CN111218432A

CN111218432A - 一种酪氨酸酶前体与编码基因及其制备与应用

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Publication number: CN111218432A
Application number: CN201811424467.3A
Authority: CN
Inventors: 尹恒; 张宁宁
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2038-11-27
Also published as: CN111218432B

Abstract

本发明公开了一种来源于奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae)的酪氨酸酶前体基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该酪氨酸酶前体的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的酪氨酸酶前体，经胰蛋白酶活化后能高效催化单酚和邻双酚类化合物，其催化单酚和双酚的能力分别是商业化酪氨酸酶的6倍和3倍。具有高的pH稳定性和较高的温度稳定性。此外此酪氨酸酶前体也可由SDS激发活性，调控反应的起始，并可由不同浓度的SDS调控酶活力。本发明提供的酪氨酸酶前体可广泛应用于有机合成、废水处理、医疗美容等领域。

Description

一种酪氨酸酶前体与编码基因及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种酪氨酸酶前体的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该酪氨酸酶前体的重组质粒和重组基因工程菌株及其在催化酚类化合物方面的应用。本发明提供的酪氨酸酶前体可广泛应用于有机合成、废水处理、医疗美容等领域。

背景技术

苯醌类化合物是指某些分子中存在环状不饱和二酮(即环己二烯二酮)结构的，具备较大共轭体系的化合物，在我们生活的大自然中苯醌类化合物普遍存在,并在很多重要的化学和生物转换过程中发挥重要作用。邻苯二酚衍生物和苯醌类化合物一样都是具有较好应用前景的化工原料，也是工业合成有机物的主要原料，常用于一些行业所需中间体的合成，如染料制造、医学制造、阻燃剂以及橡胶防老剂的生产等。

目前苯醌类化合物和邻苯二酚衍生物都是用化学方法进行生产，其合成方法较多，存在副产物多，污染严重，转化率低、反应条件苛刻、成本高问题。生物催化方法避免了化学方法的缺点，反应条件温和易控，能达到绿色化学的现代理念。与化学方法以及非生物催化剂相比，生物催化剂具有很大的优势，能在常温下反应，反应速率快，催化作用专一，价格较低等优点。

苯醌类化合物和邻苯二酚衍生物的生产可以借助酚氧化酶，在氧分子存在的条件下，以酚类为氧化底物生产。常用的酚氧化酶包括单酚氧化酶(monophenol oxidase，亦称酪氨酸酶)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，亦称儿茶酚氧化酶)，漆酶(laccase)。其中单酚氧化酶既能催化单酚又能催化邻双酚，多酚氧化酶只能催化邻双酚，漆酶能催化邻双酚和对双酚。

酪氨酸酶(tyr)在自然界分布广泛，是结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。酪氨酸酶是生物体内黑色素合成的关键酶，与人的衰老，昆虫的伤口愈合与发育，果蔬的褐变等有密切关系，涉及生物、医学、农学、化学、药学等多个学科和领域。酪氨酸酶具有独特的双重催化功能：单酚酶活性(催化单酚生成双酚)和双酚酶活性(催化双酚生成苯醌)。国内外对酪氨酸酶的克隆表达包括细菌、真菌、植物，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，双孢蘑菇(Agaricus bisporus)，米曲霉(Aspergillusoryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)，漏斗大孔菌(Polyporus arcularius)、放线菌中链霉菌(Streptomyces)、苹果(Malus domestica)、葡萄(Vitis vinifera)、蒲公英(Taraxacum officinale)等，但是来源于奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae)的酪氨酸酶未有报道，与漏斗大孔菌酪氨酸酶同源性最高仅为57％。目前商业化酪氨酸酶是从双孢蘑菇中提取的，其提取纯化过程复杂，成本高，产品不纯，通常混有漆酶等同工酶，活性也较低，应用受限，不适于大规模生产应用。因此，寻找一种能够高效、稳定催化酚类化合物是降低双酚化合物和苯醌生产成本的有利途径。异源表达的酪氨酸酶易于纯化分离并可以对其进行改造，以提高酶活及底物特异性，借助分子克隆和异源表达的手段进行高量表达是提高酪氨酸酶产量的一种有效措施。

