CN110564791A - 一种改性琼脂粉 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及琼脂粉的改性，具体涉及一种改性琼脂粉，其通过以下方法制得：将琼脂粉用50mmol/L pH 9.0的Tris‑HCl缓冲液溶解，以便获得琼脂粉溶液；将芳香基硫酸酯酶加入所述琼脂粉溶液中，再置于50℃下温浴6h，以便获得所述改性琼脂粉。本发明制得的改性琼脂粉的性质类似于商品琼脂糖，在核酸电泳试验时，对凝胶电泳的DNA片段具有较好的分离分辨率。

Description

一种改性琼脂粉
技术领域
本发明涉及琼脂粉的改性领域，具体涉及一种改性琼脂粉。
背景技术
琼脂糖主要由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间结合构成的链状中性多糖；由于其硫酸根、丙酮酸等带电基团含量低，因此电内渗小，对蛋白质、碱性染料无吸附，可作为理想的电泳介质，通常用于核酸电泳试验。
目前，国产琼脂糖的获取主要是使琼脂糖与硫琼脂分离，以达到纯化琼脂糖的目的；由此，国产琼脂糖产品质量不高，导致实验室用的商品琼脂糖大多依赖国外进口。
为此，一种可替代商品琼脂糖的物质，有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种改性琼脂粉。本发明制得的改性琼脂粉的性质类似于商品琼脂糖，在核酸电泳试验时，对凝胶电泳的DNA片段具有较好的分离分辨率。
有鉴于此，在本发明的一方面，本发明提出了一种改性琼脂粉，其通过以下方法制得：
将琼脂粉用50mmol/L pH 9.0的Tris-HCl缓冲液溶解，以便获得琼脂粉溶液；
将芳香基硫酸酯酶加入所述琼脂粉溶液中，再置于50℃下温浴6h，以便获得所述改性琼脂粉。
本发明采用芳香基硫酸酯酶对琼脂粉进行脱硫处理，改变琼脂粉的性质，使得改性后的琼脂粉性质接近于商品琼脂糖，可应用在核酸电泳上，在核酸电泳试验时，对凝胶电泳的DNA片段具有较好的分离分辨率。
另外，根据本发明上述实施例提出的一种改性琼脂粉，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，在温浴结束后，取1mL的样品，离心处理，获得上清液，向所述上清液中加入BaCl2·2H2O-吐温80混合液和浓盐酸，在室温下静置30min后，置于420nm处测量吸光度，吸光度带入硫酸标准曲线，即可计算释放的硫酸盐量。
根据本发明的实施例，所述芳香基硫酸酯酶的加酶量为1.20U/mL。
根据本发明的实施例，所述上清液、BaCl2·2H2O-吐温80混合液与浓盐酸的比例为9:6:2。
根据本发明的实施例，所述芳香基硫酸酯酶通过以下方法制得：将含有芳香基硫酸酯酶基因的工程菌，按体积比1：100转接到250mL的LB液体培养基中，37℃、180r/min下培养至OD600达到0.8，加入终浓度为0.1mmol/L IPTG，18℃、180r/min培养20h，离心，收集菌体；菌体再重悬于结合缓冲液中，置于冰上进行超声波破碎处理，离心，收集上清液，上清液再进行Ni-NTA亲和层析，经洗涤缓冲液洗涤后，利用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，以便获得所述芳香基硫酸酯酶。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1本发明实施例的改性琼脂粉、商品琼脂粉和商品琼脂糖的溶解温度；
图2为发明实施例的改性琼脂粉、商品琼脂粉和商品琼脂糖的融化温度；
图3为发明实施例的改性琼脂粉、商品琼脂粉和商品琼脂糖的凝固温度；
图4为发明实施例的改性琼脂粉、商品琼脂粉和商品琼脂糖的凝胶强度；
图5为发明实施例的改性琼脂粉、商品琼脂粉和商品琼脂糖的透明度；
图6为发明实施例的改性琼脂粉、商品琼脂粉和商品琼脂糖的粘度；
图7为发明实施例的改性琼脂粉、商品琼脂粉和商品琼脂糖的白度；
图8为发明实施例的改性琼脂粉、商品琼脂粉和商品琼脂糖的凝胶电泳图；
其中*表示改性琼脂粉和商业琼脂粉存在显著差异，P<0.05；**表示改性琼脂粉和商业琼脂粉存在极显著差异，P<0.01。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明提出了一种改性琼脂粉，下面将对其进行详细描述。
