CN111434693B - 一种抗氧化融合蛋白及应用 - Google Patents
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
Abstract
本发明提供了一种抗氧化融合蛋白及应用，属于抗氧化技术领域，将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后得到抗氧化融合蛋白。本发明提供的抗氧化融合蛋白的抗氧化活性明显高于SOD蛋白，而且对温度、酒精、胃蛋白酶和胰蛋白酶具有耐受性，表明抗氧化融合蛋白可用作口服保健品和化妆品中。
Description
技术领域
本发明涉及抗氧化技术领域，具体涉及一种抗氧化融合蛋白及应用。
背景技术
超氧化物歧化酶SOD，是英文Superoxide Dismutase的缩写，是体内对抗自由基的第一道防线。根据其活性中心结合的金属离子的不同，SOD主要分为三类：铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD，也称为SOD1)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)。其中，Fe-SOD主要存在于原核细胞的基质中。当我们身体吸入氧气进行新陈代谢，就会产生超氧阴离子自由基，若不予以消除，会在体内产生连锁反应破坏细胞。正常情况下，体内自由基的产生和清除处于动态平衡。SOD在年轻人的血液中很多，人们过了30岁以后，人体内的SOD随着人体组织的老化而产生率逐渐降低。由于体内的SOD随着年龄的增加而渐减，再加上环境的恶化，大量的自由基超过身体所能应付的程度，因此借助外来的补充是必需的。
SOD的来源极为广泛，目前已从细菌、真菌、藻类、鱼类、昆虫、植物和哺乳类动物等各种生物体分离得到。国内已开发的SOD资源有：动物血液(牛、猪等)，菌类发酵(酵母菌、大肠杆菌等)，高等植物(藻类、刺梨等)等。动物提取SOD的主要原料可以是各种哺乳动物血液、肝脏、脑等，然而一些人畜共患病的原因使得许多国家禁止在食品、化妆品、医疗等领域使用动物来源的SOD。然而从上述来源中所提取的SOD普遍存在酶活性较低、清除氧自由基的能力较差等缺点。
金属硫蛋白(Metallothionein，MT)，又称巯基金属结合蛋白，化学名为金属硫组氨酸三甲基内盐，是一种广泛存在于人体、动物、植物以及微生物体内的有特殊功能的蛋白质。人类MT按分子特征和分布分为四个亚群：MT1、MT2、MT3、MT4。MT1又分9个亚类，MT2又分MT-2a和MT-2b。MT1和MT2分布全身，MT3分布于脑，MT4主要分布于皮肤。具有参与体内微量元素代谢、重金属解毒、清除自由基、参与DNA复制和转录，影响蛋白质和能量代谢、拮抗电离辐射、增强机体免疫力和应激保护等生物学功能。其中，清除自由基和结合金属离子是MT最重要的两项功能。当前国内对MT的研究开发虽然起步较早，但大多都集中在基因的克隆和生物学功能的探讨上，并没有大规模生产应用重组金属硫蛋白融合蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗氧化融合蛋白，采用本发明提供的抗氧化融合蛋白，与超氧化物歧化酶相比，提高了酶活，进而提高了抗氧化活性。
本发明提供了一种抗氧化融合蛋白，将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后得到。
优选的，所述融合包括直接融合或通过连接肽融合。
优选的，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
优选的，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。
优选的，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.22所示。
优选的，所述抗氧化融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)以MT-2a全基因组序列为模版，用MT-Fw-2和MT-Rev-2引物对进行第一PCR扩增，得到MT-2a片段；
所述MT-Fw-2引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
所述MT-Rev-2引物有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
2)以FeSOD全基因组序列为模版，用SOD-Fw-2和SOD-Rev-2引物对进行第二PCR扩增，得到FeSOD片段；
所述SOD-Fw-2引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
所述SOD-Rev-2引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
3)将所述步骤1)得到的MT-2a片段与步骤2)得到的FeSOD片段混合后进行第三PCR扩增，得到扩增产物；
4)以所述步骤3)得到的扩增产物为模版，用MT-Fw-2和SOD-Rev-2引物对进行第四PCR扩增，得到MT-SOD-his片段；
5)将所述步骤4)得到的MT-SOD-his片段连接到载体上，转化大肠杆菌后，得到抗氧化融合蛋白。
优选的，所述步骤1)第一PCR扩增的程序包括：95℃，2min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗氧化融合蛋白在制备化妆品中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗氧化融合蛋白在制备增强机体免疫力保健品中的应用。
本发明提供了一种抗氧化融合蛋白，将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后得到。本发明将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后，提高了融合蛋白的酶活，进而提高了抗氧化能力。
本发明实施例的结果显示：本发明提供的抗氧化融合蛋白的抗氧化活性均明显高于Fe-SOD蛋白，而且对温度、酒精、胃蛋白酶和胰蛋白酶具有耐受性，表明抗氧化融合蛋白可用作口服保健品和化妆品中。
附图说明
图1为不同pH值处理MT-SOD融合蛋白和SOD的结果；
图2为不同温度处理MT-SOD融合蛋白和SOD结果，以横坐标40min时为基准，最上边的线为70℃处理MT-SOD融合蛋白结果，从上往下的第二条线为70℃处理SOD结果，从上往下第三条线为90℃处理MT-SOD融合蛋白结果，最下边的一条线为90℃处理SOD结果；
图3为蛋白对酒精耐受结果，其中，以横坐标10％时为基准，最上边的线为MT-SOD融合蛋白的酒精耐受结果，最下边的线为SOD的酒精耐受结果；
图4为胃蛋白酶处理MT-SOD融合蛋白和SOD结果，以横坐标3min时为基准，最上边线为胃蛋白酶处理MT-SOD融合蛋白的结果，最下边线为胃蛋白酶处理SOD的结果；
图5为胰蛋白酶处理MT-SOD融合蛋白和SOD结果，最上边线为胰蛋白酶处理MT-SOD融合蛋白结果，最下边线为胰蛋白酶处理SOD结果。
具体实施方式
本发明提供了一种抗氧化融合蛋白，其特征在于，将金属硫蛋白和超氧化物歧化酶融合后得到。
本发明对所述金属硫蛋白没有特殊限定，优选采用人金属硫蛋白，更优选采用人金属硫蛋白的不同亚型，或不同种属来源的其它金属硫蛋白及其变异体。
在本发明中，所述金属硫蛋白融合在所述超氧化物歧化酶的N端或C端。
在本发明中，所述超氧化物歧化酶包括来源于藻类、细菌、真菌、动物肝的Fe-SOD及其变异体、Mn-SOD及其变异体、Cu/Zn-SOD及其变异体。其中所述变异体不仅指全长蛋白，还包括天然产生或非天然产生的变异体。例如由常规基因工程方法产生的氨基酸突变体，个别氨基酸化学修饰突变体等，与本发明所公开的金属硫蛋白和超氧化物歧化酶天然产生的蛋白质序列至少有60％相似或50％相同，更优选的至少75％相似或55％相同，最优选的80％相似或60％相同。
在本发明中，所述融合优选包括直接融合或通过连接肽融合。本发明对所述连接肽没有特殊限定，采用常规即可，如(GGGGs)n、(EAAK)n或富含脯氨酸的序列。本发明对所述通过连接肽融合的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
在本发明中，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID No.1所示，具体如下所示：
MDPNCSCAAGDSCTCAGSCKCKECKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCAQGCICKGASDKCSCCAGGGGSGGGGSGGGGSMAFVQEPLPFDPGALEPYGMSAKTLEFHYGKHHKGYVDNLNKLTQDTELADKSLEDVIRTTYGDAAKVGIFNNAAQVWNHTFFWNSLKPGGGGVPTGDVAARINSAFGSYDEFKAQFKNAAATQFGSGWAWLVLEAGTLKVTKTANAENPLVHGQVPLLTIDVWEHAYYLDYQNRRPDFIDNFLNQLVNWDFVAKNLAAAHHHHHH。其中GGGGSGGGGSGGGGS为连接肽，HHHHHH为his标签。