本发明从奥氏蜜环菌中克隆得到一个酪氨酸酶前体基因，并成功实现了异源表达，该酪氨酸酶前体经胰蛋白酶活化后能高效催化单酚和邻双酚类化合物，其催化单酚和双酚的能力分别是商业化酪氨酸酶的6倍和3倍。在25℃、pH5.0的条件下具有最佳酶活性，并具有高的pH稳定性和较高的温度稳定性。此外此酪氨酸酶前体也可由SDS激发活性，调控反应的起始，并可由不同浓度的SDS调控酶活力。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于奥氏蜜环菌(Armillariaostoyae)的酪氨酸酶前体pro-Ao tyr及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型酪氨酸酶前体pro-Ao tyr的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的酪氨酸酶前体pro-Ao tyr基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种新型酪氨酸酶前体pro-Ao tyr在催化酚类化合物中的应用。

本发明所提供的酪氨酸酶前体pro-Ao tyr，来源于奥氏蜜环菌(Armillariaostoyae)，从中扩增出的酪氨酸酶前体pro-Ao tyr编码基因(命名为pro-Ao tyr)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码活化后具有酪氨酸酶活性的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码活化后具有酪氨酸酶活性的核苷酸序列。

本发明还提供了酪氨酸酶前体pro-Ao tyr的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：

1)序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-647位氨基酸残基序列，其中35-647位为活化后具有酪氨酸酶活性的氨基酸序列，1-34位为酶切位点及His-Tag的氨基酸序列；

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-647或35-647位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成活化后具有酪氨酸酶活性不变的氨基酸序列。

本发明的酪氨酸酶前体pro-Ao tyr的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的酪氨酸酶前体pro-Ao tyr的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶pro-Ao tyr的方法，是将酪氨酸酶前体基因克隆入重组表达载体，和分子伴侣共表达载体共同导入宿主细胞，获得重组表达的酪氨酸酶前体。

上述酪氨酸酶前体基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码活化后具有酪氨酸酶活性的核苷酸序列；

所述的重组表达酪氨酸酶前体pro-Ao tyr的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达酪氨酸酶前体pro-Ao tyr的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

本发明的酪氨酸酶前体pro-Ao tyr的基因序列是通过PCR技术从奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae)中克隆得到。该基因编码区长1944bp，属于多酚氧化酶ppo(polyphenol oxidase)家族。

本发明提供的酪氨酸酶前体在催化酚类化合物中可以应用，包括以下应用中的一种或二种：

1)在催化单酚，获得邻双酚和苯醌中的应用；

2)在催化邻双酚，获得苯醌中的应用。

本发明从大肠杆菌重组表达获得的酪氨酸酶前体pro-Ao tyr，经活化后，可以高效催化单酚、邻双酚，在25℃、pH5.0的条件下具有最佳酶活性。Ao tyr具有很高的pH稳定性，在pH3-10的范围内，Ao tyr保留其最佳活性的60％以上，并且具有较高的温度稳定性，在20-50℃范围内，Ao tyr保留其最佳活性的60％以上。在最佳条件下，以对叔丁基苯酚(单酚)为底物时，Ao tyr的活性为10.70U/mg，而商业化双孢蘑菇Ab tyr的活性仅为1.69U/mg，前者是后者的6.33倍。以L-Dopa(双酚)为底物时，Ao tyr的活性为37.05U/mg，而商业化双孢蘑菇Ab tyr的活性仅为12.67U/mg，前者是后者的2.92倍。Ao tyr还具有较宽的底物范围，能够催化L-Dopa、4-叔丁基邻苯二酚、苯酚、3，4-二甲基苯酚、4-乙基苯酚、2，4-二甲基苯酚、2，3，5-三甲基苯酚、2-氟-4-甲基苯酚等酚类底物，解决了现有对邻双酚、苯醌生产成本高、污染严重的难题，具有重要的实用价值，可应用于大规模的工业化生产。

