CN110241096B - 一种可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶Sulf1694及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶及其用途。所述脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶的基因序列如SEQ ID NO:1所示。具有脱除琼脂硫酸基团的用途。

Description

一种可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶Sulf1694及其用途

技术领域

本发明涉及基因领域，尤其涉及一种可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶Sulf1694及其用途。

背景技术

琼脂(Agar)又称琼胶，俗称洋菜、冻粉或冻胶，就是由红海藻纲中提取的亲水性胶体，在食品、医药工业、轻工、生物工程等许多方面有广泛的应用。红藻中的天然琼脂分子上带有大量的硫酸基团，是影响琼脂形成凝胶的关键因素。而凝胶强度又是衡量琼脂产品品质的主要指标，所以在琼脂的生产过程中去除硫酸基团，提高琼脂的凝胶强度是非常必要和关键的环节。当前工业生产中普遍使用碱处理来去除海藻粗琼脂中高含量的硫酸基团，碱处理过程后要消耗大量水将海藻洗至中性，不仅会导致环境的污染，而且会造成水资源的严重消耗，同时也会使得琼脂流失。与碱处理技术相比，采用生物酶处理去除粗琼脂中的硫酸基团，不但反应条件比较温和，而且经济环保，无疑为新型琼脂的生产奠定了坚实的基础。

硫酸酯酶(Sulfatases，EC3.1.6.1)是一类可以水解硫酸酯键产生无机硫酸根和相应醇的酶类，它分为烷基硫酸酯酶和芳香基硫酸酯酶。芳香基硫酸酯酶广泛分布于从细菌到哺乳动物的各种生物中，可用于脱除琼脂上的硫酸基团。2012年，Jung KT等人(JungKT,Kim HW,You DJ,Nam SW,Kim BW,Jeon SJ.Identification of the first archaealarylsulfatase from Pyrococcus furiosus and its application to desulfatationof agar.Biotechnology and Bioprocess Engineering.2012,17(6):1140-1146)首次从古菌中发现了芳香基硫酸酯酶，并对其在去除琼脂上的SO42-方面的功能进行了验证。2018年Yanbing Zhu等人(Improvement thermostability of Pseudoalteromonascarrageenovora arylsulfatase by rational design.International Journal ofBiological Macromolecules,2018,108.)也有提到使用芳香基硫酸酯酶去除琼脂上的硫酸基团。这些结果表明芳香基硫酸酯酶在提高琼脂质量方面具有很大应用潜力。但是，目前大多数产芳香基硫酸酯酶的菌株的活性较低，酶稳定性较差，阻碍了此方向的发展和进步。因此，开发活性高、稳定性好的芳香基硫酸酯酶成为了本技术领域的当务之急。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶Sulf1694，其特征在于，所述硫酸酯酶的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步，所述硫酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供一种含有所述可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶Sulf1694的重组载体，其特征在于，含有所述可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶的基因序列；优选的，所述重载载体为含有所述可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶与pET-28a进行重组得到的重组载体。

本发明还提供一种含有所述可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶Sulf1694的重组细胞，其特征在于，含有所述可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶的基因序列；优选的，所述重载细胞为含有所述可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶与载体重组得到的重组载体再转化得到的重组细胞。

本发明还保护一种用于扩增所述可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶Sulf1694的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO:3和4所示。

本发明还保护所述可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶Sulf1694具有脱除琼脂硫酸基团的用途。

本发明的Sulf1694来源于海洋细菌Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5，通过设计特异性引物，获得硫酸酯酶Sulf1694的DNA序列，该基因编码区长1122bp，编码373个氨基酸，其中1-20个氨基酸为信号肽，理论分子量为42kDa。大肠杆菌重组表达获得的Sulf1694具有较高酶活性和热稳定性，特别是热稳定性较已有的芳香基硫酸酯酶优良许多，由于琼脂的溶解温度基本在40℃以上，使得此酶在琼脂的酶法提取上更显优势。同时该酶在较广的温度范围和pH范围内都保持较高的催化效率，，可替代或部分替代琼胶提取生产过程中的碱处理过程，减少污染，节约水资源，具有良好的应用价值。

