋白交联结合成坚硬的支架，起到保护作用。在植物体内，酪氨酸酶可以催化生成一些对人体有益的物质，例如茶多酚。此外，水果表面受损时的褐变也与酪氨酸酶相关，食品行业研究开发酪氨酸酶抑制剂来保鲜水果。此外，酪氨酸酶在工业上也有重要的应用。首先，酪氨酸酶可以催化酪氨酸合成左旋多巴等有益的酚类物质，左旋多巴是效果良好的抗颠麻痹药，已经被广泛的应用于临床。此外，酪氨酸酶还可以用于制备生物传感器，用来检测环境中酚类化合物的浓度。由于工业污染，导致大量的酚类化合物被排放到自然环境中(主要是水源)，导致严重的污染，而大部分酚类化合物对人体有毒害作用，而酪氨酸酶由于底物的广谱性，大部分的酚类化合物均可以被酪氨酸酶催化，因此，酪氨酸酶还可以被用来清除污染环境中的酚类化合物。当然，酪氨酸酶还以用来制备黑色素。
黑色素广泛存在于动植物和微生物中，与生物自我保护机制有关。有研究表明，天然的黑素色具有紫外吸收、抗氧化、清除自由基、螯合阳离子(例如有毒的重金属)、新型的药物载体、作为治疗某些与黑色素缺乏相关的神经系统疾病，例如着色性干皮病、帕金森氏症、老年性痴呆症、亨廷氏舞蹈病等，有报道指出，可溶性的黑色素在体外具有抗HIV的活性，为治疗艾滋病开辟了一个新途径。目前黑色素生产主要为动植物提取和采用化学法以酪氨酸为原料生产，这两种方法成本高、工艺繁琐，使黑色素因价格昂贵而限制其大规模的生产与应用。微生物所产的黑色素是由其体内的酪氨酸酶催化酪氨酸形成的多巴类黑色素，是氨基酸的衍生物，具有无毒、无害等特点，而且产黑色素的微生物种类繁多，生产工艺简单，易于操作，不受时间与地域的限制，因此用微生物来生产黑色素具有巨大的优势。
Streptomyces kathirae SC-1是本实验室前期筛选获得的一株高产黑色素菌株(保藏编号为：CCTCC M 2012432，专利申请公布号：CN104403975A)，对S.kathirae SC-1发酵产黑色素条件进行了优化，发现该菌株具有极高的黑色素生产潜力，但发现酪氨酸酶的稳定性较低，导致黑色素发酵后劲不足，严重限制黑色素的产量。因此需要提高酪氨酸酶的稳定性。
定点突变是提高酶稳定性的重要手段之一。与其他提高酶稳定性的策略相比，定点突变更迅速，直接并且节约成本。而随着生物信息学的发展，很多预测软件被研究开发出来用来辅助定点突变，使定点突变得到正突变的效率明显提高。本发明基于已得到的酪氨酸酶在大肠杆菌中的表达平台，利用以计算机模拟为基础的定点突变技术，对酪氨酸酶进行分子改造，获得稳定性显著提高的酪氨酸酶。
发明内容
本发明的目的在于，通过对酪氨酸酶进行分子改造，使改造后的酪氨酸酶在稳定性方面有所提高，最终应用于黑色素的生产。
本发明提供了一种定点突变改造的酪氨酸酶突变体，有链霉菌Streptomyceskathirae SC-1酪氨酸酶基因出发，运用定点突变获得，所述的酪氨酸酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.1，该酪氨酸酶突变体是由SEQ ID No.2的核苷酸系列所编码。
所述发生突变的氨基酸位于酪氨酸酶蛋白结构的表面，所述突变可以增加蛋白表面的静电相互作用或增加蛋白疏水相互作用。
所述的氨基酸发生突变的是酪氨酸酶第7位谷氨酰胺替换成赖氨酸、第234位甘氨酸替换成脯氨酸，所得单突变体分别命名为Q7K、G234P。
所述多个氨基酸发生突变包括：第7位谷氨酰胺替换成赖氨酸、第234位甘氨酸替换成脯氨酸，所得单突变体分别命名为Q7K/G234P。
本发明提供一种所述酪氨酸酶突变体的制备方法，具体步奏如下：
1、将SEQ ID No.2通过PCR的方法，以含有酪氨酸酶基因序列的pET-28aC2为模板，获得含有pET-28a(+)质粒RBS序列的酪氨酸酶基因，并且克隆至已含有酪氨酸酶金属伴侣基因序列的质粒pET-28aC1中，使酪氨酸酶金属伴侣及酪氨酸酶各自携带有pET-28a(+)的RBS序列，构建重组质粒pET-28aC1NC2；
2、利用Swiss-Model软件对亲本酪氨酸酶进行模拟，获得酪氨酸酶空间结构；
3、设计突变引物，通过反向PCR对酪氨酸酶基因序列进行定点突变，获得含有突变酪氨酸酶基因序列的重组载体；
4、将突变后的重组载体热激转化大肠杆菌BL21，诱导表达，离心收集菌体，破细胞后使用Ni-NTA进行蛋白纯化获得酪氨酸酶突变体。
本发明提供的酪氨酸酶单突变体或组合突变体热稳定性均显著提高，其中组合突变体的最适作用温度提高了10℃，在60℃下的半衰期提高了3倍。相对于采用筛菌或定向进化等手段，缩短了酶学性质的改造时间。将该酪氨酸酶体变体应用于提高黑色素的产量及其他相关应用具有广阔的应用前景。
具体实施方法
实施例1酪氨酸酶突变位点的确定
