CN112322609A - 一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法 - Google Patents
一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112322609A CN112322609A CN202011339206.9A CN202011339206A CN112322609A CN 112322609 A CN112322609 A CN 112322609A CN 202011339206 A CN202011339206 A CN 202011339206A CN 112322609 A CN112322609 A CN 112322609A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- microalgae
- silk fibroin
- solution
- silk
- immobilization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000011419 induction treatment Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 7
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 claims description 6
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 claims description 3
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 claims description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 claims description 2
- 241000196317 Platymonas Species 0.000 claims description 2
- 241000195663 Scenedesmus Species 0.000 claims description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004898 kneading Methods 0.000 claims 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 claims 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 claims 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 15
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 abstract description 4
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 abstract description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 13
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 13
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 13
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 4
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229910052755 nonmetal Inorganic materials 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000007769 metal material Substances 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000029219 regulation of pH Effects 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001391944 Commicarpus scandens Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229940023476 agar Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 1
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
Landscapes
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法。本发明将生丝经过脱胶、溶解、透析、离心处理，制备成浓度为1～9％w/v的丝素蛋白溶液；将微藻细胞浓度为104～6个细胞/mL，获得微藻培养液；将丝素蛋白溶液采用物理诱导处理，在未成胶之前，与微藻培养液以0.5～2:1体积比进行混匀，在5‑30min形成凝胶。本发明方法制备的丝素蛋白固定化微藻系统，具有稳定、无毒、透光性好、传质性和固定效率高的优点；固定化后不影响细胞活力并且可以延长微藻的寿命。本发明在不添加任何额外化学试剂的情况下形成适宜于微藻包埋的丝素蛋白凝胶材料，主要通过物理方法形成丝素水凝胶材料，最大限度维持了微藻的原有活性，并且不会对内部微藻细胞增殖造成影响，微藻日增殖速率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法，属于微藻固定化技术领域。
