CN103352045A - 一种芳香基硫酸酯酶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种芳香基硫酸酯酶及其制备方法与应用，涉及一种具有新基因序列的芳香基硫酸酯酶及制备，提供来源于太平洋火色杆菌H2的芳香基硫酸酯酶Ary423，包括芳香基硫酸酯酶基因Ary423、芳香基硫酸酯酶Ary423的制备方法。克隆其基因Ary423，构建携带该基因的重组表达载体，再转化到大肠杆菌BL21中，选取阳性克隆于培养基中培养，重悬于裂解缓冲液中，裂解后离心，收集上清液再与Ni-NTA Agarose混匀纯化。芳香基硫酸酯酶Ary423能在大肠杆菌中稳定表达，重组酶在较广的温度范围和pH范围内保持高催化效率，可克服现有芳香基硫酸酯酶活力低，酶分离纯化过程繁琐等不足。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有新基因序列的芳香基硫酸酯酶及其制备方法，以及其在琼胶提取工艺中的应用。
背景技术
琼胶是由红藻类海藻中提取的天然多糖胶体，在食品工业、医药工业、日用化工、生物工程等许多方面有广泛的应用。凝胶强度是衡量琼胶产品品质的主要指标，而硫酸基团是阻碍琼胶分子形成凝胶的关键因素。在生产琼胶的过程中，海藻中的粗琼胶分子中硫酸基团含量很高，需要用碱（NaOH）处理，以降低琼胶分子中的硫酸基（SO4 2-）含量，从而提高琼胶产品的凝胶强度，因此碱处理是琼胶工业生产过程中必不可少的工序。在碱处理工艺中，每吨海藻需要用大约400kg的NaOH，并需要用大约120吨的水将处理后的海藻洗至中性以继续进行琼胶提取。因此整个工艺所造成的环境污染以及水资源的消耗十分严重。如能在琼胶的生产过程中采用生物酶法替代碱处理法去除硫酸基团，无疑具有重要的经济效益和环境效益。硫酸酯酶（Sulfatases，EC3.1.6.1)是一类可以水解硫酸酯键产生无机硫酸根和相应醇的酶类，它分为烷基硫酸酯酶（Alkylsulfatase）和芳香基硫酸酯酶（Arylsulfatase）。芳香基硫酸酯酶广泛分布于从细菌到哺乳动物的各种生物中。目前对于芳香基硫酸酯酶功能的研究大部分集中在两个方面，包括对土壤中硫元素循环的作用，以及对人体的疾病和健康产生的影响。2004年，Lim JM等(Lim JM,Jang YH,Kim HR,Kim JK,Nam SW.Overexpression of arylsulfatase in E.coli and its application to desulfation of agar,J Microbiol Biotechnol.2004,14:777–782.)发现来源于Pseudoalteromonas carrageenovora ATCC43555菌株的芳香基硫酸酯酶可以降解底物p-nitrophenyl sulfate（pNPS），其基因在大肠杆菌中表达后具有降解琼胶上SO4 2-的能力，使琼胶的凝胶强度增加、电导率下降。Kim JH等(Kim JH,Byun DS,Godber JS,Choi JS,Choi WC,Kim HR.Purification and characterization of arylsulfatase from Sphingomonas sp.AS6330.ApplMicrobiol Biotechnol.2004,63:553–559)同样发现来源于一株鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.AS6330）的芳香基硫酸酯酶能有效降解pNPS底物，也可去除琼胶上的SO4 2-，提高凝胶强度。2012年，Jung KT等人(Jung KT,Kim HW,You DJ,Nam SW,Kim BW,Jeon SJ.Identification ofthe first archaeal arylsulfatase from Pyrococcus furiosus and its application to desulfatation of agar.Biotechnology and Bioprocess Engineering.2012,17(6):1140-1146)首次从古菌（Pyrococcusfuriosus）中发现了芳香基硫酸酯酶，并对其在去除琼胶上的SO4 2-方面的功能进行了验证。这些结果表明芳香基硫酸酯酶在提高琼胶质量方面具有应用潜力。