在本发明中，所述抗氧化融合蛋白的制备方法，优选包括以下步骤：
1)以MT-2a全基因组序列为模版，用MT-Fw-2和MT-Rev-2引物对进行第一PCR扩增，得到MT-2a片段；
所述MT-Fw-2引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
所述MT-Rev-2引物有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
2)以FeSOD全基因组序列为模版，用SOD-Fw-2和SOD-Rev-2引物对进行第二PCR扩增，得到FeSOD片段；
所述SOD-Fw-2引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
所述SOD-Rev-2引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
3)将所述步骤1)得到的MT-2a片段与步骤2)得到的FeSOD片段混合后进行第三PCR扩增，得到扩增产物；
4)以所述步骤3)得到的扩增产物为模版，用MT-Fw-2和SOD-Rev-2引物对进行第四PCR扩增，得到MT-SOD-his片段；
5)将所述步骤4)得到的MT-SOD-his片段连接到载体上，转化大肠杆菌后，得到抗氧化融合蛋白。
本发明优选以MT-2a全基因组序列为模版，用MT-Fw-2和MT-Rev-2引物对进行第一PCR扩增，得到MT-2a片段；所述MT-Fw-2引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述MT-Rev-2引物有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述MT-2a全基因组序列如SEQ ID No.6所示，具体序列如下所示：
ATGGATCCGAACTGCAGCTGCGCGGCGGGCGATAGCTGCACCTGCGCGGGCAGCTGCAAATGCAAAGAATGCAAATGCACCAGCTGCAAGAAAAGCTGCTGCAGCTGCTGCCCGGTGGGCTGCGCGAAATGCGCGCAGGGCTGCATTTGCAAAGGCGCGAGCGATAAATGCAGCTGCTGCGCG。
在本发明中，所述MT-Fw-2引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体序列如下：
CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGAACTGCAGCTG；
所述MT-Rev-2引物有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体序列如下：CCTCCACTTCCGCCACCGCCGCTGCCGCCACCTCCCGCGCAGCAGCTGCATTTATC。
在本发明中，所述第一PCR扩增的体系优选每20μL包括：PFU ultra II Fusionbuffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FW primer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water 16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
在本发明中，所述第一PCR扩增的程序优选包括：95℃，2min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min。
本发明优选以FeSOD全基因组序列为模版，用SOD-Fw-2和SOD-Rev-2引物对进行第二PCR扩增，得到FeSOD片段；所述SOD-Fw-2引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述SOD-Rev-2引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述FeSOD全基因组序列具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，具体序列如下：
ATGGCGTTTGTGCAGGAACCTCTGCCTTTTGATCCGGGAGCGCTGGAACCGTATGGCATGAGCGCGAAAACCCTGGAATTTCACTATGGCAAACATCATAAAGGCTATGTGGATAATCTGAATAAACTGACCCAGGATACCGAACTGGCGGATAAAAGCCTGGAAGATGTGATTCGTACCACCTATGGGGACGCTGCCAAGGTGGGCATTTTCAATAATGCGGCGCAGGTGTGGAATCATACCTTTTTTTGGAATAGCCTGAAACCGGGAGGTGGCGGCGTGCCGACCGGGGATGTGGCCGCTCGTATAAACAGCGCGTTTGGGAGCTATGACGAATTCAAGGCGCAGTTTAAGAATGCCGCAGCCACCCAGTTTGGCTCTGGCTGGGCGTGGCTGGTGCTGGAAGCGGGCACCCTGAAGGTGACCAAAACCGCGAACGCGGAGAATCCGCTTGTTCATGGCCAAGTGCCACTGCTGACCATTGATGTGTGGGAACATGCGTATTATCTGGATTATCAGAATCGTCGTCCGGATTTCATAGACAATTTTCTGAATCAGCTGGTGAATTGGGATTTTGTGGCGAAAAACTTAGCAGCGGCG。
在本发明中，所述SOD-Fw-2引物优选具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，具体序列如下：
GGCGGTGGCGGAAGTGGAGGCGGTGGCAGCATGGCGTTTGTGCAGGAAC；
所述SOD-Rev-2引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，具体序列如下：
GGATCCGTTATCCACTTTTAATGATGATGATGATGGTGCGCCGCTGCTAAGTTTTTC。
在本发明中，所述第二扩增的体系优选每20μL包括：PFU ultra II Fusionbuffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FW primer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water 16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
在本发明中，所述第二扩增的程序优选包括：5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min。
本发明优选将得到的MT-2a片段与得到的FeSOD片段混合后进行第三PCR扩增，得到扩增产物。
在本发明中，所述第三PCR扩增的体系优选每20uL包括：PFU ultra II Fusionbuffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FW primer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，MT-2a 5μl，FeSOD 5ul，Sterile miliQ water 6.4μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
在本发明中，所述第三PCR扩增的程序优选包括：95℃，2min；95℃，20s，50℃，20s，72℃，30s，10个循环；72℃，5min。
本发明优选以得到的扩增产物为模版，用MT-Fw-2和SOD-Rev-2引物对进行第四PCR扩增，得到MT-SOD-his片段。
在本发明中，所述第四PCR扩增的体系优选每20μL包括：PFU ultra II Fusionbuffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FW primer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water 16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
在本发明中，所述第四PCR扩增的程序优选包括：95℃，2min；95℃20s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，5min。