本发明务来源于奥氏蜜环菌(Armillaria ostoyae)的酪氨酸酶前体基因及其酶，将该酪氨酸酶前体的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的酪氨酸酶前体，经胰蛋白酶活化后能高效催化单酚和邻双酚类化合物，其催化单酚和双酚的能力分别是商业化酪氨酸酶的6倍和3倍。在25℃、pH5.0的条件下具有最佳酶活性，并具有高的pH稳定性和较高的温度稳定性。此外此酪氨酸酶前体也可由SDS激发活性，调控反应的起始，并可由不同浓度的SDS调控酶活力。

本发明的酪氨酸酶Ao tyr可广泛应用于有机合成、废水处理、医疗美容等领域。

附图说明

图1：酪氨酸酶前体基因pro-Ao tyr琼脂糖凝胶电泳检测。

图2：酪氨酸酶前体pro-Ao tyr表达及纯化的SDS-PAGE图。各泳道加入的样品分别是：泳道1-蛋白分子量标准，泳道2-pro-Ao tyr未诱导菌体总沉淀，泳道3-pro-Ao tyr诱导后菌体总沉淀，泳道4-pro-Ao tyr破菌沉淀，泳道5-pro-Ao tyr破菌上清，泳道6-pro-Aotyr上柱三次流穿液，泳道7-50mM咪唑洗脱流穿液，泳道8-200mM咪唑洗脱流穿液，泳道9-pro-Ao tyr活化后样品。

图3：pH值对酪氨酸酶Ao tyr的影响曲线。

图4：温度对酪氨酸酶Ao tyr的影响曲线。

图5：酪氨酸酶Ao tyr对对叔丁基苯酚催化产物的液相图谱。

具体实施方式

序列表

SEQ ID No.1的信息

(a)序列特征

长度：1944核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.1

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGTCTCGCTTCATCATTACTGGTGCCAAGGGTGGTAATACCCAAGGTGCAGACGCTCCCAATCGACTCGAAATCAACGTTCTCGTCAAGAAACAGGATCAGTTCTCGTTATACATCCAAGCCCTCGACGCGATGTATTCCGAGCAACAAGGCAACGACATTTCGTTTTTCGGTATTGGAGGCATTCATGGTCTTCCATACGTCCAGTGGGATGGATCTGGCGGCACCAAGCCTGTACCAAAGTCGGAATGGGGCGGTTACTGCCACCATGGATCGACCCTCTTCCCCACTTGGCACAGACCCTACGTCGCGCTCTTCGAGCAAGTCCTGCAGCAACATGCTGTAGCCATTGCTGAAAAGTACACCGTCGATAACGCACGCTGGAAAGCCGCCGCCGCCAACCTTCGTGCCCCATATTGGGATTGGGCCGCCAATTCCGTTCCTCCCCCAGAAGTCATCTCTCTGGCAACCGTCAAGATCATTAAACCAGATGGCAAGTTGGGTTCTGTTGCGAATCCGTTACTCAAATATGGATTCCACCCCATCGACAAGTCGTTCCCTCCGCCATACAGTGGGTGGCGCACGACGTTGAGGCATCCTACAAGCGCAAACCCTAATGCAACGAGCAATATCGACGATTTGAAGAGTGATCTTAGTGCTGCGCAGGATGACATTACTACGAGTACTTACAACTTGCTGACTCGTGTCCATACATGGCCAGCTTTCAGTAACCATAGTCCCGGTGACGGTGGCAGCAGCGGTAACTCGTTAGAGGCGATCCATGATGGTATTCACGATGATATTGGAGCTGGAGGACATATGGGCGACCCCGCTGTCGCTGGTTTCGATCCTATCTTCTTCCTGCATCACGCCAACGTCGACCGCATGCTCTCACTGTGGTCTGCGCTCAATCCTACCGTCTGGGTATCCGAAGGACCGGCAACGGGCGGAACCTTCACCGTGCCCGCCAACACCCCAGTAGATGCTAAGACTTCGTTGACACCATTCTGGGATTCCCAAACCGGTTACTGGGCATCTTCGGAGGCGACCATCACAAGCAAGCTCGGATACACCTATCCCGAGTTCAACGGTCTCAATATGGGAAACCCGCCTGCTGTTCAAGATGCGATCGCGCAAGCTGTCAACAAATTGTACGGCGGTCCCATTTTCAACGTATTCAGCCAAACCAGTCCCGGCACGACCAACTTCTTGGCCTCAAGGTCTCTGGCTCCTAGTTCAAGCGATGCTCAGGCCACCGGTACAAGTGAGAGTACAGTATCTGCCGTAGCACCTCCTGCAGGAGGAGATGCCTCGGTTTCCGTCCGGTCCATTGACCCAGCTGGCACCCCTGCCCCCAACAGCTTCTACGACTGGACCGCCCGCATCCAGGTTAAGAAGTACGCGCTCGGAGGCAGCTTCTCCGTTCTGATTTTCCTGGGTGAAGTTCCCGAGAATTCACGGGGCTGGCGCTCTTCCCCGTCGTTCGTAGGCGCACATCATGCCTTCGTCAACAGCGCAGCGGATCAATGCGAGAACTGCAGGAATCAGGCAGATCTCGTTATCGAGGGATTCGTTCACTTGAACACTGCAATTGCACAGCGCTCTGGGTTGGGCTCGTTTGAGCCTGCTGTTGTTGAGCCGTACTTGAAGCGTGAATTGTCGTGGCGTGTCCAGAAGGTCGACAGGACGGCAGTTGATCTCTCCGATGTCCCATCCTTGGAGGTCGTCGTCTCTGCCACTCCGCTCACTCTGGAGCCTGGCGCGACGTTCCCCACTTCAGGGGAATGCCATTATCATCACCGTATCACAGCTGGTCGTCCCGGTGGTAGTCAACCTGAGTGA

SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

长度：647氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

(b)分子类型：蛋白

序列描述：SEQ ID NO.2

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSMSRFIITGAKGGNTQGADAPNRLEINVLVKKQDQFSLYIQALDAMYSEQQGNDISFFGIGGIHGLPYVQWDGSGGTKPVPKSEWGGYCHHGSTLFPTWHRPYVALFEQVLQQHAVAIAEKYTVDNARWKAAAANLRAPYWDWAANSVPPPEVISLATVKIIKPDGKLGSVANPLLKYGFHPIDKSFPPPYSGWRTTLRHPTSANPNATSNIDDLKSDLSAAQDDITTSTYNLLTRVHTWPAFSNHSPGDGGSSGNSLEAIHDGIHDDIGAGGHMGDPAVAGFDPIFFLHHANVDRMLSLWSALNPTVWVSEGPATGGTFTVPANTPVDAKTSLTPFWDSQTGYWASSEATITSKLGYTYPEFNGLNMGNPPAVQDAIAQAVNKLYGGPIFNVFSQTSPGTTNFLASRSLAPSSSDAQATGTSESTVSAVAPPAGGDASVSVRSIDPAGTPAPNSFYDWTARIQVKKYALGGSFSVLIFLGEVPENSRGWRSSPSFVGAHHAFVNSAADQCENCRNQADLVIEGFVHLNTAIAQRSGLGSFEPAVVEPYLKRELSWRVQKVDRTAVDLSDVPSLEVVVSATPLTLEPGATFPTSGECHYHHRITAGRPGGSQPE

实施例1酪氨酸酶前体全长基因克隆

参照柱式真菌总RNA抽提纯化试剂盒(上海生工)操作步骤提取奥氏蜜环菌菌索总RNA并参照RevertAid Frist Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)操作步骤合成第一链cDNA。对The National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中酪氨酸酶前体基因序列进行多序列比对分析后，设计引物pro-Ao tyr-F:5’-CGACGGATCCATGTCTCGCTTCATCATTAC-3’；pro-Ao tyr-R:5’-CAGCTCGAGTCACTCAGGTTGACTACCAC-3’，以奥氏蜜环菌的第一链cDNA为模板，扩增编码酪氨酸酶前体蛋白的基因序列。PCR反应条件为：94℃ 3min，1个循环；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃2min，30个循环；72℃ 5min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的基因进行切胶回收，经双酶切的方法连接到原核表达载体pET28a上后测序。