但迄今为止芳香基硫酸酯酶脱SO4 2-活性的研究均采用商品化琼胶进行，这些酶对未经碱处理的粗琼胶上的SO4 2-是否具有同样的降解活性并未见研究。目前也未见芳香基硫酸酯酶的专利，也未见与处理琼胶相关的硫酸酯酶的专利。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种芳香基硫酸酯酶基因Ary423。
本发明的第二个目的是提供一种由所述芳香基硫酸酯酶基因Ary423编码的重组芳香基硫酸酯酶Ary423。
本发明的第三个目的是提供一种所述重组芳香基硫酸酯酶Ary423的制备方法。
本发明的第四个目的是提供一种所述重组芳香基硫酸酯酶Ary423在降解海藻中的粗琼胶分子上的SO4 2-基团中的应用。
所述芳香基硫酸酯酶基因Ary423的生产菌株为太平洋火色杆菌（Flammeovirga Pacifica）H2该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2012229。
所述芳香基硫酸酯酶基因Ary423的序列如下：
1 ATGAAAAGCT CTCTTTTGGC CATACTTTTT TTGGCCTTTT CATTGACGAC TTCATTCGCC
61 CAAAAAAAGA AAAAAAAATC CTCTACTTCA GACAAACCCA ATATCTTAGT GATATGGGGA
121 GATGATATTG GTTGGGGTAA CATCAGTAAG TACAATCATG GAATGATGGG GTATCAAACT
181 CCTAACATTG ATAGAATTGC CAATGAAGGG GCAATGTTTA CAGATTGGTA CGCACAACAA
241 TCTTGTACAG CTGGTCGTGC TGCATTTATT CTTGGTCAAC ATCCGTTTAG AAGTGGATTG
301 CTTACTATTG GTATGCCGGG CTCTAAACAA GGTATCCGTG ATGATCAGCC TACTATTGCT
361 GAACTTCTTA AGCCTCTAGG TTATACCTCA GGACAATTTG GTAAAAACCA CTTGGGCGAC
421 CAAGATATGC ACCTTCCTAC AAATCATGGA TTTGATGAGT TCTTTGGTAA CCTATACCAC
481 TTGAACGCAG AAGAAGAACC AGAAACTTAT TACTATCCAA AAGATGAAGA GTTTCATAAG
541 AAATTTGGTC CTCGTGGTGT GATCCACTCT TATGCTGATG GACGTATTTC AGATACTGGT
601 CCTTTAACTA GAAAAAGAAT GGAAACAGTA GATGATGAAT TTACTGGTGC AGCTTTAGAG
661 TTTATCGAAA ATGCACACGA AGCAGGTAAA CCTTTCTTTG TATGGTTAAG TGCTACAAGA
721 ATGCACGTTT GGACTCGACT AAAAGAAGAA TCTGTTGGAG TTACTGGTAT TGGTTTATAT
781 CCTGACGGTA TGGTAGAACA CGATAAAAAT ATTGGTGTTG TATTAGCCAA ATTAGAAGAA
841 CTAGGTATTA TTGATAACAC GATCATTATG TATTCTACAG ATAATGGTGC AGAAAAATTC
901 ACATGGCCTG ATGGTGGATC AACTCCATTT GCTGGTGAAA AAGGAACTAC TTGGGAAGGT
961 GGTTTTAGAG TACCATGTGC AATACGTTGG CCTGGTGTAA TTAAACCTGG TACTATTGAT
1021 AATAATATTT ATTCTCATGA AGACATGATG CCTACATTAT TAGCTGCTGC TGGTGTTTCT
1081 GATGTAAAAG AAAAGATGCT AAGTGGTTAT GGTGCTGGAG ATAAAAACTT CAAATGTCAC
1141 CTTGATGGAT ATAATATGCT TCCTTTCTGG GACGGGTCTA CTGAAGTTGC TCCTAGAAAT
1201 GAAATCTTCT ACTTCGATGC TGCAGGTAAT TTAAATGCAC TTCGATATAA AGACTGGAAA