本发明将所述得到的MT-SOD-his片段连接到载体上，转化大肠杆菌后，得到抗氧化融合蛋白。
本发明对所述载体的种类和来源没有特殊限定，采用常规即可。本发明对所述连接的方法没有特殊限定，采用常规即可。本发明对所述大肠杆菌的种类没有特殊限定，采用常规转化中用到的大肠杆菌即可。本发明对转化的方法没有特殊限定，采用常规转化方法即可。
在本发明中，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID No.12所示，具体序列如下：
MDPNCSCAAGDSCTCAGSCKCKECKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCAQGCICKGASDKCSCCAGGGGSGGGGSGGGGSMAFVQEPLPFDPGALEPYGMSAKTLEFHYGKHHKGYVDNLNKLTQDTELADKSLEDVIRTTYGDAAKVGIFNNAAQVWNHTFFWNSLKPGGGGVPTGDVAARINSAFGSYDEFKAQFKNAAATQFGSGWAWLVLEAGTLKVTKTANAENPLVHGQVPLLTIDVWEHAYYLDYQNRRPDFIDNFLNQLVNWDFVAKNLAAA。其中，GGGGSGGGGSGGGGS为连接肽。
在本发明中，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID No.17所示，具体序列如下：
HHHHHHMAFVQEPLPFDPGALEPYGMSAKTLEFHYGKHHKGYVDNLNKLTQDTELADKSLEDVIRTTYGDAAKVGIFNNAAQVWNHTFFWNSLKPGGGGVPTGDVAARINSAFGSYDEFKAQFKNAAATQFGSGWAWLVLEAGTLKVTKTANAENPLVHGQVPLLTIDVWEHAYYLDYQNRRPDFIDNFLNQLVNWDFVAKNLAAAGGGGSGGGGSGGGGSMDPNCSCAAGDSCTCAGSCKCKECKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCAQGCICKGASDKCSCCA。其中，HHHHHH为His标签，GGGGSGGGGSGGGGS为连接肽。
在本发明中，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID No.22所示，具体序列如下：
MAFVQEPLPFDPGALEPYGMSAKTLEFHYGKHHKGYVDNLNKLTQDTELADKSLEDVIRTTYGDAAKVGIFNNAAQVWNHTFFWNSLKPGGGGVPTGDVAARINSAFGSYDEFKAQFKNAAATQFGSGWAWLVLEAGTLKVTKTANAENPLVHGQVPLLTIDVWEHAYYLDYQNRRPDFIDNFLNQLVNWDFVAKNLAAAGGGGSGGGGSGGGGSMDPNCSCAAGDSCTCAGSCKCKECKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCAQGCICKGASDKCSCCA。其中GGGGSGGGGSGGGGS为连接肽。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗氧化融合蛋白在制备化妆品中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的抗氧化融合蛋白在制备增强机体免疫力保健品中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种抗氧化融合蛋白及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
以下实施例中的SOD均为FeSOD。
实施例1
MT-SOD-His融合蛋白的制备：
MT-SOD-his片段的扩增：
(1)以合成的MT-2a全基因序列(SEQQ ID No.6)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到MT-2a片段：
PCR扩增的体系：PFU ultra II Fusionbuffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
PCR反应程序如下：
95℃2min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min(SEQ ID No.2)MT-Fw-2:
CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGAACTGCAGCTG；
(SEQ ID No.2)MT-Rev-2：
CCTCCACTTCCGCCACCGCCGCTGCCGCCACCTCCCGCGCAGCAGCTGCATTTATC。
(2)以合成的FeSOD全基因序列(SEQ ID No.7)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到FeSOD片段：
PCR扩增的体系：PFU ultra II Fusionbuffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
PCR反应程序如下：
95℃2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min
(SEQ ID No.4)SOD-Fw-2：
GGCGGTGGCGGAAGTGGAGGCGGTGGCAGCATGGCGTTTGTGCAGGAAC；
(SEQ ID No.5)SOD-Rev-2:
GGATCCGTTATCCACTTTTAATGATGATGATGATGGTGCGCCGCTGCTAAGTTTTTC。
(3)将上述两段PCR片段混合后，PCR预反应10个循环，反应条件如下：
扩增体系：每20uL包括：PFU ultra II Fusion buffer2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FW primer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，MT-2a 5μl，FeSOD 5ul，SterilemiliQ water6.4μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
扩增程序为：95℃2minutes；95℃20s，50℃20s，72℃30s，10个循环；72℃5min。
(4)以步骤(3)反应后产物为模板，引物MT-FW-2和SOD-Rev-2进行PCR，得到MT-SOD-His片段；
扩增体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
扩增程序：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，5min。
(5)MT-SOD-His片段的克隆
将MT-SOD-His片段分别连接到载体pet15b上，转化大肠杆菌DH5a，涂布于含有100ug/ml Amp的LB固体培养基平板上，37℃培养16小时，分别挑选单克隆菌落进行鉴定。鉴定为阳性克隆的DH5a经DNA测序验证基因序列正确。将含有重组融合蛋白的质粒分别转化到大肠杆菌Rosseta(DE3)中，得到融合蛋白的表达菌株。
(6)融合蛋白的表达与纯化
A.融合蛋白的表达
将上述融合蛋白单克隆接种到含有100ug/ml Amp、34ug氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时后，将培养物按照1:100比例接种到500ml含有100ug/ml Amp、34ug氯霉素新鲜TB培养基中，37℃培养4h至OD600达到0.8～1时，加入IPTG终浓度至0.2mM，ZnCl2浓度至0.2mM。20℃诱导12～16h。
B.菌液裂解
离心收集菌体，重悬于20mM Tris，300mM NaCl，20mM咪唑中，高压破碎仪破碎，裂解后4℃，10000rpm离心30min，取上清，过镍柱纯化。
C.Ni柱纯化
(1)Ni柱先用含10mM咪唑的上样缓冲液平衡5倍柱体积。
(2)将粗酶液通过0.45um滤膜过滤，过滤后的上清穿过平衡后的Ni柱。
(3)含有10mM咪唑，0.1％Triton X-114缓冲液冲洗10倍柱体积。
(4)20mM咪唑冲洗5倍柱体积洗杂。
(5)300mM咪唑洗脱目的蛋白，得到MT-SOD-His抗氧化融合蛋白。
经检测可知，抗氧化融合蛋白的纯度可达到95％以上。
实施例2
MT-SOD融合蛋白的制备：
his-MT-SOD片段的扩增：
(1)以合成的MT-2a全基因序列(SEQQ ID No.6)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到MT-2a片段：