附图说明

图1为本发明硫酸酯酶Sulf1694的蛋白质三维结构模型；

图2为硫酸酯酶基因Sulf1694重组表达纯化的SDS-PAGE图谱；

图3为本发明温度对硫酸酯酶Sulf1694活性影响曲线；

图4为本发明温度对硫酸酯酶Sulf1694稳定性影响曲线；

图5为本发明pH对硫酸酯酶Sulf1694活性影响曲线；

图6为本发明pH对硫酸酯酶Sulf1694稳定性影响曲线。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

生物材料来源：Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5，中文名称为食鹿角菜假交替单胞菌，分离自厦门红树林土壤腐叶样品，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号23819。

实施例1：硫酸酯酶Sulf1694基因的获得

将Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接种至人工海水培养基中，在25℃，180r/min的条件下，震荡培养至OD₆₀₀为1-1.5，取培养菌液1mL，利用东盛生物细菌基因组快速提取试剂盒(硅胶膜离心柱法)提取Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5菌株基因组DNA。

上述人工海水培养基配置方法如下：

牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、蒸馏水250mL、人工海水750mL(NaCl 37.51g、KCl1.03g、CaCl₂ 1.61g、MgCl₂·6H₂O 6.4g、NaHCO₃ 0.15g、MgSO₄·7H₂O 4.67g、蒸馏水1000mL)。牛肉浸膏和胰蛋白胨溶解后调pH至7.8，加热煮沸10min，冷却后调pH至7.3，然后和人工海水混合，121℃灭菌20min。固体培养基再添加20g琼脂。

以得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，引物序列如下：

正向引物：Sulf1694-F(SEQ ID NO：3)：

5’-CGCGGATCCAACTTTTACGCCGACTACGCAGCCA-3’；下划线标注的是限制性内切酶位点BamHI，反向引物：Sulf1694-R(SEQ ID NO：4)：

5’-CCGCTCGAGTAGTTTTATTTCGCTTGGTGTTGTT-3’，下划线标注的是限制性内切酶XhoI位点。

所用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS购自中国大连宝生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。

PCR反应系统为：

基因组DNA(0.645mg/mL)：0.5μL；

dNTP：4μL；

Sulf1694-F(10μmol/L)：1μL；

(Sulf1694-R(10μmol/L)：1μL；

高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS：0.5μL；

5xBuffer:10μL；

ddH2O：补齐50μL。

PCR条件为：95℃，5min；94℃，15s；56℃，15s，72℃，1min，30次循环，最后72℃，10min。

将PCR产物进行测序，序列如SEQ ID NO:1所示。共含有373个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。用ExPASy的protparam工具进行分析，显示蛋白质Sulf1694的理论分子量约为42kDa。信号肽分析结果显示，其N端有1-20个氨基酸为信号肽序列。硫酸酯酶Sulf1694的蛋白质三维结构模型，如图1所示。利用SWISS-MODEL对Sulf1694进行建模，模板为来自PDB数据库编号为5fgn.1.A的硫酸酯酶，相似度为42.55％。

