CN102337253B - 分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞 - Google Patents

分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN102337253B
CN102337253B CN201110309181.2A CN201110309181A CN102337253B CN 102337253 B CN102337253 B CN 102337253B CN 201110309181 A CN201110309181 A CN 201110309181A CN 102337253 B CN102337253 B CN 102337253B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
thr
val
leu
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201110309181.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102337253A (zh
Inventor
于洪巍
王珏
王丹
王博
刘敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Xinhai Enzyme Source Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201110309181.2A priority Critical patent/CN102337253B/zh
Publication of CN102337253A publication Critical patent/CN102337253A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102337253B publication Critical patent/CN102337253B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物工程领域，公开了一种分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞。多肽选自：（1）SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示氨基酸序列；和（2）在（1）所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQ ID NO：2的氨基酸序列编号记第48位氨基酸残基为Val，67位氨基酸残基为Ala，以及311位氨基酸残基为Ser，且具有脂肪酶活性的由（1）衍生的多肽。本发明得到的突变基因所编码的脂肪酶具有更高的水解活性以及对高温的耐受性。

Description

分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及了一种分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞。
背景技术
脂肪酶（三脂酰甘油酰基水解酶，EC3.1.1.3）是一类能在油水界面催化酯水解，转酯化和酯合成的酶。其被广泛地应用于化学，食品，制药和日化等工业中。比如：利用脂肪酶水解油脂的能力可获得重要的轻化工原料脂肪酸和甘油，并且对皮革加工、造纸工业都有重要的帮助；脂肪酶另一个重要工业应用就是催化油脂改性，新的油脂可通过在甘油的Sn-1 和Sn-3 位上酰基交换获得。例如用价格便宜的棕榈油升级为类可可脂。其中来源于真菌米黑霉的脂肪酶RML（Rhizomucor miehei Lipase）就是一种能够专一性水解甘油三酯1,3位酯键的脂肪酶，得到的二酯和单酯在食品和商品业中都具有更广泛的应用价值。
提高脂肪酶的催化活力，是降低脂肪酶生产成本的有效途径之一。而若同时提高脂肪酶的热稳定性，则使其在工业应用中更具有价值。本发明以具有1，3专一选择性的米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei Lipase）为研究对象，首先采用易错PCR定向进化技术，利用大肠杆菌表达体系，建立脂肪酶突变库，通过高通量筛选方法，筛选出热稳定性和酶催化比活提高的RML突变脂肪酶，将其相应的突变基因测序后，分析氨基酸突变位点，并针对这些位点进行定点饱和突变，以达到进一步提高脂肪酶催化比活力及耐热性的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时具有高热稳定性及对甘油三酯的高水解能力的脂肪酶突变基因，涉及了一种分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
多肽，所述多肽选自：
（1）SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示氨基酸序列；和
（2）在（1）所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQ ID NO：2的氨基酸序列编号记第48位氨基酸残基为Val，67位氨基酸残基为Ala，以及311位氨基酸残基为Ser，且具有脂肪酶活性的由（1）衍生的多肽。
作为优选，以SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号计，（2）所述的多肽至少还保留一个或多个以下位置上的残基：第78位的Thr，第113位的Ser，第168位的Pro，第173位的Arg，第190位的Asn，第240位的Ser，和第313位的Asp。
作为优选，以SEQ ID NO:2的氨基酸序列编号计，（2）所述的多肽或者至少还保留一个或多个以下位置上的残基：第67位的Asp，第240位的Ala（或240位的Val，或240位的His），第311位的Cys，第313位的His。
多核苷酸，所述的多核苷酸选自：编码上述技术方案中任一所述的多肽的多核苷酸和与（1）所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
作为优选，所述的多核苷酸编码如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示的多肽。
作为优选，所述的多核苷酸的核苷序列如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19或21所示。
载体，所述的载体含上述技术方案中任一所述的多核苷酸。
作为优选，所述的宿主细胞含有上述的载体，或含有上述技术方案中任一所述的多核苷酸。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：
本发明得到的突变基因所编码的脂肪酶具有更高的水解活性以及对高温的耐受性。
附图说明
图1是本发明考马斯亮蓝测蛋白浓度标准曲线。
图2是 PCR扩增RML基因结果。RML基因全长1020bp，如图中箭头指向。
图3是 RML基因成功克隆于载体pET30a的鉴定。RML基因全长1020bp，如图中箭头指向。
图4是 SDS-PAGE检测RML的表达；M: 蛋白质Marker；Control:未加诱导剂的样品；1，加入IPTG诱导，取菌体离心后的上清为样品，检验是否有分泌表达；2，根据前述步骤，加入IPTG诱导，超声破碎菌体细胞得到样品。脂肪酶RML克隆于载体pET30a后，蛋白表达大小42kD，为胞内表达，而非分泌表达。如图中箭头指向。
图5是SDS-PAGE检测RML纯化结果；蛋白大小42kD，如图中箭头指向。
图6是野生型脂肪酶催化油脂反应释放的产物量随时间的变化，30分钟内通过酸碱滴定所释放的脂肪酸的量随时间增长成线性增长。
图7是对硝基苯酚标准曲线。
图8是易错PCR扩增结果。
图9是定向进化提高脂肪酶活性和热稳定性的趋势图。
图10是Quick Change 法定点饱和突变氨基酸流程图。
图11是Quick Change 定点饱和突变PCR扩增结果。M:DNA Marker; 脂肪酶RML全基因克隆于载体pET30a中，重组质粒全长6442bp，如图中箭头所示。
图12是定点饱和突变技术持续提高脂肪酶活性和热稳定性趋势图。
具体实施方式
下面结合附图1至附图12与实施例对本发明作进一步详细描述：
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的多肽”或“分离的脂肪酶”是指脂肪酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化脂肪酶。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、丝状真菌、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
在本发明中，术语“脂肪酶”包括具有脂肪酶活性的SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示的多肽。该术语还包括具有脂肪酶功能的、SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20或22的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：一个或多个（例如1-10个，最佳地1-5个，更佳地，1-3个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个（通常为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。优选所述变异形式包括一个或多个（例如1-10个，最佳地1-5个，更佳地，1-3个）保守性取代。“保守性取代”是利用具有相似侧链的一种氨基酸残基替代另一种氨基酸残基。具有相似侧链的家族在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
应理解，对于本发明SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20或22的变异形式，优选的是它们保留了本发明所特别指出的突变位点上的突变。“保留”在本文中指本发明多肽的变异形式除具有本发明所特别指出的突变位点上的突变外，还含有其它变异，例如在其它一个或多个（优选1～5个，更优选1～3个）位点上发生如前文所述的插入、缺失或突变。例如，本发明多肽的变异形式至少保留第48位残基为Val，第67位残基为Ala，第311位为Ser。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第48位残基为Val，第67位残基为Ala，第311位为Ser和第168位为Pro。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第48位残基为Val，第67位残基为Ala，第311位为Ser和第240位为Thr。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第48位残基为Val，第67位残基为Ala，第311位为Ser，第168位为Pro和第240位为Thr。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第48位残基为Val，第67位残基为Ala，第311位为Ser，第78位为Thr，第190位为Asp，第313位为Val 等。
此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。本发明的脂肪酶的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17或19所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20或22的蛋白质，但与SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19或21所示的编码区序列有差别的核酸序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度在15-50个核苷酸，较好是15-30个核苷酸之间。核算片段可用于核酸的扩增技术（如PCR）以确定和/或分离编码脂肪酶的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的脂肪酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当待扩增的序列较长并希望引入突变时时，本发明选择采用Quick-Change法进行PCR扩增，此时需要一对交错部分重叠的引物。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或脂肪酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。优选的，本发明的载体是表达载体。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的脂肪酶。一般来说有以下步骤：
（1）用本发明的编码脂肪酶的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
（2）在合适的培养基中培养的宿主细胞
（3）从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码脂肪酶的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；丝状真菌细胞、或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理或者利用专门制备超级感受态的缓冲液处理，所用的步骤在本领域的分子克隆技术操作方面都有详尽的介绍。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