PCR扩增的体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
PCR反应程序如下：
95℃2min；95℃，30s，57℃，20s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min(SEQ ID No.8)MT-Fw-1:
CTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCATCATCATCATCATGAGAATC；
(SEQ ID No.9)MT-Rev-1：
CCTCCACTTCCGCCACCGCCGCTGCCGCCACCTCCCGCGCAGCAGCTGCATTTATC。
(2)以合成的FeSOD全基因序列(SEQ ID No.7)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到FeSOD片段：
PCR扩增的体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
PCR反应程序如下：
95℃2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min
(SEQ ID No.10)SOD-Fw-1：
GGCGGTGGCGGAAGTGGAGGCGGTGGCAGCATGGCGTTTGTGCAGGAAC；
(SEQ ID No.11)SOD-Rev-1:
GGATCCGTTATCCACTTTTACGCCGCTGCTAAGTTTTTC。
(3)将上述两段PCR片段混合后，PCR预反应10个循环，反应条件如下：
扩增体系：每20uL包括：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FW primer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，MT-2a 5μl，FeSOD 5ul，SterilemiliQ water 6.4μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
扩增程序为：95℃2min；95℃20s，50℃20s，72℃30s，10个循环；72℃5min。
(4)以步骤(3)反应后产物为模板，引物MT-FW-1和SOD-Rev-1进行PCR，得到His-MT-SOD片段；
扩增体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
扩增程序：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，5min。
(5)His-MT-SOD片段的克隆
将His-MT-SOD片段分别连接到载体pet15b上，转化大肠杆菌DH5a，涂布于含有100ug/ml Amp的LB固体培养基平板上，37℃培养16小时，分别挑选单克隆菌落进行鉴定。鉴定为阳性克隆的DH5a经DNA测序验证基因序列正确。将含有重组融合蛋白的质粒分别转化到大肠杆菌Rosseta(DE3)中，得到融合蛋白的表达菌株。
(6)融合蛋白的表达与纯化
A.融合蛋白的表达
将上述融合蛋白单克隆接种到含有100ug/ml Amp、34ug氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时后，将培养物按照1:100比例接种到500ml含有100ug/ml Amp、34ug氯霉素新鲜TB培养基中，37℃培养4h至OD600达到0.8～1时，加入IPTG终浓度至0.2mM，ZnCl2浓度至0.2mM。20℃诱导12～16h。
B.菌液裂解
离心收集菌体，重悬于20mM Tris，300mM NaCl，20mM咪唑中，高压破碎仪破碎，裂解后4℃，10000rpm离心30min，取上清，过镍柱纯化。
C.Ni柱纯化
Ni柱先用含10mM咪唑的上样缓冲液平衡5倍柱体积；
将粗酶液通过0.45um滤膜过滤，过滤后的上清穿过平衡后的Ni柱；
含有10mM咪唑，0.1％Triton X-114缓冲液冲洗10倍柱体积；
20mM咪唑冲洗5倍柱体积洗杂；
300mM咪唑洗脱目的蛋白，得到His-MT-SOD抗氧化融合蛋白。
经检测可知，抗氧化融合蛋白的纯度可达到95％以上。
(7)His标签的切除
His-MT-SOD融合蛋白的His-tag后面含有一段TEV蛋白酶识别位点，可以通过TEV蛋白酶作用除掉标签。
Ni柱纯化后的融合蛋白测得蛋白浓度后，按质量比50:1加入TEV蛋白酶，即1μgTEV蛋白酶作用于50μg目的蛋白。4℃酶切过夜。
(8)超滤浓缩、换液及标签的清除
酶切后的蛋白经过10kd超滤管浓缩至合适体积后，用脱盐柱G25换液到10mM咪唑上样缓冲液中，再次使用Ni柱进行纯化，此时，被切割下的标签及未切除标签的蛋白吸附在Ni柱上，无his标签的融合蛋白穿过柱子，收集穿过液，即为目的蛋白，得到MT-SOD抗氧化融合蛋白。
MT-SOD抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，具体如下：
MDPNCSCAAGDSCTCAGSCKCKECKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCAQGCICKGASDKCSCCAGGGGSGGGGSGGGGSMAFVQEPLPFDPGALEPYGMSAKTLEFHYGKHHKGYVDNLNKLTQDTELADKSLEDVIRTTYGDAAKVGIFNNAAQVWNHTFFWNSLKPGGGGVPTGDVAARINSAFGSYDEFKAQFKNAAATQFGSGWAWLVLEAGTLKVTKTANAENPLVHGQVPLLTIDVWEHAYYLDYQNRRPDFIDNFLNQLVNWDFVAKNLAAA。其中，GGGGSGGGGSGGGGS为连接肽。
实施例3
His-SOD-MT融合蛋白的制备：
His-SOD-MT片段的扩增：
(1)以合成的MT-2a全基因序列(SEQQ ID No.6)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到MT-2a片段：
PCR扩增的体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
PCR反应程序如下：
95℃2min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min(SEQ ID No.13)MT-Fw-3:
GGCGGTGGCGGAAGTGGAGGCGGTGGCAGCATGGATCCGAACTGCAGCTG；
(SEQ ID No.14)MT-Rev-3：
GGATCCGTTATCCACTTTTACGCGCAGCAGCTGCATTTATC。
(2)以合成的FeSOD全基因序列(SEQ ID No.7)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到FeSOD片段：
PCR扩增的体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
PCR反应程序如下：
95℃2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min
(SEQ ID No.15)SOD-Fw-3：
CTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCATCATCATCATCATGAGAATC；
(SEQ ID No.16)SOD-Rev-3:
CCTCCACTTCCGCCACCGCCGCTGCCGCCACCTCCCGCCGCTGCTAAGTTTTTC。
(3)将上述两段PCR片段混合后，PCR预反应10个循环，反应条件如下：
扩增体系：每20uL包括：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FW primer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，MT-2a 5μl，FeSOD 5ul，SterilemiliQ water 6.4μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
扩增程序为：95℃2minutes；95℃20s，50℃20s，72℃30s，10个循环；72℃5min。
(4)以步骤(3)反应后产物为模板，引物MT-FW-2和SOD-Rev-2进行PCR，得到His-SOD-MT片段；
扩增体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
扩增程序：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，5min。
(5)His-SOD-MT片段的克隆
