CN115851631A - 一种酪氨酸酶及其工程菌、制备方法和应用 - Google Patents
一种酪氨酸酶及其工程菌、制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种酶活力提高的酪氨酸酶突变体及其制备。本发明通过分子生物学技术手段获得来自阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)的酪氨酸酶基因，利用迭代饱和突变技术对突变体G43R酪氨酸酶基因进行突变，得到酪氨酸酶突变体G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W，及其编码基因tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6，重新构建重组质粒，并实现了其在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得高活力的酪氨酸酶。
Description
技术领域：
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及迭代饱和突变技术获得酶活力提高的酪氨酸酶突变体及其制备。
背景技术：
酪氨酸酶(tyrosinase,TYR,EC 1.14.18.1)又称多酚氧化酶和儿茶酚氧化酶等，是一种参与黑色素合成的“3”型双核含铜金属酶。在分子氧存在的条件下，酪氨酸酶可以单酚为底物进行两次连续的反应，首先，将单酚作为底物进行催化，生成邻苯二酚，进一步以邻苯二酚为底物，氧化生成醌类物质，醌类物质会自发的聚合形成黑色素。酪氨酸酶广泛存在于人体、动植物以及微生物中，在不同来源的酪氨酸酶中，其活性位点是高度保守的，均有六个组氨酸残基协调两个铜离子激活酪氨酸酶活性。
在哺乳动物体内，酪氨酸酶催化生成的黑色素，可以起到动物皮肤、毛发等组织细胞中的染色作用，帮助眼睛与皮肤抵御紫外线辐射，哺乳动物酪氨酸酶功能的衰退与缺失还会引起白化病和白癜风，常见的帕金森病也与其有关；在植物中酪氨酸酶更多被称为多酚氧化酶，参与单宁和黄酮类的酚类聚合物的合成，引起水果和蔬菜等植物的褐变；在昆虫体内酪氨酸酶常以酶原形式存在，在昆虫的不同部位完成不同的生理功能，是昆虫角质硬化唯一用到的酶，在节肢动物中还参与到伤口愈合等生理过程。
目前，酪氨酸酶已在多个领域中具有广泛应用。在生物医药的应用方面，目前左旋多巴主要的合成方法是化学合成，存在反应过程复杂和需要金属催化剂等问题，而左旋多巴是酪氨酸酶以酪氨酸为底物的第一个产物，因此，可以利用酪氨酸酶催化酪氨酸合成左旋多巴；在蛋白质交联方面，在食品加工中，蛋白质会因为其所处条件的变化发生蛋白质的交联，使其结构发生变化，对食品的特性影响很大，直接导致产品的营养与性质的改变，相比于传统交联剂，酪氨酸酶的底物特异性更广泛，目前已有很多使用酪氨酸酶作为肉类、奶制品和植物蛋白食品的交联剂的应用；在环境保护方面，苯酚、甲酚等酚类化合物具有毒性且不易降解，大多数酚类化合物被认为是环境污染物，对泌尿系统、消化系统、呼吸系统和神经系统造成负面影响。通过离子交换、光催化和酶生物催化降解法去除酚类化合物。酪氨酸酶由于其可以酚类物质为底物，催化生成醌类物质，可以对苯酚等有毒有机物进行催化脱毒；在生物检测方面，酪氨酸酶由于可以特异性识别酚类物质而被开发出一些生物检测器，用于检测例如红酒等样品中的多酚含量。
酪氨酸酶几乎存在于自然界的各个领域，参与各种生物学功能。目前已经有多种包括真菌、细菌、动物等不同来源的酪氨酸酶被分离纯化，并成功获得了多个来源酪氨酸酶的晶体结构。研究发现，不同来源的酪氨酸酶氨基酸残基数目相差较大，但大部分成熟的酪氨酸酶蛋白的分子量为35-50kDa左右。
酶分子改造是改善蛋白质功能和活性的重要手段，主要包括定向进化、理性设计和半理性设计，在对蛋白质结构及其催化位点不了解的情况下多选择定向进化手段对酶分子进行改造，随着更多的蛋白质结构被解开和计算机对蛋白质结构预测的发展，越来越多的采取理性设计和半理性设计对酶分子进行改造，通过对蛋白质结构及其催化机制的分析，理性的分析和选择可能影响蛋白质活性的和功能的氨基酸位点，通过定点突变获得较少突变体，建立筛选体系，达到快速高效筛选得到理想突变体的目的，相比于定向进化，具有更高的效率和更少的工作量。
芽孢杆菌表达系统与常用的大肠杆菌表达系统相比，可将表达产物分泌到胞外，有利于对产物的分离纯化，芽孢杆菌属遗传背景研究清晰、生长速度快、对培养基要求低等优点，被广泛应用于农业、食品、医药、工业等领域。
在本发明中，对野生型酪氨酸酶基因进行迭代饱和突变获得高活力的酪氨酸酶突变基因，并且实现了其在解淀粉芽孢杆菌表达系统中的高效表达，得到了产高活力酪氨酸酶的突变体菌株。
发明内容：
基于现有技术存在的问题，为了进一步推动酪氨酸酶在工业领域的应用，需对其现有性质作进一步的提升，本发明的目的在于提供一种高活力酪氨酸酶的突变体。
实现本发明目的的技术路线概述如下：