背景技术
微藻在整个地球生态系统中都扮演着重要的角色，作为生态圈内最大的太阳同化者，地球40％的光合作用均来自于微藻。这也促使对微藻的研究成为了近年来的热点。近些年来，微藻在各个行业的应用也变得越来越普遍，主要运用于食品产业、水产养殖业、生物制药、生态保护、新能源等行业。然而由于微藻的高效采收制约着微藻的利用率，这也是悬浮液微藻大规模利用的瓶颈，而微藻固定化技术将微藻固定在有限的空间内，不仅可以提高微藻的利用效率，同时可以解决微藻采收费时费力的难题。
与传统游离微藻应用相比较，固定化微藻具有以下几个明显优点：(1)微藻经过固定化后，相当于在微藻外层形成保护层可以阻止有毒物质对内部微藻的损害；(2)固定化后的细胞在营养物质、代谢产物输送方面都有较为明显的不同，例如，其营养物质和代谢产物都可以凝胶独特的孔隙结构与外界进行交换；(3)固定化后的微藻细胞所处的环境与游离微藻细胞不同，而伴随着环境的改变，细胞的生物代谢、理化性质发生改变，进而改变微藻的活性，使固定化后的微藻细胞在污染物抵制能力、固碳效率、产氧效率、氢气产率等方面都有较为明显的提升；(4)与游离微藻相比较，固定化后微藻的细胞密度有很大提升，不仅可以提高微藻细胞的利用率，而且可以大大地减少在人力、物资方面的投入。
目前固定化微藻的方式主要三种，1)吸附法：指将微藻以吸附的方式固定在载体表面的方法，主要依靠微生物体和载体间的相互作用(氨键、范德华力、共价键、离子键等)，固定过程对细胞活性的影响小，但是存在细胞保存量低、吸附力较弱，细胞易脱落等问题。所用的载体多是无机性的，常用纤维素、多孔玻璃、多孔瓷器等。2)交联法：交联法又称无载固定化法，主要是利用功能基团直接与微藻细胞作用，使微藻连接成网状的结构，从而达到同定化的作用。一般的交联剂主要有戊二醛、异氰酸酯、氨基硅烷等，交联法所使用的交联剂大多比较昂贵，因此其在实际应用中受到一定的限制。3)包埋法：目前，包埋法是最常用的，最广泛使用的微藻固定方法，其原理是将微藻细胞包埋在水溶性聚合物或微生物的细胞膜，或使微生物细胞扩散进入内部的多孔性载体中，可以让基质渗入和代谢产物扩散出来，又可防止细胞的泄漏。
微藻固定化的载体材料主要分为：无机非金属和高分子材料，其中高分子材料又分为天然高分子材料和合成高分子材料。无机非金属材料主要包括:二氧化硅、无机玻璃、多孔瓷器等，采用非金属材料作为固定化微藻的载体操作简便，但是会出现微藻吸附力较弱的问题，因此需要对材料表面修饰进行以增强对微藻的吸附力，同时其微藻的保留容量有限，无法大幅度提高微藻的吸附密度。合成高分子材料：聚乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯等，合成高分子材料固定微藻细胞材料具有优异的稳定性和包埋效率，但是其在合成过程中反应剧烈且对微藻有一定的毒性，影响微藻的增殖和活性。天然高分子材料：海藻酸钠、琼脂、卡拉胶、蚕丝等。天然高分子材料作为固定微藻的材料具有无毒、不影响细胞活性和高微藻保留量等特点，但同时这些材料固定化微藻的操作步骤复杂且受外界条件影响较大。
由于固定化微藻技术的独特的优点，近年来固定化微藻技术在各个领域应用发展都得到了广泛关注，但是仍然还是存在许多需要解决的问题，其中最为突出的就是固定化载体材料的选择受限。目前固定化微藻载体材料使用最多的是海藻酸钠和琼脂，但是海藻酸钠凝胶在含有高盐溶液的培养液中时，会出现凝胶破碎和溶解，长期培养还会出现细胞渗漏的现象。对于琼脂固定微藻则需要较高的温度，一般在35℃左右，这对于绝大部分微藻细胞都是不能忍受的，并且琼脂固定化微藻后，微藻出现明显的生长滞后，会影响微藻的利用效率。所以，未来固定化微藻技术的发展趋势应该是开发一种无毒、透光性好、传质性和固定效率高、固定化后不影响微藻细胞活力、延长微藻寿命以及包埋系统稳定的理想载体材料。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法，构建一种稳定、无毒、透光性好、传质性和固定效率高、固定化后不影响微藻细胞活力和延长寿命的固定化微藻系统。
本发明的第一个目的是提供一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法，包括如下步骤：
S1、制备丝素蛋白溶液：将生丝经过脱胶、溶解、透析、离心处理，制备成浓度为1～9％w/v的丝素蛋白溶液；
S2、制备微藻培养液：将微藻细胞接种至微藻培养基中，培养至微藻浓度为104～6个细胞/mL，获得微藻培养液；
S3、将S1步骤制备的丝素蛋白溶液采用物理诱导处理，在未成胶之前，与S2步骤制备的微藻培养液以0.5～2:1体积比进行混匀，在5-30min形成凝胶。
进一步地，所述的物理诱导的方式为超声、涡旋、震荡、调节PH中的一种或多种形成的组合方式。
进一步地，所述的物理诱导的方式为超声时，超声的时间为30-50s，超声功率为15～30watts。
进一步地，微藻细胞培养是在26-30℃，光照6000-8000Lux条件下进行培养。
进一步地，所述的脱胶是将生丝置于碳酸钠溶液中，搅拌煮沸30-50min，用水揉搓2-4遍，干燥得到干燥丝。
进一步地，所述的溶解是将经过脱胶处理后的生丝溶解在9-10M的溴化锂溶液中。
进一步地，所述的微藻为小球藻、硅藻、衣藻、栅藻、扁藻中的一种。
进一步地，所述的微藻培养基为BG-11培养基、TAP培养基、F/2培养基中的一种。