1261 CTTCATTTTG CAATCATGGA AGGAGCAATT AACACCGCTT ACAGAAAAAC TCCATCTTGG
1321 CCAATTCTTA TCAATTTAAG AGCTGACCCT TATGAAGTAT CTTATAAGTC CGCCTTATAT
1381 ATCAGATGGT TTGCTGATAA TATGTGGACC TTCGTTCCTG CTCAAGCTTA CACCGCTAAG
1441 TTTTTAGCTA CTTTTAAGGA GTTCCCTCCT GTTCAAGGCT CATCACTCAG TATTGATGGT
1501 GTGATGCAAA CTTTGAAAAG TAAACCACAG AATTAA
所述芳香基硫酸酯酶基因Ary423编码的芳香基硫酸酯酶Ary423的氨基酸序列如下：
1 MKSSLLAILF LAFSLTTSFA QKKKKKSSTS DKPNILVIWG DDIGWGNISK YNHGMMGYQT
61 PNIDRIANEG AMFTDWYAQQ SCTAGRAAFI LGQHPFRSGL LTIGMPGSKQ GIRDDQPTIA
121 ELLKPLGYTS GQFGKNHLGD QDMHLPTNHG FDEFFGNLYH LNAEEEPETY YYPKDEEFHK
181 KFGPRGVIHS YADGRISDTG PLTRKRMETV DDEFTGAALE FIENAHEAGK PFFVWLSATR
241 MHVWTRLKEE SVGVTGIGLY PDGMVEHDKN IGVVLAKLEE LGIIDNTIIM YSTDNGAEKF
301 TWPDGGSTPF AGEKGTTWEG GFRVPCAIRW PGVIKPGTID NNIYSHEDMM PTLLAAAGVS
361 DVKEKMLSGY GAGDKNFKCH LDGYNMLPFW DGSTEVAPRN EIFYFDAAGN LNALRYKDWK
421 LHFAIMEGAI NTAYRKTPSW PILINLRADP YEVSYKSALY IRWFADNMWT FVPAQAYTAK
481 FLATFKEFPP VQGSSLSIDG VMQTLKSKPQ N
所述芳香基硫酸酯酶Ary423的制备方法包括以下步骤：
1）克隆芳香基硫酸酯酶基因Ary423；
2）将芳香基硫酸酯酶基因Ary423插入表达载体，构建携带所述芳香基硫酸酯酶基因Ary423的重组表达载体；
3）将重组表达载体转化到大肠杆菌（E.coli）BL21中；
4）选取转化后E.coli BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；
5）离心收集发酵后的E.coli BL21细胞，重悬所述E.coli BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解；
6）将步骤5）中裂解后的悬液离心，收集上清液，再与Ni-NTA Agarose混匀，按照纯化试剂盒说明书进行纯化，即得所述芳香基硫酸酯酶。
在步骤2）中，所述表达载体可选自pET-His载体等。
在步骤4）中，所述培养基可为含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，所述发酵的条件可为：温度为37°C，摇床培养至A600=0.6时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）至终浓度为50μmol/L，在16°C条件下诱导过夜。
在步骤5）中，所述裂解缓冲液的配方可为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/LNaH2PO4，pH8.0。
在步骤6）中，所述离心为18000×g，离心20min，4℃。
本发明提供了一种来自一株深海细菌太平洋火色杆菌（Flammeovirga Pacifica）H2的芳香基硫酸酯酶及其制备方法。该酶对未经碱处理的粗琼胶上的SO4 2-具有良好的降解功能，可替代或部分替代琼胶提取生产过程中的碱处理步骤，减少污染，节约水资源，具有良好的应用价值。
本发明中芳香基硫酸酯酶的突出特点表现为：
1.具有新的基因序列，在NCBI数据库中没有相似的完整ORF基因序列。