对来自阿耶波多氏杆菌(Bacillus aryabhattai)TCCC 111983的酪氨酸酶进行突变获得的突变体G43R进行迭代饱和突变，其编码基因为tyrm1，利用大肠杆菌表达系统筛选得到TYR突变体G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W，及其编码基因tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6，并实现了各突变体在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得酶活力提高的TYR突变体。
本发明提供的技术方案之一，是一种酪氨酸酶突变体，所述突变体是在SEQ IDNO.1所述的野生型酪氨酸酶基础上发生G43R、M61H、A232C、Q214D、V217A、F197W等突变中的至少一种获得的；
进一步地，所述酪氨酸酶突变体为G43R/M61H突变体，具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
更进一步地，所述G43R/M61H突变体的编码基因tyrm2具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
进一步地，所述酪氨酸酶突变体为G43R/M61H/A232C突变体，具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；
更进一步地，所述G43R/M61H/A232C突变体的编码基因tyrm3，具有SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
进一步地，所述酪氨酸酶突变体为G43R/M61H/A232C/Q214D突变体，具有SEQ IDNO.9所示的氨基酸序列；
更进一步地，所述G43R/M61H/A232C/Q214D突变体的编码基因tyrm4，具有SEQ IDNO.10所示的核苷酸序列；
进一步地，所述酪氨酸酶突变体为G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A突变体，具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；
更进一步地，所述G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A突变体的编码基因tyrm5，具有SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
进一步地，所述酪氨酸酶突变体为G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W突变体，具有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列；
更进一步地，所述G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W突变体的编码基因tyrm6，具有SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列。
本发明提供的技术方案之二，是包含上述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株；
进一步地，所述重组质粒采用的表达载体为pET22b，或pBSA43质粒；
进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞为大肠杆菌BL21，或解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218；
优选地，所述重组菌株是将突变体编码基因与表达载体pBSA43连接后在宿主解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218中表达所得。
本发明提供的技术方案之三，是上述重组质粒或重组菌株的应用，特别是在生产酪氨酸酶中的应用。
本发明提供的技术方案之四，是技术方案一所述酪氨酸酶突变体的应用，具体是在单酚氧化中的应用，特别是应用于生物医药、食品加工、环境保护、生物检测等技术领域中。
本发明的实验方案具体如下：
1、TYR突变体编码基因的获得，包括如下步骤：
(1)以SEQ ID NO.4所示的G43R突变体编码基因tyrm1为出发基因，构建表达载体pET22b-tyrm1，进行迭代饱和突变；
(2)将突变后的TYR编码基因，通过构建重组质粒后转入大肠杆菌BL21中，经筛选获得酶活力提高的TYR突变体，经测序获得TYR突变体编码基因tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6，将含有酶活力提高的TYR突变体编码基因的质粒pET22b-tyrm2、pET22b-tyrm3、pET22b-tyrm4、pET22b-tyrm5、pET22b-tyrm6保存。