SEQ ID NO：1如下所示：

GTGAACTTTTACGCCGACTACGCAGCCACTGGCCGTAATAATCGCATTTTGAAAAAAGAAATCATTCCATTTCAGTACCTCTCTAGCGGTTATAAATACATGCGCGATCAACTGCTATACACCAATATAAAGTTTAAAAATATAGATACAATACCCACTTTAATTGCGCCTACTACTACCAGCGTAACAGTTATAGTTGTTGGCGAAACCGCACGAGCAGACAATTTTGCTTACCAGGGTTATAAACGTAACACCAATCCTTATACACAAAAGCATAATGTAACGTATTTTAATAATGTGGCGTCTTGTGGCACAGCTACGGCTGTGTCTGTGCCGTGTATGTTTTCATTGCAAACACACGATAACTTTGATCGATTAGCAGCCGACAACCAACAAAACCTGATTGACCTAGCACAACAAGCTGGCAGTGATGTACTGTGGGTTGATAACAACAGCGGCTGTAAAAACGTATGCACCCGTGTTGTTAACATAAATATCCCAACCGCTGCATCAGCGCTTTGCGATGGGAAATATTGTTTTGATGAAGCACTTATTGCTCCACTTAAACGCAAACTCGCCAATTTAAGCCAAGCTAATACCGTTATCGTCCTACATATGATGGGCTCGCACGGACCAACCTACTTTAAACGCTACCCAGAAAAGTTTAAGCAATTTACGCCTACGTGCGACAGAAGCGACATTCAGAACTGCTCACTCGATGAATTAGTTAATACCTACGACAATACAATTGCGTACAGCGACTTTGTTAACGCCCAAGTAATTGATCAATTAAAAGCACTGCCGAACAACATAGATAAGCAGTTTTTATATGTCTCTGATCATGGTGAATCACTTGGCGAAGCCGGTGCTTACTTGCATGGCTTTCCGTATAGCTTTGCGCCTAGCACGCAAACACATGTTCCTCTTTATATGTGGGCCGATGAGCATAACCAACGCATTACCAATACCTGTTTAGCTAATTTAGACACACGAGCTGCACGCTCACACAACAACATTTTTCACACCCTTTTAAATTTAATTGGCATTAAAAGCAAAACGTATCAGGCATCCCTTGATTTACTTGCTCGCTGCCAAACAACACCAAGCGAAATAAAACTATGA。

SEQ ID NO：2如下所示：

MNFYADYAATGRNNRILKKEIIPFQYLSSGYKYMRDQLLYTNIKFKNIDTIPTLIAPTTTSVTVIVVGETARADNFAYQGYKRNTNPYTQKHNVTYFNNVASCGTATAVSVPCMFSLQTHDNFDRLAADNQQNLIDLAQQAGSDVLWVDNNSGCKNVCTRVVNINIPTAASALCDGKYCFDEALIAPLKRKLANLSQANTVIVLHMMGSHGPTYFKRYPEKFKQFTPTCDRSDIQNCSLDELVNTYDNTIAYSDFVNAQVIDQLKALPNNIDKQFLYVSDHGESLGEAGAYLHGFPYSFAPSTQTHVPLYMWADEHNQRITNTCLANLDTRAARSHNNIFHTLLNLIGIKSKTYQASLDLLARCQTTPSEIKL。

实施例2：基因Sulf1694在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的中的重组表达和纯化

将实施例1所得的PCR产物及pET-28a质粒用限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切，回收酶切后的产物片段。限制性内切酶XhoI和BamHI购自中国大连宝生物公司，酶切用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。

将经过XhoI和BamHI双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET-28a(+)质粒载体，在T4DNA连接酶的催化下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有0.1mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后，挑取阳性转化子，将阳性转化子接入含有0.1mg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，180r/min，培养12h，用正向引物Sulf1694-F和反向引物Sulf1694-R进行菌液PCR验证。