本发明的第二个目的是提供所述的方法制备得到的固定化微藻。
本发明的第三个目的是提供所述的固定化微藻在食品产业、水产养殖业、生物制药、生态保护、新能源中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明方法制备的丝素蛋白固定化微藻系统，具有稳定、无毒、透光性好、传质性和固定效率高的优点；固定化后不影响细胞活力并且可以延长微藻的寿命。本发明在不添加任何额外化学试剂的情况下形成适宜于微藻包埋的丝素蛋白凝胶材料，主要通过涡旋、震荡、超声、调节PH等物理方法形成丝素水凝胶材料，所以最大限度维持了微藻的原有活性，并且不会对内部微藻细胞增殖造成影响，微藻日增殖速率高。
附图说明
图1悬浮液微藻的生长曲线；
图2丝素蛋白材料和海藻酸钠材料固定微藻的样品图；
图3丝素蛋白材料与常用海藻酸钠材料的稳定性比较；
图4丝素蛋白材料固定微藻后，微藻增殖活性。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：
1)取一个250mL的容量瓶分别加入50mL的小球藻藻液和200mL的BG-11培养液。
2)将容量瓶置于温度和光照强度分别为27℃、8000Lx的条件下进行培养。
3)取100μL的微藻藻液置于96孔板中，采用酶标仪进行300-750nm波长扫描，波长间隔为5nm，确定小球藻的最大吸收波长为680nm。
4)每天从容量瓶中取100μL的溶液采用酶标仪检测其在680nm处的OD值同时采用细胞计数板法计算小球藻的细胞数，所测得的OD值应减去不含有微藻的培养液的OD值。以时间作为横坐标，OD值为纵坐标建立小球藻的生长曲线。结果如图1所示。
实施例2：
用分析天平称取30g生丝和25.44g的无水碳酸钠备用，量取12L的去离子水倒入钢桶中，并采用电磁炉加热。在去离子水将要沸腾的时候加入称量好的无水碳酸钠，继续加热至沸腾使得无水碳酸钠充分溶解，再加入30g的生丝煮40min，每隔10min搅拌一次，以溶解生丝表面的丝胶。将脱胶后的生丝用去离子水揉搓3遍使得生丝表面的丝胶充分脱落，最后置于通风橱过夜干燥。第二天称取25g的干燥丝溶于100mL，9.3M的溴化锂溶液中，置于60℃烘箱中。期间每小时搅拌一次使得熟丝能够充分溶解，4小时后将溶解完的丝素溶液从烘箱中取出，降至室温，倒入透析袋中，使用去离子水透析40h，每隔5h换一次去离子水。将透析完的丝素溶液使用高速离心机(9000rpm，20min)离心两次去除杂质备用。
实施例3：
量取1980μL浓度为1～9％(w/v)的丝素蛋白溶液与1mL的微藻溶液进行充分混合，然后加入10μL，1000U辣根过氧化物酶(HRP)和10μL双氧水，丝素蛋白溶液的最终浓度为6％。室温静置直到获得包埋微藻细胞的HRP凝胶。包埋微藻细胞的HRP凝胶样品图，如图2所示。图中采用了HRP交联的丝素蛋白凝胶经过5天的培养后出现凝胶破碎、细胞渗出的现象，这是由于HRP交联的丝素凝胶交联程度过低，交联所形成的双酪氨酸键并不稳定，从而导致丝素HRP凝胶容易破碎、溶解。
实施例4：
量取5mL浓度为1～9％(w/v)的丝素蛋白溶液，然后采用超声仪器进行超声处理。设置不同的超声时间(30～50s)和功率(30～60％)以优化成胶时间。将1mL的微藻溶液与2mL超声后的丝素蛋白溶液进行充分混合，丝素蛋白溶液的最终浓度为6％。室温静置成胶。而作为对照样的海藻酸钠凝胶的制备方法如下：配置10mL的浓度为2％的海藻酸钠溶液，水浴加热搅拌(60℃)4个小时，冷却至室温待用。量取2mL的海藻酸钠溶液与1mL的微藻细胞液充分混合。向混合液中加入2％浓度的氯化钙溶液，成胶后将残余氯化钙溶液吸出，并采用培养液冲洗3次。
在本发明中，诱导方式采用物理诱导的方式进行诱导，如果采用化学交联的方法则会微藻的活性造成一定的影响。经过物理诱导的丝素溶液必须控制在一定的时间内成胶，最好在5min-30min以内，因为过快的成胶可能会导致微藻细胞无法混入，无法达到固定化的效果，而成胶时间的过长的话可能会让微藻细胞无法及时接触到培养液，从而影响微藻细胞的活性。
丝素/微藻超声凝胶和海藻酸钠/微藻凝胶的样品图，如图2所示。图2展示了本发明所采用的丝素蛋白超声凝胶和海藻酸钠凝胶包埋微藻后的样品图，图中可以看出海藻酸钠凝胶在培养10天后会出现凝胶破碎的现象，而丝素蛋白超声凝胶依旧保持着良好的稳定性。这是由于海藻酸钠凝胶在接触含有高浓度的盐溶液(微藻培养基)时会发生降解的情况。丝素溶液经过超声后丝素蛋白形成了稳定的β-折叠结构，所以稳定性更好。海藻酸钠凝胶在第10天的质量损失为42％，而不同浓度制备的丝素蛋白超声凝胶均低于20％(图3)，对比结果同样说明了丝素超声凝胶具有更好的稳定性。
称取0.5克的MTT溶于100mL的PH为7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，采用0.2μm的滤膜去除溶液中的细菌，4℃避光保存备用。在24孔板中制备包埋不同浓度微藻细胞的超声凝胶，并加入200μL的培养液。每天取一个超声凝胶样品，先更换原先的细胞培养液，然后每孔滴入50μL的MTT溶液，室温孵育4h。吸掉孔板内的上清液，加入200μL的二甲基亚砜(DMSO)低速振荡10min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪测量570nm处的吸光值。每隔一天对微藻细胞活性进行MTT比色法检测，一周后以时间为横坐标，570nm处的OD值为纵坐标建立曲线。微藻活性检测结果表明：丝素材料内微藻具有良好的增殖活性。结果如图4所示。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备丝素蛋白溶液：将生丝经过脱胶、溶解、透析、离心处理，制备成浓度为1～9％w/v的丝素蛋白溶液；