2、所述TYR突变体G43R、G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W的酶学特性如下：
(1)比活：TYR突变体G43R的比活为218.7U/mg，TYR突变体G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W的比活分别为292.0U/mg、377.4U/mg、469.9U/mg、550.4U/mg、677.8U/mg。
(2)最适反应温度：60℃。
(3)最适pH：5.0。
3、含有酪氨酸酶编码基因的解淀粉芽孢杆菌重组菌株及以其制备酶活力提高的酪氨酸酶的过程，包括如下步骤：
(1)将TYR突变体编码基因tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6与解淀粉芽孢杆菌表达质粒pBSA43通过连接得到新的重组质粒pBSA43-tyrm2、pBSA43-tyrm3、pBSA43-tyrm4、pBSA43-tyrm5、pBSA43-tyrm6；
(2)将重组质粒转入解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218中，经卡纳霉素(Kan)抗性筛选，酶切验证得到重组菌株，之后将重组菌株进行培养发酵，得到酪氨酸酶。
在本发明中采用如下定义：
1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用单字母或三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2.酪氨酸酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示TYR突变体中突变的氨基酸。如Gly43Arg，表示位置43的氨基酸由野生型TYR的Gly替换成Arg，位置的编号对应于SEQ IDNo.1中野生型TYR的氨基酸序列编号。
在本发明中，小写斜体tyr表示野生型酪氨酸酶TYR的编码基因，小写斜体tyrm1表示突变体G43R的编码基因，小写斜体tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6分别表示突变体G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W的编码基因，信息如下表。
有益效果：
1、本发明利用迭代饱和突变技术对TYR突变体G43R进行突变，得到酶活力提高的突变体G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W，在解淀粉芽孢杆菌表达系统内发酵酶活最高值分别为3040.4U/mL、3591.7U/mL、4798.8U/mL、5228.6U/mL、6901.9U/mL。
2、本发明使用了解淀粉芽孢杆菌表达系统实现酶活力提高的TYR突变体的高效表达。
附图说明：
图1为野生型TYR、突变体G43R和本发明突变体G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W蛋白纯化样品的SDS-PAGE图；
其中：M为Protein Marker，1为野生型TYR超滤浓缩样品、2为突变体G43R超滤浓缩样品、3为突变体G43R/M61H超滤浓缩样品、4为突变体G43R/M61H/A232C超滤浓缩样品、5为突变体G43R/M61H/A232C/Q214D超滤浓缩样品、6为突变体G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A超滤浓缩样品、7为突变体G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W超滤浓缩样品。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明实施例所用培养基如下：
LB培养基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，其余为水。
培养基的固态培养基添加2％琼脂。
本发明野生型酪氨酸酶TYR来自阿耶波多氏杆菌(Bacillus aryabhattai)，氨基酸如SEQ ID NO.1所示：
MSNKYKVRKNVLSLTDAEKRDFIRAVLILKKKGIYDRYIAWHGAAGKFHTPPSSDRNAAHMSSAFLPWHREYLLRFERDLQSIDSEVTLPYWEWETDAQLQDPSQSQIWSADFMGGNGNPKKDFIVDTGPFVAGRWTTIDEQGNPSGGLKRNFGATKEAPTLPTRDDVLNALKITKYDTPPWDMTSQNSFRNQLEGFINGPQLHNRVHRWVGGQMGVVPTAPNDPVFFLHHANVDRIWAVWQMVHRNQNYQPMKNGPFGQNFRDPMYPWNTTPEDVMNHRKLGYVYDIELRKSKRSS。