根据本发明的实施例，该改性琼脂粉，通过以下方法制得：
将琼脂粉用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)溶解，以便获得琼脂粉溶液；在该步骤中，将琼脂粉溶解，制得琼脂粉溶液。具体的，称取4g的琼脂粉置于100mL的缓冲液中，以获得浓度为4％的琼脂粉溶液。发明人发现，琼脂粉溶液的pH为9时，有助于芳香基硫酸酯酶对琼脂粉进行更好地脱硫处理，以获得接近于商品琼脂糖性质的改性琼脂粉。
根据本发明的一个实施例，琼脂粉的种类并不受特别限制，本领域的技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，琼脂粉可以选自市售的商品琼脂粉(生产厂商：广东环凯微生物科技有限公司)。
将芳香基硫酸酯酶加入所述琼脂粉溶液中，再置于50℃下温浴6h，以便获得所述改性琼脂粉。在该步骤中，将芳香基硫酸酯酶加入所述琼脂粉溶液中，温浴，进行脱硫处理，以便获得所述改性琼脂粉。发明人发现，采用芳香基硫酸酯酶对琼脂粉溶液进行脱硫处理，可改变琼脂粉的性质，使得商品琼脂粉的质量明显提高，使得改性后的琼脂粉性质接近于商品琼脂糖，可应用在核酸电泳上，在核酸电泳试验时，该琼脂粉对凝胶电泳的DNA片段具有较好的分离分辨率。
根据本发明的一个实施例，芳香基硫酸酯酶处理琼脂粉溶液的加酶量并不受特别限制，本领域的技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，所述芳香基硫酸酯酶的加酶量为1.20U/mL。发明人发现，若芳香基硫酸酯酶的加入量较少时，会造成琼脂粉脱硫速率慢。由此，采用该加酶量，可以保证琼脂粉的脱硫速率的同时保证改性琼脂粉的品质。
根据本发明的再一个实施例，上述琼脂粉与芳香基硫酸酯酶在温浴后，取1mL的样品，离心处理，获得上清液，向所述上清液中加入BaCl2·2H2O-吐温80混合液和浓盐酸，在室温下静置30min后，置于420nm处测量吸光度，吸光度带入硫酸标准曲线，即可计算释放的硫酸盐量。根据本发明的一个具体示例，温浴6h后，取样1mL，置于12000×g离心10min，获得上清液，取0.9mL上清液与0.2mL浓盐酸和0.6mL 13.33％BaCl2·2H2O-2.67％吐温80混合溶液混合，之后，在室温下静置30min后，在420nm处测量吸光度。使用在2～20μg/mL硫酸范围内稳定的标准曲线计算释放的硫酸盐量。以灭活酶处理的琼脂粉为参照。测定加酶处理的琼脂粉的硫酸盐含量，从而计算出芳香基硫酸酯酶作用于琼脂粉的脱硫率，进而对琼脂粉改性过程的条件进行控制。
根据本发明的又一个实施例，芳香基硫酸酯酶的具体类型并不受特别限制，本领域的技术人员可以根据实际需要进行选择，根据本发明的一个具体实施例，所述芳香基硫酸酯酶通过以下方法制得：将含有芳香基硫酸酯酶基因的工程菌(该工程菌是大肠杆菌，是将Pseudoalteromonas carrageenovora来源的芳香基硫酸酯酶基因(GenBank收录号：KJ509595)进行定点突变，得到热稳定性更高的突变酶K253H/H260L基团，将其在大肠杆菌中表达)，按体积比1：100转接到250mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃、180r/min培养至OD600达到0.8，加入终浓度为0.1mmol/L IPTG，18℃、180r/min培养20h，在6000×g离心10min，收集菌体；菌体重悬于结合缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L氯化钠，15mmol/L咪唑，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理，再置于4℃下18000×g离心20min，收集上清液，然后进行Ni-NTA亲和层析，经过洗涤缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L氯化钠，30mmol/L咪唑，pH 8.0)洗涤后，利用洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L氯化钠，250mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱，收集洗脱液，获得芳香基硫酸酯酶。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明：