将His-SOD-MT片段分别连接到载体pet15b上，转化大肠杆菌DH5a，涂布于含有100ug/ml Amp的LB固体培养基平板上，37℃培养16小时，分别挑选单克隆菌落进行鉴定。鉴定为阳性克隆的DH5a经DNA测序验证基因序列正确。将含有重组融合蛋白的质粒分别转化到大肠杆菌Rosseta(DE3)中，得到融合蛋白的表达菌株。
(6)融合蛋白的表达与纯化
A.融合蛋白的表达
将上述融合蛋白单克隆接种到含有100ug/ml Amp、34ug氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时后，将培养物按照1:100比例接种到500ml含有100ug/ml Amp、34ug氯霉素新鲜TB培养基中，37℃培养4h至OD600达到0.8～1时，加入IPTG终浓度至0.2mM，ZnCl2浓度至0.2mM。20℃诱导12～16h。
B.菌液裂解
离心收集菌体，重悬于20mM Tris，300mM NaCl，20mM咪唑中，高压破碎仪破碎，裂解后4℃，10000rpm离心30min，取上清，过镍柱纯化。
C.Ni柱纯化
(1)Ni柱先用含10mM咪唑的上样缓冲液平衡5倍柱体积。
(2)将粗酶液通过0.45um滤膜过滤，过滤后的上清穿过平衡后的Ni柱。
(3)含有10mM咪唑，0.1％Triton X-114缓冲液冲洗10倍柱体积。
(4)20mM咪唑冲洗5倍柱体积洗杂。
(5)300mM咪唑洗脱目的蛋白，得到His-SOD-MT抗氧化融合蛋白。
经检测可知，抗氧化融合蛋白的纯度可达到95％以上。
His-SOD-MT抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，具体序列如下：
HHHHHHMAFVQEPLPFDPGALEPYGMSAKTLEFHYGKHHKGYVDNLNKLTQDTELADKSLEDVIRTTYGDAAKVGIFNNAAQVWNHTFFWNSLKPGGGGVPTGDVAARINSAFGSYDEFKAQFKNAAATQFGSGWAWLVLEAGTLKVTKTANAENPLVHGQVPLLTIDVWEHAYYLDYQNRRPDFIDNFLNQLVNWDFVAKNLAAAGGGGSGGGGSGGGGSMDPNCSCAAGDSCTCAGSCKCKECKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCAQGCICKGASDKCSCCA。其中，HHHHHH为His标签，GGGGSGGGGSGGGGS为连接肽。
实施例4
SOD-MT融合蛋白的制备：
SOD-MT-his片段的扩增：
(1)以合成的MT-2a全基因序列(SEQQ ID No.6)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到MT-2a片段：
PCR扩增的体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
PCR反应程序如下：
95℃2min；95℃，30s，57℃，20s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min(SEQ ID No.18)MT-Fw-4:
GGCGGTGGCGGAAGTGGAGGCGGTGGCAGCATGGATCCGAACTGCAGCTG；
(SEQ ID No.19)MT-Rev-4：
GGATCCGTTATCCACTTTTACGCGCAGCAGCTGCATTTATC。
(2)以合成的FeSOD全基因序列(SEQ ID No.7)为模板，使用以下引物进行PCR扩增，得到FeSOD片段：
PCR扩增的体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
PCR反应程序如下：
95℃2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，20s，30个循环；72℃，5min
(SEQ ID No.20)SOD-Fw-4：
CTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCATCATCATCATCATATGGCGTTTGTGCAGGAAC；
(SEQ ID No.21)SOD-Rev-4:
CCTCCACTTCCGCCACCGCCGCTGCCGCCACCTCCCGCCGCTGCTAAGTTTTTC。
(3)将上述两段PCR片段混合后，PCR预反应10个循环，反应条件如下：
扩增体系：每20uL包括：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FW primer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，MT-2a 5μl，FeSOD 5ul，SterilemiliQ water 6.4μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
扩增程序为：95℃2min；95℃20s，50℃20s，72℃30s，10个循环；72℃5min。
(4)以步骤(3)反应后产物为模板，引物MT-FW-4和SOD-Rev-4进行PCR，得到His-MT-SOD片段；
扩增体系：PFU ultra II Fusion buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.4μl，FWprimer(20μM)0.4μl，REV primer(20μM)0.4μl，Template 0.1μl，Sterile miliQ water16.3μl，pFU ultra IIfusion enzyme 0.4μl。
扩增程序：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，5min。
(5)SOD-MT-his片段的克隆
将SOD-MT-his片段分别连接到载体pet15b上，转化大肠杆菌DH5a，涂布于含有100ug/ml Amp的LB固体培养基平板上，37℃培养16小时，分别挑选单克隆菌落进行鉴定。鉴定为阳性克隆的DH5a经DNA测序验证基因序列正确。将含有重组融合蛋白的质粒分别转化到大肠杆菌Rosseta(DE3)中，得到融合蛋白的表达菌株。
(6)融合蛋白的表达与纯化
A.融合蛋白的表达
将上述融合蛋白单克隆接种到含有100ug/ml Amp、34ug氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时后，将培养物按照1:100比例接种到500ml含有100ug/ml Amp、34ug氯霉素新鲜TB培养基中，37℃培养4h至OD600达到0.8～1时，加入IPTG终浓度至0.2mM，ZnCl2浓度至0.2mM。20℃诱导12～16h。
B.菌液裂解
离心收集菌体，重悬于20mM Tris，300mM NaCl，20mM咪唑中，高压破碎仪破碎，裂解后4℃，10000rpm离心30min，取上清，过镍柱纯化。
C.Ni柱纯化
Ni柱先用含10mM咪唑的上样缓冲液平衡5倍柱体积；
将粗酶液通过0.45um滤膜过滤，过滤后的上清穿过平衡后的Ni柱；
含有10mM咪唑，0.1％Triton X-114缓冲液冲洗10倍柱体积；
20mM咪唑冲洗5倍柱体积洗杂；
300mM咪唑洗脱目的蛋白，得到SOD-MT-his抗氧化融合蛋白。
经检测可知，抗氧化融合蛋白的纯度可达到95％以上。
(7)His标签的切除
SOD-MT-his融合蛋白的His-tag后面含有一段TEV蛋白酶识别位点，可以通过TEV蛋白酶作用除掉标签。
Ni柱纯化后的融合蛋白测得蛋白浓度后，按质量比50:1加入TEV蛋白酶，即1μgTEV蛋白酶作用于50μg目的蛋白。4℃酶切过夜。
(8)超滤浓缩、换液及标签的清除
酶切后的蛋白经过10kd超滤管浓缩至合适体积后，用脱盐柱G25换液到10mM咪唑上样缓冲液中，再次使用Ni柱进行纯化，此时，被切割下的标签及未切除标签的蛋白吸附在Ni柱上，无his标签的融合蛋白穿过柱子，收集穿过液，即为目的蛋白，得到SOD-MT抗氧化融合蛋白。
SOD-MT抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.22所示，具体如下：
MAFVQEPLPFDPGALEPYGMSAKTLEFHYGKHHKGYVDNLNKLTQDTELADKSLEDVIRTTYGDAAKVGIFNNAAQVWNHTFFWNSLKPGGGGVPTGDVAARINSAFGSYDEFKAQFKNAAATQFGSGWAWLVLEAGTLKVTKTANAENPLVHGQVPLLTIDVWEHAYYLDYQNRRPDFIDNFLNQLVNWDFVAKNLAAAGGGGSGGGGSGGGGSMDPNCSCAAGDSCTCAGSCKCKECKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCAQGCICKGASDKCSCCA。其中GGGGSGGGGSGGGGS为连接肽。
实施例5
采用超氧化物歧化酶(SOD)活性测定法中的羟胺法，分别对实施例1～4得到的4种抗氧化融合蛋白进行活性检测，并与从蓝藻中获取的Fe-SOD蛋白为对照进行对比，结果如表1所示。
表1融合蛋白的活性结果
| 蛋白种类 | 酶活(U/mg) |
| 对照 | 1500～2500 |
| MT-SOD融合蛋白 | 4000～5000 |
| MT-SOD-His融合蛋白 | 4500～5500 |
| SOD-MT融合蛋白 | 3000～4000 |
| SOD-MT-His融合蛋白 | 2500～3000 |
从表1中可以看出，实施例1～4获得的4中不同种类的融合蛋白的酶活性都要高于从蓝藻中获取的Fe-SOD蛋白的酶活性。
以单独的FeSOD蛋白做对照，通过羟基自由基清除实验测定实施例1～4得到的4种融合蛋白清除羟自由基的酶活性，结果见表2。
表2羟基自由基清除结果
| 蛋白种类 | 酶活(U/mg) |
| 对照 | 36 |
| MT-SOD融合蛋白 | 46 |
| MT-SOD-His融合蛋白 | 46 |
| SOD-MT融合蛋白 | 47 |
| SOD-MT-His融合蛋白 | 47.6 |
从表2可以得出，实施例1～4得到的融合蛋白的清除羟基自由基能力为对照的1.5倍以上。
以SOD蛋白为对照，纯化后的融合蛋白在90℃水浴加热20min后，测定酶活，结果见表3。
表3不同蛋白的酶活结果
| 蛋白种类 | 加热前酶活(U/mg) | 加热后酶活(U/mg) |
| 对照 | 36 | 26 |
| MT-SOD融合蛋白 | 46 | 43.5 |
| MT-SOD-His融合蛋白 | 46 | 46 |
| SOD-MT融合蛋白 | 47 | 36 |
| SOD-MT-His融合蛋白 | 47.6 | 39 |
从表3可以得出，MT-SOD融合蛋白在高温下热稳定性明显高于SOD。
用不同pH的水溶液溶解MT-SOD融合蛋白和SOD蛋白后，检测其酶活性，结果见表4和图1。
表4不同pH值处理后的酶活结果
从表4和图1中可以得出，MT-SOD融合蛋白在pH值1～13宽范围内都具有活性，并在较宽范围3～9维持较高活性，对pH耐受性明显高于SOD。
用水溶液溶解MT-SOD融合蛋白和SOD蛋白后，将蛋白在不同温度不同时间内处理，处理后样品进行酶活测定，结果见表5和图2。
表5不同温度处理后的蛋白酶活结果
从表5和图2中可以得出，MT-SOD融合蛋白的高温稳定性均明显高于SOD蛋白。
用不同浓度酒精溶解稀释MT-SOD融合蛋白和SOD蛋白后，检测融合蛋白活性，SOD蛋白作为对照，结果见表6和图3。
表6不同浓度酒精处理后的酶活结果
从表6和图3中可以得出，MT-SOD融合蛋白对酒精耐受度良好，能够添加到化妆品等含酒精成分中保持活性。
在pH2.5的HCl-生理盐水中，加入终浓度为200U/ml胃蛋白酶，37℃保温，用胃蛋白酶处理MT-SOD融合蛋白和SOD，在不同时间下取样检测蛋白活性，结果见表7和图4。
表7不同胃蛋白酶处理蛋白结果
从表7和图4中可以得出，不同处理时间下的MT-SOD融合蛋白的活性均明显高于SOD蛋白，所以MT-SOD融合蛋白可用作口服保健品。
在pH8.5的碳酸钠缓冲液中，加入终浓度100U/ml的胰蛋白酶，37℃保温，用胰蛋白酶对MT-SOD融合蛋白和SOD进行处理，处理后检测蛋白活性，结果见表8和图5。
表8胰蛋白酶处理蛋白结果
| 无酶 | 5min | 30min | 60min | 2h | |
| SOD(U/mg) | 3532 | 3575 | 3886 | 3811 | 3758 |
| MT-SOD(U/mg) | 3886 | 4058 | 4080 | 4123 | 4004 |
从表8和图5中可以得出，胰蛋白酶基本对蛋白活性无影响。
由以上实施例可以得出，本发明提供的抗氧化融合蛋白的抗氧化活性均明显高于Fe-SOD蛋白，而且对温度、酒精、胃蛋白酶和胰蛋白酶具有耐受性，表明抗氧化融合蛋白可用作口服保健品和化妆品中。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏芝大生物科技有限公司
<120> 一种抗氧化融合蛋白及应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala
1 5 10 15
Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser
20 25 30
Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys
35 40 45
Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Phe Val
65 70 75 80
Gln Glu Pro Leu Pro Phe Asp Pro Gly Ala Leu Glu Pro Tyr Gly Met
85 90 95
Ser Ala Lys Thr Leu Glu Phe His Tyr Gly Lys His His Lys Gly Tyr
100 105 110
Val Asp Asn Leu Asn Lys Leu Thr Gln Asp Thr Glu Leu Ala Asp Lys
115 120 125
Ser Leu Glu Asp Val Ile Arg Thr Thr Tyr Gly Asp Ala Ala Lys Val
130 135 140
Gly Ile Phe Asn Asn Ala Ala Gln Val Trp Asn His Thr Phe Phe Trp
145 150 155 160
Asn Ser Leu Lys Pro Gly Gly Gly Gly Val Pro Thr Gly Asp Val Ala
165 170 175
Ala Arg Ile Asn Ser Ala Phe Gly Ser Tyr Asp Glu Phe Lys Ala Gln
180 185 190
Phe Lys Asn Ala Ala Ala Thr Gln Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu
195 200 205
Val Leu Glu Ala Gly Thr Leu Lys Val Thr Lys Thr Ala Asn Ala Glu
210 215 220
Asn Pro Leu Val His Gly Gln Val Pro Leu Leu Thr Ile Asp Val Trp
225 230 235 240
Glu His Ala Tyr Tyr Leu Asp Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Asp Phe Ile
245 250 255
Asp Asn Phe Leu Asn Gln Leu Val Asn Trp Asp Phe Val Ala Lys Asn
260 265 270
Leu Ala Ala Ala His His His His His His
275 280
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctttaagaag gagatataca tatggatccg aactgcagct g 41
<210> 3
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctccacttc cgccaccgcc gctgccgcca cctcccgcgc agcagctgca tttatc 56
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcggtggcg gaagtggagg cggtggcagc atggcgtttg tgcaggaac 49
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggatccgtta tccactttta atgatgatga tgatggtgcg ccgctgctaa gtttttc 57
<210> 6
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggatccga actgcagctg cgcggcgggc gatagctgca cctgcgcggg cagctgcaaa 60
tgcaaagaat gcaaatgcac cagctgcaag aaaagctgct gcagctgctg cccggtgggc 120
tgcgcgaaat gcgcgcaggg ctgcatttgc aaaggcgcga gcgataaatg cagctgctgc 180
gcg 183
<210> 7
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggcgtttg tgcaggaacc tctgcctttt gatccgggag cgctggaacc gtatggcatg 60