接着将PCR验证正确的重组质粒pET-28a(+)-Sulf1694转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有0.1mg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h后，挑取阳性转化子，将阳性转化子接入含有0.1mg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，180r/min,培养12h，用正向引物Sulf1694-F和反向引物Sulf1694-R进行菌液PCR验证，结果得到大小约为1100bp的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确。将重组质粒送至厦门铂瑞生物科技有限公司进行测序，结果表明，在pET-28a(+)的XhoI和BamHI酶切位点插入SEQ ID NO.1所示的基因Sulf1694，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET-28a(+)-Sulf1694。使用异丙基硫代半乳糖甘(IPTG)进行重组硫酸酯酶的诱导表达。加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.05mmol/L，16℃诱导20h后将菌液收集至200mL的离心管中，6000rpm离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在20mL的溶解缓冲液(溶解缓冲液配方为：0.3mol/LNaCl，15mmol/L咪唑，50mmol/LNaH₂PO₄，pH8.0)中，超声波破碎处理至菌液成半透明(参数设置为300w，超声时间5s，间歇时间5s，总工作时间15min)，11000rpm离心20min，上清与预先用溶解缓冲液平衡的Ni-NTA Agarose混匀，4℃结合1小时，纯化过程按照纯化试剂盒(购自Qiagen公司)说明进行。纯化后的蛋白经的SDS-PAGE电泳分析，其分子量约为42kDa，使用Bradford法测定蛋白浓度，得到浓度约为1.5mg/ml的重组硫酸酯酶Sulf1694(结果参见图2)。泳道M为蛋白Marker，泳道1为空载体pET-28a在E.coliBL21中的表达，泳道2为重组载体pET-28a(+)-Sulf1694在E.coli BL21中的未诱导表达，泳道3为重组载体pET-28a(+)-Sulf1694在E.coli BL21中的诱导表达，泳道4、5为经Ni-NTA纯化所得的目的蛋白Sulf1694(42kDa)。可以看出来，目的蛋白Sulf1694得到了诱导表达，同时得到了纯化，有效去除了杂质。

实施例3：重组硫酸酯酶Sulf1694酶学性质分析

1.重组酶活力的测定：

将30μL纯化后的重组硫酸酯酶Sulf1694与70μL(20mmol/L)p-NPS混匀，置于60℃反应15min，加入40μL(5mol/L)NaOH终止反应，用蒸馏水补足体积为1ml测定反应液在410nm处的吸光值。每分钟降解pNPS产生1μmolp-NP所需的酶量定义为1个活力单位(U)。2.温度对酶活性及稳定性的影响

在反应温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、65℃、70℃、75℃条件下处理15min后测定重组硫酸酯酶Sulf1694酶活，以最高酶活为100％。测定重组硫酸酯酶Sulf1694温度稳定性时，酶液在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下分别处理30min和120min，在最适反应温度下测定剩余酶活，以未处理时的酶活为100％。结果见图3和图4，从图3可以看出，重组硫酸酯酶Sulf1694在60℃时达到最大活力，表明Sulf1694的最适反应温度为60℃。从图4可以看出，重组硫酸酯酶Sulf1694在45℃下处理120min，酶的活力几乎不受影响，在60℃下处理120min，酶的相对活力为69.2％，说明该酶的热稳定性相当好。

3、pH值对酶活性及稳定性的影响

用不同pH的缓冲体系配制底物，在最适反应温度下测定酶活，以最高酶活100％。缓冲液体系分别为50mmol/L的乙酸-乙酸钠(pH 4-6)、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(pH 6-8)、Tris-Hcl(pH8-9)甘氨酸-NaOH(pH9-10)。pH稳定性的研究是通过将纯化后的重组硫酸酯酶Sulf1694的酶液与不同pH的缓冲液等比例混合后，并在4℃放置1h，然后测定剩余酶活力，以未处理时酶活力为100％。结果显示，在pH 7.5时重组硫酸酯酶Sulf1694的活力最高，表明重组硫酸酯酶Sulf1694的最适pH为7.5，如图5所示。重组硫酸酯酶Sulf1694在pH高于9.0或低于5.5的条件下处理1h，酶活损失十分严重，如图6所示。