本发明采用的高通量筛选方法是水解pNPP法，反应体系的总体积通常为少于高通量筛选用多孔板每个孔的容积。因此，可根据待加入的酶液体积和孔容积选择适当的反应体系体积。通常，酶液量从5微升到100微升都可用于pNPP法检测酶活。本发明中的高通量筛选反应还包括在某一实施例中，将酶液于70oC处理2小时后再用于反应体系。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。
实施例1
脂肪酶的克隆表达及目标蛋白比活力的测定
1.1.1 材料
1.1.1.1目的基因、菌株与质粒
来源于真菌米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）的脂肪酶基因（包括编码前导肽部分）由上海闪晶分子生物科技有限公司合成；克隆及表达质粒pET30a，pET22b，pET32a和宿主菌E.coli BL21购于Novagen(WI)公司(Wisconsin, USA)。所用菌株均在相应培养基中添加相应的抗生素进行37℃摇床培养。
1.1.1.2工具酶
PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 购于Takara公司，制品包括：PrimeSTARTM HSDNA Polymerase，PrimeSTARTM Buffer（包括Mg2+）以及dNTP。限制性内切酶EcoRI、NotI、HindIII、NcoI以及T4DNA快速连接酶均购于生工生物工程（上海）有限公司。
1.1.1.3试剂
PCR Cleanup试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶纯化试剂盒购于axygen公司，PCR引物由上海英俊生物公司合成，其他试剂均为国产分析纯。
LB培养基：
1%蛋白胨、0.5%酵母粉，1%NaCl。用NaOH调pH7.2，120oC灭菌备用。（固体培养基在LB培养基中添加1.5-2%琼脂）。
1.1.1.4主要仪器
PCR仪；凝胶成像系统；高速冷冻离心机；水平电泳系列；垂直电泳系列；恒温金属浴；生化培养箱；恒温摇床；超声破碎仪；生物安全柜
1.1.2 实验方法
1.1.2.1 琼脂糖凝胶电泳
所配试剂：
10×TBE：108gTris base、55g硼酸、40ml 0.5mol/l EDTA (pH8.0)，定容1L
6×上样缓冲液：50%甘油、0.25% bromophenol blue、0.25% xylene cyanol FF、1mmol/L EDTA (pH8.0)。
实验方法:
(1)称量0.2g琼脂糖倒入锥形瓶中，加入0.5×TBE buffer 20ml;
(2)微波炉中加热煮沸至琼脂糖完全溶解后，室温放置到50oC左右，加入2μl DNAGreen染色剂，摇匀后倒入两端已封口并且已经放置好梳子的电泳槽中；
(3)带琼脂糖凝固后，取走梳子，将凝胶板放入电泳槽中，根据正、负极放好，将5μlDNA样品与1μl上样缓冲液混匀后加入胶孔中，接通电源，以10V/cm的电压进行DNA的电泳分析。
1.1.2.2质粒的提取与纯化
所配试剂：均有质粒提取试剂盒自带
实验方法：按千分之一的接种量将含有目标质粒的宿主菌接入到5mlLB培养液中（含有相对应的抗生素，比例为千分之一），37oC，200r/min培养12-16小时，然后参照Plasmid extraction kit说明书处理菌液，进行质粒的提取及纯化。
1.1.2.3 扩增目的基因的引物设计
（1）带有前导肽及去掉前导肽的目的基因的PCR引物设计
由于合成得到的基因是由前导肽（70个氨基酸）和蛋白的成熟区（270个氨基酸）构成的，因此首先要研究前导肽对目标蛋白的表达的影响，据此，设计扩增目标基因的引物时，应分为带有前导肽的扩增引物以及去掉前导肽的扩增引物。
引物设计见表1。
（2）克隆载体的选择与引物设计和合成
该实施案例中，选用常用的大肠杆菌表达载体pET30a为克隆载体，通过Primer软件，对目标基因进行引物设计（包括酶切位点和保护碱基），见表1。
表1 用于扩增目的基因的PCR引物设计
载体 上引物 下引物 酶切位点
pET30a 5‘GCGGAATTCGGTGCCAATCAAGAGACAATC3’ 5’GCGAAGCTTTTAATGGTGGTGATGATGGT3’ EcoRI+HindIII
1.1.2.4 PCR反应体系及程序设置
PCR反应体系：
5×DNA polymerase buffer 10μl （含有Mg2+）
dNTPs (10mmol/L) 4μl
Forward primer (50μmol/L) 1μl
Reverse primer (50μmol/L) 1μl
含有目的基因的重组载体模板1μl（10pg/μl）
PrimeSTARTM HS DNA Polymerase (2.5 U/μl) 0.5μl
加ddH2O至总体积为50μl
PCR反应程序：(3 Step法，共35个循环)
Step one：98℃预变性10 sec
Step two：55℃退火5sec-15sec
Step three：72℃延伸1min
循环全部结束后于4℃保温
1.1.2.5脂肪酶基因的纯化、酶切以及与载体的连接
纯化：
所配试剂：均由Cleanup纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒自带
方法：由PCR扩增得到的基因通过PCR-Cleanup kit直接进行纯化或者选用 DNAextraction kit试剂盒进行割胶回收纯化（方法步骤根据试剂盒自带的protocol进行操作）。
酶切：
根据所设计的PCR引物的酶切位点进行双酶切反应，同时，将需要连接的质粒也采用同样的内切酶进行双酶切反应。
酶切体系(40μl)：
PCR产物或质粒DNA：29μl
10×Tango buffer缓冲液：8μl
内切酶1：1.5μl
内切酶2：1.5μl
在37oC条件下，酶切体系保温3-4小时。
酶切产物纯化：
所配试剂：均由凝胶纯化试剂盒自带
方法: 将酶切产物与4.4μl0×loading buffer上样缓冲液进行混合后，进行凝胶电泳，通过割胶回收的方法，分别纯化回收PCR酶切产物与质粒酶切产物。割胶回收纯化方法根据凝胶回收试剂盒自带说明进行。
连接：
将割胶回收的酶切产物进行电泳后，大致计算浓度，以PCR产物：质粒为1:5的浓度进行连接，其中加入0.5μl的T4DNA快速连接酶（5U/μl）以及1μl连接酶缓冲液，最后加ddH2O补足至10μl，22oC下连接1小时，以用于下一步的转化。
1.1.2.6 大肠杆菌BL21普通感受态的制备以及转化
所配试剂：
CaCl2溶液：60mmol/l CaCl2、15%甘油（pH7.2），121oC灭菌后4oC保存。
方法：
感受态细胞的制备：
（1）挑取细菌单菌落接种到5ml LB培养基中，37oC震荡培养12-16小时；
（2）取2ml培养物接种到200ml LB培养基/500ml三角瓶中，37oC震荡培养基至OD600为0.3-0.4；
（3）将培养物转移到50ml离心管中，冰上放置20min;
（4）4oC、3000rpm离心5min，收集菌体，弃去上清液；
（5）用10ml预冷的CaCl2溶液重悬菌体，4oC、3000rpm离心5min；
（6）用10ml预冷的CaCl2溶液重悬菌体，冰浴30min;
（7）分装100μl到eppendorf管中，立即投入液氮中，再于-80oC保存，备用。
感受态细胞的转化：
（1）准备PCR连接产物以及质粒自连的对照连接产物（该体系中，用ddH2O代替PCR产物）;
（2）取两管100μl的感受态细胞，在冰上融化；
（3）将10μl的PCR连接产物与质粒自连产物分别加入到感受态细胞中，轻轻用枪混匀；
（4）冰浴20-40min;
（5）42 oC热击90s，迅速放入冰中，冰浴5min;
（6）添加1mlLB培养基，37oC，200rpm震荡培养40-50min；
（7）取200-300μl培养液涂布于含有相应抗生素的LB培养基平板上，于37oC培养箱培养30min后，倒置培养过夜。
1.1.2.6 重组子的鉴定
（1）从转化平板上挑取单菌落接种于5mlLB培养基中，37oC振荡培养6-8小时，进行质粒提取；
（2）根据PCR引物的设计，以相同的内切酶进行酶切（反应体系见上）3小时，将酶切产物进行凝胶电泳，检测目的基因的存在。
（3）保存阳性克隆，用于今后使用。
1.1.2.7目标蛋白的诱导表达
所配试剂：
100mmol/LIPTG(溶于DMSO中)；
PBS：NaCl 8g/l, KCl 0.2g/l, Na2HPO4•12H2O 3.63g/l,KH2PO4 0.24g/l,pH7.4。
Tris-HCl 缓冲液：50mmol/L Tris-HCl (pH8.0)
实验方法：
（1）将阳性克隆挑取到5ml含抗生素的LB培养基的试管中，培养12-16小时，后以2%的接种量转接于含50ml含抗生素的LB培养基的250ml摇瓶中于37oC进行培养；
（2）待菌液OD600值达到0.5左右时，加入0.1mmol/L的IPTG于16oC条件下诱导16-20个小时；
（3）次日，离心收集菌体，并用PBS（pH7.4）进行洗涤，离心后收集菌体，溶于4ml的50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液中，进行超声破碎；
（4）破碎后进行离心（4000rpm,10min）,目的蛋白则溶于上清液中，取其中得的10μl与30μl 4×的蛋白质上样缓冲液进行混匀后，进行SDS-PAGE蛋白质电泳。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，进行凝胶成像系统查看结果。
1.1.2.8 SDS-PAGE蛋白电泳
所配试剂：
10%APS；10%SDS
4×蛋白质电泳上样缓冲液：200mmol/L Tris-HCl (pH6.8)、8%SDS、0.04%溴酚蓝、40%甘油、400mmol/L DDT, 4oC保存；
10×蛋白质电泳电极缓冲液：Tris 6g、Glycine 28.8g、SDS10g、pH8.3，定容1L；
30%胶母液：30% Acrylamide、0.8%bis；
分离胶缓冲液（pH8.8）：3.0mmol/L Tris；
浓缩胶缓冲液（pH6.8）：1.0mol/L Tris；
考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250 1.0g、甲醇500ml、冰醋酸100ml，定容1L；
脱色液：甲醇50ml，醋酸75ml，定容1L；
分离胶与浓缩胶配方见表1：
表1：SDS-PAGE蛋白电泳中分离胶和浓缩胶的配方
试剂 12%分离胶 5%浓缩胶
H2O 3.5ml 2.1ml
30%胶母液 3ml 0.5ml
分离（浓缩）胶缓冲液 0.9ml 0.37ml
10%SDS 75μl 25μl
10%APS 60μl 20μl
TEMED 5μl 5μl
实验方法：
电泳前准备：
（1）装板；
（2）配分离胶（采用15%凝胶）
（3）将配好的分离胶溶液混匀后，立即灌于胶中；
（4）在分离胶上覆盖一层异丙醇（约200μl），室温放置约2小时左右，使分离胶完全聚合；
（5）倒去异丙醇，用水清洗，吸干多于水分后，配制浓缩胶；
（6）将浓缩胶溶液混匀后，立即灌入胶中，并插上梳子，注意不能产生气泡；
（7）室温放置约半小时，等浓缩胶完全聚合后，用蒸馏水洗涤，然后在上、下电泳槽中加入1×SDS电泳缓冲液反复清洗加样孔后，在上、下电泳槽中加入1×SDS电泳缓冲液。上槽的1×SDS电泳缓冲液要高过凝胶加样孔。
电泳操作：
（1）将30μl的蛋白溶液与10μl的4×SDS上样缓冲液混合，100oC处理5min，离心后取上清；
（2）将样品加入加样孔中，将电压调至100V开始电泳，当样品进入浓缩胶后加大电压为150V直至电泳结束；
（3）小心取出胶，割去浓缩胶后将分离胶部分浸泡在考马斯亮蓝R520溶液中，平缓摇动约1小时，将染液回收，再用脱色液进行脱色，更换几次脱色液后并脱色过夜；
（4）将SDS-PAGE电泳放于凝胶成像系统中，查看结果。
1.1.2.9 Bradford法测定蛋白浓度
所配试剂：
标准蛋白质溶液，用g-球蛋白或牛血清蛋白（BSA），配置成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液；
考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%磷酸，用水稀释至1升。
实验方法：
（1）将玻璃比色皿事先浸泡在95%乙醇中清洗，然后小心用镊子夹取，用吹风机烘干。（注意：不可使用石英比色皿，因其染色后不易洗去，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。）然后在其中加入1.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，于595nm处测量吸光值，作为空白对照。
（2）分别选取不同浓度的蛋白标准品（0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml）20μl,小心加入上一步中提到的加有考马斯亮蓝的比色皿中，轻轻混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除），待蓝色均匀分布整个比色皿后，于595nm处读取数值，则为该浓度下所对应的蛋白吸光值。
（3）以OD595数值为横坐标，用标准蛋白质浓度（mg/ml）为纵坐标作图，即得到考马斯亮蓝测蛋白质浓度的标准曲线。（见图1）
1.1.2.10 目标蛋白的纯化
所配试剂：
结合缓冲液(pH7.4):Na3PO4·12H2O(20mM),NaCl(0.5M),咪唑（20mMol）
洗脱缓冲液(pH7.4):Na3PO4·12H2O(20mM),NaCl(0.5M),咪唑（0.5M）
实验方法：
（一）待纯化目标蛋白样品的处理
1.按照前述处理菌体的方法，通过超声破碎得到粗酶液；
2.将粗酶液分装于2ml eppendorf管中，于13000rpm离心5-10min，进一步分离可溶性蛋白和包涵体及细胞碎片；
3.收集离心后的上清液，用水溶性过滤器过滤，纯化样品；
（二）纯化带组氨酸标签蛋白
1.将Ni2+装于蛋白纯化仪上；
2.用3倍体柱体积的无菌水冲洗填充树脂；
3.用3倍柱体积的结合缓冲液（pH7.8）平衡树脂；
4.将树脂上的结合缓冲液引流到柱顶部；
5.将细胞裂解液上清进行上柱，流速调整为每小时10个柱体积；