以下将通过具体实施例对本发明作进一步解释说明。
实施例1：TYR突变体的获得
1.突变位点的选择：对TYR蛋白质结构及催化机制进行分析，选择了铜离子结合位点周围氨基酸残基(Trp41、Gly43、Ala59、Met61、Trp68、Arg70、Leu203、Asn205、Val207、Arg209、His230和Ala232)、底物结合位点周围氨基酸残基(Gln214、Met215、Gly216、Val217、Val218和Pro219)和介导水分子去质子化保守氨基酸位点周围氨基酸残基(Glu195、Gly196、Phe197、Ile198、Asn199、Gly200、Pro201、Gln202、Leu203、Asn205)。按照铜离子结合位点周围氨基酸残基、底物结合位点周围氨基酸残基和介导水分子去质子化保守氨基酸位点周围氨基酸残基三个区域的顺序，对每个区域选择的位点逐一进行迭代饱和突变。
2.反向PCR：以SEQ ID NO.4所示的G43R突变体编码基因tyrm1为出发基因，与pET22b质粒连接构建表达载体pET22b-tyrm1，以重组质粒pET22b-tyrm1为出发模板利用反向PCR进行迭代饱和突变，反向PCR所用引物及反应体系如下：
注：上述反向PCR所需试剂来自东洋纺(上海)生物科技有限公司的KOD-PlusMuragenesis Kit。
将反应体系按上述配比混匀后，进行反向PCR反应，程序设置如下：
PCR反应结束后，将PCR产物进行消化去模板后使自身环化连接，通过转化大肠杆菌BL21，涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基，37℃培养箱静置培养12h，得到转化子。
3.筛选方法：本实验采用荧光检测法进行酪氨酸酶单酚酶活力的测定，荧光光谱仪可以在275nm的激发波长下测量稳定酪氨酸的荧光，发射光通过280-420nm扫描获得，激发与发射单色仪的狭缝宽度设置在3-5nm。由于发酵上清存在目的蛋白，可以直接用发酵上清进行筛选，荧光强度越低，代表底物消耗量越大，证明酶活性更高。
4.突变体文库的筛选：在96孔板1中每个孔中加入200μL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基，随后，用灭过菌的牙签挑取每一个转化子的单克隆至96孔板中，挑取过程中尽可能使得每次都刚好沾到少量的菌。将96孔板转移至摇床培养，160rpm，37℃培养48h。然后采用低温离心机(4℃)，4000rpm离心10min，取10μL发酵上清加入到200μL反应液中，60℃反应5min，检测反应体系的荧光强度。
溶液：(1)2mmol/L L-酪氨酸溶液：准确称取36mg L-酪氨酸，用Tris-HCl(pH7.0)溶解并定容至100mL，4℃冰箱保藏；
(2)0.2mol/L硼酸溶液：用700mL去离子水溶解12.37g的硼酸，定容至900mL。
(3)0.2mol/L硼砂溶液：用80mL去离子水溶解1.907g的硼砂，定容至100mL。
(4)硼酸盐缓冲液：将900mL硼酸溶液与100mL硼砂溶液混合，混合均匀后的pH为7.4。
(5)反应液：取1.4mL溶液(1)和28.6mL溶液(4)与10μL羟胺混合后充分混匀，配制成反应液。
5.选取酶活力提高的突变体。根据荧光检测结果，计算每个突变体的酶活力，选取相较于上一代突变体酶活力提高的突变体，将该突变体接入平板，并送出菌样进行测序，测序验证正确后在此基础上进行下一位点的饱和突变。
经过上述步骤的迭代饱和突变，选取出酶活力提高的突变体进行测序，后得到酶活力提高的突变体：
G43R/M61H(GGT→CGG/ATG→CAC)；
G43R/M61H/A232C(GGT→CGG/ATG→CAC/GCA→TGC)；
G43R/M61H/A232C/Q214D(GGT→CGG/ATG→CAC/GCA→TGC/CAG→GAC)；
G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A(GGT→CGG/ATG→CAC/GCA→TGC/CAG→GAC/GTT→GCG)；
G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W(GGT→CGG/ATG→CAC/GCA→TGC/CAG→GAC/GTT→GCG/TTT→TGG)。