实施例4：硫酸酯酶Sulf1694去除琼脂粗多糖硫酸基团的研究

利用明胶-氯化钡法进行测定硫酸根含量。(1)明胶-氯化钡溶液的配制：配制0.5％的明胶溶液于4℃静置过夜，用其配制BaCl浓度为1％的明胶-氯化钡溶液，于4℃储存待用。(2)K₂SO₄标准溶液的配制：称取0.1088g(精确至0.001g)经105℃烘干至恒重的K₂SO₄粉末，用1mol/L盐酸定容至100mL，储存待用。(3)标准曲线的绘制：将K₂SO₄标准溶液稀释5倍，分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1mL稀释液于试管中，其余用0.1mol/L盐酸补足至1mL，取1mL样品溶液添加3mL明胶-氯化钡溶液，震荡混匀，静置10min，于360nm波长下测定其吸光值，得到不同浓度硫酸根对其吸光度的标准曲线。标准曲线方程为Y＝3.8972X+0.1121，R²＝0.999。(4)样品的处理：称取1g的琼脂粗多糖溶解于100ml的50mmol/L的Tris-Hcl(pH7.5)的缓冲液中，分别加入20U、40U、80U、120U的重组硫酸酯酶50℃处理6h，将处理后的混合溶液，用超纯水经八层纱布洗涤过滤，烘干粉碎。称取等重的未处理样品和处理过的样品于25mL比色管中，加入25mL浓度为1mol/L的盐酸，于100℃水浴消化4-5h后冷却至室温，用活性炭脱色，过滤得澄清溶液待用。(5)硫酸根含量的测定：取1mL消化液加3mL明胶-氯化钡溶液，震荡混匀，静置10min，于360nm波长下测定其吸光值，利用标准曲线计算样品中硫酸根含量。

表1硫酸酯酶Sulf1694去除琼脂粗多糖硫酸基团的研究表

从表1的结果可以看出，50℃下酶处理6h，可以显著看出硫酸基团被脱除，并且随着加入的酶含量，硫酸根去除的效果也随之增加，当加入的酶量为120U时候能够脱除89.8％的硫酸根，表明该酶有非常好的应用价值。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 集美大学