6.用6个柱体积的结合缓冲液（pH7.8）洗柱；
7.用4个柱体积的洗脱缓冲液（pH6.0）洗柱，直到A280<0.01；
8.用6个柱体积的10mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱结合蛋白，每份1ml分布收集，检测A280的值；
9.用更高浓度咪唑洗脱缓冲液洗脱，每份1ml分布收集，检测A280的值；
10.将收集获得的蛋白进行12%的SDS-PAGE进行电泳，分析聚组氨酸标签蛋白的分布。
11.采用1.1.2.9所述的Bradford法测定重组蛋白的浓度。
1.1.2.11 目标蛋白活性的测定
所配试剂：
橄榄油乳化液：将橄榄油和聚乙烯醇溶液（0.02kg/l）按照1:4的比例进行超声乳化，得到橄榄油乳化液，为酸碱滴定的底物。
磷酸盐缓冲液：50 mM, pH 8.5
NaOH溶液：25 mM（溶于30%的ddH2O和70%的无水乙醇）
酚酞：10g/l (溶于95%乙醇)
实验方法：
获得粗酶液后，采用固化Ni2+层析柱对目标蛋白进行分离纯化，主要采用酸碱滴定法来检测纯蛋白的比活。由1.1.2.10得到的纯蛋白经稀释以使其浓度远远小于底物的浓度，从而使得米式方程在这个反应中有效。
反应体系：底物4ml，缓冲液5ml,混合均匀后于37oC预热5min，加入10ul纯化后的酶液，开始反应，反应15分钟后，加入10ml乙醇终止反应。加入2-3滴酚酞，混匀，用事先配好的NaOH溶液滴定。
1.2 结果
1.2.1 PCR扩增RML基因结果（见图2）
1.2.2阳性克隆的鉴定（见图3）
1.2.3 SDS-PAGE检测RML表达（见图4）
1.2.4 SDS-PAGE 检测RML纯化结果（见图5）
1.2.5野生型RML催化甘油三酯反应的出速率测定
为确保反应条件符合米式方程规定，则在保证参与反应的酶浓度远远小于底物浓度的同时，还需测定在不同反应时间内底物的释放量，从而确定实验反应条件是否符合测得脂肪酶的催化反应初速率的要求，实验结果见表2，变化趋势线见图6。
表2. 不同时间下通过滴定所释放的产物量
WT: wild type. 没有任何突变的目的基因克隆于表达载体pET30a上表达的蛋白
脂肪酶酶活力单位定义为：
每分钟催化底物释放出1μmol脂肪酸的酶量为1个脂肪酶活力单位（U）。
酶活计算公式：
式中： V：滴定样液所消耗的NaOH溶液体积 (ml)
V0：滴定空白样所消耗的NaOH溶液体积 (ml)
t：反应时间 (min)
n：酶液体积 (ml)
M：滴定用的NaOH溶液的浓度 (mmol/l)
样品酶的比活(U/mg)=样品的酶活力（U/ml）/样品的浓度（mg/ml）
经计算，未经改造的野生型RML水解甘油三脂的比活力为150±30U/mg。
实施例2
利用易错PCR定向进化技术提高脂肪酶的活性和热稳定性
2.1 材料与方法：
2.1.1材料
2.1.1.1
菌株：前述实验已构建的重组菌，重组质粒为pET30a-RML,宿主菌为BL21，用于提取质粒DNA做易错PCR的模板。
工具酶：限制性内切酶、T4 DNA快速连接酶购于生工生物工程（上海）有限公司；Taq DNA聚合酶及其配套PCR所需试剂均购于Promega (USA)公司。
2.1.1.2
试剂：均为国产分析纯
细胞裂解液：先配置50mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.0-pH8.5）500ml ,再加入氯化镁（其终浓度达到5mmol/L）,溶菌酶250mg,DNA酶1000U。
溴百里酚蓝和苯酚红指示剂：
用10 mM pH 8.5Tris-HCl溶液配成各0.5 mg/ml 的双指示剂浓度。
醋酸钙溶液：
用10 mM pH 8.5Tris-HCl溶液配50 mM醋酸钙溶液。
Inoue转化缓冲液：
a.0.5mol/L的PIPES（pH6.7）[哌嗪-N.N’-双（2-乙磺酸）]溶液的配制:将15.1gPIPES溶于80ml水中，用5mol/LKOH调pH至6.7。最后加纯水定容至100ml。
（-20oC保存），用预先灭菌处理的过滤器过滤除菌。
b.将下列组分溶于800ml纯水中，然后加20ml0.5mol的PIPES（pH6.7），加纯水定容至1L: MnCl2·4H2O，55mmol/L；CaCl2·2H2O，15mmol/L；KCl，250mmol/L
2.1.1.3主要设备
PCR仪；凝胶成像系统；酶标仪；分光光度计；碱式滴定管；恒温培养箱；恒温摇床；冷冻离心机；超声破碎仪；蛋白纯化仪
2.1.2实验方法：
2.1.2.1BL21超级感受态的制备
（1）准备Inoue转化缓冲液（用前冰上预冷）
（2）挑取一个经37oC培养16-20h平板上的单菌落(BL21)。接种至250ml锥形瓶中有25mlLB培养基中， 37oC摇床（250-300r/min）培养6-8小时。
（3）晚上约6点钟，将上述初始培养物接种于一个盛有125mlLB培养液的500ml锥形瓶中，第一个加500μl,第二个加1ml，第三个加2ml，于18-22oC，200r/min摇床过夜。
（4）次日早晨，测量三瓶培养物的OD600值，每半小时测一次，当其中一瓶的OD600值达到0.55时，将培养瓶置于冰上20min，弃去另两瓶培养物。
（5）于4oC，4000r/min离心10min收集菌体。
（6）倒去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体，加40ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬细菌沉淀（轻轻旋转吹打，不要用振荡器）。
（7）于4oC，4000r/min离心10min收集菌体。
（8）用10ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬细菌沉淀。
（9）加入0.75mlDMSO，轻轻婚约细菌沉淀，放置冰上10min。
（10）迅速将悬液分装到冷却的无菌的eppendorf管中，封紧管口，投入液氮中快速冰冻感受态细胞，-80 oC备用。
2.1.2.2 易错PCR与突变文库的建立
PCR引物：Forward primer: 5’-CGCGCCATGGTGCCAATCAAGAGACAA
TC-3’，NcoI；Reverse primer: 5’-GCCGAAGCTTAAGTACAGAGGCCTGTG
T-3’,HindIII;PCR体系：准备7支PCR管，每管中PCR体系为50μl，其中质粒DNA模板1μl (约为10pmol)，上游引物1μl，下游引物1μl，dNTP 1μl，Mg2+ 4μl，Buffer 5μl，酶0.5μl，另在体系中加入Mn2+，使其浓度依次达到
0mmol/L,0.1mmol/L，0.2mmol/L，0.3mmol/L，0.4mmol/L，0.5mmol/L，0.6mmol/L；其余用ddH2O补足，根据DNA凝胶电泳成像结果挑选合适的Mn2+浓度。PCR条件：预变性，95oC，3min，变性，95oC，30S；退火，55oC，50S；延伸，72oC，1min，共35个循环，72oC延伸10min，4oC保温30min。
将PCR产物以1%（W/V）的琼脂糖凝胶电泳，用PCR纯化回收试剂盒进行纯化回收。纯化后的易错PCR产物用限制性内切酶NcoI和HindIII进行3-4小时的37oC的酶切，后与同样经过酶切的pET30a载体进行连接，连接方法和体系见前述。然后将连接产物转化大肠杆菌BL21超级感受态细胞中，涂布于LB（含50mg/ml Kanamycin）平板，37oC培养16-20小时。突变体个数要求达到6000-8000左右。
2.1.2.3 RML脂肪酶突变体的诱导表达
对于RML脂肪酶突变体，采用96微孔板进行表达，方法由Bornscheuer UT 曾报[1]。将LB固体培养平板上的单菌落逐个挑到每个孔含有200μl LB培养基的96孔板中（此板称为母版），于37oC,200r/min转速培养12-16小时，然后以2%
接种量，将母板上每个孔中的菌液接种到新的每个孔都含有500μlLB培养基的96孔微量板中（此板为子板）。同时，母板中每个孔加10%的甘油，-80oC保存以备今后适用。同时，子板于37oC，200r/min摇床中进行培养。待每个孔中菌液的浓度达到OD值为0.5左右，加入IPTG诱导，使其终浓度达到0.1mmol/l。诱导4小时后，经离心、洗涤以后，收集菌体。含有诱导表达菌体的子板放入-80oC过夜后，每个孔中加入250μl的细胞裂解液，放置于37oC 1-2小时，使菌体裂解。此时，由于冷热膨胀，菌体细胞壁破碎，所含有的酶蛋白将释放在液体中。然后4000rpm，4oC离心20分钟，目标蛋白即溶于上清中，将其在4oC保存，用于之后测定反应。
2.1.2.4 突变体对油脂催化活性的初筛（高通量筛选方法）
采用经典的pNPP法进行突变体活性的高通量筛选。原理是：
（1）脂肪酶酶活性单位的定义在温度为37℃，pH值8.0的条件下，样品水解底物对-棕榈酸硝基苯酯出1μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
（2）脂肪酶活力测定标准曲线的绘制
（3）称取0.1391 g pNP,溶于50 mL异丙醇中配成20 mmol/L的母液，取10 mL母液用异丙醇准确定容至100 mL，即为2.0 mmol/L的工作液。各种试剂的加量见表3。制作标准曲线时的反应体积和反应条件与试验中测定样品酶活的条件相一致。
（4）表中各种溶液混合后，在37℃水浴锅内处理15 min，加入95%乙醇2 mL。7,000rpm离心2min，上清液在410 nm处测定吸光值(蒸馏水调零)。根据测定结果绘制对硝基苯酚标准曲线，如图3所示。并计算出吸光度值和pNP含量的相关公式Y=aX+b(Y：pNP浓度，X：吸光度值，a，b：反应系数)
表3 测定对硝基苯酚标准曲线各试剂用量的变化
编号 1 2 3 4 5 6 7 8
2.0mmol/L pNP(uL) 0 7.5 15 30 60 90 120 180
异丙醇(μL) 250 242.5 235 220 190 160 130 70
底物缓冲液(mL) 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25
pNP浓度(μmol/L) 0 6 12 24 48 72 96 144
A410nm 0 0.125 0.13 0.35 0.62 0.82 1.08 1.65
底物缓冲液：
0.2 mol/l NaH2PO4溶液(A液)：称取NaH2PO4 3.12 g，用蒸馏水溶解并定容至100mL。0.2 mol/l Na2HPO4溶液(B液)：称取Na2HPO4·12H2O 71.7 g，用蒸馏水溶解并定容至1000 mL。取A液5.3 mL，B液94.7 mL，混合后加入约280 mL水，加入0.92 g脱氧胆酸钠，0.44g阿拉伯树胶粉，搅拌溶解，用H3PO4或NaOH调节pH值至8.0，定容至400 mL,4℃保存。
以pNP浓度为纵坐标，A410nm为横坐标作图，得出对硝基苯酚标准曲线。（见图7）
（5）由该案例中所得到的对硝基苯酚标准曲线图可看出，随着对硝基苯酚浓度的提高，待测体系在410nm处的吸光值也依次增加，线性关系很好。因此，可以利用这一良好的线性关系将该方法用于高通量筛选。以pNPP为底物，利用脂肪酶对其的水解作用，可释放出pNP，酶活力越高，释放出的pNP的浓度越高，则在410nm处的吸光值就越高，然后根据实验结果，可挑出活性较高的脂肪酶。
（6）反应在96孔微孔板中发生。反应体系如下：pNPP溶液2 mL，底物缓冲液18 mL，混合，每个微孔中加入200 uL，酶液加入20-50 uL，反应10-15分钟（在此反应体系中，还包括在加入酶液反应前，将裂解细胞得到的酶液置于70oC烘箱中2/3小时培养，然后再加入到反应体系中，考察酶液的耐高温能力）。
注：底物pNPP溶液(0.0795 mol/L，3mg/mL)：称取0.030 g，加入10 mL异丙醇搅拌溶解，4℃保存。
2.1.2.5突变体对油脂催化活性的复筛
通过高通量筛选每一轮挑出大约20株活性较野生菌相比提高的菌株，采用碱滴定法测定活性，具体操作步骤如实施案例1所述。
反应体系为：
a.4ml橄榄油乳化液：3ml聚乙烯醇（2% W/V），1ml橄榄油混合，先于混合震荡仪上震动混匀，再于超声破碎仪中进行进一步乳化，直至形成乳白色乳状体，油、水不再分层。
b.5ml Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液（50mmol/L; pH8.5）；
c.加入10μl酶液（酶液纯化后做反应）（在此反应体系中，还包括在加入酶液
反应前，将破碎细胞得到的酶液置于70oC烘箱中2/3小时培养，然后再加入到反应体系中，考察酶液的耐高温能力）
2.2 实验结果
2.2.1易错PCR结果（见图8）
其中，泳道 1-7：No，0.1mmol/L Mn2+ ，0.2 mmol/L Mn2+ ，0.3 mmol/L Mn2+ ，0.4mmol/L Mn 2+ ，0.5 mmol/L Mn2+，0.6 mmol/L Mn2+。 从图中可以看出，随着体系中加入Mn2+的浓度变大，PCR的条带依次变暗，若选择Mn 浓度过大的PCR条件，则PCR亮度不够，且不能保证突变平衡，有过高的突变，导致表达蛋白活性下降；若选择Mn2+浓度过低的PCR条件，则没有保证一定的突变率，因此，综上分析，选择Mn2+浓度为 0.3mmol/L为理想突变浓度。
2.2.2 定向进化结果
通过上述初筛和复筛，本发明筛选到一系列突变的脂肪酶，根据上文所述方法纯化得到这些脂肪酶，并对其进行测序和活性测定。
活性测定结果及基因突变结果如表4所示：
表4 定向进化提高脂肪酶活性和热稳定性结果
野生型脂肪酶的核苷酸序列见SEQ ID NO:1，氨基酸序列见SEQ ID NO:2。
该案例中，得到4种脂肪酶RML的突变基因，其对甘油三酯的水解能力以及热稳定性较野生型脂肪酶基因相比，均有明显提高，其中，定向进化第三轮得到的突变体，蛋白比活是野生型的11.71倍，将该蛋白的酶溶液置于70oC下培养二小时，测得其比活仍可达到1110±50 U/mg ,而野生型的酶溶液经热处理后，是没有活性的。脂肪酶RML活性和热稳定性的趋势变化见图9。