从而获得TYR突变体G43R/M61H(氨基酸序列SEQ ID NO.5)、G43R/M61H/A232C(氨基酸序列SEQ ID NO.7)、G43R/M61H/A232C/Q214D(氨基酸序列SEQ ID NO.9)、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A(氨基酸序列SEQ ID NO.11)、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W(氨基酸序列SEQ ID NO.13)，及其编码基因tyrm2(SEQ ID NO.6)、tyrm3(SEQ ID NO.8)、tyrm4(SEQ ID NO.10)、tyrm5(SEQ ID NO.12)、tyrm6(SEQ ID NO.14)，比活分别为292.0U/mg、377.4U/mg、469.9U/mg、550.4U/mg、677.8U/mg对照组野生型和突变体G43R比活分别为131.0U/mg、218.7U/mg。
实施例2：酪氨酸酶解淀粉芽孢杆菌重组菌的构建
1.表达质粒的构建
从上述筛选获得突变体G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A和G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W的菌株中提取质粒pET22b-tyrm2、pET22b-tyrm3、pET22b-tyrm4、pET22b-tyrm5、pET22b-tyrm6，获得目的基因tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6，与解淀粉芽孢杆菌表达载体pBSA43连接构建重组表达质粒pBSA43-tyrm2、pBSA43-tyrm3、pBSA43-tyrm4、pBSA43-tyrm5、pBSA43-tyrm6。
2.表达质粒转化解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218
将1μL(50ng/μL)的重组质粒pBSA43-tyrm1、pBSA43-tyrm2、pBSA43-tyrm3、pBSA43-tyrm4、pBSA43-tyrm5、pBSA43-tyrm6分别加入到50μL的解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.11218感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，确定获得表达不同突变体编码基因的解淀粉芽孢杆菌重组菌株：CGMCC No.11218/pBSA43-tyrm1、CGMCC No.11218/pBSA43-tyrm2、CGMCCNo.11218/pBSA43-tyrm3、CGMCC No.11218/pBSA43-tyrm4、CGMCC No.11218/pBSA43-tyrm5、CGMCC No.11218/pBSA43-tyrm6。
实施例3：酶活力提高的酪氨酸酶在解淀粉芽孢杆菌重组菌中的表达及制备
1.将解淀粉芽孢杆菌重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-tyrm1、CGMCC No.11218/pBSA43-tyrm2、CGMCC No.11218/pBSA43-tyrm3、CGMCC No.11218/pBSA43-tyrm4、CGMCCNo.11218/pBSA43-tyrm5、CGMCC No.11218/pBSA43-tyrm6分别接种于含卡纳霉素(50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；
2.按1％接种量转接于50mL的LB培养基中，37℃，220r/min培养48h，4000r/min离心15min后收集上清获得高活力TYR粗酶液，以L-酪氨酸为底物在60℃，pH＝7.0的条件下，测定TYR突变体粗酶液酶活力。
3.随后收集发酵液上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后透析除盐，再将盐析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/LTris-HCl(pH 8.0)缓冲液溶解，上样至离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0～1mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH 8.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液平衡，上样至凝胶柱后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化的酶液。纯化后酶液经冷冻干燥制得高活力TYR纯酶酶粉。蛋白纯化样品的SDS-PAGE图件图1。
实施例4：酪氨酸酶酶活力测定
1.酪氨酸酶酶活测定原理