S2、制备微藻培养液：将微藻细胞接种至微藻培养基中，培养至微藻浓度为104～6个细胞/mL，获得微藻培养液；
S3、将S1步骤制备的丝素蛋白溶液采用物理诱导处理，在未成胶之前，与S2步骤制备的微藻培养液以0.5～2:1体积比进行混匀，在5-30min形成凝胶。
2.根据权利要求1所述的微藻固定化方法，其特征在于，所述的物理诱导的方式为超声、涡旋、震荡、调节PH中的一种或多种形成的组合方式。
3.根据权利要求2所述的微藻固定化方法，其特征在于，所述的物理诱导的方式为超声时，超声的时间为30～50s，超声功率为15～30watts。
4.根据权利要求1所述的微藻固定化方法，其特征在于，微藻细胞培养是在26-30℃，光照6000-8000Lux条件下进行培养。
5.根据权利要求1所述的微藻固定化方法，其特征在于，所述的脱胶是将生丝置于碳酸钠溶液中，搅拌煮沸30-50min，用水揉搓2-4遍，干燥得到干燥丝。
6.根据权利要求1所述的微藻固定化方法，其特征在于，所述的溶解是将经过脱胶处理后的生丝溶解在9-10M的溴化锂溶液中。
7.根据权利要求1所述的微藻固定化方法，其特征在于，所述的微藻为小球藻、硅藻、衣藻、栅藻、扁藻中的一种。
8.根据权利要求1所述的微藻固定化方法，其特征在于，所述的微藻培养基为BG-11培养基、TAP培养基、F/2培养基中的一种。
9.一种权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的固定化微藻。
10.权利要求9所述的固定化微藻在食品产业、水产养殖业、生物制药、生态保护、新能源中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011339206.9A CN112322609A (zh) | 2020-11-25 | 2020-11-25 | 一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011339206.9A CN112322609A (zh) | 2020-11-25 | 2020-11-25 | 一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112322609A true CN112322609A (zh) | 2021-02-05 |
Family
ID=74309477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011339206.9A Pending CN112322609A (zh) | 2020-11-25 | 2020-11-25 | 一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112322609A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115991939A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-04-21 | 北京师范大学 | 一种天然多糖-蛋白互穿网络微生物水凝胶及其制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101502670A (zh) * | 2009-03-05 | 2009-08-12 | 苏州大学 | 一种丝素蛋白水凝胶的制备方法 |
| US20100178304A1 (en) * | 2007-05-29 | 2010-07-15 | Trustees Of Tufts College | Method for silk fibroin gelation using sonication |
| CN111254137A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-06-09 | 深圳大学 | 一种固定化炭藻材料及其制备方法、用途 |
| WO2020223415A1 (en) * | 2019-04-29 | 2020-11-05 | Trustees Of Tufts College | Systems and methods for living silk articles |
-
2020
- 2020-11-25 CN CN202011339206.9A patent/CN112322609A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100178304A1 (en) * | 2007-05-29 | 2010-07-15 | Trustees Of Tufts College | Method for silk fibroin gelation using sonication |
| CN101502670A (zh) * | 2009-03-05 | 2009-08-12 | 苏州大学 | 一种丝素蛋白水凝胶的制备方法 |
| WO2020223415A1 (en) * | 2019-04-29 | 2020-11-05 | Trustees Of Tufts College | Systems and methods for living silk articles |