2.能够在E.coli中稳定表达，并且纯化后的酶活力很高，在较广的温度范围和pH范围内都保持较高的催化效率，可以克服现有芳香基硫酸酯酶活力低，酶分离纯化过程繁琐等不足。
3.重组表达的芳香基硫酸酯酶对海藻中的粗琼胶分子上的SO4 2-具有很好的降解作用，在琼胶提取生产过程中可替代或部分替代碱处理，从而减少污染，节约水资源。
附图说明
图1为芳香基硫酸酯酶基因Ary423重组表达纯化的SDS-PAGE图谱。在图1中，M为蛋白Marker，1泳道为重组载体pET-Ary423在E.coli BL21中的表达（未进行诱导），2泳道为重组载体pET-Ary423在E.coli BL21中的诱导表达，3泳道为经Ni-NTA纯化所得的目的蛋白Ary423（55kDa）。
图2为重组酶Ary423的最适作用温度。在图2中，横坐标为温度（℃），纵坐标为酶的相对活性（％）。
图3为重组酶Ary423的最适作用pH值。在图3中，横坐标为pH值，纵坐标为酶的相对活性（％）。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001）中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。
用于制备所述芳香基硫酸酯酶基因Ary423的生产菌株为太平洋火色杆菌（FlammeovirgaPacifica）H2。该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2012229。
1.芳香基硫酸酯酶Ary423的制备
1）Flammeovirga Pacifica H2基因组DNA的提取
用接种环挑取－80℃保存的Flammeovirga Pacifica H2菌种，在LB培养基平板（一种细菌培养基，含有1%的胰蛋白胨，1%的氯化钠，0.5%的酵母提取物，1.5%的琼胶糖）上划线分离单菌落。划线后的平板置37℃培养过夜，挑取一个单菌落接种到5mL的LB培养液管中（一种细菌培养基，含有1%的胰蛋白胨，1%的氯化钠，0.5%的酵母提取物），37℃摇动培养过夜。取1.5mL的培养物2000r/min离心2min；再加入500μL6mol/L盐酸胍，轻轻混匀，直至裂解清亮（可酌量增加盐酸胍用量）；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，15000r/min离心4～5min，将上层水相移入新管；缓慢加入等体积异丙醇，混匀后放置5min；15000r/min离心15s，去除上清，沉淀用70%乙醇洗两次，吹干；加入200μL TE溶液(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/LEDTA)，2μL RNase A，37℃酶解1h；加入120μL异丙醇，2μL1mol/L MgCl2，轻轻混匀，静置10min；15000r/min离心5min，去除上清，沉淀用70%乙醇洗两次，吹干；沉淀溶解于50μL TE溶液。
2）芳香基硫酸酯酶基因Ary423的PCR扩增和序列分析
根据Flammeovirga Pacifica H2菌株基因组测序后的基因注释结果，设计引物F：5’-CCGGAATTCCGG ATGAAAAGCTCTCT-3’（划线为EcoR I酶切位点）和R：5’-CGGCTAGCCGTTAATTCTGTGGTT-3’（划线为Nhe I酶切位点）。以提取的FlammeovirgaPacifica H2基因组DNA为模板，用引物F和R扩增全长的Ary423基因。PCR反应条件为：在50μL的反应体系中含有，100ng模板，400nmo/L引物F，400nmo/L引物R，200μmo/LdNTP，2.5mmo/L Mg2+，5U Primer Star HSTaq酶（购自TaKaRa公司），5mL10×PCR反应缓冲液；反应条件：94℃5min预变性；98℃10s、55℃45s、72℃2min循环30圈；72℃延伸10min。所得PCR产物纯化后用EcoR I和Nhe I进行酶切，并与同样用EcoR I和Nhe I酶切后的pET-His载体连接，CaCl2法转化到E.coli DH5α中，挑取阳性克隆进行测序。
3）重组酶Ary423的表达和纯化