利用Swiss-Model软件对亲本酪氨酸酶进行模拟，获得酪氨酸酶空间结构为基础，利用POPMuSiC在线服务器计算酪氨酸酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(ΔΔG)来辅助设计提高酪氨酸酶的稳定性，选择去折叠自由能变化显著的氨基酸作为突变位点。确定位于蛋白表面的第7位谷氨酰胺和第234位脯氨酸的去折叠自由能变化最为显著。以共表达酪氨酸酶及其金属伴侣的重组质粒为模板，该模板来自于能够甲基化的大肠杆菌宿主E.coli DH5α，以表1的引物进行方向PCR扩增相应的突变质粒。
表1突变引物如下：
反向PCR体系为：
PCR扩增条件：97℃预变性5min；97℃变性50s，65℃退火30s，72℃延伸10min，25个循环；72℃延伸10min。
实施例2DpnI消化模板质粒
使用DNA胶回收试剂盒直接纯化回收6.2.3所述PCR产物，并使用DpnI限制性内切酶消化回收后的PCR产物。
酶切反应体系如下：
实施例3
将实施例2中的酶切产物直接转化E.coli JM109，并将质粒送至上海生工生物工程有限公司测序。将测序正确的突变质粒转化至E.coli BL21。
实施例4
组合突变则是以已经突变的质粒为模板，使用以其他突变位点的引物为引物，按照实施例1-3方法构建组合突变菌株。
实施例5
酪氨酸酶保存于50-70℃的水浴中30min，然后再冰浴处理10min，在最适的反应条件下测酶活，酪氨酸酶酶活为未处理时酶活的一半的温度为酪氨酸酶的T50值酪氨酸酶酶活测定
取2mL发酵液，8000r·min-1离心15min，吸取适量上清液，与酶活反应液混合试管中至终体积为5mL，30℃反应10min，反应结束后测OD475吸光度。(酶活反应液配制：10mmol·L-1左旋多巴，15μmol·L-1CuSO4，0.05mol·L-1磷酸盐缓冲液，pH 6.2)
酶活定义：在此条件下，每分钟催化生成1μmol·L-1多巴醌的酶量定义为一个酶活单位(U)。多巴醌的测量在475nm的吸光度下进行。
实施例6
1、最适温度
在pH为6.2的条件下，将反应体系分别置于25-60℃的温度下反应测定酪氨酸酶酶活。酪氨酸酶酶活最高时作为100％。
2、半衰期t1/2
酪氨酸酶溶于pH 7.5的缓冲液中，将酪氨酸酶酶液置于60、65、70、75℃的水浴中，在不同时间中取样测酶活，酪氨酸酶酶活为未处理时酶活的一半的时间为酪氨酸酶的半衰期。
实施例7酪氨酸酶最适温度及热稳定性
亲本酪氨酸酶、单突变体及组合突变体的半衰期如表2所示。
表2酪氨酸酶突变前后的半衰期

Claims (7)

1.一种定点突变改造的基因工程酪氨酸酶，所述的基因工程酪氨酸酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1。
2.权利要求1所述的定点突变改造的酪氨酸酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQID No.2所示。
3.一种宿主细胞，其含有如权利要求2所述的基因。
4.根据权利要求1所述的基因工程酪氨酸酶，其特征在于，将含有通过PoPMuSiC预测获得的氨基酸突变点的酪氨酸酶突变质粒转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)宿主中，构建突变体，进行序列验证确认，得到7位和234位两个酶稳定性及最适温度提高的突变体，分别为：Gln7Lys和Gly234Pro，以Gln7Lys突变质粒为模板，以携带Gly234Pro突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，进一步的组合突变，获得组合突变Gln7Lys/Gly234Pro。
5.根据权利要求1所述的基因工程酪氨酸酶，其特征在于，第7位谷氨酰胺Gln突变为赖氨酸Lys，第234为甘氨酸Gly突变为脯氨酸Pro。
6.权利要求1所述的基因工程酪氨酸酶的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以来自于能够甲基化的大肠杆菌宿主携带的酪氨酸酶基因的重组质粒为模板，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，进行反向PCR，扩增突变质粒全长；使用DpnI限制性内切酶进行消化；取经过DpnI限制性内切酶处理的PCR产物热击转化E.coli DH5α，涂布于含有卡那霉素抗性的固体LB平板培养；挑起单菌落接入含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，提取质粒，测序；将测序结果正确的质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得突变体。
7.权利要求1所述基因工程酪氨酸酶的应用，其特征在于，所述的基因工程酪氨酸酶可用于黑色素的生产、化工生产和环境治理中。
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