实施例2酪氨酸酶前体基因序列分析

测序结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，DNAMAN软件进行多序列比对，Vector NTI分析序列信息。

获得的酪氨酸酶前体(命名为pro-Ao tyr)编码区长1944bp，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示。pro-Ao tyr编码647个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，蛋白质理论分子量为68.99kDa，预测等电点为6.18。pro-Ao tyr编码的氨基酸具有酪氨酸酶中心结构域，此表明pro-Ao tyr为多酚氧化酶家族的一名成员。

实施例3酪氨酸酶前体pro-Ao tyr基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化

为了便于基因的重组表达，在设计的上下游引物中分别引入BamH I和XhoI酶切位点。将PCR清洁产物pro-Ao tyr和表达载体pET28a分别用BamH I和XhoI进行双酶切，酶切产物经清洁回收后，用T₄DNA连接酶连接(连接体系：(5μLT₄DNA Ligase 0.5μL，10×T₄DNALigase Buffer 0.5μL，pET21a 2μL，PCR产物2μL)，连接条件：室温过夜连接。)。取5μL连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL卡那霉素的固体Luria-Bertani培养基上，37℃培养12-16h。挑取单克隆，使用简并引物进行菌落PCR验证，将扩增正确的单克隆接入含有100μg/mL卡那霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；使用内切酶BamH I和XhoI对提取的质粒进行双酶切，结果正确的重组质粒送华大基因测序。测序结果表明，在pET28a的BamH I和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO 1所示的pro-Ao tyr基因，且插入方向正确，证明重组质粒构建成功，将该重组质粒命名为pET28a-pro-Ao tyr。

将pET28a-pro-Ao tyr转化E.coli pro7BL21(DE3)，对其进行诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酪氨酸酶前体pro-Ao tyr的表达及纯化情况，结果如图2所示，纯化后的酪氨酸酶前体pro-Ao tyr(泳道8)在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

向纯化后的酪氨酸酶前体pro-Ao tyr中加入1％1mg/mL胰蛋白酶，置于4℃活化24h，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测消化情况，结果如图2条所示，酪氨酸酶前体pro-Ao tyr被活化为酪氨酸酶Ao tyr(带9)，在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例4酪氨酸酶Ao tyr的活性测定及酶学性质分析

(1)酪氨酸酶Ao tyr的活力测定

以180μL2mM pH7.4(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)的L-Dopa为底物，加入20μL重组酶Ao tyr，通过紫外分光光度计于457nm下连续跟踪其吸光度的变化，连续测1h，每隔5分钟读取数据。酶活力单位定义为:每分钟产生1μmol多巴色素所需的酶量为一个酶活力单位(U)。蛋白浓度使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

(2)温度对酪氨酸酶Ao tyr的影响

在pH6.0的条件下，以180μL 2mM L-Dopa为底物，分别在0-80℃下加入20μL重组酶Ao tyr，通过紫外分光光度计于457nm下连续跟踪其吸光度的变化，连续测1h，每隔5分钟读取数据。以灭活的酶为对照，以反应最高酶活力为100％计算相对酶活，根据酶在不同温度下的相对活性绘制曲线。结果如图4所示，Ppman的最适反应温度为25℃。

(3)pH对酪氨酸酶Ao tyr的影响

在25℃的条件下，分别以180μL2mM，pH3.0-11.0(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)的L-Dopa为底物，加入20μL重组酶Ao tyr，通过紫外分光光度计于457nm下连续跟踪其吸光度的变化，连续测1h，每隔5分钟读取数据。以灭活的酶作为对照，以活性最高的值为100％，测定在各个反应pH下酶的相对活性。根据酶在不同pH下的相对活性绘制曲线，确定酶的最适反应pH。结果如图3所示，Ao tyr的最适反应pH为5.0，随着pH的升高或降低，Ao tyr的活性均降低。