| CN111254137A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-06-09 | 深圳大学 | 一种固定化炭藻材料及其制备方法、用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 胡泽云等: "丝素纳米纤维及丝素复合纳米纤维在生物医学材料领域应用的研究进展", 《蚕业科学》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115991939A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-04-21 | 北京师范大学 | 一种天然多糖-蛋白互穿网络微生物水凝胶及其制备方法 |
| CN115991939B (zh) * | 2022-12-06 | 2024-03-29 | 北京师范大学 | 一种天然多糖-蛋白互穿网络微生物水凝胶及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6153416A (en) | Immobilization of microbial cells and enzymes in calcium alginate-polyethylene glycol-polyethylene imide beads | |
| CN108578771B (zh) | 具有促进细胞增殖活性的fgf1丝胶蛋白凝胶的制备方法及其产品 | |
| Francou et al. | Hydrogen production by Rhodopseudomonas capsulata cells entrapped in carrageenan beads | |
| Homburg et al. | Entrapment and growth of Chlamydomonas reinhardtii in biocompatible silica hydrogels | |
| CN112322609A (zh) | 一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法 | |
| CN103255123A (zh) | 菌丝球吸附光合细菌形成混合菌丝球的方法 | |
| CN102774964B (zh) | 一种微生物固定化载体及其制备方法 | |
| CN102516473B (zh) | 细胞片智能分离用共聚纳米复合水凝胶及其制备方法与应用 | |
| CN112047478A (zh) | 一种静电纺丝纤维膜固定微藻复合材料去除硝酸盐的方法 | |
| CN105754862A (zh) | 一种用污水养殖微藻的方法 | |
| Mishra et al. | Entrapment of Saccharomyces cerevisiae and 3T3 fibroblast cells into blue light cured hydrogels | |
| CN113005054A (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌ss-zc-26及其制备方法和应用 | |
| CN105238828B (zh) | 一种利用分子网布包埋β-葡萄糖苷酶提高纤维素水解效率并降低纤维素乙醇成本的方法 | |
| Koyama et al. | Evaluation of mass-transfer characteristics in alginate-membrane liquid-core capsules prepared using polyethylene glycol | |
| CN112063611A (zh) | 一种固定化藻球及其制备方法及应用 | |
| Park et al. | Production of cephalosporin C by immobilized Cephalosporium acremonium in polyethyleneimine-modified barium alginate | |
| CN116622694A (zh) | 一种悬浮型固定化藻菌共生颗粒及其制备方法和应用 | |
| Baran et al. | Comparison of β‐galactosidase immobilization by entrapment in and adsorption on poly (2‐hydroxyethylmethacrylate) membranes | |
| CN112921026A (zh) | 一种颗粒型复合微生物菌剂及其制备方法 | |
| CN117089543B (zh) | 一种水处理菌剂及其在水产养殖废水处理中的应用 | |
| CN109750025A (zh) | 一种水凝胶包覆树枝状二氧化硅固定化cpo酶反应器及其制备方法和应用 | |
| CN109207464A (zh) | 一种复合型固定化微生物颗粒制备及其应用 | |
| Christ et al. | Application of electrospun chitosan-based nanofibers as immobilization matrix for biomolecules | |
| CN114349984B (zh) | 一种用于废水处理的复合水凝胶及其制备方法和应用 | |
| Aoyagi et al. | Development of simple methods for preparation of yeast and plant protoplasts immobilized in alginate gel beads |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210205 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |