CN114921428B

CN114921428B - 一种Baeyer-Villiger单加氧酶及其用途

Info

Publication number: CN114921428B
Application number: CN202210589622.7A
Authority: CN
Inventors: 李盛英; 刘琨; 陈月星; 郭嘉伟; 赵之怡
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2022-05-27
Filing date: 2022-05-27
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2042-05-27
Also published as: CN114921428A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Baeyer‑Villiger单加氧酶及其用途。一种Baeyer‑Villiger单加氧酶，该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种新型的Baeyer‑Villiger单加氧酶及表达该酶的工程菌；该酶能够催化香紫苏醇衍生物发生Baeyer‑Villiger氧化反应，为龙涎醚的生产提供了新途径。

Description

一种Baeyer-Villiger单加氧酶及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Baeyer-Villiger单加氧酶及其用途。

背景技术

龙涎醚是来源于抹香鲸的名贵香料龙涎香的主要香味成分。由于龙涎香的天然来源越来越稀少，且很多国家目前已立法禁止龙涎香交易，龙涎醚已取代龙涎香作为定香剂和致香剂被应用于香水、高端日化产品、香烟等产品中，具有很高的市场价值。目前龙涎醚的主要来源是以植物提取的天然产物香紫苏醇为原料，进行化学氧化、还原、环化三步反应，先后形成香紫苏内酯和香紫苏二醇，最终产生龙涎醚，如图2所示。除了化学法以外，也可以用生物转化—化学催化结合的方式进行龙涎醚的生产：一种是利用真菌Cryptococcusalbidus ATCC 20918以化合物(1)为原料发酵生产化合物(2)(US005212078A,1993)，随后以化合物(2)为原料通过化学法生产化合物(4)；另一种方式是用真菌Hyphozymaroseoniger ATCC 20624以化合物(1)为原料生产化合物(3)(US4798799A,1989)，再以化合物(3)为原料通过化学法生产化合物(4)。

化学-酶法合成龙涎醚近年来也有报道，来源于酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的角鲨烯藿烯环化酶(Squalene Hopene Cyclase,SHC)可催化16碳前体(3E,3E)-homofarnesol发生环化反应直接生成龙涎醚(AdvancedSynthesis&Catalysis 2018,360,2339-2351)。该方法目前主要存在两个问题：首先，(3E,3E)-homofarnesol需以橙花叔醇为原料经四步化学反应合成(US9758500B2,2017)，成本较高且产率较低；其次，SHC催化的反应会产生气味远远低于龙涎醚的同分异构体。因此，龙涎醚的合成方法仍有较大的改进空间。

发明内容

本发明的目的是提供一种真菌来源的Baeyer-Villiger氧化酶，该酶及表达该酶的工程菌株均能够催化香紫苏醇衍生物发生Baeyer-Villiger氧化反应生成乙酸酯，后续可通过温和易发的酯键水解、脱水缩合反应生产龙涎醚。为龙涎醚的合成开辟了新的途径。

为实现上述目的，本发明首先采用的技术方案是：一种Baeyer-Villiger单加氧酶，该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，本发明还提供所述Baeyer-Villiger单加氧酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明还提供一种包含所述Baeyer-Villiger单加氧酶的编码基因的表达载体。

进一步地，本发明还提供一种表达所述Baeyer-Villiger单加氧酶的工程菌，所述工程菌包含所述的表达载体或所述编码基因。

进一步地，本发明还提供一种Baeyer-Villiger单加氧酶的用途，该酶在制备龙涎醚的过程中，用于催化香紫苏醇衍生物发生Baeyer-Villiger氧化反应。

进一步地，本发明还提供一种化学-酶法生产龙涎醚的方法，该方法包括：利用所述的Baeyer-Villiger单加氧酶催化香紫苏醇衍生物发生Baeyer-Villiger氧化反应生成乙酸酯，后续通过酯键水解、脱水缩合反应生产龙涎醚；其中，反应体系中，酶与底物的摩尔比为1:4～1:50。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果在于：