在最适温度和最适pH条件下，按标准方法测得Ppman的比活为140.33U/mg。

(4)重组酪氨酸酶Ao tyr的底物特异性

选取L-Dopa、苯酚、2，4-二甲基苯酚、3，4-二甲基苯酚、2-氟-4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、对甲苯甲醚、2，3，5-三甲基苯酚、4-叔丁基苯酚、4-叔丁基邻苯二酚8种底物考察重组酶Ao tyr的底物特异性。将20μL重组酶Ppman分别加入到180μL的饱和的不同底物中，反应24h，Ao tyr催化酚类底物生成有色的苯醌类产物，通过观察催化前后的颜色变化，可以得知Ao tyr对底物的催化活性。根据颜色变化的快慢，将活性分成高、较高、较低、低4个等级，结果如表1所示，重组酶Ao tyr对邻双酚活性最高，对邻位上无取代基的单酚次之，对邻位上有取代基的单酚活性最低。

表1 Ao tyr的底物特异性

实施例5酪氨酸酶Ao tyr催化对叔丁基苯酚产物分析

将0.5mM对叔丁基苯酚与重组酶Ao tyr按9:1(体积比)的比例混合后，在25℃，pH5.0条件下反应2h，加入3倍体积乙腈沉淀除去蛋白后，对其产物进行高效液相分析。如图5所示，Ao tyr催化对叔丁基苯酚的效率可以达到100％。因此，Ao tyr可用于对叔丁基邻苯二酚的制备以及与酚类化合物氧化相关方面的研究，包括有机合成、废水处理、医疗美容等领域。

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种酪氨酸酶前体与编码基因及其制备与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1944

<212> DNA

<213> 酪氨酸酶前体基因(pro-Ao tyr)