将步骤2）中获得的序列正确的重组表达载体pET-Ary423转化E.coli BL21，选取阳性克隆在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C摇培至A600＝0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）至终浓度100μmol/L，16°C诱导12h后将菌液收集至200mL的离心管中，5000×g离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在20mL的裂解缓冲液（裂解缓冲液配方为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/L NaH2PO4，pH8.0）中，超声波处理至菌液成半透明，18000×g离心20min，上清与预先用裂解缓冲液平衡的Ni-NTA Agarose混匀，4°C结合1小时，纯化过程按照纯化试剂盒（购自Qiagen公司）说明进行。纯化的蛋白经12%的SDS-PAGE电泳分析，其分子量约为55kDa，纯度达95％以上（结果参见图1）
2.重组酶Ary423基本酶学性质分析
1）酶活力的测定方法
以pNPS为底物检测重组酶Ary423的活力，以便于与其它研究报道中表达的酶进行活力比较。将1mL纯化后的重组酶Ary423与250μl25mM NPS混匀，置于45℃反应30min，加入1ml0.5M NaOH终止反应，测定反应液在410nm处的吸光值。每分钟降解pNPS产生1μmolp-nitrophenol（pNP）所需的酶量定义为1个活力单位（U）。结果表明，纯化后重组酶Ary423的比活力为637U/mg（目前研究报道中活力最高的是来自Pseudoalteromonas carrageenovora菌株的芳香基硫酸酯酶，468U/mg）。
2）重组酶Ary423的最适温度测定方法及结果
采用Tris-HCl缓冲液（pH8.0），在不同温度下进行酶促反应，检测经纯化的重组酶Ary423的最适温度。结果（图2）表明，重组酶Ary423的最适作用温度为40℃，在30～50℃范围内活力可达90％以上，在低温条件（20℃）时的剩余活力也可达70％，在高温条件（60℃）时的剩余活力达75％以上，甚至在70℃时仍可保持月45％的剩余活力，表现出较宽的作用温度范围。
3）重组酶Ary423的最适pH测定方法及结果
经纯化的重组酶Ary423在不同pH值的缓冲液中，于40℃下进行反应以测定其最适pH，结果（图3）表明，重组酶Ary423的最适pH为8.0，在pH7～9的范围内保持90％的活力，在pH6和pH10的条件下分别可保持65％和75％的剩余活力，具有较宽的pH作用范围。
3.重组芳香基硫酸酯酶Ary423在琼胶提取工艺中的应用
1）重组酶Ary423与碱浸泡两种粗琼胶预处理方式
设定空白组、碱处理组（即对照组）和酶处理组（即实验组）三组实验，分别对龙须菜进行预处理，再按照下述步骤2）和3）中的方法提取琼胶，并测定琼胶产率、SO4 2-含量、凝胶强度等三个决定琼胶产品质量的关键参数进行比较。
空白组：取10g已切成约1～2cm小段的龙须菜，加入100mL水，在80℃下水浴2h，除去上清后用以提取琼胶。
碱处理组：取10g已切成约1～2cm小段的龙须菜，加入100mL10％NaOH溶液，在80℃下水浴2h，除去上清后用以提取琼胶。
酶处理组：取10g已切成约1～2cm小段的龙须菜，加入100mL重组酶Ary423的粗酶液，在40℃下振荡反应6h，再于80℃下水浴2h，除去上清后用以提取琼胶。
2）琼胶的制备及产率、凝胶强度的测定
在上述三组经过预处理的海藻样品中分别加入300mL沸水，放入高压灭菌锅中，在0.12MPa的条件下保持25min。用8层纱布过滤，滤液冷却后切条，称重，于－20℃冷冻完全。冻后加1.5倍（v/w）95％乙醇融化脱水，再用85％乙醇浸泡一次，于50℃下烘干，称重，计算琼胶产率。配制1％的琼胶溶液，在30℃恒温后用质构仪测定凝胶强度。
3）琼胶中SO4 2-的含量的测定
取400μL步骤2）中所得的纱布滤过液，与3.6mL3%三氯乙酸及1mL0.5%BaCl2-明胶混合均匀，在室温下静置15min。测定反应液在360nm处的吸光值。测定结果见表1。
表1
| 组别 | 琼胶产率（％） | 凝胶强度（g/cm2） | SO4 2-含量（％） |
| 空白组 | 29.3 | 35 | 5.62 |
| 碱处理组（对照） | 17.4 | 727 | 0.97 |
| 酶处理组（实验） | 16.5 | 796 | 0.31 |