实施例1
芳香基硫酸酯酶的制备：
将含有芳香基硫酸酯酶基因的工程菌，按体积比1：100转接到250mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃、180r/min培养至OD600达到0.8，加入终浓度为0.1mmol/LIPTG，18℃、180r/min培养20h，在6000×g离心10min，收集菌体；菌体重悬于结合缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L氯化钠，15mmol/L咪唑，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理，再置于4℃下18000×g离心20min，收集上清液，然后进行Ni-NTA亲和层析，经过洗涤缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L氯化钠，30mmol/L咪唑，pH 8.0)洗涤后，利用洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L氯化钠，250mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱，收集洗脱液，获得芳香基硫酸酯酶。
芳香基硫酸酯酶的活力检测：
通过上述获得的芳香基硫酸酯酶作用p-nitrophenyl sulfate(pNPS)底物，释放pNP来检测芳香基硫酸酯酶的活性。具体操作：将20μL酶液加入到80μL含有20mmol/L pNPS底物溶液(pH 7.0)中，在50℃下温育10min后，加入25μL1mmol/L NaOH溶液终止反应。使用Epoch2T分光光度计(BioTeK，USA)在410nm处监测pNP的释放量。一个单位的芳香基硫酸酯酶活性定义为在测定条件下每分钟释放1μmoL pNP所需的酶量。结果显示，芳香基硫酸酯酶的比活力达到28.6U/mg。
实施例2
芳香基硫酸酯酶对商品琼脂粉的脱硫处理：
在100mL4％的琼脂粉溶液(pH 9.0)中加入120U芳香基硫酸酯酶，50℃温浴6h，取样1mL，12000×g离心10min。将0.9mL上清液与0.2mL浓盐酸和0.6mL沉淀溶液(其中含有13.33％BaCl2·2H2O和2.67％吐温80)混合，使混合液在室温下静置30min后，在420nm处测量吸光度。使用在2～20μg/mL硫酸范围内稳定的标准曲线计算释放的硫酸盐量。以加灭活酶的琼脂粉溶液为空白。获得改性琼脂粉，备用。
实施例3
改性琼脂粉理化性质分析
分别测定实施例2获得的改性琼脂粉、商品琼脂粉、商品琼脂糖的理化性质，包括：溶解温度、融化温度、凝胶温度、凝胶强度、透明度、黏度等。
溶解温度：
将0.1g的商品琼脂粉、商品琼脂糖、改性琼脂粉样品分别加入不同的试管中，添加10mL蒸馏水后塞上试管塞，置于30℃水浴锅中，以1℃/15min的速度升温，观察样品的溶解情况，当试管内溶液澄清透明且无分层现象时的温度即为琼脂的溶解温度。结果如图1所示，商品琼脂糖、商品琼脂粉和改性琼脂粉的溶解温度分别为97.45℃、95.10℃和95.93℃。
融化温度：
配制质量分数为1.5％的琼脂溶液，加热溶解后取15mL倒入内径22mm的试管中，插入温度计，使其水银球在液面以下，液面水平放置凝固。次日，在凝胶表面放1粒直径3mm的不锈钢珠，将试管放在水浴中加热，使凝胶温度渐渐上升，观察钢珠突然落至试管底部时的温度即为融化温度。结果如图2所示，商品琼脂糖、商品琼脂粉和改性琼脂粉的融化温度分别为94℃、93.9℃和93.3℃。
凝固温度：