agcgcgaaaa ccctggaatt tcactatggc aaacatcata aaggctatgt ggataatctg 120
aataaactga cccaggatac cgaactggcg gataaaagcc tggaagatgt gattcgtacc 180
acctatgggg acgctgccaa ggtgggcatt ttcaataatg cggcgcaggt gtggaatcat 240
accttttttt ggaatagcct gaaaccggga ggtggcggcg tgccgaccgg ggatgtggcc 300
gctcgtataa acagcgcgtt tgggagctat gacgaattca aggcgcagtt taagaatgcc 360
gcagccaccc agtttggctc tggctgggcg tggctggtgc tggaagcggg caccctgaag 420
gtgaccaaaa ccgcgaacgc ggagaatccg cttgttcatg gccaagtgcc actgctgacc 480
attgatgtgt gggaacatgc gtattatctg gattatcaga atcgtcgtcc ggatttcata 540
gacaattttc tgaatcagct ggtgaattgg gattttgtgg cgaaaaactt agcagcggcg 600
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<212> DNA
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ctttaagaag gagatataca tatgcaccat catcatcatc atgagaatc 49
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<212> DNA
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cctccacttc cgccaccgcc gctgccgcca cctcccgcgc agcagctgca tttatc 56
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<212> DNA
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ggcggtggcg gaagtggagg cggtggcagc atggcgtttg tgcaggaac 49
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<212> DNA
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<400> 11
ggatccgtta tccactttta cgccgctgct aagtttttc 39
<210> 12
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala
1 5 10 15
Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser
20 25 30
Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys
35 40 45
Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Phe Val
65 70 75 80
Gln Glu Pro Leu Pro Phe Asp Pro Gly Ala Leu Glu Pro Tyr Gly Met
85 90 95
Ser Ala Lys Thr Leu Glu Phe His Tyr Gly Lys His His Lys Gly Tyr
100 105 110
Val Asp Asn Leu Asn Lys Leu Thr Gln Asp Thr Glu Leu Ala Asp Lys
115 120 125
Ser Leu Glu Asp Val Ile Arg Thr Thr Tyr Gly Asp Ala Ala Lys Val
130 135 140
Gly Ile Phe Asn Asn Ala Ala Gln Val Trp Asn His Thr Phe Phe Trp
145 150 155 160
Asn Ser Leu Lys Pro Gly Gly Gly Gly Val Pro Thr Gly Asp Val Ala
165 170 175
Ala Arg Ile Asn Ser Ala Phe Gly Ser Tyr Asp Glu Phe Lys Ala Gln
180 185 190
Phe Lys Asn Ala Ala Ala Thr Gln Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu
195 200 205
Val Leu Glu Ala Gly Thr Leu Lys Val Thr Lys Thr Ala Asn Ala Glu
210 215 220
Asn Pro Leu Val His Gly Gln Val Pro Leu Leu Thr Ile Asp Val Trp
225 230 235 240
Glu His Ala Tyr Tyr Leu Asp Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Asp Phe Ile
245 250 255
Asp Asn Phe Leu Asn Gln Leu Val Asn Trp Asp Phe Val Ala Lys Asn
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Leu Ala Ala Ala
275
<210> 13
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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ggatccgtta tccactttta cgcgcagcag ctgcatttat c 41
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<211> 49
<212> DNA
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ctttaagaag gagatataca tatgcaccat catcatcatc atgagaatc 49
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<211> 54
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<400> 16
cctccacttc cgccaccgcc gctgccgcca cctcccgccg ctgctaagtt tttc 54
<210> 17
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
His His His His His His Met Ala Phe Val Gln Glu Pro Leu Pro Phe
1 5 10 15
Asp Pro Gly Ala Leu Glu Pro Tyr Gly Met Ser Ala Lys Thr Leu Glu
20 25 30
Phe His Tyr Gly Lys His His Lys Gly Tyr Val Asp Asn Leu Asn Lys
35 40 45
Leu Thr Gln Asp Thr Glu Leu Ala Asp Lys Ser Leu Glu Asp Val Ile
50 55 60
Arg Thr Thr Tyr Gly Asp Ala Ala Lys Val Gly Ile Phe Asn Asn Ala
65 70 75 80
Ala Gln Val Trp Asn His Thr Phe Phe Trp Asn Ser Leu Lys Pro Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Val Pro Thr Gly Asp Val Ala Ala Arg Ile Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Ser Tyr Asp Glu Phe Lys Ala Gln Phe Lys Asn Ala Ala Ala
115 120 125
Thr Gln Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu Val Leu Glu Ala Gly Thr