无论是碱处理或者酶处理，均能显著降低SO4 2-的含量，并提高所得琼胶的凝胶强度。与碱处理相比，利用重组酶Ary423处理后所得琼胶的SO4 2-含量更低，凝胶强度更高，而且能够得到相近的琼胶产率。由于碱处理方法与实际工业生产中的琼胶提取工艺一致，因此，重组酶Ary423的处理结果表明其在提取琼胶的工业生产中具有良好的应用价值。
Claims (10)
1.芳香基硫酸酯酶基因Ary423，其特征在于其生产菌株为太平洋火色杆菌（FlammeovirgaPacifica）H2，该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2012229。
2.如权利要求1所述芳香基硫酸酯酶基因Ary423，其特征在于其序列如下：
1 ATGAAAAGCT CTCTTTTGGC CATACTTTTT TTGGCCTTTT CATTGACGAC TTCATTCGCC
61 CAAAAAAAGA AAAAAAAATC CTCTACTTCA GACAAACCCA ATATCTTAGT GATATGGGGA
121 GATGATATTG GTTGGGGTAA CATCAGTAAG TACAATCATG GAATGATGGG GTATCAAACT
181 CCTAACATTG ATAGAATTGC CAATGAAGGG GCAATGTTTA CAGATTGGTA CGCACAACAA
241 TCTTGTACAG CTGGTCGTGC TGCATTTATT CTTGGTCAAC ATCCGTTTAG AAGTGGATTG
301 CTTACTATTG GTATGCCGGG CTCTAAACAA GGTATCCGTG ATGATCAGCC TACTATTGCT
361 GAACTTCTTA AGCCTCTAGG TTATACCTCA GGACAATTTG GTAAAAACCA CTTGGGCGAC
421 CAAGATATGC ACCTTCCTAC AAATCATGGA TTTGATGAGT TCTTTGGTAA CCTATACCAC
481 TTGAACGCAG AAGAAGAACC AGAAACTTAT TACTATCCAA AAGATGAAGA GTTTCATAAG
541 AAATTTGGTC CTCGTGGTGT GATCCACTCT TATGCTGATG GACGTATTTC AGATACTGGT
601 CCTTTAACTA GAAAAAGAAT GGAAACAGTA GATGATGAAT TTACTGGTGC AGCTTTAGAG
661 TTTATCGAAA ATGCACACGA AGCAGGTAAA CCTTTCTTTG TATGGTTAAG TGCTACAAGA
721 ATGCACGTTT GGACTCGACT AAAAGAAGAA TCTGTTGGAG TTACTGGTAT TGGTTTATAT
781 CCTGACGGTA TGGTAGAACA CGATAAAAAT ATTGGTGTTG TATTAGCCAA ATTAGAAGAA
841 CTAGGTATTA TTGATAACAC GATCATTATG TATTCTACAG ATAATGGTGC AGAAAAATTC
901 ACATGGCCTG ATGGTGGATC AACTCCATTT GCTGGTGAAA AAGGAACTAC TTGGGAAGGT
961 GGTTTTAGAG TACCATGTGC AATACGTTGG CCTGGTGTAA TTAAACCTGG TACTATTGAT
1021 AATAATATTT ATTCTCATGA AGACATGATG CCTACATTAT TAGCTGCTGC TGGTGTTTCT
1081 GATGTAAAAG AAAAGATGCT AAGTGGTTAT GGTGCTGGAG ATAAAAACTT CAAATGTCAC
1141 CTTGATGGAT ATAATATGCT TCCTTTCTGG GACGGGTCTA CTGAAGTTGC TCCTAGAAAT
1201 GAAATCTTCT ACTTCGATGC TGCAGGTAAT TTAAATGCAC TTCGATATAA AGACTGGAAA
1261 CTTCATTTTG CAATCATGGA AGGAGCAATT AACACCGCTT ACAGAAAAAC TCCATCTTGG
1321 CCAATTCTTA TCAATTTAAG AGCTGACCCT TATGAAGTAT CTTATAAGTC CGCCTTATAT