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatgtctcg cttcatcatt 120

actggtgcca agggtggtaa tacccaaggt gcagacgctc ccaatcgact cgaaatcaac 180

gttctcgtca agaaacagga tcagttctcg ttatacatcc aagccctcga cgcgatgtat 240

tccgagcaac aaggcaacga catttcgttt ttcggtattg gaggcattca tggtcttcca 300

tacgtccagt gggatggatc tggcggcacc aagcctgtac caaagtcgga atggggcggt 360

tactgccacc atggatcgac cctcttcccc acttggcaca gaccctacgt cgcgctcttc 420

gagcaagtcc tgcagcaaca tgctgtagcc attgctgaaa agtacaccgt cgataacgca 480

cgctggaaag ccgccgccgc caaccttcgt gccccatatt gggattgggc cgccaattcc 540

gttcctcccc cagaagtcat ctctctggca accgtcaaga tcattaaacc agatggcaag 600

ttgggttctg ttgcgaatcc gttactcaaa tatggattcc accccatcga caagtcgttc 660

cctccgccat acagtgggtg gcgcacgacg ttgaggcatc ctacaagcgc aaaccctaat 720

gcaacgagca atatcgacga tttgaagagt gatcttagtg ctgcgcagga tgacattact 780

acgagtactt acaacttgct gactcgtgtc catacatggc cagctttcag taaccatagt 840

cccggtgacg gtggcagcag cggtaactcg ttagaggcga tccatgatgg tattcacgat 900

gatattggag ctggaggaca tatgggcgac cccgctgtcg ctggtttcga tcctatcttc 960

ttcctgcatc acgccaacgt cgaccgcatg ctctcactgt ggtctgcgct caatcctacc 1020

gtctgggtat ccgaaggacc ggcaacgggc ggaaccttca ccgtgcccgc caacacccca 1080

gtagatgcta agacttcgtt gacaccattc tgggattccc aaaccggtta ctgggcatct 1140

tcggaggcga ccatcacaag caagctcgga tacacctatc ccgagttcaa cggtctcaat 1200

atgggaaacc cgcctgctgt tcaagatgcg atcgcgcaag ctgtcaacaa attgtacggc 1260

ggtcccattt tcaacgtatt cagccaaacc agtcccggca cgaccaactt cttggcctca 1320

aggtctctgg ctcctagttc aagcgatgct caggccaccg gtacaagtga gagtacagta 1380

tctgccgtag cacctcctgc aggaggagat gcctcggttt ccgtccggtc cattgaccca 1440

gctggcaccc ctgcccccaa cagcttctac gactggaccg cccgcatcca ggttaagaag 1500

tacgcgctcg gaggcagctt ctccgttctg attttcctgg gtgaagttcc cgagaattca 1560

cggggctggc gctcttcccc gtcgttcgta ggcgcacatc atgccttcgt caacagcgca 1620

gcggatcaat gcgagaactg caggaatcag gcagatctcg ttatcgaggg attcgttcac 1680

ttgaacactg caattgcaca gcgctctggg ttgggctcgt ttgagcctgc tgttgttgag 1740

ccgtacttga agcgtgaatt gtcgtggcgt gtccagaagg tcgacaggac ggcagttgat 1800

ctctccgatg tcccatcctt ggaggtcgtc gtctctgcca ctccgctcac tctggagcct 1860

ggcgcgacgt tccccacttc aggggaatgc cattatcatc accgtatcac agctggtcgt 1920

cccggtggta gtcaacctga gtga 1944

<210> 2

<211> 647

<212> PRT

<213> 酪氨酸酶前体基因(pro-Ao tyr)

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Met Ser Arg Phe Ile Ile Thr Gly Ala Lys Gly Gly Asn Thr

35 40 45

Gln Gly Ala Asp Ala Pro Asn Arg Leu Glu Ile Asn Val Leu Val Lys

50 55 60

Lys Gln Asp Gln Phe Ser Leu Tyr Ile Gln Ala Leu Asp Ala Met Tyr

65 70 75 80

Ser Glu Gln Gln Gly Asn Asp Ile Ser Phe Phe Gly Ile Gly Gly Ile

85 90 95

His Gly Leu Pro Tyr Val Gln Trp Asp Gly Ser Gly Gly Thr Lys Pro

100 105 110

Val Pro Lys Ser Glu Trp Gly Gly Tyr Cys His His Gly Ser Thr Leu

115 120 125

Phe Pro Thr Trp His Arg Pro Tyr Val Ala Leu Phe Glu Gln Val Leu

130 135 140

Gln Gln His Ala Val Ala Ile Ala Glu Lys Tyr Thr Val Asp Asn Ala

145 150 155 160

Arg Trp Lys Ala Ala Ala Ala Asn Leu Arg Ala Pro Tyr Trp Asp Trp

165 170 175

Ala Ala Asn Ser Val Pro Pro Pro Glu Val Ile Ser Leu Ala Thr Val

180 185 190

Lys Ile Ile Lys Pro Asp Gly Lys Leu Gly Ser Val Ala Asn Pro Leu

195 200 205

Leu Lys Tyr Gly Phe His Pro Ile Asp Lys Ser Phe Pro Pro Pro Tyr

210 215 220

Ser Gly Trp Arg Thr Thr Leu Arg His Pro Thr Ser Ala Asn Pro Asn

225 230 235 240

Ala Thr Ser Asn Ile Asp Asp Leu Lys Ser Asp Leu Ser Ala Ala Gln

245 250 255

Asp Asp Ile Thr Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Leu Thr Arg Val His Thr