130 135 140
Leu Lys Val Thr Lys Thr Ala Asn Ala Glu Asn Pro Leu Val His Gly
145 150 155 160
Gln Val Pro Leu Leu Thr Ile Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu
165 170 175
Asp Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Asp Phe Ile Asp Asn Phe Leu Asn Gln
180 185 190
Leu Val Asn Trp Asp Phe Val Ala Lys Asn Leu Ala Ala Ala Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Asp Pro
210 215 220
Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala Gly Ser Cys
225 230 235 240
Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser Cys Cys Ser
245 250 255
Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys Ile Cys Lys
260 265 270
Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala
275 280
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggcggtggcg gaagtggagg cggtggcagc atggatccga actgcagctg 50
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggatccgtta tccactttta cgcgcagcag ctgcatttat c 41
<210> 20
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctttaagaag gagatataca tatgcaccat catcatcatc atatggcgtt tgtgcaggaa 60
c 61
<210> 21
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cctccacttc cgccaccgcc gctgccgcca cctcccgccg ctgctaagtt tttc 54
<210> 22
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Met Ala Phe Val Gln Glu Pro Leu Pro Phe Asp Pro Gly Ala Leu Glu
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Met Ser Ala Lys Thr Leu Glu Phe His Tyr Gly Lys His
20 25 30
His Lys Gly Tyr Val Asp Asn Leu Asn Lys Leu Thr Gln Asp Thr Glu
35 40 45
Leu Ala Asp Lys Ser Leu Glu Asp Val Ile Arg Thr Thr Tyr Gly Asp
50 55 60
Ala Ala Lys Val Gly Ile Phe Asn Asn Ala Ala Gln Val Trp Asn His
65 70 75 80
Thr Phe Phe Trp Asn Ser Leu Lys Pro Gly Gly Gly Gly Val Pro Thr
85 90 95
Gly Asp Val Ala Ala Arg Ile Asn Ser Ala Phe Gly Ser Tyr Asp Glu
100 105 110
Phe Lys Ala Gln Phe Lys Asn Ala Ala Ala Thr Gln Phe Gly Ser Gly
115 120 125
Trp Ala Trp Leu Val Leu Glu Ala Gly Thr Leu Lys Val Thr Lys Thr
130 135 140
Ala Asn Ala Glu Asn Pro Leu Val His Gly Gln Val Pro Leu Leu Thr
145 150 155 160
Ile Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Asp Tyr Gln Asn Arg Arg
165 170 175
Pro Asp Phe Ile Asp Asn Phe Leu Asn Gln Leu Val Asn Trp Asp Phe
180 185 190
Val Ala Lys Asn Leu Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala
210 215 220
Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys
225 230 235 240
Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys
245 250 255
Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys
260 265 270
Ser Cys Cys Ala
275
Claims (2)
1.一种抗氧化融合蛋白，其特征在于，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1或SEQ ID No.12所示。
2.权利要求1所述的抗氧化融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）以MT-2a全基因组序列为模版，用MT-Fw-2和MT-Rev-2引物对进行第一PCR扩增，得到MT-2a片段；所述MT-Fw-2引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述MT-Rev-2引物有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；
2）以FeSOD全基因组序列为模版，用SOD-Fw-2和SOD-Rev-2引物对进行第二PCR扩增，得到FeSOD片段；所述SOD-Fw-2引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述SOD-Rev-2引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
3）将所述步骤1）得到的MT-2a片段与步骤2）得到的FeSOD片段混合后进行第三PCR扩增，得到扩增产物；
4）以所述步骤3）得到的扩增产物为模版，用MT-Fw-2和SOD-Rev-2引物对进行第四PCR扩增，得到MT-SOD-his片段；
5）将所述步骤4）得到的MT-SOD-his片段连接到载体上，转化大肠杆菌后，得到抗氧化融合蛋白；
或包括以下步骤：
1）以MT-2a全基因组序列为模版，用MT-Fw-1和MT-Rev-1引物对进行第一PCR扩增，得到MT-2a片段；所述MT-Fw-1引物具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；所述MT-Rev-1引物有SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；
2）以FeSOD全基因组序列为模版，用SOD-Fw-1和SOD-Rev-1引物对进行第二PCR扩增，得到FeSOD片段；所述SOD-Fw-1引物具有SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；所述SOD-Rev-1引物具有SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；
3）将所述步骤1）得到的MT-2a片段与步骤2）得到的FeSOD片段混合后进行第三PCR扩增，得到扩增产物；
4）以所述步骤3）得到的扩增产物为模版，用MT-Fw-1和SOD-Rev-1引物对进行第四PCR扩增，得到MT-SOD-his片段；
5）将所述步骤4）得到的MT-SOD-his片段连接到载体上，转化大肠杆菌后，得到抗氧化融合蛋白；
步骤1）第一PCR扩增的程序包括：95℃，2min；95℃，30s，57℃，30s，72℃，10s，30个循环；72℃，5min。
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