然而，定向进化对基因的改造都会逐渐达到平台期，实验中也发现，继续下一轮的定向进化，无论活性还是热稳定性都没有明显的提高。然而，定向进化带来的另一个好处是，我们可以得到一些比较敏感的氨基酸位点，其的替换可以影响整个蛋白的结构和功能，这就是常说的“hot spot”。因此，根据以上三轮定向进化的结果，加以RML三级结构分析，我们选择了一些点进行定点饱和突变，以期能够达到蛋白活性和热稳定性持续提高的目的。
实施例3
利用定点饱和突变技术持续提高脂肪酶的活性和热稳定性
3.1材料与方法
3.1.1 材料
3.1.1.1 菌株与质粒
野生型水解甘油三酯的脂肪酶由第二章中所述的实验部分获得，宿主菌E. coliBL21与E. coli DH5α（DE3）购于Novagen (WI) 公司(Wisconsin，USA)。
3.1.1.2 工具酶
PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 购于Takara公司，内切酶Dpn I购于生工生物工程（上海）有限公司。
3.1.1.3 试剂
PCR所用的Mg2+、dNTP购自大连宝生物公司；DL-2000 DNA marker、1kb DNAmarker、SDS-PAGE 蛋白质Marker购自上海生工生物工程公司；PCR纯化试剂盒、质粒提取试剂盒以及胶纯化试剂盒均购自Axygen (USA) 公司；PCR引物由上海英骏生物公司合成；HisTrap HP Ni2+蛋白纯化柱购于GE Healthcare。其它试剂为国产化学纯或分析纯药品。
LB培养基：
1% 蛋白胨、0.5% 酵母粉、1%NaCl。用NaOH调pH至7.3，121°C 灭菌备用。（固体培养基在LB培养基中添加1.5-2%琼脂）。
3.1.1.4 主要仪器
PCR仪 (LongGene MGL96G)，
凝胶成像系统 (JS-380B)
水平电泳系列 (Tanon EPS 300)
垂直电泳系列 (Tanon EPS 300)
恒温金属浴 (Sanhao CMB100)
生化培养箱 (DNP-9162)
恒温摇床 (HuaLiDa HZ-9310K-A)
超声破碎仪 (JY92-Ⅱ)
生物安全柜 (BSC-1300ⅡAz)
AKTA蛋白纯化仪 (AKTAPrime 11-0031-18)
真空浓缩仪 (LNG-T83)
分光光度计 (WFZ-UV2800H)
3.1.2实验方法
3.1.2.1重组质粒pET30a-RML的提取与纯化
将重组质粒pET30a-RML从大肠杆菌BL21中提取出来，再转入大肠杆菌DH5α中，使其甲基化后再提取出来，用作定点突变的PCR模板。
试剂：均由质粒提取试剂盒自带
实验方法：
质粒pET-30a（+）的提取直接采用Plasmid extraction kit 进行提取和纯化，方法根据试剂盒自带的Protocol说明进行操作。
3.1.2.2 琼脂糖凝胶电泳
所用试剂与方法同1.1.2.1所述。
3.1.2.3 定点饱和突变
实验中所用的定点饱和突变的方法是较经典、研究较为成熟的Quick Change法，其主要原理是以含有目的基因片段的重组质粒为PCR模板，根据所要突变的氨基酸碱基上下游的基因序列信息，设计定点突变的一对引物，从而通过PCR直接得到带有突变点的目的基因片段的重组质粒。具体流程见图10。
图10所述的方法仅需一次PCR即可得到目的基因产物，并且该目的基因在得到预计突变的同时也已经连接在了克隆载体上，不再需要通常克隆手段中的没切、连接等步骤。工作量和成本都较小，省时省力。然而由于其引物完全互补，在nick缺口处不能在此扩增，因此其理论最大扩增速度只能达到线性扩增速度，而远远低于普通PCR的指数扩增速度。本实验中的定点突变设计方法参考了Quick-ChangeTM定点突变试剂盒提供的简便定点突变法，同时做了优化。设计了两条部分互补的引物，并且根据PCR 5'至3'的延伸特点，要保证两条引物都是3’端游离，这样的设计可以避免nick缺口引起的扩增速度的限制，使得经过约30轮PCR循环即可得到足够浓度的产物以用于核酸电泳的检测。
需要注意的是，在使用此法时，必须使用从大肠杆菌DH5α等dam+菌株中提取的模板质粒。只有这样的质粒才有可被限制性内切酶DpnI识别的甲基化位点，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样使用甲基化酶DpnI处理后，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来，从而确保从转化子中挑取阳性突变子的较高概率。
由于本章实验所需的模板质粒为第二章中所得的大肠杆菌BL21中的重组质粒，因此，需要先将其提取并转入大肠杆菌DH5α菌株中再提取出来后方可用作后续PCR的模板。
实验中要注意以下几点要求：
(1)准备突变的质粒必须是甲基化的，因为只有被甲基化的酶切位点才能被Dpn I酶消化
(2)引物是一对包含突变位点的互补的核苷酸链，而且要比一般的PCR引物（18bp-21bp）长，一般要在25bp以上，因为引物中含有突变位点，和模板不能完全匹配。并且引物的突变位点任何一侧都必须满足4×（GC 碱基数）+2×(AT碱基数)≧45，但引物也不宜过长，否则通常会形成非常稳定的二级结构，此外，尽量把引物的GC含量控制在40%-60%。
(3)必须使用高保真的DNA聚合酶，保证碱基信息的扩增准确度。
(4)PCR延伸步骤时间要充足，有时需要适量增加酶量以补充长时间高温下的酶活力损失。
(5)PCR产物要用限制性内切酶DpnI充分酶切消化，以提高突变检出率。
根据以上所述要求，并利用Primer软件，进行引物设计如表5所示：
表5 定点饱和突变引物设计
PCR反应体系：
5×DNA polymerase buffer 10μl
dNTPs (10 mmol/L)4μl
引物3(10μmol/L)1μl
引物4(10μmol/L)1μl
重组质粒模板：约10 ng
Prime STAR HS DNA polymerase (2.5 U/μl) 0.5μl
加ddH2O至总体积为50μl。
PCR反应程序：
Step one:
98°C预变性3min,
Step two：（30 cycles）
98°C变性10s，55°C退火5s, 72°C延伸7min
Step three：72°C 10min
4°C冷却。
3.1.2.4 突变体的纯化与野生型模板的消化
突变体PCR扩增产物的纯化：
所配试剂：
由PCR纯化试剂盒自带提供。
方法：
由PCR所获得的各脂肪酶酶突变体的扩增子，通过PCR-Cleanup kit直接进行纯化（根据试剂盒自带的protocol进行操作）。
Dpn I消化野生型模板：
PCR产物：10μl (5-10μg)
10×缓冲液：2μl
DpnI：1μl
用ddH2O补足至20μl
在37°C条件下，酶切反应1 h。
Dpn I消化完毕后，可直接用于转化，或者-20oC保存备用。
3.1.2.5感受态细胞的制备与突变文库的构建
感受态细菌的转化效率必须至少在107以上，否则很难得到克隆。因此也要制备超级感受态。具体方法参照2.1.2.1。根据所使用的感受态细菌，加入尽量多的经过Dpn I消化后的突变产物用于转化。通常每100μl感受态细胞中可以加入5-10μl经过Dpn I消化后的突变产物。具体转化方法参照1.1.2.6。
3.1.2.6 RML脂肪酶突变体的诱导表达
由3.1.2.5得到了RML脂肪酶突变体文库，用2.1.2.3所述的方法对其进行诱导表达。
3.1.2.7 RML脂肪酶突变体的初筛
用2.1.2.4所述的高通量筛选方法进行脂肪酶活性和热稳定性的初筛。
3.1.2.8 RML脂肪酶突变体的复筛
用2.1.2.5所述的碱式滴定法进行脂肪酶活性和热稳定的复筛，并计算出脂肪酶突变体的比活。
3.2 实验结果
3.2.1 Quick Change定点饱和突变PCR扩增结果（见图11）
3.2.2 突变体筛选结果
通过上述初筛和复筛，本发明筛选到一系列突变的脂肪酶，根据上文所述方法纯化得到这些脂肪酶，并对其进行测序和活性测定。
活性测定结果及基因突变结果如表6所示：
表6 定点饱和突变技术持续提高脂肪酶活性和热稳定性结果
以实施案例2中得到的HAHT5为模板，对氨基酸67位，240位进行定点饱和突变，得到HAHT6，HAHT7，HAHT8，HAHT9和 HAHT10 这5个突变体，其在自然条件下对油脂的水解催化活性以及热处理后对油脂的水解催化活性较野生型脂肪酶都有不同程度的提高。
脂肪酶RML活性及热稳定性趋势图见图12。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
<110> 浙江大学
<120>分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞
<210>1
<160>1020
<212>DNA
<213>米黑霉（Rhizomucor miehei）
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggatgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggt ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt ttcatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgttc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa acctctgatt gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagtg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210> 2
<160>339
<212>PRT
<213>米黑霉（Rhizomucor miehei）
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser
1 5 10 15 20
Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met
25 30 35
Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala
40 45 50 55
Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala
60 65 70 75
Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser
80 85 90 95
Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr
100 105 110 115
Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met
120 125 130 135
Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
140 145 150 155
Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val
160 165 170 175
His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
180 185 190 195
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
200 205 210 215
Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser
220 225 230 235
Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr
240 245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
260 265 270 275
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser
280 285 290 295
Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile
300 305 310 315
Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys
320 325 330 335
Thr
<210> 3
<160>1020
<212>DNA
<213>突变的脂肪酶HAHT1的编码序列
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggttgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggc ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt ttcatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgttc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa tcctctgatt gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagcg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210> 4
<160>339
<212>PRT
<213>突变的脂肪酶HAHT1的氨基酸序列
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser
1 5 10 15 20
Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met
25 30 35
Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Val Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala
40 45 50 55
Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Ala Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala
60 65 70 75
Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser
80 85 90 95
Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr
100 105 110 115
Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met
120 125 130 135
Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
140 145 150 155
Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val
160 165 170 175
His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
180 185 190 195
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
200 205 210 215
Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser
220 225 230 235
Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr
240 245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
260 265 270 275
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser
280 285 290 295
Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Ser Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile
300 305 310 315
Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys
320 325 330 335
Thr
<210> 5
<160>1020
<212>DNA
<213>突变的脂肪酶HAHT2的编码序列
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggttgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggc ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt tccatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgttc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa tcctctgatt gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagcg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210> 6
<160>339
<212>PRT
<213>突变的脂肪酶HAHT2的氨基酸序列
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser
1 5 10 15 20
Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met
25 30 35
Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Val Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala
40 45 50 55
Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Ala Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala
60 65 70 75
Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser
80 85 90 95
Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr
100 105 110 115
Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met
120 125 130 135
Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
140 145 150 155
Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Pro Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val
160 165 170 175
His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
180 185 190 195
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
200 205 210 215
Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser
220 225 230 235
Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr
240 245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
260 265 270 275
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser
280 285 290 295
Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Ser Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile
300 305 310 315
Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys
320 325 330 335
Thr
<210> 7
<160>1020
<212>DNA
<213>突变的脂肪酶HAHT3的编码序列
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggttgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggc ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccacagtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt tccatatcct ccggtcagag gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgttc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa tcctctgatt gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagcg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210> 8
<160>339
<212>PRT
<213>突变的脂肪酶HAHT3的氨基酸序列
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser
1 5 10 15 20
Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met
25 30 35
Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Val Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala
40 45 50 55
Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Ala Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala
60 65 70 75
Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser
80 85 90 95
Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Ser Asp Ala Thr
100 105 110 115
Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met
120 125 130 135
Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
140 145 150 155
Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Pro Tyr Pro Pro Val Arg Gly Thr Lys Val
160 165 170 175
His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
180 185 190 195
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
200 205 210 215
Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser
220 225 230 235
Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr
240 245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
260 265 270 275
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser
280 285 290 295
Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Ser Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile
300 305 310 315
Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys
320 325 330 335
Thr
<210> 9
<160>1020
<212>DNA
<213>突变的脂肪酶HAHT4的编码序列
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggttgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggc ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gttacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt tccatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaagac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgttc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa tcctctgatt gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagcg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210> 10
<160>339
<212>PRT
<213>突变的脂肪酶HAHT4的氨基酸序列
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser
1 5 10 15 20
Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met
25 30 35
Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Val Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala
40 45 50 55
Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Ala Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Thr
60 65 70 75
Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser
80 85 90 95
Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr
100 105 110 115
Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met
120 125 130 135
Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
140 145 150 155
Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Pro Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val
160 165 170 175
His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asp Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
180 185 190 195
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
200 205 210 215
Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser
220 225 230 235
Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr
240 245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
260 265 270 275
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser
280 285 290 295
Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Ser Ser Val Cys Ser Asn Ser Ile
300 305 310 315
Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys
320 325 330 335
Thr
<210> 11
<160>1020
<212>DNA
<213>突变的脂肪酶HAHT5的编码序列
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggttgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggc ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt tccatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgtcc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa tcctctgatt gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagcg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210> 12
<160>339
<212>PRT
<213>突变的脂肪酶HAHT5的氨基酸序列
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser
1 5 10 15 20
Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met
25 30 35
Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Val Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala
40 45 50 55
Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Ala Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala
60 65 70 75
Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser
80 85 90 95
Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr
100 105 110 115
Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met
120 125 130 135
Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
140 145 150 155
Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Pro Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val
160 165 170 175
His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
180 185 190 195
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
200 205 210 215
Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser
220 225 230 235
Asn Leu Ser Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr
240 245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
260 265 270 275
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser
280 285 290 295
Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Ser Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile
300 305 310 315
Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys
320 325 330 335
Thr
<210> 13
<160>1020
<212>DNA
<213>突变的脂肪酶HAHT6的编码序列
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggttgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggc ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt tccatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgtcc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa tgctctcact gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagcg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210> 14
<160>339
<212>PRT
<213>突变的脂肪酶HAHT6的氨基酸序列
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser
1 5 10 15 20
Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met
25 30 35
Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Val Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala
40 45 50 55
Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Ala Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala
60 65 70 75
Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser
80 85 90 95
Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr
100 105 110 115
Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met
120 125 130 135
Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
140 145 150 155
Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Pro Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val
160 165 170 175
His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
180 185 190 195
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
200 205 210 215
Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser
220 225 230 235
Asn Leu Ser Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr
240 245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
260 265 270 275
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser
280 285 290 295
Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Cys Ser His Cys Ser Asn Ser Ile
300 305 310 315
Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys
320 325 330 335
Thr
<210> 15
<160>1020
<212>DNA
<213>突变的脂肪酶HAHT7的编码序列
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggttgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtgga ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt tccatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgtcc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa tgctctcact gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagcg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210> 16
<160>339
<212>PRT
<213>突变的脂肪酶HAHT7的氨基酸序列
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser
1 5 10 15 20
Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met
25 30 35
Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Val Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala
40 45 50 55
Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Asp Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala
60 65 70 75
Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser
80 85 90 95
Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr
100 105 110 115
Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met
120 125 130 135
Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
140 145 150 155
Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Pro Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val
160 165 170 175
His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
180 185 190 195
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
200 205 210 215
Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser
220 225 230 235