荧光光谱仪可以在275nm的激发波长下测量稳定酪氨酸的荧光，发射光通过280-420nm扫描获得，激发与发射单色仪的狭缝宽度设置在3-5nm。由于发酵上清存在目的蛋白，可以直接用发酵上清进行筛选，荧光强度越低，代表底物消耗量越大，证明酶活性更高。
2.本发明采用的酪氨酸酶酶活测定方法与步骤
在终体积为3mL反应体系中加入0.14mL 2mmol/L的酪氨酸溶液(终浓度为70μM)，1μL羟胺，用硼酸盐溶液补足至3mL，在60℃下保温1min，加入20μL酶液(实施例3获得的TYR粗酶液)吹吸混匀，反应5min，将反应的初始的荧光强度和反应后的荧光强度记录下来。样品均含有3组平行实验。
空白对照：100℃处理酶液10min使酶失活，使用热失活的酶液作为对照，反应体系及方法同上。
注：溶液：(1)2mmol/L L-酪氨酸溶液：准确称取36mg L-酪氨酸，用Tris-HCl(pH7.0)溶解并定容至100mL，4℃冰箱保藏；
(2)0.2mol/L硼酸冲液：用700mL去离子水溶解12.37g的硼酸，定容至900mL。
(3)0.2mol/L硼砂溶液：用80mL去离子水溶解1.907g的硼砂，定容至100mL。
(4)硼酸盐缓冲液：将900mL硼酸溶液与100mL硼砂溶液混合，混合均匀后的pH为7.4。
3.酪氨酸酶活的定义及计算
酶活定义：在一定反应条件下(如未特别说明，条件为：60℃，pH7.0)，每分钟消耗1μmol的L-酪氨酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位，记为U/mL。
酶活力计算：
酶活力：U/mL＝x×V1/y×Δt×V2
式中：x代表从反应开始到结束，荧光强度的变化量；
V1代表反应体系的总体积(μL)；
Δt代表从反应开始到结束所用时间(min)；
V2代表在反应体系中酶液的体积(μL)；
y代表以检测酪氨酸荧光强度的标准曲线的斜率。
酶比活(U/mg)＝酶活力/蛋白浓度。
4.对实施例3解淀粉芽孢杆菌表达系统所得发酵液酶活进行测定，G43R突变体酶活为2087.5U/mL，G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W突变体分别为3040.4U/mL、3591.7U/mL、4798.8U/mL、5228.6U/mL、6901.9U/mL。
实施例5：利用高活力突变体G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W以单酚为底物合成双酚
以L-酪氨酸为底物，TYR为催化剂制备左旋多巴为例。在50mL L-酪氨酸浓度为0.5mmol/L，铜离子浓度为2μmol/L，抗坏血酸浓度为2mmol/L的反应体系中，TYR突变体G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W酶添加量为250U，反应条件为35℃、pH 7.0，在反应5min、15min、30min、60min和120min时取样检测左旋多巴的产率，左旋多巴的产率分别为27.39％、48.63％、65.27％、81.64％和84.5％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
Claims (9)
1.一种酪氨酸酶突变体，其特征在于，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示的野生型酪氨酸酶基础上发生以下突变中的一种获得的：
G43R/M61H、G43R/M61H/A232C、G43R/M61H/A232C/Q214D、G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A或G43R/M61H/A232C/Q214D/V217A/F197W。
2.如权利要求1所述的酪氨酸酶突变体，其特征在于，所述突变体具有SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.13所示氨基酸序列。
3.权利要求1所述酪氨酸酶突变体的编码基因。
4.权利要求3所述酪氨酸酶突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.14所示。
5.一种包含权利要求3所述基因的重组载体或重组菌株。
6.如权利要求5述的重组载体或重组菌株，其特征在于，表达载体为pET22b或pBSA43质粒，宿主细胞为大肠杆菌BL21，或解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218。
7.权利要求5所述重组载体或重组菌株在生产酪氨酸酶中的应用。
8.权利要求1所述酪氨酸酶突变体的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述酪氨酸酶突变体应用于单酚氧化。
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