配制质量分数为1.5％的琼脂溶液，加热溶解后取10mL倒入内径15mm的试管中，插入温度计，使其水银球在液面以下。使胶液温度慢慢下降(约1℃/min)，至试管倾斜90°角，液面凝固不流动时的温度即为凝固温度。结果如图3所示，商品琼脂糖、商品琼脂粉和改性琼脂粉的凝固温度分别为37.8℃、36.4℃和36.6℃。
凝胶强度：
根据国标GB 1975-2010琼脂凝胶强度测定方法测定3种琼脂粉样品的凝胶强度。结果如图4所示，商品琼脂糖、商品琼脂粉和改性琼脂粉的凝胶强度分别为1204.4g/cm2、833.4g/cm2和1139g/cm2。与商品琼脂粉相比，改性后的琼脂粉凝胶强度明显大于商品琼脂粉，提升了琼脂粉的品质。
透明度：
配制质量分数为1％的琼胶溶液，趁热倒入比色皿中，室温放置24h，用紫外分光光度计在400～800nm间扫描，确定最大吸收波长700nm，在最大吸收波长处测定样品的透光率(T)。结果如图5所示，商品琼脂糖、商品琼脂粉和改性琼脂粉的透明度分别为54.1％、63.1％和57.5％。与商品琼脂粉相比，改性后的琼脂粉透明度明显优于商品琼脂粉，提升了琼脂粉的品质。
粘度：
配制质量分数为1.5％的琼脂溶液，微波加热至溶液均匀透明，倒入300mL高型烧杯内，60℃恒温水浴30min，温度稳定后使用DV-C数显粘度仪进行测定。结果如图6所示，商品琼脂糖粘度为28.83Pa·s，商品琼脂粉粘度为38.07Pa·s，改性琼脂粉粘度为32.53Pa·s。与商品琼脂粉相比，改性后的琼脂粉粘度明显低于商品琼脂粉，提升了琼脂粉的品质。
白度：
根据国标GB12097-1989淀粉白度测定方法测定3种琼脂粉样品的白度。结果如图7所示，改性琼脂粉白度(67.12％)虽比商业琼脂糖白度(85.27％)较低，但与商业琼脂粉白度(54.55％)存在明显差异，表明改性琼脂粉的白度有所提升。
综上，改性琼脂粉理化性质分析结果显示，改性琼脂粉的溶解温度、凝胶温度、凝胶强度、透明度、粘度和白度均优于商品琼脂粉，更接近与商品琼脂糖。
实施例4
改性琼脂粉应用在核酸凝胶电泳
利用改性琼脂粉配制1％凝胶。用1000bp和2000bp的DNA分子标准，在100V，迁移60min。以未经处理的商业琼脂粉和商业琼脂糖制备1％凝胶，进行电泳，作为对照实验。
结果如图8所示，A为商品琼脂粉凝胶图，B为商品琼脂糖凝胶图，C为改性琼脂粉凝胶图。本发明的改性琼脂粉和商品琼脂糖凝胶电泳的DNA片段均具有较好的分离分辨率，结果表明在芳香基硫酸酯酶的处理下商品琼脂粉的质量明显提高，类似于商品琼脂糖。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (5)

1.一种改性琼脂粉，其特征在于，其通过以下方法制得：
将琼脂粉用50mmol/L pH 9.0的Tris-HCl缓冲液溶解，以便获得琼脂粉溶液；
将芳香基硫酸酯酶加入所述琼脂粉溶液中，再置于50℃下温浴6h，以便获得所述改性琼脂粉。
2.如权利要求1所述的一种改性琼脂粉，其特征在于：在温浴结束后，取1mL的样品，离心处理，获得上清液，向所述上清液中加入BaCl2·2H2O-吐温80混合液和浓盐酸，在室温下静置30min后，置于420nm处测量吸光度，吸光度带入硫酸根含量标准曲线，即可计算释放的硫酸盐量。
3.如权利要求1所述的一种改性琼脂粉，其特征在于：所述芳香基硫酸酯酶的加酶量为1.20U/mL。
4.如权利要求2所述的一种改性琼脂粉，其特征在于：所述上清液、BaCl2·2H2O-吐温80混合液与浓盐酸的比例为9:6:2。
5.如权利要求1所述的一种改性琼脂粉，其特征在于：所述芳香基硫酸酯酶通过以下方法制得：将含有芳香基硫酸酯酶基因的工程菌，按体积比1：100转接到250mL的LB液体培养基中，37℃、180r/min下培养至OD600达到0.8，加入终浓度为0.1mmol/LIPTG，18℃、180r/min培养20h，离心，收集菌体；菌体再重悬于结合缓冲液中，置于冰上进行超声波破碎处理，离心，收集上清液，上清液再进行Ni-NTA亲和层析，经洗涤缓冲液洗涤后，利用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，以便获得所述芳香基硫酸酯酶。
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