<120> 一种可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶Sulf1694及其用途

<130> JMDX-19026-CNI

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1122

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5

<400> 1

gtgaactttt acgccgacta cgcagccact ggccgtaata atcgcatttt gaaaaaagaa 60

atcattccat ttcagtacct ctctagcggt tataaataca tgcgcgatca actgctatac 120

accaatataa agtttaaaaa tatagataca atacccactt taattgcgcc tactactacc 180

agcgtaacag ttatagttgt tggcgaaacc gcacgagcag acaattttgc ttaccagggt 240

tataaacgta acaccaatcc ttatacacaa aagcataatg taacgtattt taataatgtg 300

gcgtcttgtg gcacagctac ggctgtgtct gtgccgtgta tgttttcatt gcaaacacac 360

gataactttg atcgattagc agccgacaac caacaaaacc tgattgacct agcacaacaa 420

gctggcagtg atgtactgtg ggttgataac aacagcggct gtaaaaacgt atgcacccgt 480

gttgttaaca taaatatccc aaccgctgca tcagcgcttt gcgatgggaa atattgtttt 540

gatgaagcac ttattgctcc acttaaacgc aaactcgcca atttaagcca agctaatacc 600

gttatcgtcc tacatatgat gggctcgcac ggaccaacct actttaaacg ctacccagaa 660

aagtttaagc aatttacgcc tacgtgcgac agaagcgaca ttcagaactg ctcactcgat 720

gaattagtta atacctacga caatacaatt gcgtacagcg actttgttaa cgcccaagta 780

attgatcaat taaaagcact gccgaacaac atagataagc agtttttata tgtctctgat 840

catggtgaat cacttggcga agccggtgct tacttgcatg gctttccgta tagctttgcg 900

cctagcacgc aaacacatgt tcctctttat atgtgggccg atgagcataa ccaacgcatt 960

accaatacct gtttagctaa tttagacaca cgagctgcac gctcacacaa caacattttt 1020

cacacccttt taaatttaat tggcattaaa agcaaaacgt atcaggcatc ccttgattta 1080

cttgctcgct gccaaacaac accaagcgaa ataaaactat ga 1122

<210> 2

<211> 373

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5

<400> 2

Met Asn Phe Tyr Ala Asp Tyr Ala Ala Thr Gly Arg Asn Asn Arg Ile

Leu Lys Lys Glu Ile Ile Pro Phe Gln Tyr Leu Ser Ser Gly Tyr Lys

Tyr Met Arg Asp Gln Leu Leu Tyr Thr Asn Ile Lys Phe Lys Asn Ile

Asp Thr Ile Pro Thr Leu Ile Ala Pro Thr Thr Thr Ser Val Thr Val

Ile Val Val Gly Glu Thr Ala Arg Ala Asp Asn Phe Ala Tyr Gln Gly

Tyr Lys Arg Asn Thr Asn Pro Tyr Thr Gln Lys His Asn Val Thr Tyr

Phe Asn Asn Val Ala Ser Cys Gly Thr Ala Thr Ala Val Ser Val Pro

Cys Met Phe Ser Leu Gln Thr His Asp Asn Phe Asp Arg Leu Ala Ala

Asp Asn Gln Gln Asn Leu Ile Asp Leu Ala Gln Gln Ala Gly Ser Asp

Val Leu Trp Val Asp Asn Asn Ser Gly Cys Lys Asn Val Cys Thr Arg

Val Val Asn Ile Asn Ile Pro Thr Ala Ala Ser Ala Leu Cys Asp Gly

Lys Tyr Cys Phe Asp Glu Ala Leu Ile Ala Pro Leu Lys Arg Lys Leu

Ala Asn Leu Ser Gln Ala Asn Thr Val Ile Val Leu His Met Met Gly

Ser His Gly Pro Thr Tyr Phe Lys Arg Tyr Pro Glu Lys Phe Lys Gln

Phe Thr Pro Thr Cys Asp Arg Ser Asp Ile Gln Asn Cys Ser Leu Asp

Glu Leu Val Asn Thr Tyr Asp Asn Thr Ile Ala Tyr Ser Asp Phe Val

Asn Ala Gln Val Ile Asp Gln Leu Lys Ala Leu Pro Asn Asn Ile Asp

Lys Gln Phe Leu Tyr Val Ser Asp His Gly Glu Ser Leu Gly Glu Ala

Gly Ala Tyr Leu His Gly Phe Pro Tyr Ser Phe Ala Pro Ser Thr Gln

Thr His Val Pro Leu Tyr Met Trp Ala Asp Glu His Asn Gln Arg Ile

Thr Asn Thr Cys Leu Ala Asn Leu Asp Thr Arg Ala Ala Arg Ser His

Asn Asn Ile Phe His Thr Leu Leu Asn Leu Ile Gly Ile Lys Ser Lys

Thr Tyr Gln Ala Ser Leu Asp Leu Leu Ala Arg Cys Gln Thr Thr Pro

Ser Glu Ile Lys Leu

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cgcggatcca acttttacgc cgactacgca gcca

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccgctcgagt agttttattt cgcttggtgt tgtt

Claims (8)

1.一种可用于脱除琼脂硫酸基团的硫酸酯酶Sulf1694，其特征在于，所述硫酸酯酶的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的硫酸酯酶Sulf1694，其特征在于，所述硫酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述的硫酸酯酶Sulf1694的基因序列。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组 载体为将权利要求1所述的硫酸酯酶Sulf1694的编码基因插入到pET-28a载体中。

5.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求1所述的硫酸酯酶Sulf1694的基因序列。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为将权利要求4所述的重组载体进行转化所得。

7.一种用于扩增权利要求1所述的硫酸酯酶Sulf1694的编码基因的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO:3和4所示。

8.一种权利要求1所述的硫酸酯酶Sulf1694在脱除琼脂硫酸基团中的用途。

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