1.提供一种新型的Baeyer-Villiger单加氧酶及表达该酶的工程菌；

2.Baeyer-Villiger单加氧酶能够催化香紫苏醇衍生物发生Baeyer-Villiger氧化反应，为龙涎醚的生产提供了新途径；

3.提供一种新的化学-酶法生产龙涎醚的方法，该方法条件温和，成本低廉。

附图说明

图1为本发明提供的化学-酶法生产龙涎醚过程中化合物(5)在HrBVMO催化下发生的Bayer-villiger氧化反应；

图2为现有龙涎醚的化学合成及本发明提供的化学-酶法合成路径；其中A，B，C，D，E，G均为已知反应，F为本发明提供的HrBVMO催化的Bayer-Villiger氧化反应；

图3为HrBVMO的表达质粒图谱；

图4为纯化后的HrBVMO的SDS-PAGE分析，图中：M.蛋白marker；1.HrBVMO蛋白，理论分子量大小为81kDa。

图5为化合物(5)和化合物(6)标准品的高分辨质谱检测；图中，a：化合物(5)；b：化合物(6)；

图6为化合物(5)和化合物(6)的¹H核磁共振图谱；图中，a：化合物(5)；b：化合物(6)；

图7为化合物(5)在HrBVMO催化下反应产物的GC-MS/MS鉴定；a.化合物(6)标准品的离子色谱图；b.化合物(6)标准品离子碎片谱；c.化合物(5)在HrBVMO催化下反应产物的离子色谱图；d.化合物(5)在HrBVMO催化下反应产物离子碎片谱；

图8为化合物(5)在HrBVMO催化下反应产物的高分辨LC-MS检测；a.反应产物中提取离子流色谱图；b.a图中提取到的离子峰处的质谱检测到与化合物(6)理论分子量一致的离子峰。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1 Baeyer-Villiger单加氧酶HrBVMO的基因与氨基酸序列分析

通过对真菌Hyphozyma roseonigra ATCC 20624(购自American Type CultureCollection)基因组测序及数据挖掘获得一个长度为2124个碱基的编码基因，该基因编码一个长度为707个氨基酸的蛋白，命名为HrBVMO。该编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通过对该蛋白HrBVMO进行Pfam分析(在线工具地址http://pfam.xfam.org/)发现，该蛋白属于Flavin-containing monooxygenase(FMO)蛋白家族，因此其催化反应时需要黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅因子。随后，在UniProt数据库(www.uniprot.org)中对该蛋白进行功能预测，与其一致性最高且有功能研究报道的蛋白为4-羟基苯乙酮单加氧酶(序列号：Q93TJ5)，该酶能够催化4-羟基苯乙酮发生Bayer-Villiger氧化反应生成4-乙酰氧基苯酚，HrBVMO与该酶的序列一致性为36％。

为了确定HrBVMO氨基酸序列的新颖性，本发明课题组通过在线BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在GenBank中搜索它的同源蛋白并按序列相似性排列，表1中所列的为GeneBank数据库中与HrBVMO一致性最高的30个序列，其中只有一个蛋白的基因序列与HrBVMO一致性大于60％，其余29个蛋白均低于60％。该分析结果说明HrBVMO蛋白为从未公开过的蛋白序列。

表1.GeneBank中与HrBVMO编码基因一致性最高的前30个蛋白的基因序列

实施例2 HrBVMO的克隆

以Hyphozyma roseonigra ATCC 20624(购自American Type CultureCollection)菌落为模板，以BV-F及BV-R为引物对HrBVMO的编码基因片段进行扩增。采用TaKaRa公司的PrimeSTAR Max DNA Polymerase，按照试剂盒说明书配置反应体系。

扩增程序为：

以pET28a为模板，28a-F及28a-R为引物对pET28a进行线性化扩增。

扩增程序为：

以上扩增引物序列如表2所示。

表2.HrBVMO编码基因克隆至pET28a的引物及其序列

将获得的HrBVMO编码基因片段与线性化的pET28a载体片段利用无缝克隆试剂盒进行连接形成表达载体pET28a-HrBVMO，图谱如图3所示。将上述表达载体转化至大肠杆菌表达菌株Escherichia coli Rosseta-gami 2(DE3)，获得表达菌株Rg2-HrBVMO。菌株Rg2-HrBVMO表达C端带有组氨酸纯化标签的HrBVMO蛋白，可通过Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化。