260 265 270

Trp Pro Ala Phe Ser Asn His Ser Pro Gly Asp Gly Gly Ser Ser Gly

275 280 285

Asn Ser Leu Glu Ala Ile His Asp Gly Ile His Asp Asp Ile Gly Ala

290 295 300

Gly Gly His Met Gly Asp Pro Ala Val Ala Gly Phe Asp Pro Ile Phe

305 310 315 320

Phe Leu His His Ala Asn Val Asp Arg Met Leu Ser Leu Trp Ser Ala

325 330 335

Leu Asn Pro Thr Val Trp Val Ser Glu Gly Pro Ala Thr Gly Gly Thr

340 345 350

Phe Thr Val Pro Ala Asn Thr Pro Val Asp Ala Lys Thr Ser Leu Thr

355 360 365

Pro Phe Trp Asp Ser Gln Thr Gly Tyr Trp Ala Ser Ser Glu Ala Thr

370 375 380

Ile Thr Ser Lys Leu Gly Tyr Thr Tyr Pro Glu Phe Asn Gly Leu Asn

385 390 395 400

Met Gly Asn Pro Pro Ala Val Gln Asp Ala Ile Ala Gln Ala Val Asn

405 410 415

Lys Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Phe Asn Val Phe Ser Gln Thr Ser Pro

420 425 430

Gly Thr Thr Asn Phe Leu Ala Ser Arg Ser Leu Ala Pro Ser Ser Ser

435 440 445

Asp Ala Gln Ala Thr Gly Thr Ser Glu Ser Thr Val Ser Ala Val Ala

450 455 460

Pro Pro Ala Gly Gly Asp Ala Ser Val Ser Val Arg Ser Ile Asp Pro

465 470 475 480

Ala Gly Thr Pro Ala Pro Asn Ser Phe Tyr Asp Trp Thr Ala Arg Ile

485 490 495

Gln Val Lys Lys Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Phe Ser Val Leu Ile Phe

500 505 510

Leu Gly Glu Val Pro Glu Asn Ser Arg Gly Trp Arg Ser Ser Pro Ser

515 520 525

Phe Val Gly Ala His His Ala Phe Val Asn Ser Ala Ala Asp Gln Cys

530 535 540

Glu Asn Cys Arg Asn Gln Ala Asp Leu Val Ile Glu Gly Phe Val His

545 550 555 560

Leu Asn Thr Ala Ile Ala Gln Arg Ser Gly Leu Gly Ser Phe Glu Pro

565 570 575

Ala Val Val Glu Pro Tyr Leu Lys Arg Glu Leu Ser Trp Arg Val Gln

580 585 590

Lys Val Asp Arg Thr Ala Val Asp Leu Ser Asp Val Pro Ser Leu Glu

595 600 605

Val Val Val Ser Ala Thr Pro Leu Thr Leu Glu Pro Gly Ala Thr Phe

610 615 620

Pro Thr Ser Gly Glu Cys His Tyr His His Arg Ile Thr Ala Gly Arg

625 630 635 640

Pro Gly Gly Ser Gln Pro Glu

645

Claims

1.一种酪氨酸酶前体基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码活化后能催化酚类化合物的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

2.一种权利要求1所述的酪氨酸酶前体基因编码的酪氨酸酶前体，其特征在于：其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-647位氨基酸残基序列；

2)对序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的活化后具有酪氨酸酶活性的氨基酸序列。

3.一种权利要求2所述的酪氨酸酶前体的制备方法，其特征在于：将酪氨酸酶前体基因克隆入重组表达载体和分子伴侣共表达载体一同导入宿主细胞，获得重组表达的酪氨酸酶前体；

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)所述的重组表达酪氨酸酶前体的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上；

5)所述的分子伴侣共表达载体，是指pG-KJE8、pGro7、PkJE7、pG-Tf2、pTf16中的一种或二种以上。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞，即用于重组表达酪氨酸酶前体的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lacticacid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaeaeucalypti等)，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)中的一种。

5.一种权利要求2所述的酪氨酸酶前体在催化酚类底物中的应用。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于：此酪氨酸酶前体也可由SDS激发活性，调控反应的起始，并可由0.05-10mM的SDS调控酶活力，在5mM SDS调控下酶活力达到最高。

7.按照权利要求5或6所述的应用，其特征在于：包括以下应用中的一种或二种：

1)在催化单酚，获得邻双酚和苯醌中的应用；

2)在催化邻双酚，获得苯醌中的应用。

8.按照权利要求5、6或7所述的应用，其特征在于：最适的反应温度范围20-30度，最适的反应pH范围4-6。