1381 ATCAGATGGT TTGCTGATAA TATGTGGACC TTCGTTCCTG CTCAAGCTTA CACCGCTAAG
1441 TTTTTAGCTA CTTTTAAGGA GTTCCCTCCT GTTCAAGGCT CATCACTCAG TATTGATGGT
1501 GTGATGCAAA CTTTGAAAAG TAAACCACAG AATTAA。
3.如权利要求1所述芳香基硫酸酯酶基因Ary423，其特征在于所述芳香基硫酸酯酶基因Ary423编码的芳香基硫酸酯酶Ary423的氨基酸序列如下：
1 MKSSLLAILF LAFSLTTSFA QKKKKKSSTS DKPNILVIWG DDIGWGNISK YNHGMMGYQT
61 PNIDRIANEG AMFTDWYAQQ SCTAGRAAFI LGQHPFRSGL LTIGMPGSKQ GIRDDQPTIA
121 ELLKPLGYTS GQFGKNHLGD QDMHLPTNHG FDEFFGNLYH LNAEEEPETY YYPKDEEFHK
181 KFGPRGVIHS YADGRISDTG PLTRKRMETV DDEFTGAALE FIENAHEAGK PFFVWLSATR
241 MHVWTRLKEE SVGVTGIGLY PDGMVEHDKN IGVVLAKLEE LGIIDNTIIM YSTDNGAEKF
301 TWPDGGSTPF AGEKGTTWEG GFRVPCAIRW PGVIKPGTID NNIYSHEDMM PTLLAAAGVS
361 DVKEKMLSGY GAGDKNFKCH LDGYNMLPFW DGSTEVAPRN EIFYFDAAGN LNALRYKDWK
421 LHFAIMEGAI NTAYRKTPSW PILINLRADP YEVSYKSALY IRWFADNMWT FVPAQAYTAK
481 FLATFKEFPP VQGSSLSIDG VMQTLKSKPQ N。
4.如权利要求1所述芳香基硫酸酯酶Ary423的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）克隆芳香基硫酸酯酶基因Ary423；
2）将芳香基硫酸酯酶基因Ary423插入表达载体，构建携带所述芳香基硫酸酯酶基因Ary423的重组表达载体；
3）将重组表达载体转化到大肠杆菌（E.coli）BL21中；
4）选取转化后E.coli BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；
5）离心收集发酵后的E.coli BL21细胞，重悬所述E.coli BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解；
6）将步骤5）中裂解后的悬液离心，收集上清液，再与Ni-NTA Agarose混匀，按照纯化试剂盒说明书进行纯化，即得所述芳香基硫酸酯酶。
5.如权利要求4所述芳香基硫酸酯酶Ary423的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述表达载体选自pET-His载体。
6.如权利要求4所述芳香基硫酸酯酶Ary423的制备方法，其特征在于在步骤4）中，所述培养基为含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。
7.如权利要求4所述芳香基硫酸酯酶Ary423的制备方法，其特征在于在步骤4）中，所述发酵的条件为：温度为37°C，摇床培养至A600=0.6时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为50μmol/L，在16°C条件下诱导过夜。
8.如权利要求4所述芳香基硫酸酯酶Ary423的制备方法，其特征在于在步骤5）中，所述裂解缓冲液的配方为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/L NaH2PO4，pH8.0。
9.如权利要求4所述芳香基硫酸酯酶Ary423的制备方法，其特征在于在步骤6）中，所述离心为18000×g，离心20min，4℃。
10.如权利要求1所述芳香基硫酸酯酶Ary423在未经碱处理的粗琼胶上降解SO4 2-的应用。
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