实施例3 HrBVMO蛋白的表达与纯化

挑取Rg2-HrBVMO单克隆接到培养基中(含有50μg/mL卡那霉素和10μg/ml氯霉素双抗性)进行种子液培养，37℃、220rpm摇床培养8-12h；扩大培养的比例为1:500～1:100，37℃、220rpm摇床培养约4h，当OD₆₀₀达到0.6～0.8时加入IPTG开始诱导，IPTG终浓度可以为0.2～1mM。诱导条件为18～30℃诱导18-24h。将诱导结束的菌液在4℃、3000～6000g条件下离心10min，收集菌体。

收集的菌体用50mL预冷的lysis buffer重悬，在冰浴中利用超声破碎仪对菌体进行破碎，破碎程序为功率为290W，超声破碎4s，停止8s，超声总时长为15min。在4℃13000g60min条件下离心取上清，上清液与3mL Ni-NTA树脂在4℃的下孵育1小时使目标蛋白与树脂充分结合，先后用15mL lysis buffer和15mL wash buffer冲洗，用5mL elution buffer洗脱收集目标蛋白，用Ultracel-30K的超滤管对洗脱液浓缩至2.5mL。将脱盐柱PD-10用25mL desalting buffer平衡，将2.5mL浓缩蛋白液加入到脱盐柱PD-10中，加入3.5mL的desalting buffer收集蛋白，用分光光度计测定纯化蛋白质的浓度为2mg/mL，取10μL蛋白用于SDS-PAGE检测，检测结果如图4所示。剩余蛋白用液氮速冻并保存于-80℃。

上述蛋白纯化各缓冲液配方：

Lysis buffer(1L)：6g NaH₂PO₄、17.5g NaCl、100g甘油，0.68g咪唑，pH 8.0。

Wash buffer(1L)：6g NaH₂PO₄、17.5g NaCl、100g甘油，1.36g咪唑溶，pH 8.0。

Elution buffer(1L)：6g NaH₂PO₄、17.5g NaCl、100g甘油，17.02g咪唑，pH 8.0。

Desalting buffer(1L)：6g NaH₂PO₄、100g甘油，pH 7.4。

实施例4 HrBVMO蛋白的功能鉴定

(1)HrBVMO蛋白的底物与产物标准品的制备

作为验证HrBVMO蛋白功能的底物与产物，化合物(5)(香紫苏酮)和化合物(6)(香紫苏二醇乙酸酯)均通过化学法合成。其中化合物(5)的合成条件依据参考文献SyntheticCommunications 2004,34,3631–3643，化合物(6)的合成条件依据参考文献Chemistry ofNatural Compounds 2011,47,574–578，合成并纯化后的化合物(5)和化合物(6)经高分辨质谱(如图5所示)及核磁共振¹H谱(如图6所示)鉴定，确认与参考文献吻合，具体数据如下：

化合物(5)：高分辨质谱分子量303.2295([M+Na]⁺,理论值303.2295)。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃,δ,ppm,J/Hz):0.79(6H,s),0.86(3H,s),1.15(3H,s),1.08–1.88(2H,m),2.13(3H,s),2.59(1H,ddd,J＝5.7,7.8,17.8),2.65(1H,dd,J＝7.8,17.8).

化合物(6)：高分辨质谱分子量319.2248([M+Na]⁺,理论值319.2244)。

以上核磁数据与参考文献一致。

(2)HrBVMO蛋白催化香紫苏醇衍生物发生Bayer-Villiger氧化反应的产物鉴定

HrBVMO蛋白催化的反应如图1所示，具体过程如下：

2.8mg化合物(5)溶于二甲基亚砜(DMSO)制成10mM底物母液，50mM NaH₂PO₄-NaH₂PO₄ pH 7.5作为反应缓冲液。

反应体系：FAD 30μM，NADPH 1mM，GDH 1μM，葡萄糖10mM，化合物(5)100μM，HrBVMO10μM(终浓度)，总体积200μL。反应5小时后用200μL乙酸乙酯萃取，产物用于后续检测。对照样品与以上反应样品相同处理，唯一不同点在于所用酶为100℃处理10min失活后的HrBVMO。