Asn Leu Ser Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr
240 245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
260 265 270 275
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser
280 285 290 295
Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Cys Ser His Cys Ser Asn Ser Ile
300 305 310 315
Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys
320 325 330 335
Thr
<210> 17
<160>1020
<212>DNA
<213>突变的脂肪酶HAHT8的编码序列
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggttgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggc ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt tccatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttggcc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa tgctctcact gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagcg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210> 18
<160>339
<212>PRT
<213>突变的脂肪酶HAHT8的氨基酸序列
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser
1 5 10 15 20
Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met
25 30 35
Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Val Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala
40 45 50 55
Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Ala Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala
60 65 70 75
Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser
80 85 90 95
Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr
100 105 110 115
Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met
120 125 130 135
Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
140 145 150 155
Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Pro Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val
160 165 170 175
His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
180 185 190 195
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
200 205 210 215
Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser
220 225 230 235
Asn Leu Ala Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr
240 245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
260 265 270 275
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser
280 285 290 295
Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Cys Ser His Cys Ser Asn Ser Ile
300 305 310 315
Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys
320 325 330 335
Thr
<210> 19
<160>1020
<212>DNA
<213>突变的脂肪酶HAHT9的编码序列
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggttgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggc ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt tccatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttggtc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa tgctctcact gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagcg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210>20
<160>339
<212>PRT
<213>突变的脂肪酶HAHT9的氨基酸序列
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser
1 5 10 15 20
Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met
25 30 35
Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Val Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala
40 45 50 55
Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Ala Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala
60 65 70 75
Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser
80 85 90 95
Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr
100 105 110 115
Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met
120 125 130 135
Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
140 145 150 155
Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Pro Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val
160 165 170 175
His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
180 185 190 195
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
200 205 210 215
Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser
220 225 230 235
Asn Leu Val Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr
240 245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
260 265 270 275
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser
280 285 290 295
Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Cys Ser His Cys Ser Asn Ser Ile
300 305 310 315
Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys
320 325 330 335
Thr
<210>21
<160>1020
<212>DNA
<213>突变的脂肪酶HAHT10的编码序列
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggttgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggc ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240
tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300
actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360
attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420
agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480
gatctcacct ttgtgccagt tccatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600
aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660
ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgcac 720
ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780
accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840
gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900
actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa tgctctcact gctctaacag cattgttccc 960
ttcacaagcg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020
<210>22
<160>339
<212>PRT
<213>突变的脂肪酶HAHT10的氨基酸序列
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser
1 5 10 15 20
Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met
25 30 35
Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Val Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala
40 45 50 55
Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Ala Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala
60 65 70 75
Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser
80 85 90 95
Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr
100 105 110 115
Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met
120 125 130 135
Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
140 145 150 155
Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Pro Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val
160 165 170 175
His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu
180 185 190 195
Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly
200 205 210 215
Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser
220 225 230 235
Asn Leu His Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr
240 245 250 255
Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
260 265 270 275
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser
280 285 290 295
Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Cys Ser His Cys Ser Asn Ser Ile
300 305 310 315
Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys
320 325 330 335
Thr
<210>23
<212>DNA
<213>人工序列
引物
GCGGAATTCGGTGCCAATCAAGAGACAATC
<210>24
<212>DNA
<213>人工序列
引物
GCGAAGCTTTTAATGGTGGTGATGATGGT
<210>25
<212>DNA
<213>人工序列
引物
CGCGCCATGGTGCCAATCAAGAGACAATC
<210>26
<212>DNA
<213>人工序列
引物
GCCGAAGCTTAAGTACAGAGGCCTGTGT
<210>27
<212>DNA
<213>人工序列
引物
TATCCTCCGGTCNNNGGTACAAAAGTACACAAGGGATTCCT
<210>28
<212>DNA
<213>人工序列
引物
GACCGGAGGATANNNAACTGGCACAAAGGTGAGATCAGCAA
<210>29
<212>DNA
<213>人工序列
引物
CAAGCGATCTGGAANNNTCTNNNTGCTCTAACAGCATTGTTCCCTTC
<210>30
<212>DNA
<213>人工序列
引物
ATGCTGTTAGAGCANNNAGANNNTTCCAGATCGCTTGTGCAGACCTG
<210>31
<212>DNA
<213>人工序列
引物
CCTATCCGGATTCTGTGNNNCAAGCAATGAGCATTGATGGTGG
<210>32
<212>DNA
<213>人工序列
引物
TCAATGCTCATTGCTTGNNNCACAGAATCCGGATAGGAAGTAG
<210>33
<212>DNA
<213>人工序列
引物
TCTCATCCAGCAACTTGNNNCTTTACACTCAAGGTCAACCACG
<210>34
<212>DNA
<213>人工序列
引物
TGACCTTGAGTGTAAAGNNNCAAGTTGCTGGATGAGAGTCC

Claims (5)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽为SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示氨基酸序列。
2.多核苷酸，其特征在于：所述的多核苷酸选自：编码权利要求1所述的多肽的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于：所述的多核苷酸编码如SEQ IDNO：4、6、8、10、12、14、16、18、20或22所示的多肽。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO：3、5、7、11、13、15、17、19或21所示。
5.载体，其特征在于：所述的载体含有权利要求2-4中任一项所述的多核苷酸。
CN201110309181.2A 2011-10-13 2011-10-13 分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞 Active CN102337253B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110309181.2A CN102337253B (zh) 2011-10-13 2011-10-13 分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110309181.2A CN102337253B (zh) 2011-10-13 2011-10-13 分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102337253A CN102337253A (zh) 2012-02-01
CN102337253B true CN102337253B (zh) 2017-08-22

Family

ID=45513205

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201110309181.2A Active CN102337253B (zh) 2011-10-13 2011-10-13 分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102337253B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161538A (zh) * 2018-09-29 2019-01-08 云南师范大学 一种热稳性提高的脂肪酶突变体及其应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103849636B (zh) * 2012-11-28 2019-03-12 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 编码米黑根毛霉脂肪酶的优化基因、由该基因转化的黑曲霉菌株及其用途
CN103993004A (zh) * 2014-01-21 2014-08-20 舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心 一种简单异尖线虫Ani s4抗原基因的克隆和表达方法
CN106459937B (zh) 2014-05-27 2024-09-10 诺维信公司 用于产生脂肪酶的方法
US10221404B2 (en) 2014-05-27 2019-03-05 Novozymes A/S Method for modifying characteristics of a lipase
WO2015181119A2 (en) * 2014-05-27 2015-12-03 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044804A1 (en) * 1997-04-09 1998-10-15 Danisco A/S Improved method for preparing flour doughs and products made from such doughs using glycerol oxidase
CN1834236A (zh) * 2006-03-31 2006-09-20 清华大学 野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶a变体及其应用
WO2007087508A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 Novozymes A/S Lipase variants
CN102851263A (zh) * 2011-07-01 2013-01-02 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 脂肪酶基因突变库高通量筛选方法和脂肪酶突变基因

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998044804A1 (en) * 1997-04-09 1998-10-15 Danisco A/S Improved method for preparing flour doughs and products made from such doughs using glycerol oxidase
WO2007087508A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 Novozymes A/S Lipase variants
CN1834236A (zh) * 2006-03-31 2006-09-20 清华大学 野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶a变体及其应用
CN102851263A (zh) * 2011-07-01 2013-01-02 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 脂肪酶基因突变库高通量筛选方法和脂肪酶突变基因

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109161538A (zh) * 2018-09-29 2019-01-08 云南师范大学 一种热稳性提高的脂肪酶突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN102337253A (zh) 2012-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102851263B (zh) 脂肪酶基因突变库高通量筛选方法和脂肪酶突变基因
CN102337253B (zh) 分离的多肽、多核苷酸、载体及宿主细胞
CN112980813B (zh) 低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G
CN112725307B (zh) 一种耐热性降低的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4及应用
CN113061591B (zh) 一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用
CN112980814B (zh) 低温适应性提高的外切菊粉酶突变体MutV268Δ13
CN112175980A (zh) 通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法及应用
US20110088121A1 (en) Genes for improving salt tolerance and drought tolerance of plant and the uses thereof
Balabanova et al. An extracellular S1-type nuclease of marine fungus Penicillium melinii
CN102020706B (zh) 一种生物镉抗性相关蛋白及其编码基因
CN104152425A (zh) 一种嗜热酯酶及其在降解PAEs中的应用
Heim et al. Functional expression of a mammalian acetylcholinesterase in Pichia pastoris: comparison to acetylcholinesterase, expressed and reconstituted from Escherichia coli
CN103805617B (zh) 1,3-专一性脂肪酶、其编码基因序列及其用途
CN106635941B (zh) 一种来源于Aquifex aeolicus菌株的嗜热酯酶及其功能验证
CN106834252A (zh) 一种高稳定型MazF突变体及其应用
CN116121215A (zh) 一种甘油磷酸氧化酶的突变体及其用途
Xiong et al. High efficiency and throughput system in directed evolution in vitro of reporter gene
CN112430610B (zh) 低温酯酶功能基因DcaE及其应用
CN105132394B (zh) 一种脂肪酶lipase6及其编码基因和应用
CN108315312A (zh) 一种热稳定性提高的脂肪酶ttl突变体及其编码基因和应用
CN108277212A (zh) 脂肪酶突变体Gly183Cys/Gly212Cys及其基因和应用
Zheng et al. Molecular cloning and heterologous expression of a true lipase in Pichia pastoris isolated via a metagenomic approach
CN106434512B (zh) 一种来源于Aquifex aeolicus菌株的嗜热酯酶及其表达
CN106755195B (zh) 一种由亚洲蜈蚣藻制备卡拉胶寡糖的方法
CN102965356B (zh) 一种重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220419

Address after: 310012 Room 202, building 1, No. 366, Jinpeng street, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province

Patentee after: Hangzhou Xinhai enzyme source Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 310027 No. 38, Zhejiang Road, Hangzhou, Zhejiang, Xihu District

Patentee before: ZHEJIANG University