反应产物首先在气相色谱(GC-MS/MS)上进行检测，所用仪器型号为Thermo QExactive^TM GC Orbitrap^TM GC-MS/MS。检测结果如图7所示，化合物(5)在HrBVMO催化下反应生成出峰时间(28.04min)及离子碎片(图7中c、d所示)与化合物(6)(如图7中a、b所示)相同的物质，证明其产物为化合物(6)。随后，将样品与对照的样品用氮吹仪吹干后用40％甲醇溶解，进行高分辨LC-MS分析，如图8所示，从反应样品中可提取到化合物(6)的离子峰。由GC-MS/MS和LC-MS结果可以确定，HrBVMO能够催化香紫苏酮发生Bayer-Villiger反应生成香紫苏二醇乙酸酯。该结果为HrBVMO应用于龙涎醚的合成提供了有力的证据。

本发明提供的化学-酶法生产龙涎醚的方法中，化合物(5)的生产可通过起始原料香紫苏醇进行一步氧化生产，其报道的最高产率为90％(Tetrahedron 1993,49,10405–10412；Tetrahedron 2011,67,1142–1144；Chemistry of Natural Compounds 2021,57,101–110.)，而后续的酯键水解及环化均为环境友好、成本低廉的反应，因此本发明对于龙涎醚合成方法的改进具有重要意义，能够带来显著的经济效益。

序列表

<110> 山东大学

<120> 一种Baeyer-Villiger单加氧酶及其用途

<141> 2022-05-26

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 707

<212> PRT

<213> Hyphozyma roseonigra

<400> 1

Met Thr Thr Pro Thr Met Thr Met Pro Ser Asp Leu Gly Ala Ala Thr

1 5 10 15

Asn Asp Thr Gln Cys Arg Asn Pro Lys Ile Asp Asp Asp Phe Val Arg

20 25 30

Ala Ala Leu Glu Glu Ala Ser Ala Pro Ala Leu Arg Leu Ala Leu Leu

35 40 45

Gln Val Thr Gly Asp Gln Gln Leu Glu Asn Met Gln Val His Lys Thr

50 55 60

Pro Ile Arg Gly Gly Val Leu Asn Asp Tyr Thr Leu Ser Asp Thr Asp

65 70 75 80

Ala Lys Leu Val Lys Glu Lys Ala Tyr Lys Tyr Leu Ala His Leu Asp

85 90 95

Glu Val Gln Glu Val Pro Lys Pro Val Ser Lys Lys Arg Ala Phe Gln

100 105 110

Leu Met Asp Leu Tyr Ser Asp Ala Pro Met Tyr Thr Thr Pro Asn Glu

115 120 125

Pro Ser Phe Asp Tyr Glu Glu Gly Tyr Glu Glu Leu Ala Phe Glu Asp

130 135 140

Tyr Pro Arg Asp Val Asn Trp Thr Gly Ala Gln Pro Ser Pro Thr Glu

145 150 155 160

Leu Ser Lys Trp Lys Val Met Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Ile

165 170 175

Ala Ala Ala Ile Pro Leu Lys Arg Leu Gly Ile Pro Phe Glu Ile Val

180 185 190

Glu Arg Gln Ser Gly Ile Gly Gly Thr Trp Leu Leu Asn Thr Tyr Pro

195 200 205

Asp Cys Arg Val Asp Thr Leu Val Tyr Leu Phe Gln Tyr Lys Phe Glu

210 215 220

Lys Lys Tyr Lys Trp Lys Asp Phe Phe Ser Ser Arg Glu Asp Leu Gln

225 230 235 240

Gln Tyr Ile Glu Tyr Val Ala Thr Lys Trp Gly Val Lys Asp Asn Ile

245 250 255

Thr Tyr Asp Arg Glu Val Val Ala Ala Thr Trp Asp Glu Lys Thr Lys

260 265 270

Leu Trp Ser Met Thr Leu Lys His Lys Asn Gly Asn Glu Glu Val Lys

275 280 285

Thr Cys Asn Ala Ile Ile Ser Ala Ala Gly Leu Phe Ser Thr Pro Asn

290 295 300

Leu Pro Asp Ile Ala Gly Ile His Asp Phe Lys Gly Pro Leu Phe His

305 310 315 320

Thr Ala Gln Trp Asp His Ser Lys Asp Tyr His Gly Lys Asn Val Ala

325 330 335

Leu Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Thr Gln Leu Thr Pro Met Val Ala

340 345 350

Glu Gly Ala Arg His Leu Ser Val Tyr Gln Arg Thr Pro Asn Trp Ile

355 360 365

Ala Ser Tyr Glu Gly Tyr Arg Ala Lys Val Thr Asp His Met His Trp

370 375 380

Leu Cys Asp Ala Met Pro Tyr Tyr Trp Asn Trp Tyr Cys Tyr Ser Ala

385 390 395 400

Trp Phe Arg Ser Leu Gln Leu Ala Asn Thr Gln Tyr His Asp Pro Glu

405 410 415

Trp Arg Ala Gln Gly Gly Leu Ile Asn Lys Arg Asn Asp Phe Leu Arg

420 425 430

Thr Ser Leu Thr Lys Phe Ile Asn Glu Lys Phe Ala Asp Arg Pro Asp

435 440 445

Leu Ile Ala Lys Val Thr Pro Lys Gln Ala Pro Met Val Arg Arg Leu

450 455 460

Val Val Asp Asn Gly Phe Tyr Asp Ala Leu Lys Arg Asp Asn Val Ser

465 470 475 480

Leu Ile Thr Asp Ser Ile Glu Arg Ile Thr Glu Lys Gly Ile Met Thr

485 490 495

Lys Asp Gly Asn Glu Ile Glu Tyr Asp Met Ile Val Leu Gly Ala Gly

500 505 510

Phe Lys Thr Ser Gln Tyr Leu Trp Pro Val Asn Tyr Thr Gly Thr Asp

515 520 525

Gly Met Thr Leu Ala Lys Ala Trp Ala Lys Asp Gly Ala Arg Ser Tyr

530 535 540

Leu Gly Met Thr Met Pro Asn Tyr Pro Asn Leu Phe Thr Leu Tyr Gly

545 550 555 560

Pro Asn His Gln Pro Arg Gly Gly Ser Leu Tyr Ser Tyr Gly Glu Met

565 570 575

Trp Ala Arg Tyr Ala Val Ala Ser Ile Val Gly Met Ile Glu Arg Gly

580 585 590

Ala Ser Ser Met Glu Ile Lys Lys Asp Val Phe Asp Lys Tyr Gln Ala

595 600 605

Ala Leu Asp Lys Gly Asn Lys Arg Ile Ile Trp Glu Ser Glu Gly Ala

610 615 620

Ala Tyr Tyr Val Asn Glu His Gly Arg Gln Ala Val Asn Met Pro Trp

625 630 635 640

Thr Thr Ala Glu Tyr His Pro Met Ile Ala Lys Val Asn Phe Asp Asp

645 650 655

Tyr Asn Leu Thr Tyr Asp Asp Lys Lys Gln Asn Gly Val His Lys Ala

660 665 670

Asn Gly Ile Asn Gly His Gln Thr Asn Gly His Ser His Ser His Thr

675 680 685

His Gly His Thr Asn Gly His Ala Asn Gly His Lys Glu Ser Trp Leu

690 695 700

Ser Asn His

705

<210> 2

<211> 2124

<212> DNA

<213> Hyphozyma roseonigra

<400> 2

atgacgactc caactatgac aatgccatcg gatctcggtg ctgcaaccaa tgacacgcaa 60

tgcagaaacc caaaaattga tgatgacttc gtacgcgctg ctttggagga ggcttctgct 120

cctgcactcc gtctggcgct tctacaagtc acaggcgatc agcaacttga gaatatgcaa 180

gttcataaga ctccaatacg tggtggtgtt ttgaacgact acactctcag cgatacggac 240

gccaaactcg tgaaggagaa ggcatacaag tatttggcac atctcgacga ggtccaggag 300

gtgccaaaac ctgtctcgaa gaagagggcg ttccagttga tggacctgta cagtgatgct 360

cccatgtaca caacgccaaa cgagccgagc tttgactatg aggaggggta cgaagagcta 420

gctttcgagg actatccacg cgatgtgaac tggactggtg ctcagccaag ccctacagag 480

ctctcaaaat ggaaggttat gattgttgga gcgggcatca gcggcattgc agctgcaatt 540

ccactcaaaa ggcttggaat acctttcgag atcgtcgaac gacaatcagg cattggaggc 600

acctggctac tcaacaccta cccagactgt agggtggata cacttgtcta cctcttccag 660

tacaagttcg agaagaagta caaatggaaa gacttcttct cgtctcggga agaccttcag 720

cagtatatcg agtatgtggc tacgaagtgg ggagtcaagg acaatatcac gtatgaccgt 780

gaagttgtgg ctgcaacctg ggacgaaaag accaagctct ggtccatgac gctcaagcat 840

aagaacggaa acgaagaggt gaagacgtgc aacgcaatta tcagtgcggc aggacttttc 900

agtacgccaa atctgccaga catcgccggc atccatgact tcaaggggcc gctctttcac 960

accgcgcagt gggatcacag caaggactat catggcaaga acgttgccct cattggcact 1020

ggttcgacag gtacacagct gacgccgatg gtggcagaag gagccaggca cttgtcagtg 1080

taccaacgaa cgccaaactg gattgcttca tatgagggat acagagccaa ggttactgat 1140

catatgcact ggctctgcga cgctatgcca tattactgga actggtactg ctactcggca 1200

tggttcagaa gcttgcagct tgctaacacg caataccacg atcccgaatg gagggcacaa 1260

ggaggactca tcaacaagcg caacgacttt ttgcggacgt ccttaacaaa attcatcaat 1320

gaaaagttcg cagatcgacc cgacctcata gccaaggtga caccaaaaca agcgcctatg 1380

gtgcgtcgac tcgttgtcga taatggattc tacgatgcat tgaagcgcga taatgtgtca 1440

ctgattacag actctatcga gagaatcaca gagaaaggca ttatgacaaa agatggcaat 1500

gagattgagt atgatatgat tgtcctcggt gcgggattca aaacctcgca gtatctctgg 1560

cctgtgaact acacaggcac agatggtatg acattggcga aagcttgggc gaaggatggc 1620

gcacgatcat atctgggaat gacaatgccg aattatccca atttgttcac gctctacggt 1680

cccaaccatc agcccagagg tggctcatta tactcttatg gtgagatgtg ggccagatat 1740

gctgttgcgt ccatcgtcgg catgattgaa agaggtgcga gctcgatgga aatcaagaaa 1800

gacgtcttcg acaagtatca agcagctttg gacaagggaa acaagcggat tatatgggag 1860

tcggaagggg ctgcttatta tgtcaatgag catggtagac aggctgtcaa tatgccatgg 1920

accacggccg agtatcatcc aatgattgcg aaggtaaact ttgatgatta taacttgacc 1980

tacgacgata agaagcagaa cggtgttcat aaagcgaatg ggattaatgg tcatcagaca 2040

aatggccatt cacatagcca tacacatggt catacaaatg ggcatgcaaa tgggcataaa 2100

gagtcgtggc tcagcaacca ttag 2124

Claims

1. 一种Baeyer-Villiger单加氧酶，其特征在于：该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 一种如权利要求1所述的Baeyer-Villiger单加氧酶的编码基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达载体，其特征在于：该表达载体包含如权利要求2所述的Baeyer-Villiger单加氧酶的编码基因。

4.一种表达如权利要求1所述的Baeyer-Villiger单加氧酶的工程菌，其特征在于：所述工程菌包含如权利要求2所述的编码基因或者如权利要求3所述的表达载体。

5.一种如权利要求1所述的Baeyer-Villiger单加氧酶的用途，其特征在于：该酶在制备龙涎醚的过程中，用于催化香紫苏酮发生Baeyer-Villiger氧化反应。

6. 一种化学-酶法生产龙涎醚的方法，其特征在于，包括：利用如权利要求1所述的Baeyer-Villiger单加氧酶催化香紫苏酮发生Baeyer-Villiger氧化反应生成香紫苏二醇乙酸酯，然后通过酯键水解、脱水缩合反应生产龙涎醚；其中，反应体系中酶与底物的摩尔比为1:4 ~ 1:50。